（环境科学专业论文）耐锰微生物的筛选、生理特性研究及鉴定.pdf

中南林业科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所警交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技人学或其他教育机构的学位或证j f 5 所 使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：灰毅葱 l 年6 目t ob 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或 借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于： l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密吖 ( 请您在以上相应方框打“4 ”) 储躲皮擗新繇 | 年易只 口b 鬟酿 山t 1 年f og l , o 日 v 、 摘要 2 0 世纪8 0 年代以来兴起的微生物除锰技术，以其效果好、投资省等优点逐渐 受到关注。微生物作为生态修复的一个主体，在重金属污染治理中起着重要作用。 本研究利用在湘潭鹤岭镇锰矿栾树恢复区采集的土壤样本，通过逐级提高 m n 2 + 浓度的方法筛选和驯化获得优势耐锰菌株，采用优势菌株进行了除锰试验， 分析测试了优势菌株的生长曲线、耐受性和相关生理生化特性，并对优势菌株进 行了分类学鉴定。研究结果如下： ( 1 ) 筛选获得了3 株耐锰性强的杆菌( 2 、3 、8 0 号) 。在低浓度范围内， m n 2 + 对筛选菌种的生长有促进作用，但在高m n 2 + 浓度点上，m n 2 + 抑制菌体生长。 菌种抗m n 2 + 性能有一定差异，8 0 号菌耐受性最强。 ( 2 ) 在测试的最低m n 2 + 浓度( 1 6m g l ) 点上，3 号菌种的锰的去除率最高 ( 8 2 6 ) ，其次是2 号( 7 2 3 ) ，8 0 号最1 k 氏( 6 4 1 ) ，在测试的最高m n 2 + 浓度( 约 2 0 0 0m g l ) 点上，8 0 号菌种的去除率最高( 4 1 o ) ，其次是2 号( 2 2 o ) ，3 号最低( 1 8 3 ) ，在m n 2 + 浓度约2 0 0m g l 点上，单一菌种和混合菌样本m n 2 + 的去除率最高( 9 0 ) 。菌种混合后在每个浓度点上均保持较高的去除率。 ( 3 ) 通过菌落形态观察、革兰氏染色、1 6 sr d n a 分子鉴定表明：菌株2 为 巨大芽孢杆菌；菌株3 为产酸克雷伯氏杆菌：菌株8 0 为弗氏柠檬酸杆菌。 ( 4 ) 筛选的菌株在1 8 - 2 1 h 左右基本达到生长最高峰，稳定期较长；8 0 号 菌株生长比其他两株菌稍慢。3 株菌的生长导致培养基p h 值升高，这有利于 m n 2 + 的氧化而形成氧化物沉淀。筛选的3 株菌适应的p h 值范围较宽( 5 - 9 ) 。 在温度2 8 - 3 7 之间，2 、3 、8 0 号菌株最适生长温度分别为3 5 、3 7 、3 3 。 电镜扫描显示的特征说明，3 株菌的除锰方式可能是将m n 2 + 氧化为m n 0 2 沉淀。 抗生素抗性试验表明，3 号菌株能抗氨苄青霉素，在浓度达到2 0 0 u g m l 时也能 生长，但对硫酸卡那霉素及氯霉素敏感。2 、8 0 号菌对三种抗生素均敏感。 ( 5 ) 从应用角度用泥炭土作为载体，制作了筛选菌株的菌制剂。 关键词：耐锰微生物；筛选；抗性；去除率；生理生化特性；种类鉴定 a b s t r a c t a c c o u n t e df o r b y i t s a d v a n t a g e o fl o wc o s ta n d h i 曲e f f i c i e n c y , t h e b i o - t e c h n o l o g yu s i n gm i c r o o r g a n i s m st or f f l t l o v em a n g a n e s eh a sr e c e i v e dm u c h a t t e n t i o ns i n c e19 8 0 s a st h ek e yf u n c t i o n a lc o m p o n e n t ，v a r i o u si d e n t i f i e ds p e c i e so f m i c r o o r g a n i s m sh a v ep l