（发酵工程专业论文）新月弯孢霉抗性菌株选育及p450酶特性分析.pdf

摘要 本实验研究了新月弯孢霉细胞色素p 4 5 0 酶与甾体1 1b 一羟基化的关系， 选育具有酮康唑抗性标记的氢化可的松高产菌株k a 一9 1 ，并对其发酵条件工 艺优化。主要研究内容和结果如下： l 、通过c o 差光谱法检测到新月弯孢霉细胞中存在p 4 5 0 酶。苯巴比妥 钠和过氧化物酶增殖剂邻苯二甲酸异辛酯以及r s a 均对p 4 5 0 酶具有诱导作 用。酮康唑对p 4 5 0 酶具有抑制作用。p 4 5 0 酶含量与氢化可的松的生成具有 正相关性。 2 、确立了新月弯孢霉原生质体的适宜形成与再生条件：将培养2 2 h 的菌 丝用0 3 m o l l 的二硫苏糖醇处理2 0 r a i n ，o 6 m o u l 的k c i 作为渗稳剂，3 0 条件下经o 5 新生酶2 3 4 和1 纤维素酶混合液( p h 5 6 ) 酶解3 h ，原生质体 释放量达到7 7 6 1 0 6 个m l ，再生率为2 3 0 7 。再生菌株菌落形态不变，保 留了甾体1 lb 一羟基化能力。 3 、采用n t g 和紫外线复合诱变，结合酮康唑抗性筛选法，选育出氢化 可的松高产菌株k a 一9 1 ，氢化可的松转化率达到6 3 0 5 。将菌株k a 9 1 连续 5 次转接斜面，发现菌株遗传性能稳定。 4 、确立了k a - 9 1 生产氢化可的松的适宜摇瓶分批发酵条件：发酵培养基 为葡萄糖2 2 9 m ，牛肉膏5 9 i n ，酵母膏4 9 l ：初始和转化p h 6 5 ；装液量 3 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶：摇瓶转速0 6 h ：1 6 0r m i n ；6 6 8 h ：2 0 0r m i n ；发酵温 度2 8 。c ；发酵周期7 2 h 。采用改进工艺和最适投料方法，r s a 投料浓度为1 0 9 l 时，氢化可的松转化率达到7 4 8 8 。 以适宜摇瓶分批发酵条件为基础，。对氢化可的松高产菌k a 。9 1 进行了7 l 罐分批发酵试验，发酵周期6 8 h ，氢化可的松转化率达到7 7 9 2 。 关键词：新月弯孢霉，氢化可的松，菌种选育，发酵条件，细胞色素p 4 5 0 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec y t o c h r o m ep 4 5 0e n z y m ea n dt h e 11 0 一h y d r o x y l a t i o n o fs t e r o i d so fc u r v u l a r i al u n a t a ，t h e s c r e e n i n g o fh i g h p r o d u c t i o ns t r a i n ，o p t i m u mf e r m e n t a t i o np r o c e s sa n dc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h e m a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： t h ec y t o c h r o m ep 4 5 0w a sd e t e r m i n a t e di nt h e p r o t o p l a s t s o fc u r v u l a r i a l u n a t ab ym e a n so fc o d i f f e r e n c es p e c t r u mm e t h o ds p b 、m e h pa n dr s a c o u l di n d u c et h e e x p r e s s i o n o fc y t o c h r o m ep 4 5 0 c y t o c h r o m ep 4 5 0w a s i n h i b i t e db yk e t o c o n a z l e t h eh y d r o c o r t i s o n ef o r m a t i o nr a t ew a s b e l o n g i n gt ot h e c 3 t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n t t h e o p t i m a l c o n d i t i o n sf o r p r o t o p l a s t s f o r m a t i o na n d r e g e n e r a t i o n o f c u r v u l a r i al u n a t aw e r eo b s e r v e d ：m y c e l i ao fc u r v u l a r i al u n a t ac u l t u r e df o r2 2 h w e r eh a r v e s t e da n d s u s p e n d e d i no 