（营养与食品卫生学专业论文）大孔吸附树脂吸附分离家蝇抗菌肽的研究.pdf

摘要 摘要 昆虫抗菌肽是昆虫免疫防御系统的重要成分，具有相对分子质量小、热稳定性好、 抗菌谱广等特点。家蝇存在独特的免疫机制，在我国分布广，资源丰富，容易养殖、成 本低，是一个等待开发的良好资源。因此对家蝇抗菌肽分离纯化的研究具有重要理论意 义和实际应用价值。 家蝇抗菌肽的抑菌活性与其疏水性有一定的联系，故采用大孔吸附树脂根据疏水性 的差异来从家蝇粗蛋白中分离家蝇抗菌肽，并对大孔吸附树脂的分离工艺进行了优化选 择，然后通过r p h p l c 进一步纯化，得到了抑菌活性最高的组分。 本论文考察多种大孔吸附树脂对家蝇蛋白的吸附性能，d 1 0 1 大孔吸附树脂对家蝇 蛋白的吸附量可达2 1 7 1 8m g g ，乙醇是比较理想的洗脱剂，随着乙醇的浓度增加，洗 脱率也相应提高，当用7 5 乙醇洗脱时，洗脱率为7 5 7 0 。通过试验确定d 1 0 1 大孔吸 附树脂富集分离家蝇抗菌肽的上样条件为：上样流速o 5b v h ( b v ，b e dv o l u m e ，床体 积) ，上样浓度为1 5m g m l 。d 1 0 1 大孔吸附树脂富集分离洗脱采用1 5 、3 5 和5 5 的乙醇分级洗脱，经过这三种浓度的乙醇溶液洗脱后得到的组分的蛋白质含量分别为 3 9 4 0 、7 1 7 2 和7 2 7 4 ，而粗家蝇蛋白的蛋白质含量只有1 2 7 9 ，说明洗脱后的蛋 白质的含量有很大的提高，同时其疏水性值也从粗家蝇蛋白的4 1 7k j t 0 0 1 分别增加到了 4 3 0k j m o l 、4 4 3k j m o l 和4 7 5k j m o l 。随着疏水性的提高，家蝇抗菌肽的抑菌活性也 呈现增加的趋势，其中5 5 7 , 醇洗脱组分的抑菌活性最高。 经过分离纯化使用后的树脂再吸附性能降低，用常规的再生方法不能恢复大孔吸附 树脂的吸附能力，研究分别采用酸醇法和碱醇法对d 1 0 1 大孔吸附树脂再生条件进行优 化：酸醇法对d i o i 大孔吸附树脂的静态再生条件为h c i 浓度0 1m o l l ，乙醇浓度8 5 ， 温度3 0 * ( 2 ，浸泡时间6h ，再生液用量5 0m l g 干树脂；动态再生条件为再生液流速 lb v h ，再生液用量6 6 7m l g ，其他条件同静态再生。碱醇法对d 1 0 1 大孔吸附树脂的 静态再生条件为n a o h 浓度0 1m o l l ，乙醇浓度8 5 ，温度为3 0 ，浸泡时间6h ，再 生液用量6 6 7m l g 干树脂；动态再生条件为再生液流速为lb v h ，其他条件同静态再 生。在上述条件下，同时使用酸醇法和碱醇法对d 1 0 1 大孔吸附树脂进行再生，使用2 0 次后树脂的吸附性能仅降低1 5 。 对d 1 0 1 大孔吸附树脂富集分离的5 5 乙醇洗脱组分迸一步进行r p - h p l c 纯化， 得到的多个峰都具有抑菌活性，其中f 1 2 的抑菌活性最高。经过二次r p h p l c 和 s d s p a g e 电泳检测，该峰达到色谱纯和电泳纯，测得其相对分子质量为4 8 4 2 。氨基酸 分析表明，f 1 2 富含碱性氨基酸和疏水性氨基酸，疏水性值为5 8 2k j m o l 。与d 1 0 1 大 孔吸附树脂分离组分相比，f 1 2 的疏水性增加更为明显，其抑菌活性也有大幅度的提高。 测定各种组分对各试验菌的m i c ( m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，最低抑菌浓度) 可以 知f 1 2 对大肠杆菌的m i c 最低，为3 0i ，t g m l 。同时，试验证明f 1 2 具有良好的耐高温、 耐低温和耐酸碱性，f 1 2 在p h9 左右抑菌活性最大。 关键词：家蝇，抗菌肽，大孔吸附树脂，疏水性 a b s t r a c t i n s e c ta n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sa r et h ei m p o r t a n tc o m p o n e n t so fi n s e c ti n l m t m es y s t e m s ， a n dh a v ea d v a n t a g e so fs m a l lm o l e c u l ew e i g h t ，h e a t - s t a b i l i t ya n db r o a da n t i b a c t e r i a la c t i v i t y m u s c ad o m e s t i c ah a st h es t r o n gd i s e a s e r e s i s t a n c ea n dt h eu n i q u ei m m u n i t ym e c h a n i s m ， d i s t r i b u t e sw i d e l yi nc h i n a , i se a s yt oc u l t u r e ，a n dl o w - e o s t , t h u st h eh o u s e f l yi sag o o d r e s o u f e ed e s e r v i n