（生物医学工程专业论文）rnai干扰技术在生物节律相关基因hper1和clock研究中的应用.pdf

四川大学硕t 学位论文 r n a i 干扰技术在生物节律基因h p e r l 和c l o c k 研究 中的应用 生物医学工程专业 研究生：叶珊指导教师：王正荣教授 r n a 干扰( r n a i ) 是指内源性或外源性双链r n a 通过一定的作用机制导致 细胞内特定基因在m r n a 水平上的表达显著降低。i 悄a 干扰技术是过去十年 里基因组学方面最引人注目的发现之一，该技术是应用2 i n t 的短双链r n a s 作 为一个短干扰r n a s ( s i r n a s ) 当它介入到哺乳动物细胞内时有效的抑制r n a 的表达。r n a 干扰技术因其具有高度特异性和显著的干扰效果，而在研究和应 用领域受到高度重视。 时间生物学的研究表明，人类的很多生命活动具有一定的节律。在各种不 同周期的节律当中，近日节律是最引人注意，被研究最多的。c i r c a d i a n ，是一 个最近几十年才出现的词。它被用来描述周期大概为2 4 小时的节律。人类有很 多节律活动的周期接近2 4 小时。 近日节律( c i r c a d i a nr h y t h m s ) 由生物钟( 近日节律钟) 系统产生和调控。 该系统在调节生物的生理功能，并使之与外界环境相适应方面起着重要的作用。 目前研究证明p e r l 是近日节律分子振荡中的关键性蛋白，主要通过蛋白与蛋 白作用的方式发挥功能。但p e r l 通过何种途径发挥作用目前还不十分清楚。 因此本文构建针对h p e r l 的高效r n a 干扰质粒，为进一步研究h p e r l 的功能构 建平台，并在此基础上对h p e r l 的功能进行初步研究。结果r t - p c r 鉴定显示 p t e r h p e r l i i 干扰质粒干扰效率最高，h p e r l 表达量降低8 4 9 。w e s t e r nb l o t 四川大学硕1 ：学位论文 显示h p e r l 表达受抑制后。p - - p 4 4 4 2m a p k 水平升高。 在哺乳动物，节律基因p e r l ，p e r 2 ，b m a l l ，c l o c k 和c r y l 已经在精子生成过 程中被发现但却不是以近日节律的形式存在。值得注意的是c l o c k 基因的表达 仅仅在圆形精子的顶体被发现，这一发现推测c l o c k 基因在雄性动物的生殖能 力中可能起到了潜在的作用。因此在本研究中我们利用r n a i 技术干扰c l o c k 在 小鼠睾丸中的表达，结果w e s t e m b l o t 显示在注射c l o c k 干扰质粒后3 天和6 天 c l o c k 表达量分别下降5 5 和4 8 ，为进一步探讨c l o c k 对小鼠生殖功能的影 响构建平台，并在此基础上对c l o c k 对小鼠生殖功能影响进行初步研究， 关键词： r n a 干扰：s i r n a ；h p e r l 基因：p - p 4 4 4 2m a p k ；c l o c k 基因 2 四川大学硕二学位论文 t h e a p p l i c a t i o no f r n a io nt h es t u d yo f b i o l o g i c r h y t h m b i o e n g i n e e r i n g g r a d u a t e ：y as h a n s u p e r vi $ o r ：p r o f e s s o r 勘n gz h e n g r o n g r n a i n t e r f e r e n c e ( r n a i ) i san e wm o d a l i t yw h i c h c a r le l i c i td o w n r e g u l m i o n o fg e n ee x p r e s s i o n r n a ii sac o n s e r v e ds y s t e mt h r o u g hw h i c hd o u b l es t r a n d e d r n a ( d s r n a ) g u i d e ss e q u e n c es p e c i f i cm r n ad e g r a d a t i o n t h er n a ia p p a r a t u s m a yb ea r t i f i c i a l l yt r i g g e r e db yd e l i v e r y o fn a k e ds i r n am o l e c u l e so rb y p l a s m i d b a s e de x p r e s s i o no fd s r n a r n ai n t e r f e r e n c ei so n eo ft h em o s te x c i t i n g d i s c o v e r i e so ft h ep a s td e c a d ei nf u n c t i o n a lg e n o m i c s d u p l e x e so f2 1n tr n a s ， k n o w na ss h o r ti