（微生物学专业论文）产有机酸采油菌株的筛选及产酸能力的分析.pdf

中文摘要 ii l ll l l l ll i iii i i i i i i i 麓 中文摘要 本实验通过对从大庆油困原油、含油污水和原油污染土壤中分离如麓株的筛 选，最终选出3 株熊以石油麓难一碳源生长、兼性厌氧，在有氧和无氧环境下均 能产有机酸，具有厌氯硝酸盐还原能力、不产生硫化氢气体等综合能力较理想的 菌株：t 1 0 - 3 、蹦一争l 、2 - 1 。 商效液相色谱对1 4 小时发酵液分析结果表明：菌株t l o - 3 产乙酸( 重。l o g e ) ， 丙酸( o 2 4 9 l ) ，丁酸( 1 5 7 9 l ) ；菌株d h - 2 一l 产乙酸( 2 3 7 9 l ) ，丙酸( o 6 8 9 l ) ， 丁酸( 2 2 1 9 l ) ；菌株2 l 产丙酸( o 5 1 9 l ) 。 + 气相色谱一质谱对7 2 小时发酵液分析结果表甥：菌株t l o - 3 发酵液中乙酸占 11 4 0 7 ，异丁酸占9 3 7 5 ，丁二醇占7 9 2 1 7 ；菌株d h - 2 - 1 发酵液中异丁酸占 4 王。5 6 ，丁二醇占4 6 6 1 9 ，异戊酸占4 。1 3 8 ，异庚酸占王o 。6 8 0 ；菌株2 - 1 发酵 液中舁丁酸占1 5 4 4 2 ，丁二醇占8 4 5 5 8 。 通过形态观察、生化实验和1 6 s r d n a 分析结果鉴定菌株t i o 一3 和d h - 2 - 1 为枯 草芽孢杆菌，菌株2 - 1 为地衣芽孢杆菌。 以菌株d h 一2 - 1 和t l o - 3 势疆标菌株，研究其在不同温度、盐度、蹦条件下的 生长情况，结果表明：3 n a c l 能促进两株菌的生长，在4 - 一4 5 c 条件下均生长 良好，最适生长渊均为8 8 2 。 关键词：微生物采油；菌种筛选；有机酸；菌种鉴定 黑龙江大学硕士学位论文 i i i l i l li l l 葺i i a b s t r a c t t h r e ei d e a lm i c r o b i a ls t r a i n s , n a m e l yt 10 3 ，d h 一2 1a n d2 - 1h a v eb e e ns e l e c t e d f r o mt h es t r a i n sw l - f i c hw e r es e p a r a t e df r o md a q i n gc r u d eo i l ，o i l s p i l l sw a t e ra n d p e t r o l e u mp o l l u t e ds o i l a l lt h a ts e l e c t e ds t r a i n sc o u l dg r o wu n d e rb o t ha e r o b i ca n d a n a e r o b i cc o n d i t i o n su s i n gp e t r o l e u ma st h es o l ec a r b o ns o u r c e a n d 穗e yh a v et h e a b i l i t yt op r o d u c eo r g a n i ca c i di na e r o b i ca n da n a e r o b i ce n v i r o n m e n t s ，t h ef u n c t i o no f n i t r a t er e d u c t a s ea n dw i t h o u th y d r o g e ns u l f i d eg e n e r a t i o n a r e r14h o u r ss e p a r a t e df e r m e n t a t i o no ft h e s et h r e ei d e a ls t r a i n s ，t h e i rf e r m e n t a t i o n s a m p l e sw e r ed e t e c t e d 诚饿h p l c ( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) f o r t 1 0 3 ，i t sa c e t i ca c i d ，p r o p a n o i ca c i d ，a n db u t y r i ca c i dw e r e 重1 0 9 l ，0 2 4 9 l ，a n d 1 5 7 9 lr e s p e c t i v e l y i nd h 一2 - 1 ，t h ea c e t i ca c i d ，p r o p a n o i ca c i da n db u t y r i ca c i dw e r e 2 3 7 9 l ，0 6 8 9 l ，a n d2 2 1 9 lr e s p e c t i v e l y a n dt h ep r o p a n o i ca c i do f 2 - 1w a s0 5 1 9 l f o r7 2 - h o u rf e r m e n t a t i o ns a m p l e