3 m o l ld t tf o r2 0 m i n t h e p r o t o p l a s t sy i e l d a c h i e v e d7 7 6 1 0 0 m lu n d e r3 0 w i t h0 5 n o v o z y m2 3 4a n d1 c e l l u l a s e ( p h 5 6 ) u s i n g0 6 m o l lk c l 嬲o s m o t i cs t a b i l i z e r i n3 h a b o u t2 3 0 7 o f p r o t o p l a s t sw e r ec a p a b l eo f r e g e n e r a t i o n ，m e a n w h i l et h em o r p h o l o g ya n d t h e1 1d h y d r o x y l a t i o na b i l i t yo fs t e r o i d sb yc o l o n i e sr e g e n e r a t e dw e r et h es a m ew i t ht h e p a r e n ts t r a i n t h ep r o t o p l a s t sf r o mc u r v u l a r i al u n a t ac l 一11 4w e r e 仃e a t e dw i mn t ga n d u l t r a v i o l e t r a y t o i m p r o v e t h e e f f i c i e n c y o f11 b - h y d r o x y l a t i o n m u t a n t k a 一9 1 w h i c hc a r r i e da b o u tt h em a r k e r so fk e t o c o n a z l er e s i s t a n c ew a so b t a i n e d t h eh y d r o c o r t i s o n ec o n v e r s i o nr a t ea n dy i e l dr a t i ow e r e6 3 0 5 t h eg e n e t i c m a r k e r sh a db e e n v e r ys t a b l ea f t e rs u b c u l t u r e d5t i m e s t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fk a - 9 1i ns h a k ef l a s kw a se s t a b l i s h e d ： f e r m e n t a t i o n m e d i u m ( g l ) ：g l u c o s e 2 2 ，b e e fe x t r a c t 5 ，y e a s t4 ：g r o w t ha n d h y d r o x y l a t i o np h6 5 ：3 0 m lm e d i u mi n2 5 0 m lf l a s k ；s h a k e rs p e e d0 6 h ：1 6 0 r m i na n d6 6 8 h ：2 0 0r m i n ；f e r m e n t a t i o n p e r i o d 7 2 h t h eh y d r o c o r t i s o n e c o n v e r s i o nr a t ew a s7 4 8 8 b a s e do nt h ei m p r o v e df e r m e n t a t i o np r o c e s sa n dt h e o p t i m a lr s aa d d i n gm e t h o dw h i l et h er s a a d d i t i o nc o n t e n t1 o g r e b a s e do nt h e o p t i m a l f e d b a t c hf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni ns h a k ef l a s k ，t h e f e d - b a t c hf e r m e n t a t i o ni n7 lf e r m e n t o rw a sa l s oo b s e r v e d n e h y d r o c o r t i s o n e i i c o n v e r s i o nr a t ew a s7 7 9 2 w i t h i n6 8 h k e yw o r d s ： c u r v u l a r i a l u n a t a ，h y d r o c o r t i s o n e ，br e e d i n g f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，c y t o c h r o m ep 4 5 0 l i t 天津科技大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 甾体化合物概述 1 1 1 甾体化合物的结构、分类与临床应用 甾体化合物( s t e r o i d s ) 又称类固醇，是一类以环戊烷多氢菲 ( c y l o p e n t a n o p e r h y d r o p h e n a n t h r e n e ) 为母核的化合物。