（生物医学工程专业论文）人fam33a基因启动子的克隆与鉴定.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文 c l o n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no fh u m a n f a m 3 3 ap r o m o t e r a b s t r a c t f a m 3 3 a ( f a m i l yw i t hs e q u e n c es i m i l a r i t y3 3 ) ，a l s ok n o w na ss k a 2 ( s p i n d l ea n dk t a s s o c i a t e d2 ) ，i sa r e c e n t l yi d e n t i f i e dm o l e c u l ei n v o l v e di n c e l lp r o l i f e r a t i o na n dc e l lc y c l er e g u l a t i o n p r r11 ( p r o l i n er i c h 11 ) w a s i n i t i a l l yb e i n gi d e n t i f i e df r o mh u m a nf u l l l e n g t he d n ai n2 0 0 4 ，w h i c hi sa p r o l i n e r i c he n c o d e dg e n el o c a t e di nc h r o m o s o m e17 t of u r t h e ri n v e s t i g a t e i t st r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r ym e c h a n i s m ，p r r l1a n df a m 3 3 a p r o m o t e r h a sb e e nc l o n e da n di d e n t i f i e di nt h ep r e s e n ts t u d yf o rt h ef i r s tt i m e a tf i r s t ，t h e t r a n s c r i p t i o n a ls t a r ts i t e sf o rf a m 3 3 ag e n eh a v eb e e n i d e n t i f i e d b y5 r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ) a n d b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s f u r t h e r m o r e ，s e v e r a l o v e r l a p p i n gg e n o m i c f r a g m e n t sf r o mt h e5 一f l a n k i n gr e g i o no fp r r l1a n df a m 3 3 ag e n eh a v e b e e nc l o n e di n t op g l 3 一b a s i cv e c t o rt oc o n s t r u c tp r r l1a n df a m 3 3 a p r o m o t e rr e p o r t e r s l u c i f e r a s er e p o r t e ra s s a yi n d i c a t e dt h a tf a m 3 3 a p r o m o t e rr e g i o ni sm a i n l yl o c a t e di na5 9 0b pr e g i o nu p s t r e a mo ft h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r ts i t e t h e o v e r l a p p i n gr e g i o ns h a r e db yp r r 1 1a n d f a m 33 ah a sp r o m o t e ra c t i v i t yt os o m ed e g r e e ，t h u st h i s o v e r l a p p i n g r e g i o nm a y s e r v ea sc o - m o d u l a t o rb o t ho fp r r 11a n df a m 33 a p r o m o t e r t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rb i n d i n ga n a l y s i si n d i c a t e dt h a t ，f a m 3 3 ap r o m o t e r c o n t a i n sg cb o x ，a sw e l la so t h e rp u t