s ，t h e i rc o m p o n e n t sw e r ea n a l y z e d 诵t l lt h e g c - m s ( g 勰c h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r y ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a t , f o rt 1 0 3 ， t h ep e r c e n t a g eo fa c e t i ca c i d ，i s o b u t y r i ca c i da n db u t a n e d i o lw e r e11 4 0 7 ，9 3 7 5 a n d 7 9 2 17 r e s p e c t i v e l y t h ei s o b u t y r i ca c i d ，b u t a n e d i o la n di s o p e n t o i ca c i da n de n a n t h i c a c i do fd h - 2 1w e r e4 1 5 6 3 , 4 6 6 1 9 4 1 3 8 a n d1 0 6 8 0 r e s p e c t i v e l y i n2 1 ， t h e r ew e r e15 4 4 2 o fi s o b u t y r i ca c i da n d8 4 5 5 8 o fb u t a n e d i 0 1 b a c t e r i a li n d e n t i f i c a t i o nw a su n d e r t a k e nb ym o r p h o l o g i c a l ，b i o l o g i c a lt e s t sa n d 1 6 s r d n a t h es t r a i n st 1 0 3a n dd h - 2 - 1b e l o n gt ob a c i l l u ss u b t i l i sa n dt h es t r a i n2 - 1 i sb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s f o rt o l e r a t i o na b i l i t i e sa n a l y s i so fd i f f e r e n ts t r a i n sg r o w i n gu n d e rd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e ，s a l i n i t ya n dp hc o n d i t i o n s , t w os t r a i n sa sd h - 2 - 1a n dt 10 - 3w e r es e l e c t e d a n da n a l y z e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a ls a l i n i t yw a s3 f o rt h e s et w o s t r a i n s ，t h ep e r f e c tt e m p e r a t u r er a n g e df r o m4 0 ct o4 5 c ，a n dt h em o s ta p p r o p r i a t ep h 王l 一 a , b s t r a e t k e y w o r d s ：m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r y ( m e o r ) ；s t r a i n ss c r e e n i n g ；o r g a n i ca c i d ； b a c t e r i a li d e n t i f i c a t i o n 强 黑龙汪大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢酌地方外，论文中不包翕其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑盍堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：懈叟勐火签字日期：。杪p 年多月o b 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉迤太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉选太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：毫 史礅 签字日期：3 01 06 月心日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师魏寺鲤哩 签字日期：? l ，o 年占月l ob 电话： 邮编： 第1 章绪论 1 1 微生物采油简介 第1 章绪论 石油是工业社会的重要能源，在经济和社会的发展中占有举足轻重的地位。