环戊烷多氢菲( 如图 1 - 1 所示) 由三个六元环和一个五元环组成，分别称为a 、b 、c 、d 环。甾 体化合物在母核的第1 0 和1 3 位有角甲基，第3 、1 l 、1 7 位可能有羟基或酮 基，a 环或b 环存在部分双键，第1 7 位上有长短不同的侧链。由于甾体母核 上取代基、双键位置或立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能 的化合物o j 。 图1 一】甾体化合物的基本结构 f i g 1 - 1 b a s i cs t r u c t u r eo fs t e r o i d s 1 1 2 甾体化合物的存在形式 甾体化合物广泛存在于动、植物组织或某些微生物的细胞中，比较常见 的甾体化合物有：动物组织中的胆固醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 、胆酸( c h o l i ca c i d ) 、脱氧 胆酸( d e o x y c h o l i ca c i d ) 、皮质醇( c o r t i s 0 1 ) ；秘皮质酮( c o r t i c o s t e r o a e ) 等肾上腺皮 质激素， ；丸n ( t e s t o s t e r o n e ) 、雄酮( a n d r o s t e r o n e ) 、孕酮( p r o g e s t e r o n e ) 和l 雌二 醇( o e s t e r 0 1 ) 等性激素；植物组织中的薯芋皂素( d i o s g e n i n ) 、豆甾醇 ( s t i g m a s t e r 0 1 ) 、和谷甾醇( s i t o s t e r 0 1 ) 等；酵母细胞中的麦角固醇( e r 9 0 s t e r 0 1 ) 等。 1 1 3 甾体化合物的作用 箝体激素药物对机体起着非常重要的调节作用，被誉为“生命的钥匙，f 3 】o 睁 ， n k 。叫 q j，*ll 咔 压h ， 第一章前言 与甾体化合物有关的激素类药物主要为： 1 肾上腺皮质激素( a d r e n o c o r t i c o s t e r o i d s ) ：简称皮质激素，包括盐皮质激 素( m i n e r a l o c o r t i c o i d s ) 并l l 糖皮质激素( g l u c o c o r t i c o i d s ) 两类。盐皮质激素在体内 主要影响水盐代谢，主要药物为醛固酮( a l d o s t e r o n e ) ，临床上主要应用于治疗 阿狄森氏内分泌疾病。糖皮质激素，主要影响糖、蛋白质、脂肪和水盐代谢， 主要药物有可的松( c o r t i s o n e ) 、泼尼松( p r e d n i s o n e ) 、地塞米松( d e x a m e t h a s o n e ) 、 倍他米松( b e t a m e t h a s o n e ) 等，其主要功效为抗炎、抗过敏、免疫抑制，对风湿 性、类风湿性关节炎、红斑狼疮等胶原性疾病有明显的治疗作用。 2 性激素( s e xh o r m o n e ) ，包括雌激素、孕激素和雄激素。雌激素( e s t r o g e n s ) 主要有雌酮( o e s t r o n e ) 、雌三醇( e s t r i 0 1 ) 等，孕激素( p r o g e s t o e n s ) 如孕酮 ( p r o g e s t e r o n e ) ，临床上常用于治疗妇科疾病和骨质疏松等。雄激素( a n d r o g e n s ) 如睾酮( t e s t o s t e r o n e ) ，临床上主要用于两性性机能不全所致的疾病，还可用于 治疗贫血、消耗性疾病以及促迸骨折和伤口的愈合等。 3 避孕药物：如乙炔雌二醇，炔诺酮和长效孕酮等。 4 蛋白同化激素( a n a b o l i cs t e r o i d s ) ：主要有1 7d 一甲基去氢睾丸素( 1 7a m e t h y l d e h y d r o t e s t o s t e r o n e ) 、苯丙酸诺龙( n a n d r o l o n e p h y l p r o p i o n a t e ) 等，主要 用于蛋白质合成不足和分解增加的治疗，如营养不良、严重烧伤、恶性肿瘤、 手术后恢复期过长、慢性消耗性疾病以及长期大剂量使用糖皮质激素引起的 负氮平衡等。 ， 近年来淄体药物的应用领域不断扩大，如用于治疗淋巴臼血病、细菌性 脑炎、人体器官移植以及和内分泌有关的老年性疾病，另外抗肿瘤、利尿、 麻醉、松肌等新药也不断涌现 4 l 。