a t i v et r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rb i n d i n g s i t e ss u c ha s s pl ，e 2 f , a n dg a t a 一1 t h e s e r e s u l t s s u g g e s t e dt h a t 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r ss u c ha ss pl ，e 2 f , a n dg a t a 一1m i g h tb ei n v o l v e di n t h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no ff a m 33 ag e n e k e yw o r d s ：f a m 33 a ，p r o m o t e r , t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ，c e l lc y c l e 。t h i sw o r kw a ss u p p o r t e ds u p p o s e db yg r a n t sf r o mt h en a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o no f c h i n a ( n o 3 0 8 0 1 3 5 6 ，3 0 8 7 1 2 3 7 ，3 0 8 7 2 7 5 8 ) ，t h en a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o np r o j e c to fc qc s t c ( n o 2 0 0 7 b b 5 3 0 2 ) 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英汉缩略语名词对照 英文缩写英文全称 a p b p b s a e d n a c 0 ， d m e m d m s o d n a e b f b s f c m g s p n u p p b s p c r r a c e r n a u t r a d a p t o rp r i m e r b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd e o x y n u c l e i ca c i d c a r b o nd i o x i d e d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e s m e d i u m d i m e t h y ls u l f o x i d e 中文全称 接头引物 碱基对 牛血清白蛋白 互补脱氧核糖核酸 二氧化碳 d u l b e c c o 改良的e a g l e 培养基 二甲基亚砜 d e o x y n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴乙锭 f e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 f l o wc y t o m e t e r流式细胞术 g e n es p e c i f i cp r i m e r n e s t e du n i v e r s a lp r i m e r p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n a e n d r i b o n u e l e i ca c i d u n t r a n s l a t e dr e g i o n 基因特异性引物 巢式通用引物 磷酸缓冲盐 聚合酶链反应 e d n a 末端快速扩增 核糖核酸 非翻译区 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本入申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中，不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名：益! 旦尘日期：塞! ! 里垒生旦鲨显 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期问论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，- - g i ；之采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 旁制 矽穹匆c f得矽诊 重庆医科大学硕士研究生学位论文 人f a m 3 3 a 启动子的克隆与鉴定 前言 f a m 3 3 a ( f a m i l yw i t hs e q u e n c es i m i l a r i t y3 3a ) ，也称s k a 2 ( s p i n d l ea n dk t a s s o c i a t e d2 ) ，是一个最近鉴定的参与细胞增殖和细胞周期的新分子【l ，2 】。