a y e di m p o r t a n tr o l e si ne c o l o g i c a lr e s t o r a t i o no fh e a v ym e t a l p o l l u t e da r e a s i nt h ep r e s e n ts t u d ys o i ls a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o mk o e l r e u t e r i ap a n i c u l a t a l a x mr e c o v e r ys i t eo fm a n g a n e s em i n i n ga r e ai nh e l i n gt o w no fx i a n g t a nc i t y m a n g a n e s e r e s i s t a n c es t r a i n sw e r es c r e e n e do u tu s i n gt h es o i ls a m p l e sb yg r a d u a l l y i n c r e a s i n gm n 2 + i o nc o n c e n t r a t i o ni nt h ec u l t u r e 1 1 h eg r o w t hc u r v e , t o l e r a n c ea n d p h y s i o a n db i o - c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h es c r e e n e dm i c r o o r g a n i s m sw e r ef u r t h e r i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h r e em a n g a n e s e - r e s i s t a n ts t r a i n s ( n o 2 ，3a n d8 0 ) w e r ei s o l a t e df r o mt h e s o i ls a m p l e sb ya d d i n gad e f i n i t ea m o u n to fm 1 1 2 + i o n si nt h em e d i u m t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ep r e s e n c eo fm n 2 + i o n se n h a n c e dt h eg r o w t ho ft h es t r a i n sa tl o wm n 2 + i o nc o n c e n t r a t i o nl e v e l sb u ti n h i b i tt h a ta th i g hc o n c e n t r a t i o nl e v e l s i nc o m p a r i s o n ， n o 8 0t o l e r a t e dh i g h e rm n 2 + i o nc o n c e n t r a t i o nt h a nt h eo t h e rt w os t r a i n s ( 2 ) a tt l l el o w e s tt e s t e dm n 2 + c o n c e n t r a t i o nl e v e l ( 16m g l ) ，s t r a i nn o 3g a v et l l e h i g h e s tm n 2 + i o nr e m o v a lr a t e ( 8 2 6 ) ，f o l l o w e db yn o 2 ( 7 2 3 ) a n dn o 8 0 ( 6 4 1 ) a tt h eh i g h e s tm n 2 + c o n c e n t r a t i o nl e v e l ( a b o u t2 0 0 0m g l ) ，n o 8 0g a v et 1 1 e h i g h e s tr e m o v a lr a t e ( 4 1 o ) ，f o l l o w e db yn o2 ( 2 2 o ) a n dn o 3 ( 18 3 ) t h e h i 曲e s tm n 2 + i o nr e m o v a lr a t e ( 9 0 ) w a so b t