此外，甾体激素亦开拓应用于促进家畜繁殖 生长及植物生长口 。甾体药物的发展方兴末艾，据国外商情统计，其销售额是 仅次于抗菌素的第二大类药物 6 1 。 关于甾体激素的作用原理，人们普遍接受“基因表达学说”。该学说认为 甾体激素分子量d x ( 3 0 0 m r 左右) ，脂溶性大，易于透过细胞膜进入细胞，并与 胞浆受体结合形成复合物，该复合物经变构获得透过核膜的能力，然后与核 内受体相结合，进而启动或抑制d n a 的转录过程，最终诱导或抑制新蛋白的 生成，引起各种生理改变【7 】d 1 2 甾体化合物的生物转化 甾体化合物广泛存在于动、植物体内，但从自然界获取的这些天然结构 天津科技大学硕士学位论文 的化合物，往往活性极低，必须对其进行结构改造，以增强其治疗活性，并 克服毒副作用。常用的方法是利用化学合成与微生物转化相结合的工艺路线， 其中微生物转化在整个生产工艺中占有重要地位。生物转化是指利用微生物 细胞对化合物某一特定部位( 基团) 的作用，使它转变为结构上相类似的另 一种化合物。转化的最终产物不是由营养物质经微生物细胞的一系列代谢过 程后产生的，而是利用微生物细胞的酶系对底物某一特定部位进行化学反应 形成的。微生物能对甾体化合物发生生物转化作用，生物酶所具有的高度专 一性，恰能弥补化学合成法的不足。 1 2 1 甾体化合物微生物转化研究发展史 甾体化合物所具有的特殊生理活性早在1 0 0 多年前已经引起人们的关注， 二十世纪二十年代，某些天然甾醇被发现具有雌激素和雄激素的活性。到了 3 0 年代人们已经成功地从肾上腺、性腺或尿中，提取和分离出多种天然甾体 激素结晶，并确定其化学结构，陆续开始人工合成的工作。1 9 3 7 年r e i c h s t e i n 成功合成了第- n 肾皮质激素一去氧皮质酮( d e s o x y c o r t i c o s t e r o n e ) ，自此许 多甾体化合物如r s 、r s a 等均以他的名字命名，但他并未在c l l 位上引进氧 原子。1 9 4 9 年美国m e r c k 公司在工业规模上研究成功了甾体化合物的化学合 成法【8 。这些工作只是探索性的，未受到应有的重视。直到1 9 4 9 年h e n c h 宣 布可的松对风湿性关节炎和急性风湿热有显著效果，震动了医药界，h e n c h 本人因此荣获诺贝尔奖p j 。甾体激素类药物在临床上获得的成功，促进了淄体 化学的快速发展，科学家们开始加大力量研究探索甾体药物的合成。 最初化学家们将希望寄于化学合成法。甾体化合物结构十分复杂，含有 几个不对称中心，尤其是它的活性高低多取决于取代基，而且往往是特定位 点的取代基，如c l lb 位上的羟基( 一o h ) ，c 1 ，2 位的双键等，这就给化学合 成法带来了极大的困难。美国m e r c k 公司s a r e t t 等人用两年时问从5 7 6 公斤 的脱氧胆酸中经过3 2 步化学反应，合成了9 3 8 毫克的醋酸可的松( c o r t i s o n e a c e t a t e ) ，收率仅为0 1 6 ，制备成的可的松每克价值高达2 0 0 美元，根本谈 不上经济效益，也无法进行工业化生产。 化学合成法应用于甾体化合物最大的局限性在于它的选择性较差，尤其 是在甾体母核的c 1 1b 位引入甾体活性所必须的氧原子极其困难。在可的松 从脱氧胆酸的合成中，仅将氧原子从c 1 2 位转移至c 1 1 位就需1 0 步反应。这 时人们的目光开始转向微生物领域。生物酶催化的酶反应所具有的高度专一 第一帝前苦 性，恰能弥补化学合成法在方面的不足，将生物酶引入甾体化合物的转化成 了一种理想的经济模式。1 9 5 2 年美国u p j o h n 公司p e t e r s o n 和m u r r a y 首先发 现少根根霉嘏h i z o p u sa r r h i z u s ) ，以后又发现黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) 能使黄 体酮一步转化成1 1n 羟基黄体酮，收率达8 5 以上，解决了生产可的松等皮 质激素药物的最大难题。化学合成难以完成的反应，利用微生物轻易而举的 实现了，开创了微生物转化甾体化合物的先河。几乎同时又发现银样链霉菌 ( s t r e t o m y c e sa r g e n t e o l u s ) 能将孕酮氧化成16 一羟基孕酮，该反应对合成抗炎 活性更强的1 6 - 羟基一9n氟氢化泼泥松( 1 6a h y d r o x y 一9u - f l u o r o p r e d n i s o l o n e ) 有重要作用。1 9 5 5 年s k u l l 和k i t a 用新月弯孢霉 ( c u r v u l a r i al u n a t a ) 由脱氧皮质醇经1 lb 一羟基化作用制成了皮质醇。随后人 们又相继发现细菌、放线蔚、酵母、霉菌的某些菌种可以使甾体化合物的一 定部位发生有价值的转化反应，微生物在甾体激素转化中的应用日益扩大。 将化学合成与微生物转化相结合的生产工艺推动了甾体药物的工业化大生 产。