f a m 3 3 a 基因定位于1 7 q 2 2 ，编码蛋白产物由1 2 1 个氨基酸组成，分子量约1 4k d 。关于 f a m 3 3 a 的功能，目前国内外仅有两篇研究报道【l 捌。一项研究结果表明，在细胞 有丝分裂期间，f a m 3 3 a 对于分裂后期的适时发生是必需的，在赤道板维持以及 纺锤体检测点沉默过程中起着至关重要的作用【l 】。另外，最近的一篇研究结果则表 明，f a m 3 3 a 在细胞增殖和糖皮质激素信号转导过程中也起着重要的作用【2 】。 p r r ll ( p r o l i n er i c h11 ) ，是在定位于1 7 号染色体长臂2 区2 亚带的一个富含 脯氨酸的新基因，基因组全长4 6 0 5 5 b p 。编码蛋白产物由3 6 0 个氨基酸组成，分子 量约4 0 k d a 。从2 0 0 4 年第一次从人全长e d n a 中全部测序鉴定以来，还没有相关 文献报道，基因的转录表达调控机制也不明确【】。有趣的是，p r r i1 与f a m 3 3 a 在基因组都是相互邻近的一对基因，在鉴定p r r ll 启动子同时，研究是否存在一 段共同序列能够双向调节这对基因的转录表达对深入理解其作用机制有着重要的 理论意义，本研究利用分子克隆技术对p r r ll 启动子区域进行了克隆鉴定并初步 分析。 另外，多种细胞增殖抑制剂均能调节f a m 3 3 a 基因的表达，而f a m 3 3 a 基因 的表达调控在细胞周期过程中也起着重要的作用，因此研究f a m 3 3 a 基因的表达 调控对于深入理解其分子功能及作用机制均有重要的理论意义【1 ，2 1 。然而，关于 f a m 3 3 a 基因的表达调控目前国内外尚没有任何报道，其启动子区域仍不清楚。 本研究利用5 r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ，c d n a 末端快速扩增) 确 定f a m 3 3 a 的转录起始位点，设计了与p r r l l 启动子2 0 5 6 b p 区域反向互补的 f a m 3 3 a 启动子序列，然后对其启动子区域进行了克隆鉴定并对其功能进行了初 步分析内容。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 材料与方法 第一部分材料和方法 第一节材料 1 1 材料 人非小细胞肺癌细胞系h 1 2 9 9 、人宫颈癌细胞系h e l a 为本实验室保存，h 1 2 9 9 采用r p m l l 6 4 0 培养基培养，h e l a 采用d m e m 培养基培养，两种培养基均添加1 0 f b s 和青霉素( 1 0 0i u m 1 ) 链霉素( 1 0 0p g m 1 ) ，培养于c 0 2 培养箱。人血液基 因组d n a 及人正常组织总r n a 购a m b i o n 公司。r p m i16 4 0 培养基、d m e m 培养 基、胎牛血清矛f l l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 试剂购于i n v i t r o g e n 公司；b ds m a r t t m r a c e c d n aa m p l i f i c a t i o nk i t 购自c l o n t e c h 公司；p t a 2 载体和各种限制性内切酶购自 t o y o b o 公司；d n a 连接试剂盒购自t a k a r a 公司：p g l 3 一b a s i cv e c t o r 和 d u a l l u c i f e r a s e r e p o r r t e ra s s a ys y s t e m i ) 选- j 自p r o m e g a 公司；质粒小抽试剂盒购自 o m e g a 公司；p c r 产物纯化回收试剂盒和琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购自 t i a n g e n 公司。 第二节方法 2 2 方法 2 2 1 生物信息学分析 从p u b m e d 、g e n b a n k 数据库提取p r r11 和f a m 3 3 a 的c d n a 和基因组序列， 用在线b l a s t 程序进行序列比对，得出p r r il 和f a m 3 3 a 基因外显子和内含子 的构成。提取f a m 3 3 a 基因起始密码子5 上游约5 0 0 0b p 的序列，用启动子分析 软件，预测启动子区域。用t f s g a r c h 等在线软件对启动子区域进行转录因子结合 位点分析，寻找潜在的转录因子结合位点。采用d n a m a n 软件进行简单的序列 比对和限制性酶切位点等简单的序列分析。 