经 过第一、二次采油仍有大量原油滞留在储油层中，这为运用各种技术手段提高原 油采收率带来了广阔的研究空间。1 8 9 5 年，b e c k m a n 首先提出利用细菌采油的设 想：1 9 4 3 年，z o b e l l 首先申请把细菌直接注入地下以提高石油采收率的专利；1 9 4 7 年，b e c k 进行了首次工业试验，这些均为微生物采油技术奠定了坚实的基础。1 9 5 4 年，在美国阿肯色州首次成功地进行了利用细菌地下发酵提高石油采收率的矿场 试验i l 刃。在此后的4 0 多年间，虽然也做了很多研究工作，但微生物采油技术在石 油工业领域并没有长足的进展。直到世界石油危机才引起人们对微生物采油技术 的重视，也加速了世界各国对m e o r 的研究和应用步伐【3 一。近十几年来，m e o r 取得了令人瞩目的进展，该技术已从室内研究走向矿场试验并逐渐开始现场应用。 1 1 1 微生物提高石油采收率的概念 微生物提高石油采收率技术( m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r y , m e o r ) 是利 用微生物及其代谢产物提高三次、四次采油过程中石油采收率的各种技术总称【5 , 6 1 。 主要是利用微生物自身的有益活动或其代谢产物对原油岩石水界面性质的作用， 改善原油的流动性质，提高原油采收率f 7 s 】。 油藏中的油并不是像河水样源源不断，而是有很多藏在岩石孔隙中，三次 采油主要目的是将深藏于地下、分散于岩石毛细孔隙中的原油开采出来1 9 , 1 0 。在一 些孔隙处仅靠物理和化学的方法很难深入达到，微生物能在多孔介质中向前推进， 能在很大压力和温度范围内生存，并通过其物理性质和生物化学性质直接作用于 油层，从而实现微生物采油【l l - 1 4 1 。 黑龙江大学硕士学位论文 1 1 2 微生物提高石油采收率的作用机理 ( 1 ) 微生物在代谢过程中能产生多种气体，如c h 4 、c 0 2 、n 2 、h 2 等，可增加 油层内部压力，促进原来不连续的原油区粘连成片；( 2 ) 微生物能产生有机酸类、 醇类、酮类等有机溶剂。有机酸类能使碳酸盐地层溶蚀而增加岩层渗透性，醇类、 酮类可降低表面张力和油水界面张力，促进原油的乳化；( 3 ) 微生物菌体及其分 泌的生物聚合物，可控制高渗地带的流度比，改善地层渗透率；( 4 ) 微生物能降 解重质烃类和石蜡组份。重质烃类被降解后，可以降低原油粘度并增加其流动性。 石蜡组份降解后，可减少井眼附近的沉积，降低地层原油的流动阻力；( 5 ) 微生 物能产生生物表面活性剂，它能乳化原油，降低石油与岩石之间的表面张力，有 些表面活性剂还能降低重油的粘度1 5 - 2 2 1 。 1 2 石油的基本性质 1 2 1 石油的组成 石油是原油和石油制品的总称，是一种由多种烃类正烷烃、支链烷烃、环烷 烃、芳香烃、多环芳烃及少量非烃化合物硫化物、氮化物、烷烃酸类和有机金属 钒、镍组成的复杂混合物，其中烃类占所有组分的9 5 - 9 9 5 1 2 3 1 。原油是未经加 工的石油，是地质变迁而形成的天然有机物质的积累，是天然有机物质经过地质 变迁而形成的一种粘稠的黑色的或深棕色的液体或固体 2 4 - 2 6 1 。 1 2 2 石油的烃类组成 ( 1 ) 正烷烃属饱和烃，根据碳原子数目不同存在状态不同。在常温常压下， c l c 4 的烷烃为气态，c 5 c 1 6 的烷烃为液态，其沸点随着相对分子质量的增加而上 升。1 7 个碳原子以上的一般多以溶解状态存在于石油中，当温度降低时，常以结 晶形式析出，工业上称这种固体烃类为蜡【2 4 , 2 7 , 2 s l 。 ( 2 ) 支链烷烃石油中的异构烷烃以c l o 为主，且以异戊二烯烷烃最重要 2 3 1 。 其特点是在直链上每个4 碳原子有一个甲基支链，支链烷烃无毒，可被多数微生 第1 蕈绪论 i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i ii 黼i i i 物生物降解，但分支越多越难于被生物降解1 2 8 捌。 ( 3 ) 环烷烃由许多个次甲基( - c h 2 ) 围成环，组成环的碳原予数可以是大 于3 的任俺数1 2 4 】。环烷烃又分为单环、双环、三环和多环的环烷烃，在磊油所含 的环烷烃中除单环的环戊烷和环已烷外，还有二环和多环烷烃孤。 ( 4 ) 芳香烃芳香烃的特征是分子中含有苯环结梅，属不饱和烃。根据其所 含苯环的数目可分为单环、多环、稠环三类芳香烃。芳香烃化合物有：苯( 1 环) 、 萘( 2 环) 、菲( 3 环) 、葱( 4 环) 。石油中含属于苯、萘、菲三种类型的化合物最 丰富，多数组分是带1 3 个碳原予的烷基衍生物。芳香烃对生物的毒性最大，特别 是多环芳烃，难以生物降解 2 4 , 2 7 。 1 2 。3 石油的非烃类组成 石油中非烃化合物是指分子结构中除含碳、氢原子外，还含有氧、硫、氮等 杂原予的化合物鲫。石油中菲烃组成主要有含氧化合物、含硫化合物、含氮化合 物及胶质和沥青质四类，主要集中在石油的高沸点馏分中。 含氧化合物：主要有酸性和中性两大类。酸性含氧化合物中有环烷酸、腊肪 酸及酚，总称石油酸。中性含氧化合物有醛、酮等，其含量较少f 2 4 n 。 