从此诞生了- - f 7 新的工业，微生物的应用也拓宽了一个新的领域甾体 微生物转化 1 0 - 1 3 1 。 1 2 2 甾体生物转化反应类型 随着对甾体生物转化的深入研究，人们相继发现细菌、放线菌、酵母菌、 霉菌的某些菌种可以使甾体化合物的一定部位发生有价值的转化反应。至今 已发现微生物几乎对甾体各位点( 包括甾体母核和侧链) 都能进行催化反应 ( 见图1 2 ，图中箭头代表可以发生生物转化的作用位点) 这些反应至今已经发现的主要有氧化、还原、水解、酯化、酰化、异构 化、卤化、a 环开环、边链降解等。这些反应不一定都是单一的转化反应， 有时种微生物还可以对某种甾体化合物同时产生数种不同的转化反应。 4 天津科技大学硕士学位论文 图1 - 2 甾体化合物的生物转化位点 f i g1 - 2r e a c t i o ns i t eo f m i c r o b i o l t r a n s f o r m a t i o ni ns t e r o i d s 比较重要的生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链降解等( 列于表1 - 1 ) 表1 1 工业上重要的甾体生物转化反应 t a b l - 1i m p o r t a n tm i c r o b i o lt r a n s f o r m a t i o no f s t e r o i di ni n d u s t r y 1 9 5 8 年以来，我国利用丰富的植物资源薯蓣皂素生产甾体药物，其中的 生物转化技术不断得到改进和提高，形成了具有我国特色的甾体药物生产路 线，主要有：( 1 ) 1 1 羟化【1 4 】；( 2 ) 1 , 2 脱氢【1 5 】；( 3 ) 1 ，4 脱氢b 6 , 1 7 】；( 4 ) a 4 ，5 脱氢【1 8 】，( 5 ) 用诺卡氏菌6 2 9 和兰色梨头霉a s 3 6 5 协同转化，以5c t 一妊烷30 ， 1 7 ，2 1 一三羟基一2 0 酮一2 1 一醋酸酯转化生产氢化可的松【1 9 】；( 6 ) a 环芳构化 6 】；( 7 ) 定向还原【2 0 】等。 、 、： 垦 j m 冀一。三_m f尚丫fa 一心砂 。 舌、0 厂八一 。上一 0”仃上。工 第一章前言 1 3 微生物的甾体1 11 3 一羟基化反应研究进展 ，j ，f ：、 。微冀塑- _ = ：_ j 。l 曼l 一兰 图l 一3 微生物的甾体1 11 3 羟基化反应 f i g 1 - 3l1 b h y d r o x y l a f i o n r e a c t i o no f s t e r o i d s b ym i c r o o r g a n i s m 1 3 2 氢化可的松的结构、性质及其作用 氢化可的松( h y d r o c o r t i s o n e ，系统名1 10 ，1 7n ，2 1 一三羟基孕甾一4 烯3 ，2 0 二酮) ，结构式如图l - 4 所示，分子式c 2 1 h 3 0 0 5 ，分子量3 6 2 4 7 。白色或几乎 无色的结晶性粉末，无嗅，初无味，随后有持续的苦味，遇光渐变质，可在 无水乙醇中结晶，晶体呈纹状，熔点2 1 2 2 2 2 。在乙醇中溶解度为 1 5 o m g m l ，在水中为o 2 8 m g m l 。比旋光度 o d 2 2 + 1 6 7 。c ( 无7 r 乙醇) ， u v m “= 2 4 2 n m ( e t e m l 4 4 5 ) 。其晶体为斜方晶系，空间基团为p 2 1 2 1 2 l a 2 1 8 6 2 ，b 2 1 4 4 2 ，c 2 7 8 0 ，d = i 4 ，z = 8 。取本品2 m g ，加浓硫酸2 m l 使之溶解，放 置5 分钟，溶液呈黄色，有绿色荧光 2 t , 2 2 t 。 图1 - 4 氢化可的松的化学结构 f i g l - 4s t r u c t u r ef o r m u l a t eo f h y d r o c o r t i s o n e 氢化可的松具有重要的临床应用价值，具有抗过敏、抗炎等作用，主要 墨望登垫查兰堕主堂笪垒薹 应用于肾上腺皮质功能减退症的替代治疗。同时它可以影响糖代谢，用于治 疗葡萄糖、血糖过多症等疾病。还可作为生产许多甾体皮质激素的前体。 1 3 31 1b 羟基化反应的微生物菌种 在自然界中发现许多微生物具有甾体1 10 一羟基化能力，其中霉菌最多 2 3 , 2 4 , 2 5 。表1 2 列出了具有这种能力的部分菌种。 表1 2 具有1 1b 羟基化作用的微生物菌种 一 翌! ! ：! 兰堡! ! ! ! ! ! ! 竖垫! = ! 尘些：! ! 坐竺! ! ! ! ! ：型竺型! 竺! ! ! - _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ 。- _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ 。- 。- _ _ _ _ - - 。- _ _ - 。