n t e r f e r i n gr n a s ( s i r n a s ) ，e f f i c i e n t l yi n h i b i tg e n ee x p r e s s i o nb y r n ai n t e r f e r e n c ew h e ni n t r o d u c e di n t om a m m a l i a nc e l l s i tw a sf o u n dt h a t t r a n s f e c t i o no fm a m m a l i a nc e l l sw i t hs y n t h e t i cs i r n ar e s u l t e di nh i g h l y , s e q u e n c e s p e c i f i cr n a i n t e r f e r e n c e f r o mt h ef m do u t so fc h r o n o b i o l o g y , p e o p l ek n o wh u m a nb e i n g sa l s oh a v e t i m i n gc h a n g el i f ea c t i v i t i e s o fa l lt h et i m i n gc h a n g ea c t i v i t i e s ，y e a rc h a n g e ，s e a s o n c h a n g e ，m o n t hc h a n g e ，d a yc h a n g e ，t h eo n ew h i c hh a sa t t r a c tm o s ta t t e n t i o ni sd a y c h a n g e c i r c a d i a n , an e wc r e a t e dw o r di su s e dt od e s c r i b et h ep a t t e mh a v e2 4h o u r s p e r i o d t h ep h y s i o l o g ya n db e h a v i o ro fa l ll i v i n go r g a n i s m sf r o mb a c t e r i at oh u m a n s a l ec o n t r o l l e db yt h ec i r c a d i a nr h y t h m sd r i v e nb yi n t e r n a lo s c i l l a t o r s ，t h ec i r c a d i a n 3 四川大学硕j ：学位论文 c l o c k i ti sc o m p o s e do ft h ep o s i t i v ea n dn e g t i v el o o p st h a tc o n s i s to fc o o c kg e n e s a n dp r o t e i n s t h ep e r i o d lg e n ew a sf o u n d 豳ak e yg e n eo ft h ec i r c a d i a nc l o c ka n d p l a y e di t s f u n c t i o nt h r o u g hp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n b u ti ti ss t i l ld i f f i c u l tt o d e s c r i b et h em e c h a n i s mo ft h ep e r li nc i r c a d i a nr h y t h m s r n ai n t e r f e r e n c e t e c h n o l o g yi se m e r g i n g 舾av e r yp o t e n tt o o lt oo b t a i nac e l l u l a rk n o c k d o w no fa d e s i r e dg e n e i nt h i sw o r kw eu s e dt h ep t e r - h p e r li n t e r f e r e n c ep l a s m i dw a s c o n s t r u c t e d v e c t o r - b a s e dr n ai n t e r f e r e n c et oi n h i b i th p e r le x p r e s s i o ni ns h - s y 5 y c e l ll i n e si nv i t r oa n di n v e s t i g a t e di t s i n t e r f e r e n c i n ge f f e c t s ，w h i c he s t a b l i s h e dt h e b a s ef o rs t u d y i n gt h ef u n c t i o no fh p e r i r t - p c rs h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f h p e r