含硫化合物；是最重要的j # 烃化合物，主要有硫醇( - s h ) 、硫化物( s ，) ( 包 括硫醚、环硫醚) 、二硫化物以及噻吩衍生物。此外，还有元素硫、硫化氢1 2 4 】。 含氮化合物：大部分以胶质、沥青质存在于渣油中。主要有碱性的毗啶类、 喹啉类和胺类化合物及其衍生物，中性的吡咯类和酰胺类化合物及其衍生物1 3 2 】。 胶质和沥青质：胶质是一秘糕稠的液体或半豳体的胶状物。一般把石油中溶 于非极性物质的小分子正构烷烃( c 5 c 7 ) 和苯的物质称为胶质1 2 4 j 。沥青质是一种 黑色的无定形霹体。一般把石油孛不溶予非极性小分子王构烷烃( c 5 c 7 ) 弱溶于 苯的物质称为沥青质，它是石油中相对分子质量最大、极性最强的非烃组分【2 丌。 黑龙江大学硕士学位论文 1 3 石油烃的降解 1 3 1 微生物对石油烃的吸收途径 烃类物质必须通过微生物细胞壁进入细胞膜才能被位于膜内的烃降解酶分 解，而石油烃的憎水性限制其与微生物的接触。一般液态烃可被摄取并渗入细胞 膜，不溶性结晶烃的微生物降解十分困难，而且高度结晶聚合物的降解比无定形 物的降解更慢【3 3 3 4 】。微生物一般存在于油水界面处，不同的微生物，烃类进入细 胞的途径亦不同。一般认为，微生物在摄取石油烃时主要采取以下三种方式： ( 1 ) “单一扩散一溶解烷烃的摄取黟模型：该模型只适用于水溶性芳香烃和气 态烷烃，不适于在水中溶解度太小的长链烷烃【3 l j 。 ( 2 ) “与大油滴直接接触弦模型：假设微生物在接触点通过扩散或主动运输 吸收烃类，那么底物对细胞接触表面积的有效性是微生物生长的限制因素。油界 面面积的增加，不仅使石油烃更易到达微生物，而且进入水体的乳化液滴使氧和 营养物更易被微生物获得，从而促进微生物对石油烃的降解田j 。 ( 3 ) “微滴接触一模型：微生物细胞在非水溶性底物的诱导下分泌生物表面 活性剂，将底物乳化成小液滴，形成烷烃一表面活性剂胶束，可使微生物有效地利 用烷烃生长【3 1 1 。烷烃液滴的界面面积与微生物的比生长速率相关，即烷烃液滴直 径越小，界面面积越大，比生长速率越大【3 5 1 。 1 3 2 微生物对石油烃的降解机理 不饱和烃比饱和烃易降解，链烃比环烃易降解，直链烃比支链烃易降解，支 链烷基愈多，其生物降解性愈差，尤其是碳链末端有季碳原子的特别顽固f 2 4 , 3 6 j 。 对于多环芳烃，2 环和3 环化合物较容易被降解，而含有5 个或更多环的那些芳香 烃难于被微生物所降解( 3 t j 。 一般的石油化学物质按以下方式被生物降解： 石油产品+ 微生物+ 0 2 + 营养元素_ c 0 2 + h 2 0 + 副产品+ 微生物细胞量 微生物对石油中不同烃类化合物的代谢途径和机理不刚3 8 1 。 第 章绪论 ( ) 烷烃的生物降解 微生物对烷烃的降解主要有单一末端氧化、次末端氧化、双末端氧化三种方 式。 单一末端氧化，烷烃末端的甲基先被氯化成醇，醇在醇脱氢酶的作用下氧化 成相应的醛，醛剡通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸，脂肪酸经一氧化生成乙酰 辅酶a ，乙酰辅酶a 在有氧的条件下进入t c a 循环而最终被完全氧化成c 0 2 和 琢。朗。 r c h 2 一c h 3 + 0 2 _ r - c h e - c h 2 - o h _ r - c h 2 - c h o 呻r - c h 2 一c o o h 次末端翌甲基氧化：首先在链内的碳原子上插入氧，生成件醇，爵进一步氧 化生成甲基酮，酮再代谢为酯，醮键裂解生成伯醇和脂肪酸，然后，伯醇和脂肪 羧再沿各自的降解途径发生相应的转化d g 。 r c h 2 一c h 2 一c h 3 一r c h 2 - c h o h - c h 3 _ r c h 2 c 0 一c h 3 叶r c h 2 0 h + c h 3 一c o o h 双末端氧化：某些环境中烷烃类物质的氧化受到阻碍，特别是支链烷烃类 物质，烃链上的分支结构会使其生物降解速度大大降低。当烃链上带有分支结构 时，会发生国一氧化。鄹在氧化受阻时，微生物在烃链的另一末端将孚基氧化。 蜘氧化偶尔也会与b 氧化同时发生，即一个烃链的两端被同时氧化【2 5 1 。 h 3 c 一( c h 2 x c h 3 + 0 2 _ 珏3 c 一( c 珏2 ) n - c h 2 0 冀_ 鹄e 一( e 掩x c h o - - h 3 c 一( c h 2 ) 一c o o h h o h 2 c - ( c h 2 ) 1 1 c o o h o h c 一( c h 2 ) n - c o o h - * h o o c - ( c h 2 ) n - c o o h 正构烷烃的三种降解方式见图1 1 。 冀龙江大学硕士学位论文 单一末端氧化 c h 3 c h 2 ( c h 2 ) n c h 2 c h 3 毒 c h 3 c h 2 ( c h 2 ) n c h 2 c h 2 0 h | ￥ c h 3 c h 2 ( c h 潮c h 式h 0 毒 次末端氧化 c h 3 c h 2 ( c h 2 ) n c h ( o h ) c h 3 | ， c h 3 c h 2 ( c h 2 ) n c o c h , 毒 c h 3 c ( c h 2 ) l 卜l e h 2 c o c h ， 毒 3 c o o h h 0 0 c c h 2 ( c h 2 ) n c h 2 c o o h 阻氧化 图i - i 微生物对正构烷烃的分解代谢途径1 3 9 】 f i g 。