a i n e da tt l i em n 2 + i o nc o n c e n t r a t i o n l e v e lo fa b o u t2 0 0m g li nb o t hi n d i v i d u a la n dm i x e ds t r a i ns a m p l e s ( 3 ) b a s e do nc o l o n ym o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n ，g r a ms t a i n i n ga n a l y s i sa n d16 s r d n am o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ，s t r a i n sn o2 ，3a n d8 0w e r ei d e n t i f i e da sb a c i l l u s m e g a t e r i u m ，k l e b s i e l l ao x y t o c aa n dc i t r o b a c t e rf f e u n d i i ，r e s p e c t i v e l y ( 4 ) a l li s o l a t e ds t r a i n sr e a c h e dt h e i rp e a kg r o w t hw i t h i n16h o u r st o18h o u r sa n d t h es t r a i ng r o w t hr e m a i n e ds t a b l ef o rar e l a t i v e l yl o n gp e r i o d n o8 0g r e ws l o w e rt h a n t h eo t h e rt w os t r a i n s t h eg r o w t ho ft h ea l li s o l a t e dm i c r o o r g a n i s m se n h a n c e dt h ep h i nt h ec u l t u r em e d i u m ，w h i c hp r o v i d e daf a v o r a b l ec o n d i t i o nf o ro x i d a t i o no fm n 2 + i o ni n t oo x i d i z e dp r e c i p i t a t e s t h r e es t r a i n sg r e ww e l lw i t h i nar e l a t i v e l yw i d ep h r a n g e ( 5 - 9 ) t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ef o rn o s 2 ，3a n d8 0w e r ef o u n dt ob e3 5 ，3 7 a n d3 3 1 2 ，r e s p e c t i v e l y , w i t h i nt h et e s t e dt e m p e r a t u r er a n g e2 8 - 3 7 c t h es c a n n i n g n j e l e c t r o nm i c r o g r a p ho ft h r e es t r a i n s m n 2 + i o ns h o w e dt h a tt h ef u n c t i o n g r o w ni nt h em e d i u mc o n t a i n i n g10 0 0 m g lo f o ft h em i c r o o r g a n i s m st ot r a n s f o r mm n 2 + i o n si n t o o x i d i z e dp r e c i p i t a t e sc o u l db eo n e o ft h em a i nm e c h a n i s m s t or 锄o v em n 2 + i o n sf r o m t h el i q u i dp h a s eo ft h ec u l t u r em e d i u m a n t i b i o t i c r e s i s t a n c ee x p e m e n ti n d i c a t e dt h a t n o3c o u l dr e s i s t a n tt o a m p i c i l l i n ，e v a t li tc o u l dg r o ww h e nt h ec o n c 蜘t r a t i o nr e a c h 2 0 0 u 咖l ，b u tt h es t r a i nw a ss e n s i t i v et 。