一一 属名种名 假单孢杆菌f 艮e u d o m o n a s ) 链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 薄膜菌( p e l l i c u l a r i a ) 聚端孢霉( t r i c h o t h e c i u m ) 葡萄孢霉( b o t r y t i s ) 伏革茁( c o r t i c i u m ) 犁头霉阳b m d i a ) 弯孢霉( c u r v u l a r i a ) 犁头霉( 7 7 e g h e m e l l a ) 某种假单孢杆菌( p s e u d o m o n a ss p ) 费式链霉菌( s t r e p t o m y c e s f r a d i a e ) 丝状薄膜菌( p e l l i c u l a r i a f i l a m e n t o s a ) 粉红聚端孢霉( t r i c h o t h e c i u mr o s e u m ) 灰葡萄孢霉( b o t r y t i sc i n e r e a ) 屉木伏革菌( c o r t i c i u ms a s a k i i ) 兰色犁头霉翻b s i d i ac o e r u l e a ) 淡紫犁头霉似b s i d i ao r c h i d i s ) 新月弯孢霉( c u r v u l a r i al u n a t a ) 短刺弯孢霉( c u r v u l a r i ab l a k e s l e e a n a ) 不正弯孢霉心“h u l a r i ai n a e q u a l i s ) 膝曲弯孢霉( c u r v u l a r i ag e n i c u l a t a ) 瘤座弯孢霉( c u r v u l a r i am b e r c u l a t a ) 镰刀弯孢霉( c u r v u l a r i au n c i n a t a ) 布氏小克银汉霉( c u n n i n g h e m e l l ab l a k e s l e e a n a ) 雅致小克银汉霉( c u n n i n g h e m e l l ae l e g a n s ) 划孢小克银汉霉( c u n n i n g h e m e l l ae c h i n u l a a t a s ) 班氏小克银汉霉( c u n n i n g h e m e t l a j a p o n i c a ) 明孢犁头霉，7 1 e g h e m e l l oh y a l o s p o r a ) 兰色犁头霉( 1 j e g h e m e l l ao r c h i d i s ) 丝核菌( r h i z o c t o n 圳佐佐木丝核菌( r h i z o c t o n i a 跟j 目前已应用于工业化生产的菌种有两种( 见表1 3 ) ，一是国外普遍采用的 新月弯孢霉，二是我国采用的兰色犁头霉，两者各有特点。 新月弯孢霉属于半知菌类，丛梗孢目，暗梗孢科，多孢亚科，弯孢霉属。 分生孢子梗深褐色，单枝或分枝，顶端多弯曲，7 0 2 7 0 2 5um 分生孢 子淡褐色，梭形，弯曲，有3 个隔膜，从基部向上数第三个细胞特大，色也 特深。两端细胞颜色浅，1 9 3 0 8 9 um ，孢子在分生孢子梗上多轮状着生， 有性世代属于旋孢腔菌【2 “。菌落在马铃薯。葡萄糖琼脂培养纂上向四周蔓延， 第一章前言 近棉絮状，暗灰绿色，背面蓝黑色。菌丝分隔，多分枝，绿褐色，直径3 3 6 ur n 2 7 】。 兰色犁头霉( a b s i d ac o e r u l e a ) ，单细胞，真菌门，藻状菌纲，毛霉目， 毛霉科，梨头霉属 2 6 , 2 8 。菌体单细胞或丝状，无隔膜，多核，无性繁殖产生 不能活动的孢囊孢子，有性生殖大多属于异宗结合，即接合力不同质系的菌 丝“+ o 相接触形成接合孢子 2 “。有匍匐枝和假根，不与假根对生，孢子 囊顶生，多呈洋梨形，孢子囊基部有明显的囊托，接合孢子着生在匍匐枝上。 孢子囊洋梨形，有明显的中轴基，孢囊轴梗大都2 5 成簇，常呈轮生或不规 则絮状，灰白色至淡兰色，分枝繁多，生长旺盛 2 6 , 2 8 , 2 9 】。 新月弯孢霉的羟化酶专一性较强，转化率高，副产物少，菌种易于改造， 但投料浓度没有兰色犁头霉高。兰色犁头霉生长繁殖速度快，生产周期短， 投料浓度高，但酶的专一性较差，副产物多，菌种不易于改造。在发酵条件 控制良好的情况下，一般生成5 7 个副产物，给氢化可的松的分离精制带来 很大困难，收率仅为4 5 4 8 ，严重影响氢化可的松的转化率和收率。如 何协调好生产能力与酶反应的专一性两者之问的关系，解决它们各自存在的 不足，一直是本课题研究的焦点。 表1 31 lb - 羟化反应的工业化生产菌株 t a bl - 3m i c r o b i a ls t r a i nw i t ht h e a b i l i t yo f l1 1 3 ：b y d r o x y l a t i o ni ni n d u s t r y r s ：1 7 a 一羟基一孕甾一4 一烯一3 ，2 0 一二酮；r s a ：1 7a 羟基孕甾4 烯3 ，2 0 一二酮2 1 醋 酸酯。 