gt ob ee x p l o r e d s t u d yo nt h ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d ef r o mt h eh o u s e f l yi sb o t h t h e o r e t i c a l l ya n dp r a c t i c a l l yi m p o r t a n t a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sf r o mm u s c ad o m e s t i c al a r v a ew a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e db y m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nc h r o m a t o g r a p h y , o fw h i c ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t yh a sp a r t i c u l a r r e l a t i o n s h i p 、) l ，i mi t sh y d r o p h o b i cp r o p e r t y n eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sf o r t h ep r o c e s s i n go ft h e a c t i v ec o m p o u n d si na n t i b a c t e r i a lp e p f i d e ss e p a r a t e db ym a r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n c h r o m a t o g r a p h y 、 ，e r ek n o w nb yt e s t 1 f 1 1 em o r ea c t i v ep e p t i d eo b t a i n e dw a sp u r i f i e db y r p h p l cf u r t h e r , a n dt h em o s ta n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sw a sa c q u i r e d a d s o r b e da b i l i t yo f m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nc h r o m a t o g r a p h yw a sr e c 0 驴i z e d m a d s o r b i n gq u a n t i t yo fd 1 0 1m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nc h r o m a t o g r a p h yf o rt h e a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sr e a c h e d2 1 7 1 8m g g e t h a n o lw a sav a r i e t yo fo p t t m i z e de l u t e d s o l u t i o n i n c r e a s e dw i t hc o n c e n t r a t i o no fe t h a n 0 1 t h ee l u t e de 伍e i e n e yw a se l e v a t e d e l u t e d e f f i c i e n c yo fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sw i t hd 1 0 1m a e r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nw a s7 5 7 0 ， w h e ne l u t e db y7 5 c o n c e n t r a t i o ne t h a n 0 1 t h eb e s tl o a d i n gp a r a m e t e r sf o rp e p t i d e so nd 1 0 1 m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nw a s15 m g m ls a m p l ec o n c e n t r a t i o nw i t h0 5b v m v ，b e d v o l u m e ) l o a d i n gr a t e n e1 5 、3 5 a n d5 5 e t h a n o ls o l u t i o nw a su s e dt oe l u t eo nd 1 0 1 m a e r o p o r o u sa d s o r p t i o n r e s i n 