k a n a m y c i ns u l f a t ea n dc h l 。r 锄p h e n i c 0 1 n 。2 a l l8 0w e r eb o t hs e n s i t i v et ot h et h r e ea n t i b i o t i c s ( 5 ) f o rp u r p o s eo fa p p l i c a t i o ns t r a i ni n o c u l a n t so ft h ei s o l a t e db a c t e d aw e r c m a d e u s i n gp e a ts o i la se a r li e r k e y w o r d s ：m a n g a n e s er e s l 。s t a n c em i c r o 。r g a n i s m ；s c r e e n i n g ；t o l e r a n c e ；r 觚1 。v a l r a t e ； p h y s i o 。b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ；s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n i ! i 目录 摘要i a b s t r a c t i i l绪论 1 1 概述1 1 2 除锰方法2 1 2 1 碱化除锰法一2 1 2 2 空气接触氧化除锰法一2 1 2 3 光化学氧化除锰法3 1 2 4 强氧化剂除锰法：一3 1 2 5 生物除锰法4 1 3 微生物与锰的相互关系6 1 3 1 微生物与锰的作用机理一6 1 3 2 微生物锰氧化的生物学作用7 1 4 固锰除锰微生物现状一7 1 4 1 氧化锰微生物7 1 4 2 微生物固锰除锰研究一8 1 5 微生物固锰除锰技术在水处理中的应用l o 1 5 1 微生固锰除锰技术应用现状1 0 1 5 2 影响微生物除锰效率的因素1 2 1 6 生物技术在微生物固锰除锰中的应用1 3 1 6 1 固定化技术在微生物除锰中的应用1 4 1 6 2 基因工程在生物除锰技术中的应用1 4 1 7 氧化锰在污染环境中的应用l5 1 816 s r d n a 在微生物中的应用l6 1 9 本研究的意义和主要内容l7 1 9 1 本研究的意义。1 7 1 9 2 本研究的主要内容1 7 2 耐锰除锰微生物的筛选与除锰特性研究 2 1 实验材料18 2 1 1 样品、试剂、仪器l8 2 2 实验方法19 2 2 1 土壤特征的测定1 9 i v 2 2 2 耐锰菌株的筛选2 2 2 2 3m n 2 + 去除率试验2 3 2 2 4 优势菌种耐锰性能测验2 3 2 3 结果与分析。2 3 2 3 1 土壤特征的测定。2 3 2 3 2 优势菌种的筛选2 4 2 3 3 优势菌种m n 2 + 去除率2 5 2 3 4 优势菌种耐锰性能。2 8 2 4 小结与讨论2 9 3 菌种的分子鉴定 3 1 实验材料3 0 3 1 1 实验仪器一3 0 3 1 2 菌株一3 0 3 1 3 主要试剂3l 3 1 4 培养基3l 3 1 5 试剂及溶液的配制3l 3 2 实验方法3 2 3 2 1 总d n a 的提取3 2 3 2 216 sr d n a 片段扩增3 3 3 2 3d n a 回收纯化3 3 3 2 4 菌株2 、3 和8 0 重组质粒的构建和鉴定3 4 3 2 51 6 sr d n a 序列测定与分析3 4 3 3 结果与分析3 4 3 3 1 总d n a 提取3 4 3 3 2l6 sr d n a 片段扩增3 4 3 3 3 菌株2 、3 和8 0 重组质粒的构建和鉴定3 5 3 3 4 菌株2 、3 和8 0 的1 6 sr d n a 序列测定与分析3 6 3 4 小结与讨论3 8 4 优势菌种理化性质测定与菌剂制备 4 1 实验材料4 0 4 1 1 实验仪器4 0 4 1 2 菌株4 0 4 1 3 试剂4 0 v 4 1 4 培养基4 l 4 2 实验方法4 l 4 2 1 菌株观察4 1 4 2 2 革兰氏染色4 2 4 2 3 生理生化特性4 3 4 2 4 菌剂制作4 4 4 3 结果与分析4 5 4 3 1 菌株2 、3 和8 0 的形态学特征4 5 4 3 21 0 0 0 m lm n 2 + 处理过的各菌形态特征4 6 4 3 3 革兰氏染色结果。