1 3 41 1b 一羟基化反应的底物与产物多样性 1 3 4 1 转化底物的多样性 天津科技大学硕士学位论文 利用微生物的1 1 口羟基化作用能够生成氢化可的松的底物很多。目前已 知，r s ( 1 7a 一羟基孕甾一4 一烯3 ，2 0 二酮) 、r s a ( 1 7q 一羟基一孕甾一4 一烯- 3 ，2 0 一二酮 2 1 醋酸酯) 、c 1 7q 位上带有侧链的衍生物如1 7q 一2 1 一( i - 乙氧基乙亚墓二羟 基) 一4 一孕烯一3 ，2 0 二酮、1 7a 一2 1 一( 1 乙基氧乙烯) 一二氧一4 孕甾一3 ，2 0 一二酮、 2 1 醋酸基一1 7 一羟基一孕甾4 烯3 ，2 0 一二酮、r s 1 7 醋酸酯、r s 3 ，1 7o ，2 1 一三醋 酸酯等都是适宜的底物【3 0 。3 4 1 ，其中应用最普遍的是r s 和r s a 。 甾体1 lb 羟基化作用与底物结构关系密切，但目前尚未确定有何规律。 由于新月弯孢霉1 1 且羟化酶是双功能酶，即催化同一底物可以同时形成1 1b o h 和1 4q o h 两种产物，因此通过菌种改造难以消除副产物1 4c t o h 。为 提高目的产物的转化率和收率，通过在底物的特定位点引入取代基，以造成 空间立体障碍抑制异构体的形成是一条有效的途径。d e f l i n e s 3 s , 3 6 发现在甾体 分子的c 1 4 附近的d 面引入较大的取代基，如1 7d 醋酸酯或1 6n 甲基，可 造成c 1 4a 位立体障碍，抑制1 4a o h 生成，提高1 1b o h 的收率。荷兰 g i s t 公司借鉴这一发现，在r s 的c 1 7 位引入一个醋酸酯基团，利用该基团 造成的空间立体障碍抑制1 4d o h 的形成，最终以8 6 8 8 的收率得到氢 化可的松及氢化可的松1 7a 醋酸酯的混合物，后者可以很容易水解生成氢化 可的松【3 ”。底物c 1 7a 位也可以引入乙醚基、乙酰基、烯烃基、烃基等，但 最好是酯基，因为酯基可以非常便利地脱去f 3 8 1 。 c 1 7a 位取代基的研究和开发吸引了众多的研究者。如日本专利报道，将 新月弯孢霉m c l l 6 9 0 的转化底物由r s 更换为r s 一1 7 a 一醋酸酯，可使新月弯 孢霉的收率由8 6 提高到9 0 吲。不同位点或同位点取代基的不同，不影 响氢化可的松的收率，但影响羟化速率。r s 的羟化速率最快，r s t 7a 醋酸 酯反应出现延迟，r s 1 7 2 1 二醋酸酯的羟基化过程则更为缓慢f 3 9 , 4 0 。 1 3 4 2 转化产物的多样性 1 1b 羟化酶是一种多酶体系，不仅对底物表现多样性，对同一底物也常 发生异常氧化生成异构体或其他杂质，而且生成的主产物氢化可的松也可能 被继续氧化成可的松【4 j l 。有时母核或侧链部位还可同时被还原，如c 1 ，2 位脱 氢形成双键 42 1 ，或c 2 1 位的羟基发生差向异构化而产生副产物 3 0 1 。 以r s a 为底物利用兰色犁头霉的1 1b 一羟基化作用生产氢化可的松时， 产生3 0 左右的副产物，经h p l c 分析：赶约有8 ，v l o 个组份，副产物的比例 较为分散，其中1 1a o h 、1 4n o h 和7a o h 化合物较多，副产物的数量以 9 第一章前言 及各个组分的比率随发酵条件的变化而变化f 4 孙。淡紫犁头霉对r s a 的1 1p 一 羟基化反应产物，除了氢化可的松、表氢化可的松和r s a 外还有强的松、雄 烯二酮、睾丸龙醋酸酮、r s 及r s a 的c l ，2 位脱氢衍生物等。产物的数量与 比率依赖于生长及转化条件4 4 1 。新月弯孢霉对r s 的1 1b - 羟基化作用生成的 副产物相对较少，主要为1 4q o h 和7a o h 化合物 4 “，易于被分离提纯， 但随若底物浓度的逐步提高，当达到0 1 以上时，副产物的数量也开始逐渐 增加 4 6 1 。如何提高羟化酶专一性，减少副产物的生成一直是人们关注的焦点。 1 3 51 1b 一羟基化反应的转化工艺及技术 微生物对甾体的转化过程通常可分为两个阶段。第一阶段是菌体的培养， 丰富的营养、适宜的温度、p h 、溶氧等条件有利于菌体繁殖和生长。第二阶 段是加入甾体底物进行转化，适宜的反应条件有利于酶反应的进行。酶的产 生贯穿于两个阶段。基于菌体的生长和酶活性方面的考虑，人们提出了如下 的转化工艺和技术： 1 。3 5 1 一步转化法 培养菌体到适当时间，添加底物，边继续培养，边进行底物转化。 目前氢化可的松等绝大多数甾体药物的生产均采用这种方式。 1 3 5 2 静息细胞转化法 菌体充分生长后，用离心或过滤等方法分离菌体，将收集到的菌体悬浮 于水或适当缓冲液中，投入底物进行转化。其核心在于易于控制反应体系中 底物与菌体量的比例，缩短反应时间，减少羟基化反应的杂质。s u k h o d o l s k a y a 等【47 】利用新月弯孢霉v k v lf - 6 4 4 进行1 l1 3 ，羟基化反应时，将o 5 9 干菌体与 o 1 9 底物r s ( o 1 呦投入到p h 6 ，0 的0 0 5 m o f l 磷酸盐缓冲液中，氢化可的松 的收率达7 2 4 ；在r s 浓度提高到1 的情况下，加入1 ：】菌体，仍能以5 5 6 0 的收率获得氢化可的松。