1 1c a t a b o l i ca p p r o a c ho f a l k a n e sb ym i c r o o r g a n i s m 3 9 烷烃在微生物的作用下，可以被氧化成为烷基氢过氧化物，烷基氢又被转化 为脂肪酸，再经过叠氧化丽被降解。 r c h 2 一c h 3 _ 【r c h 2 - c h 2 - c o o h 】一r c h 2 一c o o h 如果在缺氧的环境中，烷烃的降解过程从脱氢开始。烷烃脱氢变成烯烃，烯 烃再羟基化形成伯醇，然盾形成酸。 r c h 2 一c h 3 - - , r c h = c h 2 r c h 2 一c h 2 0 h r c h 2 一c o o h 这时的艏肪酸如果继续处于缺氧环境，则发生还原脱羧终用，如果进入有氧 环境则发生圣一氧化 2 5 , 3 8 。 对异构烷烃的代谢研究得很少。正烷烃b 氧化酶一般不能酶促支链烷烃的氧 化，单支链烷烃的氧化多从离支点最远的甲基处开始，并且支链越多越大，被微 生物降解的难度越大。相对正构烷烃而言，支链烷烃较难为微生物降解，支链的 存在增强了烷烃的抗蚀能力。 第l 章绪论 ( 2 ) 环烷烃的生物降解 环烷烃是蜡和某些植物油的主要组成成分1 2 7 1 。具有碱基取代基的环烷烃可作 为微生物生长基矮，没有取代基的则对微生物的降解抗性较大。自然界几乎没有 以环烷烃为唯一碳源生长的微生物，可以通过微生物群落的共同代谢实现对环烷 烃的生物降解。环烷烃的降解需要两种氧化酶的协网氧化，种氧化酶先将其氧 化为环醇，接着脱氢形成环酮，另一种氧化酶再氧化环酮，细菌通过内酯中间体 将环烷酮环断裂抒开，开环形成羟基羧酸，而后进一步被氧纯为二羧酸【3 1 翊。环 已烷分解代谢的可能途径如图1 2 所荆4 1 ，4 2 】： o h 0 一b q c 0 0 h | _ ( 骈1 2 ) 4 l c 0 0 h 图卜2 微生物对环己烷的分解代谢途径啪1 f i g 1 - 2c a t a b o l i ca p p r o a c ho fc y c l o h e x a n eb ym i c r o o r g a n i s m f 嗣 烷基取代的脂环化合物可能被氧化的两个位置是侧链和脂环，化合物的性质， 微生物的属种和其它因素都将影响反应的初始位置湖。 ( 3 ) 烯烃的生物降解 烯烃比芳香烃、烷烃更容易被微生物降解。降解烯烃时，微生物可以攻击甲 基端，也可以攻击双键，形成的中间代谢物有不饱和醇、不饱和脂肪酸、伯醇或 仲醇、甲基酮类、l ，2 环氧化物和1 ，2 二醇等。也就是说，主要是产生具有双键 的加氧化合物，迸步形成饱和或不饱和的脂肪酸，然后脂肪酸再经氧化进入 t c a 循环而完全被降解f 2 4 1 。 ( 4 ) 芳香烃的生物降解 芳香烃的有氯代谢是在加氧酶催化下将分子氧引入芳香化合物的过程。加氧 酶分单加氧酶和双加氧酶两种，分别催化不同的反应途径 4 4 , 4 7 。一般焉言，真核 黑龙江大学硕士学位论文 细胞真菌等微生物是利用单加氧酶将分子氧中的一个氧原子引入芳香环中，再通 过水合作用形成水合中间产物进行进一步的分解；原核细胞生物细菌则常常利用 双加氧酶将分子氧中的两个氧原子引入芳香化合物中，形成无毒的中间产物顺式 二醇，然后二醇再转化形成邻苯二酚 2 4 , 2 8 。单加氧酶和双加氧酶的两条不同降解 途径都经过邻苯二酚这个环节，最后邻苯二酚再通过邻位或间位途径使环断开， 形成三羧酸循环的中间产物。芳香烃的微生物代谢途径如图1 3 所示1 2 5 1 。 芳香烃化合物在厌氧条件下通过脱氢酶及氧化还原酶的参与，经二醇的中间 过程代谢成邻苯二酚和取代基邻苯二酚，后者可在邻位或间位处断裂，形成羧酸， 再通过末端氧化、p 氧化等使之矿化为甲烷和二氧化碳【4 5 硼。 溢 薜 曩 隧 图卜3 芳香烃化合物的微生物代谢途径瞄1 f i g 1 - 31 1 1 em e t a b o l i cp a t h w a yo fa r o m a t i ch y d r o c a r b o nd e g r a d i n gb ym i c r o o r g a n i s m 嘲 8 一 韪婿具辞llill上 第1 章绪论 1 3 3 微生物代谢产生有机酸的作用 综上所述，一些采油菌能够利用原油中的烷烃并将其降解产生有机酸，对于 环烷烃与芳香烃也能降解并形成三羧酸循环的中闻产物，尤其是有机酸与有机醇 等。一般情况下微生物都可以葡萄糖为唯一碳源生长，有的也能代谢分解并产生 有机酸或有机醇。采油菌代谢产生有机酸可以提高石油的采出量。通常产酸的采 油菌代谢产生嵩相对分子质量和低相对分子质量两类有机酸，还有些无机酸。 在井下，一般离相对分子质量的有机酸( 醇) 溶解在原油相中，可以提高原油的 酸值，有助改善化学驱效果【4 8 】；低相对分子质量的有机酸( 醇) 具有良好的水溶 性，一般留在水相孛，这些有机酸可以与储油层的孔隙孛沉积的碳酸盐、硅酸盐 等反应，从而形成可溶性的碳酸盐。由于反应溶解了石灰质岩石，油层的孔隙度 变大，将深藏于孔隙中的原油释放出来，达到增产的目的【5 0 1 。