4 8 4 3 4 生理生化特性4 8 4 3 5 菌制剂的制作5 2 4 4 小结与讨论5 3 5 结果与建议 5 1 结论5 5 5 2 本论文的主要创新点5 6 5 3 建议5 6 参考文献58 附录a ：菌株2 、3 、8 0 的1 6 sr d n a 基因片段测序报告( 部分) 6 7 附录b ：2 、3 、8 0 号菌株b l a s t 比对结果。7 0 附录c ：攻读硕士学位期间的主要学术成果8 4 餮 访 85 v i 烦l j 学位论义耐锸微生物的筛选、生理特性研究及筘定 1 绪论 1 1 概述 锰是地壳的主要金属元素构成成分之一，广泛分布于自然界中，其 含量占地壳岩石圈的0 0 8 5 。自然界中m n 存在的价态较多，如+ 2 、 + 3 、+ 4 、+ 7 价，其中+ 2 、+ 4 价较为稳定。+ 3 价是只有在酶催化氧化过 程中会产生的中间产物，+ 7 价具有强氧化性，如遇到还原性物质，将被 还原成低价形式【l 】。+ 2 价锰溶于水是要去除的主要对象，十4 价锰则常 以固体物质m n 0 2 及水合物的悬浮粒子形式存在于水中，其溶解度甚低， 不足为害。锰虽然是人体所必需的微量元素之一，但锰过量或过少均会引 起疾病，它与蛋白质构成的双成分酶是细胞酶系中的主要催化剂，然而 锰摄入过多会引起慢性疾病，如典型帕金森综合症【2 】。锰是一种环境神 经毒素，能导致动物锰中毒【3 】，对植物也有毒害性【4 1 。在生产和生活用 水当中锰过量会导致一系列的问题，如水出现色度，在卫生洁具和工业 产品上形成斑点等。在国外，地下水含锰也较普遍，例如，在芬兰b e d r o c k ， 地下水含锰最高达7 6 m g l 5 1 。由于锰矿的开采，我国锰污染较严重。 素有中国“锰三角”之称的湘渝黔三省市交界地区：重庆秀山、湖南花垣、 贵州松桃，由于长期粗放型经营，锰污染十分突出，对当地的生态环境、 水质造成了严重影响。在我国洞庭湖区，地下水蕴藏量十分丰富，经测 定该地区地下水含锰量普遍在o 4 1 0 m g l 之间，超过国家允许标准几 倍乃至几十倍。将溶解态的锰离子转化为化合态的氧化锰沉淀是除锰的 主要方式。目前锰污染主要来源有：开采锰矿造成的锰矿废弃地、锰 矿尾渣等水体及土壤的锰污染；电解二氧化锰、电解金属锰、钢铁冶 炼等行业产生的含锰废水和废渣；高锰含量的地表水与地下水( 我国 2 0 的地下水锰含量过高) 。长期以来，国内外除锰以化学方法占主导地 位，如碱化除锰法、强氧化剂除锰法等。在2 0 世纪8 0 年代初，国外才 逐渐开始重视有关微生物在铁锰中的去除作用。国内在2 0 世纪9 0 年代 初开始关注微生物除铁除锰。比较而言，虽然国内对生物除铁除锰的研 究开展得比国外要晚，但研究更为深入，从微观上对微生物除锰的机理 进行了深入分析，提出了生物固锰除锰机制，并且按照生物除锰理论对 硕i j 学位论文 耐镭微生物的筛选、生理特性研究及裕定 生产滤池进行了实践指导1 6 - 8j 。 用化学、物理方法治理大面积污染不仅耗费大量人力物力财力而且 很难得到理想的效果。与这些方法比较，生物除锰技术有效果好、问题 少、投资省三大优点，倍受水处理工作者的青睐。已有的研究表明1 9 】，环 境中氧化锰的形成与微生物作用紧密相关，微生物作用可使自然环境中 的m n ( 1 1 ) 氧化速率提高l0 5 倍。微生物具有在低浓度下处理重金属效果 好、吸附容量大、易操作、速度快等优势使之逐渐成为重金属污染的研 究热点和发展方向【1 0 川】。因此，研究筛选抗锰除锰微生物对锰污染土壤 及水体的修复具有深远意义。 1 2 除锰方法 锰的危害是由于溶解在水中的m n ”被空气氧化为m n o o h 沉淀物， 在水中产生色度。除锰的原理是使溶解的m n 2 + 氧化成m n 0 2 沉淀从而将 其除掉。对于环境中的锰污染，如水体及土壤中的锰的去除，国内外用 到了多种技术。目前的除锰方法有化学方法及生物方法。 1 2 1 碱化除锰法 最初采用的除锰方法是向含二价锰离子( m n 2 + ) 的水中投加碱性物质 如石灰、n a o h 、n a h c 0 3 等，利用此法将待处理水的p h 值提高，在溶 解氧的作用下二价锰离子( m n 2 + ) 被迅速氧化成m n 0 2 从而沉淀析出，进而 将锰去除。许多学者对此进行了研究 1 2 - 13 】，但其准确的p h 值范围目前 仍未确定。