li ns h s y 5 yc e l l st r a n s f e r r e dp t e r h p e r l i iw a s d e c r e a s e db y8 4 9 w h i c h d e m o n s t r a t e d t h a tt h e r ew a s h i i g h i n t e r f e r e n c e e f f i c i e n c y o f p t e r - h p e r l i ii n t e r f e r e n c ep l a s m i d w e s t e r nb l o tt e c h n o l o g ys h o w e dt h a th p e r l i n s h s y 5 yc e l l sw a sd e c r e a s e d w e s t e r nb l o tt e c h n o l o g ys h o w e dt h a tp - - p 4 4 4 2 m a p ki ns h s y 5 yc e l l sw a si n c r e a s e d i nm a m m a l s ，c i r c a d i a ng e n e sp e r l ，p e r 2 , b m a l l ，c l o c ka n dc r y lh a v eb e e n d e t e c t e dt ob ee x p r e s s e dd u r i n gt h es p e r m a t o g e n e s i sp r o c e s s ，b u ti nas t a g e s p e c i f i c a n dc i r c a d i a n i n d e p e n d e n tm a n n e r m o s tn o t a b l y ，t h ec l o c kg e n ee x p r e s s i o nh a s e x c l u s i v e l yb e e nd e t e c t e di n t h ea e r o s o m eo fr o u n ds p e r m a t i d s t h e s ef m d i n g s s u g g e s tap o t e n t i a lr o l eo f t h ec l o c kg e n ei nm a l er e p r o d u c t i v i t y t h u s ，i nt h i ss t u d y w ed e c i d e dt od e t e r m i n et h e s i g n i f i c a n c e ，i fa n y ，o ft h er o u n ds p e r m a t i d s p e c i f i c c l o c kg e n ee x p r e s s i o nu s i n gad n a b a s e dr n a is t r a t e g y ，w h i c hh a sb e e np r o v e nt o b ev e r ye f f e c t i v ei ns i l e n c i n gi nv i v og e n ee x p r e s s i o nd u r i n gs p e r m a t o g e n e s i s w e h a r v e s t e dt h em o u s et e s t e sa td i f f e r e n td a y sa f t e r p l a s m i dd n ai n j e c t i o na n d p r e p a r e dt i s s u eh o m o g e n a t e sf o rw e s t e r nb l o ta n a l y s i so fm c l o c kg e n ee x p r e s s i o n c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l s ，m c l o c kg e n ee x p r e s s i o nw a sd o w n r e g u l a t e db y5 5 a t d a y3a n d 4 8 a t d a y6 k e y w o r d s ：r n a i ；s i r n a ；h p e r l ；h p e r l ；p - - p 4 4 4 2m a p k ；c l o c k 4 网川大学颐上学位论文 第一章前言 k n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，简称r n a i ) 是指内源性或外源性双链r n a 通过一定的作用机制导致细胞内特定基因在m r n a 水平上的表达显著降低的现 象。r n a i 能高效特异的阻断基因的表达，在小鼠和人的体外培养细胞中r n a i 技术阻断特定基因表达的效率可高达9 0 以上，能够实现细胞水平的基因敲除。 随着r n a i 研究的迸一步深入，对r n a i 机制的进一步理解，以及对应用方面 的限制因素的解决，r n a i 将是基因功能研究和疾病基因治疗的革命性工具。 