酸与岩石反应产生 的c 0 2 等气体酉增加油层压力，部分气体溶于原油中使其膨胀，降低原油粘度， 改善其流动性，从而提高原油的采收率【5 1 5 3 1 。因此，对采油菌发酵液中的低相对 分子质量的有机酸进行定性及定量的分析对研究微生物采油技术至关重要。何正 嚣等( 1 9 9 9 ) 的研究结果表明微生物作用予原油主要产生乙酸、丙酸，另外还有其它 几种短链有机酸，与此同时，微生物还产生两种未知醇类f 5 4 】；伍晓林等( 2 0 0 5 ) 采用g c m s 直接进样法分析以原油为唯一碳源的两种菌的发酵液，种菌主要产 乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸，另一穗菌主要产乙酸、丙酸、t 酸疆5 1 。包本太( 2 0 0 1 ) 分析出以原油为唯一碳源发酵时产生的缀链有机酸主要是乙酸，通过酸碱滴定测 得总酸量为o 0 0 5 6 m o l l 1 5 6 1 。 1 3 4 发酵液中有机酸的分析方法 半个多世纪来人们对于采油微生物代谢产物中有机酸的分析研究作了很多工 佟，采油微生物代谢产生的低分子量的短链( c l - - - c 6 ) 有枫脂肪酸主要是乙酸、 丙酸、丁酸等脚1 。主要分析方法有高效液相色谱法( h p l c ) 、气相色谱法( g c ) 、 等速电泳法、水相蒸发直接进样法，其次还有比色法、柱色谱法、纸色谱法等， 这三种方法各有缺点，如比色法不熊测定混合酸，柱、纸色谱法分离时闻长，试 9 罴龙江大学硕士学位论文 剂用量大，准确度低，且重现性差，所以不为常用。 ( 1 ) 高效液相色谱法( 玎? l c ) 在高效输液泵的作用下，当流动相流入色谱 柱时，溶质在固定相上高速传播，几分钟到几十分钟即可完成对一个样品的分析， 并且可以通过改变流动相控制和改善分离过程的选择性。由于采用灵敏度较高的 检测器，霹以检出最小壁达l 矿的样品梦s j 。 ( 2 ) 气相色谱法( g c ) 可以先将发酵液蒸馏浓缩后进行复杂的酯化萃取；也 可以先加酸酸化再加乙醚混匀后离心，将离心后的试管冻存，解冻后倾出乙醚， 处理完后再将发酵液进行气相色谱分析【5 9 1 。 ( 3 ) 等速电泳法基于在有机溶剂中有机酸和无机盐等的溶解度不同，先蒸 馏国去氯离子，再利用两台等速电泳仪在多种电解康体系中对短链有机酸进行定 性定量对照实验测定鳓。 ( 4 ) 水相蒸发直接进样法通过蒸发将发酵液中大量的无机盐和表面活性荆 等除去，再利用旋转蒸发的方法将发酵液浓缩，然后取处理后的发酵液作g c 或 g c m s 分析【5 6 , 6 1 , 6 2 1 。 1 4 环境因素对微生物采油的影响 ( ) 温度 温度以两种方式影响采油微生物的采油效率：一是采油菌的生长速度，菌中 酶活性，以及影响微生物的种群构成；二是影响油的物理状态，油的化学组成 f 3 8 4 8 6 3 】。生化反应遵循的一个总的原则就是反应速度随温度升高而升高【6 2 】。研究表 明，一般在3 0 , - - - 4 0 * ( 2 时烃代谢率达到最大；温度继续升高，烃的膜毒性增大，抑 制采油菌的烃类降解能力；在低温时，油粘度增加，有毒的短链烷烃挥发性下降， 烃在水中的溶解性降低，生物降解启动滞后 6 2 , 6 熨。此外，微生物活性需要有液态 水，所以温度至少应在水的凝固点以上 3 3 , s s 。 ( 2 ) p h p l a 对微生物的影响通过以下几个方面实现：一是导致蛋白质、核酸等生物大 分子交性；二是引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质能力改变； 1 8 第1 孳绪论 其三是改变繇境中营养物质的可给性及有害物质的毒性1 3 l 】。娄p h 为7 o 7 8 时烃 类的生物降解速度最快，p h 太高或太低都对微生物有影响。大多异养菌和真菌适 宜于中性环境，囊菌也能适应一定的酸性环境【碉。采油微生物在降解石油烃的过 程中会产生一些酸性代谢产物而使得油藏的p h 下降1 6 5 6 7 , 6 8 。一般认为，低p n 会 影响氮的转化，当斌稍离子中性时，对硝化作用及氦的进一步转化均有利，丽磷 的有效性在p h 为6 0 - - 一8 0 时很高1 3 3 , 6 - q 。 ( 3 ) 盐度 油层盐度对采油菌数量影响较小，但影响微生物代谢活动。随着盐度的升高， 烃盼代谢速率降低，并盈在一般微生物代谢烃过程孛普遍存在这种现象嘲。 ( 4 ) 供氧量 微生物对石油的生纯降解是在加氧酶的催纯佟用下起始的。据计算，每分解 1 9 石油需3 4 9 氧气6 6 p - q 。无氧条件下，也发生石油烃类的微生物降解，只是速 率很低，生态意义不大，但是芳香烃的微生物降勰通常在厌氧条件下降解效果较 好，如苯甲酸和卤化芳香化合物等。 ( 5 ) 表面活性物质 采油过程中常人为向油井加入表面活性剂。研究发现，在微生物降解的初期 ( o - - - - 5 d ) ，表面活性剂直接影响烃类降解效率。因为表面活性物质可以促进石油 烃的乳化，增强有机物的亲水性、溶解度及生物利用性 6 5 6 7 】。但若加入的表面活 性剂过多，会抑制微生物生长1 6 7 1 。微生物在降解毒油烃的过程中自身能产生生物 表面活性剂，以特定的方式加入或利用微生物自身产生的生物表面活性剂可以增 强烃类的降解湖。 