硼1 ep r o t e i nc o n t e n to fc o m p o u n d ss e p a r a t e db yd 101 m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nw i t h15 、3 5 a n d5 5 e t h a n o ls o l u t i o nw e r e3 9 4 0 7 1 7 2 a n d7 2 7 4 r e s p e c t i v e l y ，w h i l et h ep r o t e i nc o n t e n to ft h eo r i g i na n t i b a c t e r i a l p e p t i d e sw a s1 2 7 9 ，i n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i nc o n t e n tw a si n c r e a s e da f t e re l u t i n g a tt h e s a m et i m e ，h y d r o p h o b i cv a l u eo fc o m p o u n d se l u t e db yt h et h r e ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n c t h a n o lw a s4 3 0 、4 4 3a n d4 7 5k j m o l 。0 13 - 4 6 4k j m o li n c r e a s e dt h a nt h eo r i g i n a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s w a sh i g h e r 谢廿1h y d r o p h o b i cv a l u ei n c r e a s e d t h ec o m p o u n d se l u t e db y5 5 e t h a n o lo w n e d t h eb e s ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t y 1 1 1 ea d s o r b e dc a p a c i t yd e c r e a s e dd r a m a t i c l ya f t e rs e p a r a t i o na n dp u r i f y , b u tt h e t r a d i t i o n a lm e t h o d sw o u l dn o tr e c o v e rt l ea d s o r b e dc a p a c i t yo fd 101m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o n r e s i n ，n l eo p t i m i z e dc o n d i t i o nf o rr e u s em e t h o dw i t ha c i da n dc e d r o lw a si n v e s t i g a t e d 弱 f o l l o w i n g ：w i t ht h es t a t i cr e u s e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fh c lw a s0 im o l l ，t h ec o n c e n t r a t i o n a n dq u a n t i t yo fe t h a n o lw a s8 5 a n d5 0m l gd r yr e s i na t3 0 f o rs i xh o u r s ；、) ，i n ld y n a m i c r e u s e ，t h er a t eo fr e u s es o l u t i o nw a s1b v ha n dt h eq u a n t i t yo fe t h a n o lw a s6 6 7m l gd r y r e s i n ，a n dt h eo t h e rp a r a m e t e r sw a s s a m ea st h es t a t i cr e u s e t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nf o rr e u s e m e t h o dw i t hb a s ea n dc e d r o lw a si n v e s t i g a t e da sf o l l o w i n g ：w i t ht h es t a t i cr e u s e ，t h e c o n c e n t r a t i o no fn a o hw a s0 1m e i l t h ec o n c e n t r a t i o na n dq u a n t i t yo fe t h a n o lw a s8 5 a n d6 6 7m l gd r yr e s i na t3 0 f o