2 2 2 转录起始位点的鉴定 2 2 2 1f a m 3 3 a 的5 - r a c e 扩增及巢式p c r 人肺组织总r n a 购自a m b i o n 公司，h e l a 总r n a 提取采用t r i z o l 法制备， 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 利用紫外分光光度计定量并计算a 2 6 0 a 2 8 0 比值，用琼脂糖凝胶电泳检测其质量以 确保r n a 的完整性。根据己知f a m 3 3 am r n a 序列采用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件 设计了两条用于5 - r a c e 的基因特异性引物( g e n e s p e c i a lp r i m e r ，g s p ) 。引物序列 分别为：5 c c g a g g c g g t t t a g a c a c c a g a c g g t - 3 ，g s p l ( 5 3 6 ) ； 5 a t c c a g t c a t t g a a g c c a a a c c c c c l - 3 ，g s p 2 ( 8 2 4 ) ，g s pl 和g s p 2 的核苷 酸序列均位于f a m 3 3 a 基因的编码区，且分别位于不同的外显子区域。稀释g s p i 和g s p 2 引物到工作浓度1 0 u m ，分别用h e | a 细胞和肺癌组织c d n a 为模板来做 5 - r a c e ，设置反应体系如下( 每管2 5 9 1 ) - l a t a q 0 2 5 9 l m g c l 2 2 51 a l u p m ( 通用引物)1 p l g s p l ( 基因特异性引物) 1 l按扩增程序为：9 4 变性3m i n ，然后 模板( c d n a )2 却l m 用逐i n 步黔。9 4 个* ( 2 循3 环0s ：最, 6 后5 * 于( 23 7 0 2 s , 延伸7 2 * ( 2l 言 d n t p 4 1 a lm i n ，4 保存。 1 0 b u f f e r 2 5 9 l d h 2 0 1 1 2 5 u l 2 5 p l p c r 结束后，各取3 9 l 跑1 5 琼脂糖凝胶电泳，3 5 m i n ，e b 染色5 m i n 。 以g s p 2 在h e l a 和正常肺组织中扩增的p c r 产物0 5 9 l 为模板，以g s p i 为 引物，按照巢式p c r 的操作步骤，反应体系如下： l at a q 0 2 5 t l m g c l 2 2 5 “l 按扩增程序为：9 4 变性3m i n ，然后用逐 n u p1p l 步程序9 4 * ( 23 0s ，6 5 * ( 23 0s ，7 2 c2m i n i n n e rg s p 1p l 完成3 0 个循环；最后于7 2 延伸1 0m i n ，8 立楠n “1 保存。p c r 产物 o 5 “l 。床仟。 d n t p 4 9 l l o b u f f e r 2 5 u l d h 2 01 3 2 5 f a l 共2 5 9 l 1 5 琼脂糖凝胶电泳3 5 m i n ，e b 染色5 m i n ，在凝胶成像仪下观察，发现在h e l a 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c d n a 为模板的巢式p c r 产物呈多条带，其中原来的8 4 2 b p 左右的条带仍然存在。 考虑到原模板中离子浓度影响，将原模板各取1 0 m i 稀释5 0 倍后再重新做巢式p c r 。 同时将模板量加大到2 5 1 a l ，p c r 后电泳发现结果基本与原来一致，证明p c r 反应 的特异性较强，将模板稀释后效果更好，其中g s p l 扩增产物在正常肺组织中呈单 一条带。最后按相同的最佳条件以正常肺组织c d n a 为模板，g s p i 为引物重新扩 增一次，体系为5 0 i t l 共二管。 2 2 1 25 r a c e 扩增产物回收 p c r 结束后，取2 1 a l 样品电泳与以前结果完全一致，按照t i a g e n 公司的p c r 产物回收试剂盒说明，将约9 0 1 l t l 的p c r 产物回收，回收完毕后跑电泳鉴定无误。 ( 图未示) 2 2 1 3 连接、转化 回收完毕后，按以下体系作t a 克隆： 2 l i g a t i o nb u f f e r5 1 a l其中p t a 2v e c t o r 和p c r 产物m o l e 比可设定 p t a 2v e c t 叭5 0 n g p l ， 赫谲。嚣戮，p 单c 位k b r ? 物oz 锝轰 p c r 产物 3 “l 产物浓度，单位n g k t l ) 。比如：0 5 k b 的p c r 产 t 4d n a l i g a s e 1u l 物5 0 n g m l ，根据公式为( 5 0 x 0 5 ) 5 0 = 0 5 m l 共1 0 i - t l ，1 6 。c 反应三个半小时 将反应液l o l a l 全部加入d h 5 al o o p l 中，冰浴3 0 m i n ，热激9 0 s ，迅速转入冰浴 中急冷3 m i n ，然后将反应液加入5 0 0 p 1 的s o c 培养基中，1 8 0 转分，3 7 。