此法有其缺点，就是处理过程中对p h 值要求过高，超过p h 值小于8 的国家饮用水卫生标准规定，处理后的水需要被酸化之后才能 进行日常生产生活用水【14 1 。 1 2 2 空气接触氧化除锰法 李圭白等多年的研究表明【15 1 ，经曝气后的含m n 2 + 地下水进入滤层中 过滤，渐渐附着在滤料表面的锰的氢氧化物形成拥有接触催化作用的锰 质活性滤膜，滤膜在p h 中性域能将m n 2 + 吸附，接着溶解氧再将m n 2 + 氧化，因此形成的新的活性滤膜物质继续参与反应，此过程不断重复， 由此可见锰质活性滤膜除锰过程是一个自催化的过程。与此同时，活性 滤膜的成分被测定，m n 0 2 被认为是接触催化物。但范懋功【1 6 】经红外光 谱测定认为接触催化物应该是m n 3 0 4 。 2 彤 i ：学位论义 耐镭微生物的筛选、生理特性研究及燎定 1 2 3 光化学氧化除锰法 在太阳光照射下，即使在没有含水二氧化锰触媒存在，而只有游离 氯存在的中性含锰水中m n 2 + 也会被氧化而析出，水由无色变成橙红色。 同本学者高井雄等为确定m n 2 + 光化学氧化的有效光，进行了一系列的实 验，实验表明紫外领域的光是光化学氧化反应的有效光，它促进了氯对 锰的氧化【1 7 】。光化学氧化除锰的基本流程是投氯凝聚沉淀过滤，在氯 氧化除铁流程中有凝聚池或沉淀池的情况下，若有太阳光的照射，除锰 效果是良好。 1 2 4 强氧化剂除锰法 当前欧洲与美国普遍采用其他氧化能力较强的氧化剂来除锰 t s - 1 9 】， 通常情况下采用高锰酸钾、二氧化氯、氯等强氧化剂。 1 2 4 1 高锰酸钾氧化除锰法 k m n 0 4 可以将m n 2 + 氧化为m n 0 2 - m h 2 0 ，而其本身也被还原为4 价 固态锰的氧化物。因此可以采用高锰酸钾氧化法，即向含m n 2 + 水中投入 k m n 0 4 ，生成的锰的氧化物经混凝沉淀从而达到去除的目的。反应方程 式如下所示： 3 m n ( h c 0 3 ) 2 + 2 k m n 0 4= 5 m n 0 2 + k 2 c 0 3+ 3 h 2 0 + 5 c 0 2 水中的二价锰离子可以在很短的时间内被高锰酸钾氧化成很细的二 氧化锰沉淀颗粒，这些颗粒需要一定的时间絮凝才能沉淀。为了利于二 氧化锰胶体颗粒的凝集，可以在处理水中加入混凝剂提高水的p h 以加速 絮凝过程。此种方法适合用于基本只含锰不含铁的江河水的处理。 1 2 4 2 氯接触氧化过滤除锰法 在p h 中性条件下，氧化剂氯利用溶解氧接触氧化过滤除锰是不可 能的。在没有任何催化剂的条件下氯对m n 2 + 的氧化速度极缓慢，而以 m n 0 2 m h 2 0 为触媒，以氯为氧化剂的接触过滤工艺却能高效地除锰。将 投加氯的含锰水通入表面披覆二氧化锰滤料的滤层。当m n 0 2 m h 2 0 与 m n 2 + 接触，氯迅速将m n 2 + 氧化为m n 0 2 m h 2 0 ，并与锰砂表面原有的 m n 0 2 m h 2 0 进行化学结合。新生成的m n 0 2 m h 2 0 仍然具有触媒能力， 对后来m n 2 + 的氧化起到触媒作用。水中的m n 2 + 在这种自触媒反应下继续 被氧化，从而不断的与锰砂表面反应并结合。在除锰过程中，滤砂表面 3 硕i j 学位论文 耐锰微生物的筛选、生理特件研究及箍定 会逐渐变成纯黑色，这是由于其表面随着反应的进行不断形成含水二氧 化锰的缘故，与此同时，滤砂表面的除锰能力也不断得到加强。以氯为 再生剂的接触过滤除锰法是一种可行可应用的除锰方法，其具有许多优 点，如具有较强的除锰性能；滤料易得，成本低；装置简单；适用于各 种水质；只需要一种药品一一氯；处理费用低廉；且除锰滤池运行的时 间越长，滤料的性能越好。这些优点是其他传统的除锰方法不可比拟的。 但同时此法也有其缺点，即当原水中n h 4 + 一n 含量较高时，必须投加大 致为n h 4 + - n 含量8 倍的氯量，其结果常常导致过滤后水中余氯含量过 高，为此还需增设脱氯处理设施，程序较复杂且成本相应增高 2 0 - 2 1 】。 1 2 5 生物除锰法 文献报道的生物法除锰技术主要有微生物除锰法和植物除锰法。 1 2 5 1 植物除锰法 植物修复主要适应于对锰工业和钢铁工业所产生的含锰废渣和锰矿 尾矿废弃地污染的土壤进行脱锰固锰。目前国内许多锰污染区基本上未 采取有效的防污措旌，从而对土壤及地下水的污染非常严重。随着经济发 展与环境保护间的矛盾日益加剧，国家环保要求的日益提高，对含锰污 染土壤的治理已刻不容缓。植物修复脱锰固锰是植物利用其吸收运输系 统将锰吸收并积累，然后从根部向地上部分转移。