rs i xh o u r s ；w i t hd y n a m i cr e u s e ，r a t eo f r e u s es o l u t i o nw a s i l a b s t r a c t 1b 讹a n dt h eo t h e rp a r a m e t e r sw a ss a m ea st h es t a t i cr e u s e b o t hr e u s em e t h o dw i t ha c i d a n dc e d r o la n dw i t hb a s ea n dc e d r o lu s e dt or e u s ed 1 0 1m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n , t h e a d s o r b e dc a p a c i t yr e d u c e db y1 5 a f t e re m p l o y i n g2 0t i m e s r p 一船l cw a sa p p l i e dt op u r i f yt h ec o m p o u n do b t a i n e db yd 1 0 1m a c r o p o r o u s a d s o r p t i o nr e s i nw i t h5 5 e t h a n o l ，t h ep e a ko ff 12w a st h eh i g h e s ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t y a m o n gt h ep e a k sw i t ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t y a f t e rt h es e c o n dr p - h p l ca n ds d s - p a g e e l e c t r o p h o r e s i st e s t , c h r o m a t o g r a p h i c a l l ya n de l e c t r o p h o r e t i c a l l yp u r ei n g r e d i e n tw a sd e t e c t e d w i t hm o l a rw e i g h to f4 8 4 2 a n a l y s i so fa m i n oa c i ds h o w e dt h a tf 1 2w a sr i c hi nb a s i ca m i n o a c i da n dh y d r o p h o b i ca m i n oa c i da n dh y d r o p h o b i cv a l u ew a s5 8 2k j m o l ，i n d i c a t e dt h a ti t w a sab a s i ca n t i b a c t e r i a lp e p t i d e 、) i ，i t l lm o r eh y d r o p h o b y c o m p a r e dw i t ht h ec o m p o u n d s e p a r a t e db yd 101 m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n , t h eh y d r o p h o b i c i t ya n da n t i b a c t e r i a l a c t i v i t yo ff 1 2w a se n h a n c e d 1 1 1 em i cf o rt e s to r g a n i s mo ff 1 2w a st h el o w e s ta m o n ge a c h i n g r e d i e n t s ，w h i c hw a s3 0i - t e g r n l t h ei n g r e d i e n to ff 12w a si n s e n s i t i v et oe i t h e rh i 曲o rz e r o t e m p e r a t u r ea n da c i do rb a s i ce n v i r m e n t w i t ht h em o s ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya tp h9 k e y w o r d s ：m u s c ad o m e s t i c a ( h o u s e f l y ) ，a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ，m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n , h y d r o p h o b i cp r o p e r t y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 竺望：笸：么 日期：碰兰：垒 第一章绪论 第一章绪论 1 1 前言 从1 9 2 9 年f l e m i n g 发现青霉素以来，抗生素使人类对于病原菌感染性疾病的治疗 产生了革命性飞跃，成为人们对抗病原菌感染的强有力武器。