c6 0 r a i n 。 取9 0 m m 的a m p ( + ) l b 平板，向中间加入x - g a l4 0 p 1 和i p t g7 1 , t l ，用加样枪轻轻 混匀，在平板上涂布均匀，最后加入i o o m i 的s o c 复苏后的菌液，涂布均匀，待 平板洌干后，倒置放入培养箱中3 7 ，培养1 2 1 6 小时。 2 2 1 4 阳性重组子鉴定 次日发现平板上长出几十颗单克隆菌落，蓝、白斑各占半，挑取生长较好 的白斑三个，同时挑取一个蓝斑作为对照，加入a m p ( + ) 的l b 液体培养基中，2 0 0 转分，3 7 培养过夜。保存菌种后，提取质粒，最后用4 0 p , l 双蒸水洗脱，再取2 1 a l 上样1 a g a r o s eg e le l e t r o p h o r e s i s 。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 2 3p r r i i 启动子报告基因重组质粒的构建 2 2 3 ip r r l l p 2 0 5 6 启动子报告基因重组删除体的构建 2 2 3 1 1 扩增p r r l l p 2 0 5 6 启动子区域 首先使用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件分别设计出一对含k p n ! 和n h e l 限制性酶切 位点引物：p r rilp f 5 6 2 ：5 - g g g g t a c c g g g a g g g a g g g a a t a a a g a g a a c ( 含 k p n l 酶 切 位点) ；p r r i lp r 2 6 1 7 ： 5 - c t a g g c t a g c t c a t c c c g c a c a g t a t t a g g c ( 含n h e l 酶切位点) 。以正常人基 因组为模板，稀释模板浓度分别为1 0 n g p l ，5 0 n g l a l ，1 0 0 u g p l ，以这三种不同浓度 p c r ，观察p r c 引物扩增p r r l l p 2 0 5 6 情况。 1 配置p c r 反应体系预混物： 5 p r i m e s t a rb u f f e r ( m 9 2 + 离子p l u s ) 1 0 p l d n t pm i x t u r e 4 p l p r i m e rl l p l p r i m e r 2 l p l p r i m e s t a rh s 高保真酶 o 5 p l 双蒸水 3 2 5 1 a l 共1 4 7 p l 将预混物按每管4 9 p t l 加入a x y g e np c r 管中，再按l o n g p l ，5 0 n g p l ，1 0 0 n g “l 各l p l 加入a x y g e nf c r 管中，混均离心。按扩增程序为：9 5 。c 变性2m i n ，然后 用逐步程序9 8 。c1 5s ，6 0 * ( 21 5s ，7 2 2 5m i n 完成5 个循环；9 8 c1 0s ，6 8 2 5 m i n 再完成3 0 个循环，最后于7 2 延伸3m i n 。反应完毕后，将三种不同原浓度 上样琼脂糖凝胶电咏，1 3 0 v , 4 0 m i n 。 2 2 3 1 2p c r 产物回收 用t i a n g e n 公司的t i a n q u i c km i d ip u r i f i c a t i o nk i t 普通d n a 产物纯化试剂 盒纯化回收l o o p l 体系的p c rd n a 产物，取1 0 u g l a l ，5 0 n g p l ，1 0 0 u g l a l 三种不同 浓度梯度扩增的p c r 产物共10 0 i t l ，按照说明操作最终得到3 0 ；- t l 回收纯化后的p c r 产物。 2 2 3 1 3 酶切、连接与转化 分别对p g l 3b a s i cv e c t o r 和p c r 回收产物人基因组d n ap r r i lp 2 0 5 6 进行 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 k p n l 和n h e l 双酶切，回收纯化酶切后产物，用t a k a r ad n al i g a t i o nk i t 将酶切后 的p g l 3b a s i cv e c t o r 与p r r llp 2 0 5 6 目的片段连接，构建含p r r i 15 端调控序列 和荧光素酶报告基因的重组质粒，重组质粒经酶切和测序进一步鉴定确认，命名 为p r r llp 2 0 5 6 ( + 5 6 2 b p + 2 6 17 b p ) p g l 3b a s i cv e c t o r 的酶切体系为：p c r 回收产物p r r l l p 2 0 5 6 酶切体系为： 1 0 l o wb u f f e r ( t a k a r a ) 1 0 9 1 0 l o wb u f f e r ( t a k a r a )l0 1 a l p g l 3b a s i cv e c t o r ( 1 u g 9 1 ) 5 p l p r r i1 - p 2 0 5 6 片段 3 3 1 t l k p n i ( 6 u p 1 ) 2 p 1 k p n i ( 6 u 9 1 ) 3 1 - t l n h e i ( 1 6 u l a l ) 1 9 ln h e l ( 1 6 u p 1 ) l h l 灭菌双蒸水 3 2 5 9 l灭菌双蒸水5 3 9 l 共l o o p l 共l0 0 9 i 3 7 水浴中过夜反应，反应结束后将上述反应液按普通d n a 产物纯化各得到 3 0 9 l 的洗脱液，电泳显示条带清晰正确。