1 9 9 0 年j o r g e n s e nr 在对矮牵牛花进行的研究中发现协同抑制现象，导入 的基因和其相似的内源基因同时都被抑制【l j 。1 9 9 5 年，康乃尔大学的s ug u o 在 利用反义r n a 技术特异性地抑制秀丽新小杆线虫( c e l e g a n s ) 中的p a r - 1 基因 的表达时，意外发现对照实验中给线虫注射正义r n a ( s e n s er n a ) 也能抑制 p a r - 1 基因的表达。该研究小组一直未能给出合理解释。直到1 9 9 8 年2 月， a n d r e wf i r e 和c r a i gm e l l o 才首次揭开这个悬疑：s ug u o 遇到的正义r n a 抑制 基因表达的现象，是由于体外转录所得r n a 中污染了微量双链r n a 而引起i “。 当他们将体外转录得到的单链r n a 纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微 弱，而经过纯化的双链r n a 却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。 该小组将这一现象称为r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，简称r n a i ) 。 随后的研究中发现，r n a i 现象广泛存在于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及 植物等生物体内，这些生物体利用r n a i 来抵御病毒的感染，阻断转座子的作 用。k n a i 能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，r n a i 能达到基 因敲除的效果。在小鼠和人的体外培养细胞中利用r n a i 技术也成功阻断了基 因的表达，实现了细胞水平的基因敲除。近几年来r n a i 的研究取得了很大进 展，它被s e i e n e e ) ) 杂志评为2 0 0 1 年的十大科学成就之一。2 0 0 2 年r n a i 的 研究又有了新的突破，发现它在基因表达调控中发挥重要作用，它也名列2 0 0 2 年( s c i e n c e ) ) 杂志评的十大科学成就之首。 目前r n a i 的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。 生物体内的双链r n a 可来自于r n a 病毒感染，转座子的转录产物，外源导入 四川大学硕l ：学位论文 的基因。这些来源的双链r n a 诱发了细胞内的r n a i 机制，结果是病毒被清除， 转座子和外源导入基因表达被阻断。同时与其同源的细胞基因组中的基因表达 也被阻断。 随着人类基因组计划的完成，生命科学研究的重心移向了功能基因组及蛋 白组学的研究。目前研究蛋白质功能的方法通常有4 种包括：反义核酸技术、 核酶技术、基因敲除( g e n ek n o c k o u t ) 和r n a 干扰。反义核酸技术是用插入 反义核酸来选择性抑制基因表达，在试管实验中显示出了极好的效果，但在实 验动物实验时由于核酸在体内被迅速分解，不能达到长期稳定的效果。核酶 ( r i b o z y m e ) 是8 0 年代初期发现的具有催化功能的r n a 分子，抑制基因表达 的特异性很高，但导入细胞的基因稳定性差且合成核酶的所需时间长费用高。 基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源d n a 与靶细胞 d n a 序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把基因赦除成 功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，同源重组的筛选和检测就成 了基因敲除技术所要解决的关键问题的且费用极其昂贵，周期也长。而r n a i ， 因其在n m o l 浓度的状态下就能显示出显著的作用效果，在体外细胞研究中几乎 能达到基因敲除的效果，且方法简单，费用较少，而在哺乳动物细胞基因功能 研究方面有极大的应用前景。 从低等生物到高等动物，几乎所有生物体都存在调控机体生命活动周期约 2 4 d , 时为周期的近日节律( c i r c a d i a nr h y t h m s ) 【3 - 6 1 。它是生物对可预测的环境变 化的一种综合性适应，是生物在自然选择和长期进化过程中保存下来的适应性 表象。近日钟系统是近日节律得以显现的结构基础和调节机制。近日钟调控表 达形成自激振荡，同时根据外界环境周期性变化的信号调控，经相关的输出途 径，从而使生物体的新陈代谢，细胞和组织器官的生理功能，以及行为等生命 活动随昼夜循环而发生以大约2 4 d , 时为周期的规律性变化 7 q o l ，并与环境保持一 致，使生物体能很好地适应外界环境的节律改变，如昼夜交替、季节变化及飞机 时差反应等。在近日钟系统的调控下，哺乳动物的血压、体温、激素水平和内 分泌功能、血液中免疫细胞的数量、睡眠觉醒周期以及药物耐受性和药物疗效 等均表现为近日节律【7 】。