锰的固定就是这样通 过根部的积累、沉淀或根表吸持来实现的。同时植物的这种固定作用可 以保护污染土壤不被侵蚀，还可减少土壤渗漏，防止锰的淋移。当植物 成熟时还可通过收割植物地上部分从而实现根系吸收的土壤中的锰的转 移，最终取得改良土壤、修复土壤的效果，减少锰的迁移扩散。因此， 对锰污染土壤进行植物修复脱锰固锰，可以在锰尾矿及含锰废渣堆场上 覆盖一层一定厚度的土壤，再在上面种植大量如美洲商陆、水蓼、杠板 归、商陆、东紫苏等具有“锰超富集”特性的植物。因适应范围广、花费 低、无二次污染物的优点，植物修复法受到广泛关注。 由于锰污染的土壤一般存在缺乏氮、磷等营养物质，存在不同程度 的酸化等限制因素，这就需要对污染土壤基质进行物化和生物性质检测 后采取相应措施进行土壤改良才能种植植物。在选择植物时也要考虑许 多因素，如其能否适应贫瘠的环境，以及固土、蓄水能力怎样等。所以 植物修复一般采用多种植物搭配的混种办法。基于豆科植物大豆能固氮， 4 硕i j 学位论义耐锰微生物的筛选、生理特性1 i j f 究及雅定 可增加基质氮含量，而美洲商陆是优良的锰超富集植物，向言词等【2 2 】采 用笳栽法栽培美洲商陆和大豆对锰尾渣污染土壤进行了植物修复的研 究，结果表明，相对于单种和对照，美洲商陆与大豆混种能使土壤酶活 性及土壤营养得到很大改善，且土壤锰含量大幅降低。在对土壤修复进 行植物选择时，经常选择的优选草本植物有毛竹、飞蓬、白茅、马唐， 锰超富集植物有商陆、藤本植物地瓜榕。优选树种有马尾松、细叶桉、 大叶桉、桂花、板栗、木荷等【23 1 。 1 2 5 2 微生物除锰法 微生物除锰法一般应用于水体中m n ”的去除。生物法固锰除锰主要 是指利用微生物的氧化作用，将水中呈溶解态的m n 2 + 转化为不溶于水的 黑色m n 0 2 ，然后通过沉淀或过滤去除。目前，生物催化氧化法除锰机理 大致如下【2 4 】： ( 1 ) 起生物氧化除锰的一级氧化作用的是锰氧化菌胞内的酶促反应； ( 2 ) m n 2 + 吸附在带负电的、锰氧化菌细胞膜表面的胞外聚合物上，随之 产生酶促反应：( 3 ) 由于锰氧化菌分泌某些生物聚合物，对其周围的微 环境产生影响，使其显碱性，从而产生了简单的催化反应。第一点和第 二点提出酶促反应除锰作用，可归纳为直接氧化，第三点为间接氧化。 由此可见，微生物氧化锰的机制分为直接与间接氧化。微生物对锰的直 接氧化主要表现为两种效应，一种是可增强自氧化的各种细胞伴生物质 的专属性结合。一些氧化锰的细菌能够合成蛋白质、碳水化合物以及其 它一些能在细胞内或细胞上联结、聚集进而增进锰自氧化的物质。通常 情况下，死亡的细菌和细胞萃取物催化锰的联结和氧化，通过联结锰降 低氧化活化能或增加反应物质浓度，加速反应进程1 25 1 。另一种是酶的催 化氧化。微生物除锰的实质是酶的催化氧化作用。水中的m n 2 + 首先被吸 附到以铁、锰氧化细菌为主的细菌体表面，然后在胞外酶或其他相关专 一性因子的催化作用下，氧化成4 价锰( 黑色沉淀物m n 0 2 ) 附着在滤料 表面，因此锰得以去除。微生物的间接氧化是微生物在其生长过程中， 通过新陈代谢作用改变其环境的e h 或p h ，在锰的氧化过程中起着间接作 用。微生物在新陈代谢过程中可以产生各种无机和有机碱等，改变了介 质的p h 值和e h 值，一些细菌通过消耗或产生0 2 以及还原化合物的排泄 改变着它们自己微环境的e h ，这样会引起锰的e h p h 关系图上某些锰化 5 硕1 j 学位论文 耐镭微生物的筛选、生理特性研究及搭定 合物稳定性的改变。微生物可以释放出新陈代谢产物如h 2 0 2 或其他过氧 化物来氧化m n ( i i ) ，特别是0 2 的增加及c 0 2 的消耗会创造一个氧化环 境，有利于低价锰向高价锰的转变。生丝微菌属、生金菌属、土微球菌 属以及节杆菌属都能引起锰的间接氧化【2 6 1 。 化学氧化作用和生物氧化作用没有严格的分界线，一方面铁锰细菌 对p h 值的适应范围比较宽，p h 为7 5 9 0 之间也存在生物氧化；另一方 面在中性条件下化学作用仍然是存在的，只是氧化速率较慢，不是二价 锰氧化的主要作用。生物氧化与非生物氧化的p h 范围如图1 1 所示。 铁的氧化 生物学氧化 ： 非生物学氧化f e 2 + _ f e 3 + i ； 34，1 0 生物学氧化 j ； 锰的氧化( 真菌，球衣纤发群菌，土壤 m n 2 + m n 0 2 细菌) 非生物学氧化 p h 图1 1 生物与非生物氧化p h 范围 f i g 1 1 p hr a n g eo fn o n - b i o l o g i c a lo x i d a t i o na n db i o l o g i c a lo x i d a t i o n 1 3 微生物与锰的相互关系 1 3 1 微生物与锰的作用机理 微生物糖代谢中许多酶类的活性都需要锰。