初步估计p r r l l - p 2 0 5 6 酶切后产物浓度， 与1u g r d 的已酶切好的p g l 3b a s i cv e c t o r 按照3 ：l 的比例混合( 即p r r l1 - p 2 0 5 6 4 51 t l ，p g l 3b a s i cv e c t o r0 51 t 1 ) ，再加入51 t l 等量t a k a r ad n a l i g a t i o nk i t 的l i g a t i o nm i x 均匀混合，在p c r 仪中1 6 。c 反应过夜。 p g l 3 - b a s i cv e c t o r 示意图 5 1 1 1 5 2 1 2 8 3 2 5 3 在超净工作台中，冰上溶化1 0 0 9 ld h 5 a 感受态细胞，待溶化后向d h 5 a 中加 重庆医科大学硕士研究生学位论文 入l o i t l 连接液冰上放置3 0 分钟，4 2 ( 2 水浴中反应9 0 秒后，迅速转移到冰浴中急 冷3 分钟( 该过程注意不要摇动离心管) ；再加入5 0 0 1 1 1s o c 或l b 培养基，放于 摇床3 7 ( 21 5 0 转分钟，l 小时。混匀转化菌，吸取1 0 0 p l 到含有氨苄青霉素抗性 a m p ( + ) l b 固体琼脂糖培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细菌涂开，待平板 上的液体被吸收后倒置平板，3 7 培养1 2 1 6 小时。 2 2 3 1 4 阳性重组子鉴定 观察a m p ( + ) 转化菌生长隋况，用无菌接种环挑取4 个单菌落，从生长较 少的平板上挑取了2 个单菌落，分别加入5 m la m p ( + ) l b 液体培养基中，3 7 摇床，2 0 0 转分，培养1 2 一1 6 小时。提取6 管质粒，电泳初步鉴定，将认为连接成 功的p g l 3 bp r r l l - p 2 0 5 6 的重组质粒共四管送交上海生工测序。结果证明重组质 粒d n a 序列与预测的完全一致，p r r l p 2 0 5 6 启动子报告基因重组质粒构建成功， 标记为p g l 3 b p r r l l p 2 0 5 6 。 2 2 3 2p r r l l - p 15 0 9 启动子报告基因重组删除体的构建 2 2 3 2 1 酶切 大量制各p g l 3 b - p r r l1 p 2 0 5 6 重组质粒，利用p r r l1 - p 2 0 5 6 上合适的酶切位 点，对2 0 5 6 b p 启动子区域内的片段进行选择性的删减，从5 端删除构建 p r r l1 p 1 5 0 9 。酶切体系如下： a 先用k p n i 单酶切：b 将反应后的5 0 p l 中再加入： 10xl o wb u f f e r ( t a k a r a ) 5 a l p g l 3 b p r r ll p 2 0 5 6 ( 约7 5 u g ) 15 p l k p n i ( 10 u i a l )2 p i 灭菌双蒸水 2 8 1 a l 共5 0 p l ( 3 7 反应3 小时) 2 2 3 2 2 产物回收 l 0 h i g hb u f f e r ( t a k a r a ) 10 p i e c o r i ( 6 u l a l )2 p l 灭菌双蒸水 3 8 p l i l l l l l l l l l 共1 0 0 1 a 1 ( 3 7 过夜反应) 酶切反应后，分别梅10 0 “1 分两孔加入0 8 琼脂糖凝胶中，13 0 v 下，电泳4 0 分钟，e b 染色1 0 分钟，在b i o - r a d 凝胶成像仪下观察条带情况并切下约6 2 8 4 b p 目的条带( 图未示) ，尽量切去多余的凝胶，放入e p p e n d o r f 管中保存，按照t i a g e n 公司的凝胶回收试剂盒说明操作，最后获得3 0 1 j i 的洗脱液，电泳证实为单一条带， 重庆医科大学硕士研究生学位论文 样品放入2 0 保存。 