但是随着耐药菌株及多重 耐药菌株的不断增加，为应对耐药菌感染，人类一直不断致力于研究和开发新型抗菌药 物。由于抗菌肽具有广谱抗菌性，特别是对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用，且不破 坏人体的正常细胞等特性【旧，有望成为抗肿瘤、抗感染的良好药物，使人类摆脱“耐药 菌危机”，找到治疗肿瘤的新途径，并将会给临床医学和临床药物学领域带来革命性的 进展，有着广阔的开发应用前景，是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。开 发抗菌肽在医药、农业，食品等方面的应用，通过进一步改进分离纯化手段，促进抗菌 肽的大批量生产和应用是当今抗菌肽研究的一个发展方向。 1 2 家蝇抗茵肽 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) 是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的肽 类生物活性物质，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。抗菌肽对生物有天然免疫作 用，具有抗菌活性。它通常富含阳离子氨基酸残基，是一类防御性多肽，被称为“第二 防御体系”。由于这类多肽具有广谱、高效的杀菌活性，因而最初被命名为“a n t i b a c t e r i a l p e p t i d e s ( a b p ，抗细菌肽) ”。随着研究工作的深入，人们发现某些抗菌肽对部分真菌、 原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，而且还可以促进伤口愈合，对癌细胞 和癌实体瘤有攻击作用而不破坏正常细胞，因此许多学者又将其城称为肽抗生素( p e p t i d e a n t i b i o t i c s ) t 3 1 。 上世纪七十年代，瑞典科学家b o m a n 以惜古比天蚕( h y a t o p h o y ac e c r o p i a ) 的蛹为实 验材料，首次得到抗菌肽c e c r o p i n 4 ，后由s t e i n e r 及其同事于1 9 8 1 年确定了天蚕素a 与b 的一级结构顺序，随后人们在细菌与真菌【2 l 、两栖类【l 孓堋、昆虫【1 9 - 2 4 、高等植物 f 2 5 1 、哺乳动物【2 6 捌、直至人类体内幽川都发现了抗菌肽。迄今为止，美国内布拉斯加 州医学中心建立的抗菌肽数据库( a p d ：t h ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d ed a t a b a s e ，2 0 0 4 ) 中搜 集了5 2 5 种肽( 4 9 8 种抗细菌肽、1 5 5 种抗真菌肽、2 8 种抗病毒肽及1 8 种抗肿瘤肽) ，其 中在昆虫中发现的抗菌肽已达1 0 0 多种。 已发现的天然抗菌肽通常是由3 0 多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，含有4 个或多于4 个带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸，具有双亲的性质。水溶性好，相对 分子质量一般在1 0 x 1 0 6 以下。大部分抗菌肽具有热稳定性，在1 0 0 加热1 0 1 5m i n 仍 能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7 ，表现出较强的阳离子特性，对不同的离子 强度和p h 值均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽还有抵抗丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶 和( 或) 胃蛋白酶水解的能力p 。 江南大学硕士学位论文 1 2 1 蝇源抗茵肽的分类及特点 蝇源抗菌肽是抗菌肽家族中的一类重要成员，其种类和数量很多，相对分子质量较 小，不同的蝇源类抗菌肽具有不同的结构，根据目前所得到的蝇源抗菌肽的氨基酸组成， 可将各蝇源抗菌肽大致归纳为以下5 个类型 3 2 - 3 6 1 ：1 ) 不含半胱氨酸残基，具有2 个洳 螺旋的抗菌肽主要有c e e r o p i n s 和c c r a t o t o x i n 。2 ) 富含半胱氨酸残基的抗菌肽主要为 d e f e n s i n 和d r o s o m y c i n 。3 ) 富含脯氨酸残基的抗茵肽主要有d r o s o e i n 和m e t c h n i k o w i n 。 4 ) 富含甘氨酸残基的抗菌肽主要包括a t t a e i n s 和d i p t e r i c i n s 。