1 。5 课题研究的目的和意义 1 5 。1 课题研究的目的 ( 1 ) 从实验室保藏的采油菌中筛选出在厌氧环境下具有生存能力、并且产酸 性能藏的菌株。 黑龙江大学硕士学位论文 ( 2 ) 利用高效液相色谱及气相色谱法对筛选菌株代谢产生的酸进行定性及定 量分析。 ( 3 ) 根据菌株的生理生化性质和1 6 s r d n a 序列确定筛出菌株的分类学和系统 发育学的地位。 ( 4 ) 研究环境因素如温度、酸度、含盐量等对筛出菌生长的影响，找出适合 菌株生长的条件。 1 5 2 课题研究的意义 ( 1 ) 采油菌产生的有机酸可有效的溶解储油岩层孔隙中沉积的碳酸盐，增大 油层的孔隙度和渗透率，改善原油的流动环境。酸与碳酸盐反应产生的气体可增 加油层压力，部分气体溶于原油中使其膨胀，降低原油的黏度，改善其流动性从 而提高原油采油率。 ( 2 ) 通过菌种鉴定确定所选的具产酸能力的采油菌的种属，为进一步利用微 生物技术采油奠定坚实基础。 ( 3 ) 研究环境因素对产酸性能较好采油菌的影响，为进一步做发酵优化和矿 场试验提供有力支撑。 _ 1 6 课题的研究内容 第1 章绪论 1 3 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章材料与方法 2 1 实验仪器与材料 2 1 1 主要实验仪器 紫外光栅分光光度计：7 5 2 型( 山东高密分析仪器厂) ， p h 计：d e l t a3 2 0 ( 梅特勒托利多仪器有限公司) 加热型磁力搅拌器：r e tb a s i cc ( i k a ) 电子分析天平：j t - 1 5 0 ( 沈阳利港净化设备有限公司) 高速离心机：j 2 m c 型( b e c k m a n ) 、3 k 3 0 型( s i g m a ) 高效液相色谱仪：l c 一1 0 a v p ( 日本岛津公司) 气一质联用仪：6 8 9 0 5 9 7 3 n ( 美i 垂i a g i l e n t 公司) 旋转蒸发仪：r 2 0 1 ( 上海申胜生物技术有限公司) 数控超声波清洗器：k q 5 0 0 d b ( 昆山市超声仪器有限公司) p c r 仪：e p p e n d o r f a g ( e p p e n d o r f ) 凝胶成像系统：u v pw h i t e m l t r a v i o l e tt r a n s i l l u m i n a t o r ( 啪) 冷藏柜：m l t r al o wt e m p e r a t u r ef r e e z e ru 5 3 5 ( n b s ) 自动灭菌装置：l a b oa u t o c l a v e ( s a n y o ) 超纯水系统：m i l l i q ( m i l l i p o i 也) d n a 计数器：g e n e q u a n t p r o r n a d n ac a l c r t l a t o r ( p h a r m a c i a ) 恒温空气浴振荡器：i n n o v a4 0 8 0 ( n b s ) 电泳装置：e c p 一3 0 0 0 型三恒电泳仪( 北京六一仪器厂) 制冰机：a f 1 0 0 ( s c o t s ma n ) 电热恒温鼓风干燥箱：d h g 9 0 7 0 ( 天津市电冰箱工业公司) 电热恒温培养箱：h h b 1 1 - 4 2 0 ( 上海三申医疗器械有限公司) 水浴振荡器：h z s h ( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) 无菌超净台：d n p 一9 0 8 2 ( 上海精宏实验设备有限公司) 繁2 章材辩与方法 2 1 2 样品以及来源 本实验采用黑龙江大学生命科学学院微生物三次采油课题组分离、保藏的菌 种。这些菌种是从大庆油田石油样品，油田排放的污水及油田油井周边土样中采 集分离到的。 2 。1 3 培养基 ( 1 ) 培养采油菌的固体培养基牛肉膏3 9 ，酵母膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c i5 9 ， 琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，用1 mn a o h 调p h 至7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 r a i n 。 ( 2 ) 葡萄糖蛋白胨培养基蛋白胨5 9 ，葡萄糖5 9 ，n a c l5 9 ，1 6 溴甲酚紫 乙醇溶液卜。2m l ，水1 0 0 0m l ，p n 7 o 7 2 ，1 1 5 。c 灭菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 伏普实验培养基蛋叁胨5 9 ，葡萄糖5 9 ，k 2 h p 0 4 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 o 7 2 ，每管分装4 - - 一5 m l ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 ( 4 ) 产硫化氢实验培养基( 半固体) 牛肉膏7 5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，琼 脂5 9 ，1 0 f e c l 2 ( 培养基灭菌后无菌加入) 5 m l ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 0 ，1 1 2 ( 2 灭 菌2 0m i n 。 ( 5 ) 硝酸盐半固体培养基牛肉膏3 9 ，蛋自膝1 0 9 ，k n 0 3l g ，琼脂o 5 ， 水1 0 0 0 m l ，p 珏7 。0 7 6 ，1 2 0 * c s x ( 菌2 0m i n 。 ( 6 ) 半固体完全培养基牛肉膏3 9 ，蛋自胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，琼脂3 , 5 - - - , 4 0 9 ， 水1 0 0 0 m l ，p h 7 o 7 6 ，分装于试管中，1 5 m l 管，1 2 0 ( 2 灭菌2 0 m i n 。 ( 7 ) 原油培养基n a c lo 5 ，m g s 0 47 h 2 00 0 2 5 ，( n h 4 ) 2 s 0 4o 1 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0l ，k h e p 0 4o 4 ，原油0 0 2 - , 0 0 5g 15 0 m l ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 5 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 8 ) l b 液体培养基胰他蛋皂胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l1 0 9 ，去离子水 10 0 0 m l ，p h 7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 9 ) s o c 培养基胰化蛋白胨o 5 9 ，酵母提取物2 9 ，n a c l0 0 5 9 ，k c l ( 2 5 0 m m o l l ) l m l ，m g c l 2 ( 2 m o l l ) 0 5 m l ( 单独灭菌) ，葡萄糖溶液( 1 m o l l ) 2 m l ( 无菌滤器除菌) ，注意：k c l ( 2 5 0 m m o l l ) 和m g c l 2 ( 2 m o l l ) 在用s o c 培养基 1 s 黑龙江大学硕学位论文 i i i ii i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 麓黼黼麓麓i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 黛搿麓黼 时加入；待培养基温度降至 4 2 9 。 l 1 9 i i l 。：谢l 。6 开9 0 】o l 1 3 l c ) 。丁二醇的覆谱图 c ) t h eg a sc h r o m a t o g r a p h yo f b u t a n e d i o l 图3 1 2 菌株2 - 1 的气相色谱一质谱测定结果 f i g 3 - 1 2t h eg a sc h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r yc h a r to f o r g a n i ca c i df o rs t r a i n2 - 1 由图3 1 2 中a ) 图可知，菌株2 1 的发酵液通过气相色谱分析共得到两个峰， 出峰时间分别为1 6 5 3 m i n 和1 6 9 6 m i n 。通过质谱图b ) 的鉴定出1 6 5 3 r a i n 检测到 的是异丁酸，图e ) 鉴定盘1 6 9 6 m i n 检测到的是丁二醇。综合图3 1 2 的三令图知， 菌株2 1 的发酵液中存在一种有机酸和一种有机醇，其中异丁酸占发酵液的 15 4 4 2 ，丁二醇占发酵液的8 4 5 5 8 。 3 3 菌种鉴定 3 3 1 菌种形态学鉴定 筛选得到的菌株2 1 ，d h 2 。l ，t 1 0 3 的蔫落形态如表3 7 所述。 表3 - 7 菌落形态描述 t a b 3 _ 7d e s c r i p t i o no fs i n g l ec o l o n y 甍株2 1 、d h - 2 1 和t 1 0 3 的染色结果如表3 8 所示。 & 38 熵枷染色r ，果 j a b38r e s u l t so fs t a i n i n g 3 32 生理生化性质鉴定 蒴株21 、2 】和t 1 03 的牛化性质鉴定结果见袭j9 袁3 - 9 生理生化特性 t a b39p h y s i c c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s 将阻上生化实验结果与伯杰细菌鉴定手册比对，这三株菌可以初步鉴定为芽 孢丰菌属的细菌。 3331 6 s r d n a 序列分析 苗株d i i 一2 - 1