2 2 3 2 3d n a b l u n t i n g 5 3 工二 工卫 3 5 - s t i c k ye n d 5 ，l t 4d n a p o l y m e m s e 具有5 到3 d n a 外切酶活性 3 5 3 3 - s t i c k ye l l d 5 连接j 黟3 ， 原理示意图 2 2 3 2 4 转化、质粒提取和鉴定 转化过程与前述一致，次日挑取单克隆菌落到a m p ( + ) l b 培养基中培养1 2 1 6 小时，用o m e g a 公司的h i g h p e r f o r m a n c ep l a s m i dm i n i p r e p a r a t i o nk i t 提取质粒， 并电泳鉴定，上海生工测序确认，标记为p g l 3 p r r l1 - p 1 5 0 9 构建成功。 2 2 3 2p r r l l 。p 8 4 7 启动子报告基因重组删除体的构建 2 2 3 2 1 酶切 大量制备p g l 3 b p r r l1 - p 2 0 5 6 重组质粒，利用p r r l l p 2 0 5 6 上合适的酶切位 点，对2 0 5 6 b p 启动子区域内的片段进行选择性的删减，从5 端删除构建 p r r i1 - p 1 5 0 9 。酶切体系如下： a 先用k p n l 单酶切：b 将反应后的5 0 t l 中再加入： 10 l o wb u f f e r ( t a k a r a ) 5 l p g l 3 b - p r r i1 - p 2 0 5 6 ( 约7 5 u g ) 2 0 p ! i oxh i g hb u f f e r ( t a k a r a ) l o l a l x p n i ( 10 u t 1 )2 p lp s t i ( 6 u i - t 1 )2 l 灭菌双蒸水 2 3 i t 1 一 灭菌双蒸水 3 8 p l 共5 0 p l ( 3 7 。c 反应3 小时) 2 2 3 2 2 产物回收 1 2 共1 0 0 1 , t l ( 3 7 。c 过夜反应) 重庆医科大学硕士研究生学位论文 双酶切反应后，分别将1 0 0 “1 分两孔加入0 8 琼脂糖凝胶中，1 3 0 v 下，电泳 4 0 分钟，e b 染色l o 分钟，在b i o r a d 凝胶成像仪下观察条带情况并切下约5 6 0 0 b p 目的条带，尽量切去多余的凝胶，加入e p p e n d o r f 管中保存，按照t i a g e n 公司的 凝胶回收试剂盒说明操作，最后获得3 0 p l 的洗脱液，电泳证实为单一条带，样品 放入2 0 保存。 ，2 2 3 2 3d n a b l u n t i n g 与转化 按照t a k a r ab l u n t i n gk i t 说明书，反应体系如下： i o x b u f f e r 1 p l d n a l i g a t i o nb u f f e r2 9 l 加入lu l1 4d n a 酶切回收p 8 4 7 产物4 p lp 计o l 时y m 5 e m r a i s n e 名主套笺詈 灭菌双蒸水4 l l l t 4 酶活性，放于冰上口 平端化后的p 8 4 7 片段3 p l l i g a t i o ns o l u t i o na2 0 p l l i g a t i o ns o l u t i o nb 5 p l 共1 0 p l ( 7 0 。c5 m i n ，后移至3 7 。c )共3 0 p l ( 1 6 c 过夜反应) 在超狰工作台中，冰上溶化l o o p ld h 5 a 感受态细胞，待溶化后向d h 5 a 中加 入2 0 p l 连接液冰上放置3 0 分钟，4 2 。c 水浴中反应9 0 秒后，迅速转移到冰浴中急 冷3 分钟( 该过程注意不要摇动离心管) ；再加入5 0 0 9 is o c 或l b 培养基，放于 摇床3 7 1 5 0 转分钟，l 小时。混匀转化菌，吸取1 0 0 p l 到含有氨苄青霉素抗性 a m p ( + ) l b 固体琼脂糖培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细菌涂开，待平板 上的液体被吸收后倒置平板，3 7 培养1 2 1 6 小时。 2 2 3 2 4 阳性重组子鉴定 观察a m p ( + ) 转化菌生长情况，平板上长出了1 0 个中等大小的菌落，用无 菌接种环挑取1 个单茵落，加入5 m la m p ( + ) l b 液体培养基中，3 7 摇床，2 0 0 转分，培养1 2 1 6 小时。用o m e g a 的h i g hp e r f o r m a n c em i n i p r e p a r t i o n 提取质粒， 电泳初步鉴定，将重组质粒共四管送交上海生工测序。结果证明重组质粒d n a 序 列与预测的完全一致，p r r l l - p 8 4 7 启动子报告基因重组质粒构建成功，标记为 p g l 3 b p r rll _ p 8 4 7 。 2 2 3 3p r r l l p 4 8 5 启动子报告基因重组删除体的构建 2 2 3 3 1 酶切 重庆医科大学硕士研究生学位论文 大量制各p g l 3 b p r r il p 2 0 5 6 重组质粒，利用p r r l l ，p 2 0 5 6 上合适的酶切位 点，对2 0 5 6 b 启动子区域内的片段进行选择性的删减，从5 端删除构建 p r r 11 一p 1 5 0 9 。