5 ) 富含芳香族氨基酸的 抗菌肽主要来自于双翅目的昆虫，尤其是蝇类的幼虫，相对分子质量较小，如来源于肉 蝇的n - a l a n y l 5sg l u t a t h i o n y l - 3 、4 - d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e 及来源于沙蝇的 p - h y d r o x y c i n n a m a l d e h y d e 。各类蝇源抗菌肽来源于不同的蝇种，但是都具有显著的抑菌 活性。 蝇源抗菌肽的种类如此之多，结构差异也很大，目前还没有一种模型可以全面的概 括所有的抗菌肽的作用机制。当前比较普遍的抗菌肽作用机制模型主要有孔洞学说( t h e b a r r e l - s t a v em o d e l ) p t , 3 8 1 、毯式模型( t h ec a r p e tm o d e l ) 【3 9 ，4 0 , 4 1 】和离子通道学说( t h e a g g r e g a t ec h a n n e lm o d e l ) 4 2 , 4 3 。在以上三种抗菌肽抑菌作用机制模型中，都需要经历抗 菌肽的疏水基团与细菌细胞膜中脂类相结合的过程，从而改变细菌细胞膜的通透性，导 致细菌死亡。由此我们推测抗茵肽的疏水性与其抑菌活性有密切的联系，抗菌肽的疏水 性越大，其抑菌活性也越大，其疏水性的差异可以作为分离纯化的依据。 1 2 2 家蝇抗茵肽的来源 家蝇( m u s c ad o m e s t i c a ) 属于双翅目、芒角亚目、蝇科、家蝇属，是一种常见的蝇 类，全世界都有分布，具有容易养殖，繁殖速度快，成本低等优点，是很好的抗菌肽资 源。目前对家蝇抗菌肽的研究大多都是以通过对家蝇幼虫进行穿刺，用各种菌液进行感 染和诱导后提取的血淋巴等体液为对象的。经过诱导后，家蝇体内抗菌肽含量会有一定 的提高陬4 5 1 ，但是穿刺诱导和体液提取的过程繁琐、规模小、对设备和操作要求高，并 不能用于快速大规模的富集和分离家蝇抗菌肽。家蝇粗蛋白粉是将家蝇幼虫直接破碎匀 浆冻干而成，虽然与家蝇幼虫体液相比，其成分更复杂一些，但是由于其来源广泛、生 产简单、成本低，很适合作为家蝇抗菌肽富集分离方法研究的原料。 1 2 3 家蝇抗茵肽分离纯化方法研究进展 家蝇抗菌肽分离纯化的报道很多，这些报道中用于家蝇抗菌肽分离纯化的主要手段 有：凝胶过滤层析、离子交换柱层析、电泳制备和反相高效液相色谱( r p - - h p l c ) 等。 凝胶过滤层析目前己被广泛用于抗菌肽的分离中，很多对家蝇抗菌肽的分离纯化研究工 作都用到了凝胶过滤层析。目前大多数文献报道的抗菌肽都为碱性抗菌肽，所以用阳离 子交换树脂可以对家蝇抗菌肽起到较好的分离效果。南开大学生命科学学院盛长忠等人 闱，使用c m s e p h a r o s e 离子交换层析从家蝇幼虫中分离出一种相对分子质量约为7 0 0 0 的抗菌肽。华南农业大学邓小娟和黄自然，也曾采用c m s e p h a r o s ef f 分离柞蚕抗菌肽 【4 7 j 。制备电泳也可以用来分离纯化家蝇抗菌肽，宫霞等用t r i e t n e s d s p a g e 电泳从家 2 第一章绪论 蝇蛆中分离出了相对分子质量为6 2 0 0 的抗菌肽m d l 1 4 s 。r p i - t p l c 由于其使用范围 广泛，分辨率高但是对样品要求高，处理量小的特点，往往只被放在分离工序的最后一 步用作对目的物的细分或者对前序的分离效果的检验。 表1 - 1 已经报道的家蝇抗茵肽 t a b 1 - 1r e v i e wo fr e p o r t e da n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sf r o mt h em u s c ad o m e s t i c a 抗菌肽名称 相鍪子 等电点 鬻 抗茵特性材料研艏时间 一 g + ，g 家蝇成虫陈留存 富含p r oc h g 一家蝇幼虫柏鸣 一g + 家蝇幼虫盛长忠 一g 一 一 g - 一g ，g +家蝇幼虫安春菊 一g一 一 g - 富含g l y g - 富含p r og - ，g +家蝇幼虫宫霞 富含3 1 y g - 一 0 - ，g + 家蝇幼虫周义文 一g ，g + 家蝇幼虫 陆婕 富含g l y g - ，g +家蝇幼虫侯丽霞 c m - 抗茵蛋白 h l 抗菌蛋白、 肽 迄今为止，研究者们用这些方法从家蝇体内分离纯化到多种不同的抗菌肽( 表1 1 ) ， 但是其中还存在一定的不足。凝胶过滤层析由于其仅是根据分离物的分离量大小进行分 离，而家蝇抗菌肽种类繁多，相对分子质量大小也各不相同，如周义文等分离出了相对 分子质量为8 9 3 0 的家蝇抗菌肽m ，侯丽霞等分离出了相对分子质量为1 9 0 4 0 的抗菌肽 4 5 1 ，陆婕等分离出相对分子质量为7 0 9 2 的家蝇抗菌肽【4 9 】。凝胶过滤层析通常作为初步 分离的手段与其他分离方法结合使用，这个阶段的样品组分往往是比较复杂的。如果使 用凝胶层析分离抗茵肽，在样品同时含有多种活性成分并且各活性组分的相对分子质量 相差比较大的情况下，很难保证所有活性组分都在所选用凝胶的有效分离范围之内，有 可能造成活性成分的损失。离子交换层析对碱性抗菌肽有很好的分离效果，虽然目前已 经发现的大多数抗菌肽都是碱性肽，但是不能排除存在酸性抗菌肽的可能性。华中科技 大学陆婕等从家蝇蛆中分离出了一种弱酸性抗菌肽，相对分子质量7 0 9 21 4 9 j 。