收获的静态菌体在低温下可保持活性，能多次 反复使用，省却了多次培养菌体的工序。 天津科技大学应用微生物研究室【4 8 】采用细胞稀释转化工艺，当兰色梨头 霉菌体培养成熟后，将发酵液( 包括菌体) 以不同比例( 最适稀释比为1 ：1 ) 稀释，既保留一定量的培养基，又可使菌体与底物达到一个合适的比例，氢 化可的松的转化率由6 8 。9 提高7 5 5 。经测定分析，细胞稀释转化过程中底 物r s a 脱酯速度明显变缓，但总转化时间缩短大约4 h ：羟化酶反应的过程曲 线呈“s ”形，与步转化工艺的“抛物线”形差异较大。 天津科技大学硕士学位论文 1 3 5 3 协同转化法 采用两种不同的微生物进行连续或混合培养，对甾体化合物进行多步反 应，称为协同转化或混合转化。典型的例子是新月弯孢霉和分枝杆菌或简单 节杆菌协同转化r s a 合成氢化泼尼松。首先利用新月弯孢霉的1 1 口- 羟基化 作用转化可的松龙生成皮质醇；再以此为底物，利用分枝杆菌或简单节杆菌 的c 1 ，2 脱氢作用生成氢化泼尼松1 4 9 5 饥。它可减少中间产物的分离提取工序， 简化工艺，缩短周期，提高效率，有时还可以抑制副产物的生成 5 1 - 5 3 1 。混合 转化的发酵方式有几种：将两种微生物分别培养后按顺序转化 5 0 , 5 3 ，将两种 微生物分别培养后混合转化 4 4 , 5 4 1 ，或将两种微生物混合培养与转化 5 5 , 5 6 】。 1 3 。5 。4 固定化细胞转化技术 将微生物活细胞固定化后可连续多次使用，利于含酶细胞与产物的分离 以及细胞的重复使用，避免细胞的频繁制备，减少了杂菌污染的机会。并可 多步反应连续顺序化，显示出其高效、低耗、安全的优越性。在淄体生产中 以脱氢及羟化反应报道较多【6 。随着固定化技术的日益成熟和发展，其在甾体 中的应用越来越广泛。甾体的c 1 ，2 位脱氢、1 l0 羟基化、1 6a 一羟基化、1 5 a 一羟基化等反应均有采用固定化技术进行转化的研究报道5 7 皤3 1 。 由于1 11 3 羟化酶稳定性较差，并且反应过程涉及氢的传递并需要n a d p h 辅酶系统，而辅酶的再生难以保证，制约了固定化酶在1 10 羟基化生产中的 应用。 1 3 5 5 无细胞体系转化法 s u z u k i 等 6 4 , 6 5 1 将新月弯孢霉1 l1 3 羟化酶的主要组分细胞色素p 4 5 0 酶 ( p 4 5 0 1 u n ) 提取出来，加入来自于酵母或猪睾丸微粒体p 4 5 0 还原酶、n a d p h 和二月桂基卵磷脂d l p c ，与3 0 m m o l i 磷酸钠缓冲液( p h 7 4 ) 、1 5 甘油、 0 6 m m o i l g s h 、1 0 u m o l 几f a d 、1 0 u m o i lf m n 、5 0 u m o l ld l p c 和5 0 0 u r n o l l 组成无细胞转化体系可以转化可的松龙生成氢化可的松。 1 3 5 6 原生质体转化技术 催化生物转化的酶大多为胞内酶，细胞壁通透性成为影响传质的主要障 碍【6 6 1 ，采用原生质体转化技术将有助于克服这一困难。d t u g o n s k i 等f 6 7 采用溶 菌酶处理获得的原生质体转化1 1 脱氧皮质醇，5 m g 该底物经4 h 转化可获 得1 1 m gt lo 和0 ，4 m 9 1 1b 。并且证明2 脱氧葡萄糖和多氧菌素是细胞壁合 成的抑制物。 第一章前言 1 3 5 71 11 3 羟化酶的预诱导 c h e nkc 等6 踟在氢化可的松的合成中用o 0 4 的底物r s 进行诱导，可 使转化率由4 8 4 6 提高到6 0 左右，猜测1 11 3 羟化酶是一种诱导酶。蒋昱等 6 9 】研究发现采用不同浓度的底物r s 进行诱导，对转化结果的影响不同，以 o 0 4 为最适；底物的加入时问为接种后8 h 。s e d l a c z e k 等【7 0 】的研究结果与此 相似，在生长期进行酶的诱导比在转化期效果高。在生长期进行诱导，由于 此时菌体细胞较为幼嫩，对有机溶剂敏感，菌体易受到伤害，对底物的转化 能力有时反而会下降【7 ”。以匕这些研究只是通过氢化可的松转化率的增强间 接推测底物对酶的诱导作用，没有直接从酶学角度加以证明。 1 3 5 8 磁化水处理技术 阳葵等1 7 2 报道了磁场因子、磁化水与生长调节剂的配合使用以及磁化水 处理绿僵菌( m e t a r h i z i u ms p ) 对1 6a ，1 7q 环氧黄体酮1 1d 一羟基化反应的影 响，发现转化能力有明显改善，其转化能力与添加适量极性生长调节剂( 主配 方是硝基酚钠类一元酚的混合物，添加量为0 0 2 ) 时相当。两者配合使用， 有利于缩短发酵周期。 1 3 6 底物的溶解性与投料方式 甾体化合物在水中的溶解度很低，一般的溶解度范围在1 0 5 1 0 。6m o l l ， 属于难溶性或微溶性化合物 7 3 1 。甾体底物的这种难溶性严重影响着甾体转化 反