酶切体系如下： a 先用k p n l 单酶切： b 将反应后的5 0 1 a l 中再加入： 1 0 l o wb u f f e r ( t a k a r a ) 5 9 l p g l 3 b - p r r i1 - p 2 0 5 6 3 0 i t l 10x h i g hb u f f e r ( t a k a r a ) lo l a l k p n i ( 10 u 9 1 ) 2 1 t ls p e i ( 6 u p i )2 h l 灭菌双蒸水 13 1 t l 哪l _ 灭菌双蒸水 3 8 p 1 共5 0 9 l ( 3 7 。c 反应3 小时)共1 0 0 “1 ( 3 7 。c 过夜反应) 2 。2 3 3 。2 产物回收 酶切反应后，分别将1 0 0 9 1 分两孔加入0 8 琼脂糖凝胶中，1 3 0 v 下，电泳4 0 分钟，e b 染色l0 分钟，在b i o r a d 凝胶成像仪下观察条带情况并切下约5 2 0 0 b p 目的条带，由于浓度很高看不清是否酶切完全，尽量切去多余的凝胶，放入 e p p e n d o r f 管中保存，按照t i a g e n 公司的凝胶回收试剂盒说明操作，最后获得3 0 9 l 的洗脱液，电泳发现为二条带说明酶切并不完全，样品放入2 0 保存。 2 2 3 3 3d n a b l u n t i n g 与转化 按照t a k a r ab l u n t i n gk i t 说明书，反应体系如下： 1 0 b u f f e r 1 u l平端化后的d n a 片段3 u l d n a l i g a t i o nb u f f e r2 9 l 加入l u l “d n a 酶切回收p 4 8 5 产物 4 “l p 计o l 时y m 篓：翟主妻雯詈l i g a t i 。n s o i u t i 。na 2 0 “l 灭菌双蒸水 4 i t 4 气譬：三l l i g a t i 。ns o l u t i 。nb5 1 a l 共1 0 9 l ( 7 0 。c5 m i n ，后移至3 7 ) 共3 0 9 1 ( 1 6 。c 过夜反应) 在超净工作台中，冰上溶化l o o g ld h 5 a 感受态细胞，待溶化后向d h 5 a 中加 入2 0 9 l 连接液冰上放置3 0 分钟，4 2 水浴中反应9 0 秒后，迅速转移到冰浴中急 冷3 分钟( 该过程注意不要摇动离心管) ；再加入5 0 0 “1s o c 或l b 培养基，放于 摇床3 70 c1 5 0 转分钟，l 小时。混匀转化菌，吸取1 0 0 9 l 到含有氨苄青霉素抗性 a m p ( + ) l b 固体琼脂糖培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细菌涂开，待平板 上的液体被吸收后倒置平板，3 7 培养1 2 1 6 小时。 2 2 3 3 4 阳性重组子鉴定 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 观察a m p ( + ) 转化茵生长情况，平板上长出了单克隆菌落，用无菌接种环 挑取1 个单菌落，加入5 m la m p ( + ) l b 液体培养基中，3 7 摇床，2 0 0 转分， 培养l2 16 小时。用o m e g a 的h i g hp e r f o r m a n c ep l a s m i dm i n i p r e p a r t i o n 提取质 粒，电泳初步鉴定( 图未示) ，将重组质粒共四管送交上海生工测序。结果证明重 组质粒d n a 序列与预测的完全一致，p r r il p 4 8 5 启动子报告基因重组质粒构建 成功，标记为p g l 3 b p r r l l p 4 8 5 。将p r r ll 启动子报告基因重组质粒全部上样 0 8 琼脂糖凝胶，13 0 v ，4 0 r a i n ，凝胶成像仪下观察并照相。 2 2 3 4p r r l l p 1 4 9 6 启动子报告基因重组删除体的构建 2 2 3 4 1p c r 产物酶切 以p g l 3 b p r r ii p 2 0 5 6 重组质粒为模板，以p c r 方法构建( t a k a r ap r i m e s t a r 酶) ，引物序列如下：p r r i1 - p f 5 6 2 ：5 - g g q q 坠g g a c c g g g a g g g a a t a a 一3 印刀 i s i t e t m 6 9 9 8 p r r l l p r 2 0 5 7 ：5 c 刚g g c t a g c g a g t c g a g t c g a t g g a g t c c g g g c t g t g 3 n h eis i t et m7 3 2 4 p c r 反应体系如下： 5xp r i m e s t a rb u f f e r l o p l d n t pm i x t u r e4 u l 10 m mp r i m e rm i x u r elu l p r i m e s t a rh s0 5l l i p l a s m i d1 u l 双蒸水 3 3 5 9 l 共5 0 9 1 分成两管，分别加入