这说明除 了被大量报道的碱性抗菌肽外，还存在着酸性抗菌肽，因此用离子交换树脂来分离家蝇 抗菌肽很可能会限制酸性抗菌肽的发现和研究。制备电泳分离抗菌肽的效果比较好，但 是制备电泳对样品要求高，样品处理量小，很难成为分离家蝇抗菌肽的主要手段。家蝇 粗蛋白成分复杂，可溶性蛋白含量较低，杂质多，用常规方法从家蝇粗蛋白中分离家蝇 抗菌肽，上述不足就会显现出来。根据蝇源抗菌肽的特点，我们考虑从抗菌肽的疏水性 大小着手，以此来富集分离纯化家蝇抗菌肽。 1 l 1 1 ， 3 i 6 7 姗姗砒 撇 嬲 粼| 言撕 一 蛐 一 一 一 一 一 一 跚蝴眈 泐 一一舢舢一一一一鲫一一跏|室一 一一一一啪 江南大学硕士学位论文 大孔吸附树脂是2 0 世纪6 0 年代发展起来的一种新型非离子型高分子聚合物，理化 性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子 化合物的影响。近年来在环保、医药、化工、分析化学、临床鉴定等领域应用很广泛。 大孔吸附树脂具有品种多、比表面积大、吸附力强、选择性高等优点，可用于多种有效 成分或有效部位的分离纯化【5 0 ，5 1 j 。选择合适的大孔吸附树脂以及洗脱剂，可以实现按照 疏水性的差异对样品进行富集和分离。 1 3 大孔吸附树脂 1 3 1 大孔吸附树脂的特点 大孔吸附树脂的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。大孔吸附树脂以范德 华力从很低浓度的溶液中吸附有机物，其吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质 5 2 1 。吸 附树脂表面上的原子力场不饱和，有表面能，因而可以吸附某些分子以降低表面能，这 也就是大孔吸附树脂能从溶液中吸附某些物质的原因【5 2 。吸附作用是一种或多种分子附 着在另一种物质表面上的过程，是由决定分子偶极距的范德华力所决定的，依靠吸附剂 的活性尖端，要求有很大的表面积。此外，还与溶液中的吸附质浓度有关，在浓度高时， 可以发生多层吸附【5 3 1 。根据不同的表面性质，可将大孔吸附树脂分为非极性、中极性和 极性三类。非极性吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合制得，不带任何功能基，孔表面 的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物；中极性的吸 附树脂是含酯基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分；极性吸附树脂是指含酰胺 基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂【5 3 】。选择不同种类的大孔吸附 树脂配合不同的洗脱剂可以达到不同的分离效果。 袁1 - 2 大孔吸附树脂的分类 t a b 1 - 2c l a s s i f i c a t i o no fm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n 1 3 2 大孔吸附树脂分离蛋白质和多肽的研究进展 目前大孔吸附树脂主要被用于皂苷类、黄酮及其苷类、葸醌及其苷类、酚酸类、色 素类、生物碱类等植物有效成分的分离纯化，在这些方面已有大量报道【5 4 - 5 7 1 。大孔吸附 树脂具有吸附和筛选性能，并且容易再生，而将其用于分离纯化蛋白质、多肽和氨基酸 等生物活性物质时还具有条件温和、设备简单和操作方便的特性。因此，很多学者将大 第一章绪论 孔吸附树脂应用到了蛋白质和肽的分离纯化中。 钱庭宝等将一定量的人血清自蛋白、胰高血糖素、胰岛素和细胞色素c 分别通过大 孔吸附树脂柱，获得了较为理想的蛋白质分离纯化及浓缩效果1 5 8 1 。解芳等采用s i p 1 3 0 0 大孔吸附树脂从猪血红细胞中制取s o d ( 超氧化物歧化酶) 的效果很好1 5 9 】。刘琦英利用 c a d - 4 0 大孔吸附树脂法直接从发酵液中提取酸性蛋白酶抑制剂，提取率比溶剂萃取法 提高了1 5 1 6 0 1 。李从军等对用s p - 2 0 7 大孔吸附树脂分离纯化谷胱甘肽进行了研究，取得 了良好的结果【6 1 】。赵利等利用d a 2 0 1 c 大孔吸附树脂对酪蛋白非磷肽进行了分离纯化 1 6 2 j 。南开大学利用n k a 9 大孔吸附树脂提纯了一种生物活性肽s p ，此夕 h a g e n m a i e r 等人 利用m 7 2 树脂为固定相的h p l c 分离八种肽，分辨率高，达到了很好的分离效果【5 3 1 。大 孔吸附树脂对以上这些蛋白质和肽的分离纯化很大程度上依赖生物活性肽的疏水性差 异，所以我们可以尝试利用大孔吸附树脂按照各个分离组分疏水性的差异从粗家蝇蛋白 中富集分离家蝇抗菌肽。 在大孔吸附树脂使用的过程中，再生是一个重要环节，树脂再生的好与否，将直接 影响对物质分离纯化的效果。常用的再生方式是用2 h c i 或3 o h 浸泡洗涤6 2 h ，但 是树脂的再生条件是随着使用后残留在树脂上的杂质的性质而改变的。大孔吸附树脂在 分离蛋白质和肽时，尤其是当被分离物成分比较复杂，杂质比较多的时候，残留在树脂 上的酸不溶性物质和碱不溶性物质比较多，用常用的再生方法并不能起到良好的再生效 果。