锰对于羧化作用是必需 的。阿拉伯糖乳酸杆菌对丙酮酸的分解需要锰。黄嘌呤氧化酶中含有锰。 浓度太高时，锰对细菌的生长有抑制( 毒性) 作用。微生物与锰的相互 作用可分为两个主要范畴 2 s 1 ：( 1 ) 锰的氧化和沉积作用；自然界中，存在 很多能氧化锰的微生物，而微生物与锰的相互作用能够促使锰沉积，形 成锰矿床或锰结核。很久以前人们就发现在深海锰结核生长过程中微生 物起着重要作用。c r e r a r 和b a r n e s 2 7 】建立了深海锰结核成因的催化模型， 此模型也适用于湖泊和海洋环境。此模型中每一个阶段都有微生物的催 6 硕i j 学位论文 耐锰微生物的筛选、生理特r + 研究及筘定 化，锰的氧化细菌，如生金菌属，在上部带中加速锰的沉淀。( 2 ) 锰的还 原和溶解作用。b r o m f i e l d 和d a v i d t 2 8 】描述了土壤中的节杆菌属 ( a r t h r o b a c t e r ) 在无氧条件下能将已形成的锰的氧化物还原。氧化和还原 锰的微生物可在特定的生态系统中的同一位置得以分离，c r e r a r 和 b a r n e s ( 19 7 4 ) t ”】建立的模型下部带中，相似的微生物群能催化锰的还原 和溶解。 1 3 2 微生物锰氧化的生物学作用 t e b o 等【2 9 】提出了微生物氧化二价锰的可能生理学功能：活性氧、 紫外线、有毒金属、捕食者或者病毒会对微生物体产生一定的毒害或侵 害作用，而微生物将二价锰氧化为二氧化锰能对其细胞产生一定的保护 作用；微生物氧化m n 2 + 能为其自身进行厌氧呼吸前储存电子受体，同 时储存生长所需能量。e h r l i c h 和s a l e m o 3 0 1 从太平洋的热液口分离得到 了锰氧化细菌s s w 2 2 ，根据对此菌的研究发现，a t p 在其氧化m n 2 + 时产 生。清除微量重金属元素。大量的文献报道，重金属离子可以被微生 物介导生成的生物锰氧化物吸附，通过增强溶解性或氧化性沉淀可改变 一些微量元素、有毒金属的生物可利用性及分布1 3 1 - 3 3 】。m n 3 + m n 2 + 和 m n 4 + m n 2 + 的高氧化还原势能使得三价和四价锰氧化物成为环境中较强 的氧化剂。且锰氧化物能够分解复杂的有机物。s u n d a 和k i e b e r t 3 4 1 发现， 锰氧化物能将复杂的腐殖酸分解为小分子有机物。锰氧化物可以提高生 物对碳的利用率，即通过将有机酸降解为低分子量的化合物【35 1 。但这些 假设缺乏直接的证据。此外，对于锰氧化酶的特异性还需深入研究，以 阐明微生物氧化m n ( i i ) 的机制 1 4 固锰除锰微生物现状 1 4 1 氧化锰微生物 作用于锰的微生物种类很多，不同种类的微生物，如柄菌、鞘菌、 真菌、藻类以及它们的混合物都能够影响锰从一种价态向另一种价态转 变，并具有催化锰氧化或还原的能力。锰氧化微生物广泛存在于土壤、 淡水、污泥沉积物、海洋等环境。很早以前，d o u k a 3 6 】就从希腊淋溶土 中分离并鉴定了2 种锰氧化细菌( d o u k a ，19 7 7 ) ：假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p n o v ) 和弗氏柠檬酸杆菌( c i t r o b a c t e r f r e u n d i i ) ，这些细菌及其提取液均可 硕i ：学位论文 耐锰微生物的筛选、生理特性研究及签定 氧化m n ( i i ) 。土壤的微生物群中，能够氧化锰的微生物约占总数的5 l5 。当p h 在5 5 8 9 范围内，这些微生物均能使锰氧化。分子 生物学研究表明 2 9 1 ，海相铁锰结核中存在着多种类型的锰氧化细菌，主 要分布在变形菌门( 尸，d f p d 6 口c f e 厂f 口) 、放线菌门( 爿c f j 舢6 口c f p 厂f 口) 和厚壁菌门 ( f i r m i c u t e s ) 。目前研究的锰氧化菌主要包括3 种模式菌株：l e p t o t h r i x d i s c o p h o r as s 1 【3 7 1 和s p 6 【3 8 】，产生的锰氧化物沉积在胞外菌鞘，它们生 长于淡水环境中；p s e u d o m o n a sp u t i d am n bl 和g b l 3 9 - 4 0 】