因此，在研究大孔吸附树脂对粗家蝇蛋白的分离的同时，应当选择和优化树脂的再 生条件。 1 4 立题背景与意义 近一百年来，抗生素一直是人类对抗病原菌感染性疾病的有效手段，但是。近年来， 由于抗药菌株的大量出现，特别是多重耐药菌的不断增多，使得人类寻找抗生素替代药 品的步伐不断加快。由于抗菌肽能非特异性地抗细菌、真菌、病毒等病原体，同时不易 产生耐药性，所以其在医药领域受到广泛的关注。目前已经有许多抗菌肽类药物通过或 者已经进入临床实验( 3 3 ，6 3 】，有望成为人类对抗疾病新的有力武器。 在食品工业中防腐剂是最重要的添加剂之一。目前我国使用的食品防腐剂以苯甲 酸、山梨酸及其盐类、对羟基苯甲酸脂类等化学合成剂为主，这些防腐剂在食品加工中 的添加量都较大，容易超标而危害人体健康。用抗菌肽作为天然的食品防腐剂具有良好 的前景。其中抗菌肽n i s i n 已经在4 0 多个国家被批准用作防腐剂，其使用历史已达5 0 多年。在一些国家，n i s i n 被用于延长奶制品的货架期及防止嗜热生物引起的罐装食品腐 烂。h a n s e n 等研究发现从脊椎动物精子细胞中得到的阳离子抗菌肽p r o t a m i n e 单独或与 e d t a 、冷藏条件结合时对食品腐败菌具有抑菌效果1 6 4 ，6 5 1 。昆虫抗菌肽的抗菌谱广，活 性强，又基本不对真核细胞起作用，把它们作为食品防腐剂前景广阔。抗菌肽具有良好 的热稳定性，可以用于热加工食品，还可以用来防止巴氏杀菌后的再污染。抗菌肽还可 以用于防止食品发酵过程中的杂菌污染，除了直接添加这类肽以外，还可以把抗性基因 5 江南大学硕士学位论文 转入发酵菌株。除了医药和食品领域，抗菌肽在基因工程和饲料添加剂方面也有广泛的 应用前景【鸭6 7 j 。 众所周知，自然界中的昆虫的数量是极为惊人的，现在已经有记载的昆虫总数已达 百万之多，其个体数量更高达1 0 1 8 ，这是一个难得的抗菌肽资源宝库，目前已被鉴定出 的抗菌肽大约有8 0 0 种，其中很大一部分是来自于昆虫。蝇从幼虫到成虫均生活在杂菌 横生的恶劣环境中，以机械性传播和生物性传播两种方式在人类和其他动物之间传播多 种疾病，如痢疾、伤寒、霍乱等，但是其自身却很少患病，说明其有其独特的免疫防御 机制，能够有效的抵御病原菌的感染。用蝇幼虫治疗难治性外伤感染、压迫性坏死等， 已早有报道1 6 8 ，明，曾一度在欧美国家的医院中被普遍应用。家蝇由于其来源广泛，易 饲养繁殖，所以成为理想的抗菌肽来源及研究对象。家蝇粗蛋白生产简单，成本低，可 以成为大规模富集分离家蝇抗菌肽的良好原料。目前，家蝇粗蛋白主要还只是用作动物 饲料的蛋白质添加剂使用，研究从家蝇粗蛋白中分离家蝇抗菌肽的工艺，可以进一步挖 掘家蝇资源的发展潜力，提升家蝇开发的层次。 传统的生化分离方法可以用来分离家蝇抗菌肽，但是各种方法都存在着一定的不 足。此外，传统的分离方法效率低，成本高，对设备和操作要求高，因此需要寻求一种 快速、有效、成本低的从粗家蝇蛋白中富集纯化家蝇抗菌肽又能尽可能多的保留原料中 活性组分的分离方法。已发现的包括抗菌肽在内的多种生物活性肽的生物活性与其疏水 性的大小存在一定的联系，同时由抗菌肽的作用机制模型可以推测，抗菌肽的疏水性对 其抑菌活性有重要的影响。所以从疏水性大小的角度对大家蝇抗菌肽进行分离可以减少 活性成分的流失，提高效率，也可以从一个侧面观察家蝇抗菌肽疏水性大小与其抑菌活 性之间的联系。大孔吸附树脂可以根据各组分的疏水性差异对被分离物进行分离，虽然 目前尚未检索到国内外关于利用大孔吸附树脂来分离家蝇抗菌肽的报道，但是由家蝇抗 菌肽和大孔吸附树脂的特点可以看出，采用大孔吸附树脂来富集分离家蝇抗菌肽预计可 以取得良好的效果。 1 5 本课题研究内容 本文探讨了大孔吸附树脂对家蝇抗菌肽富集分离的可能性，旨在寻找一种快速、有 效、简便、廉价的富集分离家蝇抗菌肽的方法，优化工艺条件，并对分离纯化后的家蝇 抗茵肽进行活性测定。主要研究内容如下： 1 、研究大孔吸附树脂对家蝇抗菌肽的吸附性能，选择合适的树脂和分离条件，并 以此为基础，富集和分离家蝇抗菌肽，并对分离组分进行氨基酸分析和抑菌活性检测。 2 、对使用后的大孔吸附树脂的再生工艺进行研究，选择和优化再生条件参数。 3 、对大孔吸附树脂富集分离得到的活性组分进一步采用r p h p l c 进行纯化，测定 活性组分的相对分子质量，氨基酸组分和抑菌活性，并对考察其耐低温和耐酸碱稳定性。 6 第二章大孔吸附树脂对家蝇抗菌肽的吸附与富集 第二章大孔吸附树脂对家蝇抗菌肽的吸附与富集 2 1 前言 自从b o m a n 等在1 9 8 1 年首次报道从惜古比天蚕蛹中成功地分离到两种抗菌肽a 和 b 4 i 以来，抗菌肽的结构，功能，性质和作用机制就成为科学家们研究的热点，目前已 有多种抗菌肽类似物进入临床或临床前的试验阶段【3 3 1 。家蝇与病原微生物有着密切接触 的习性，对病原微生物应有很强的抵抗力，因而家蝇由于其生长条件和由此决定的生理 特征的特殊性1 7 0 1 以及易于饲养等特点，成为研究抗菌肽的常用材料。目前，关于家蝇抗 菌肽的报道中所使用的材料大多为通过对三龄家蝇幼虫进行穿刺，用各种菌液进行感染 和诱导后提取的血淋巴等体液，而以天然粗家蝇蛋白为材料的报道尚未见到。 有报道的家蝇抗菌肽的分离纯化主要以凝胶层析，离子交换层析，制备电泳， r p i