近日钟系统的失调会引起一系列的疾病发生，包括与 睡眠有关的a s p s 、d s p s 、n o n 2 4 一hs l e e p - w a k es y n d r o m e ，与情绪有关的季节 性情感障碍，肿瘤等1 。 6 四j i i 大学硕士学位论文 对近日节律的研究已有5 0 多年的历史，随着1 9 9 7 年克隆出第一个钟基因， 该方面的研究才取得突破性进展。基因是近日节律产生的物质基础，这己在多 个物种上得到了证实。( 近日节律是由一组近日钟基因及其基因产物相互作用构 成的一个闭环震荡系统产生的。不同种属动物的近日节律系统有很大差异，但 总体来说由三个基本部分组成：接受和传递外界环境刺激至振荡器的输入途径， 启动产生节律的振荡器，节律的输出部分1 1 2 j 。 振荡器是维持生物节律的关键组分，它是指生物体内的关键基因表达随昼 夜节律而有规律的振荡，导致蛋白水平也随昼夜更替有规律地振荡，通过对下 游基因( 钟控基因) 表达的调控输出其影响，调节众多生命过程。对近日钟 ( c i r c a d i a nc l o c k ) 的分子机制的研究主要集中在振荡器的研究上。自1 9 8 4 年 r o c k e f e l l e r 大学的遗传学家m y o u n g 等从果蝇中发现了与近日节律有关的基因 p e r i o d 后，基因( c i r c a d i a nc l o c kg e n e ) 的相关研究逐渐引起人们的重视。大量 的近日钟基因( 如c l o c k ，t i m ，b m a l l ，c r y l 2 ，f e v 等) 。以及钟控基因( c c g ) ( 如 d b p , p k 2 , e 4 b p 4 , v i p , t e f 等) 被发现，人们对近日节律钟振荡器部分有了一个较 为清楚的认识【1 3 。人类的这些基因称为h p e r i o d ，h c l o c k ，h t i m e l e s s 等，而小鼠 的这些基因称为m p e r i o d ，m c l o c k ，m t i m e l e s s 等。 近年来，国外学者研究发现哺乳动物近日节律中枢位于下丘脑前部的视交 叉上核( s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ，s c n ) 1 4 , 1 5 1 。破坏大鼠的s c n ，使大鼠的运动 及其它近日节律消失【l 8 j ；在s c n 受损的大鼠体内移植s c n 细胞，能够使大鼠 可重新获得近日节律 1 7 - 1 9 1 ，且呈现供体鼠的节律特征【1 7 1 。这些结果充分i 正b ) j s c n 为哺乳动物的近日节律中枢。通过对s c n 的研究，大量的钟基因被发现( j f l p e r l 3 ， c l o c k , c r y l 一2 ，b m a l l ，t i m ，i e v 等) 以及钟控基因( c c g ) ( 如p k 2 ，e 4 b p 4 ，d b p ，v f p ，t e f 等) ，人们对近日节律钟控系统才有了一个较为清楚的认识【2 0 - 2 2 。钟基因的节律 性表达是通过细胞内转录一翻译反馈环路来实现的。目前研究认为，s c n 部位由 两条正向调节和三条负向调节途径共同构成闭环振荡环路。其中正向调节途径 l ：转录因子c l o c k 和b m a l l 构成异二聚体，该异二聚体可与目的基因上游启 动序列中的e ，b o x 结合，启动三种p e r ( p e r l 、p e r 2 、p e r 3 ) 和两种c r y ( c r y i 、 c r y 2 ) 蛋白以及t i m 蛋白的表达1 2 3 - 2 7 ；正向调节途径2 ：p e r 2 蛋白反馈促进 c l o c k 和b m a l i 异二聚体形成。负向调节途径1 ：c r y 蛋白可通过抑制p 3 0 0 乙 酰化酶1 来抑制c l o c k 和b m a l l 异二聚体的转录活性 2 3 , 2 8 , 2 9 1 ；负向调节途径2 ： 7 四川大学颂j 二学位论文 p e r l 和c r y 蛋白形成复合物反馈抑制c l o c k 与t i mp o 】；负向调节途径3 ：c l o c k 和b m a l l 异二聚体的激活产物r e v - e r b a 可反馈抑制c l o c k , b m a l l ，c r y l 基因的 表达【2 3 ，3 卜3 3 1 。另外，近日时钟节律的产生还与钟蛋白的磷酸化，降解，转移入 核有关。其中参与钟蛋白磷酸化的关键性蛋白是酪蛋白激酶1 6 和( c k l 8 、) 1 3 4 - 3 7 。这些蛋白的激活与反馈抑制共同构成了近日节律钟控系统。但事实上， 近日节律时钟节律的产生机制远没有这样简单，一些参与其中的新蛋白将被不 断发现。 与近日节律中枢s c n 相对应的外周组织也存在近日节律钟系统【3 引，它们 有其自身的节律，其时相较s c n 慢3 - 9 小时。s c n 的近日节律钟系统通过神经 和内分泌通路对其进行调控，使其节律与s c n 的节律同步i 4 4 4 6 1 ，从而使生物体 的多种生理生化过程保持协调一致 4 5 , 4 7 1 。外周组织的近日节律钟系统，其组成 与s c n 钟系统有相似之处，但也有很大的不同。利用基因芯片技术比较s c n 与外周组织的与近日节律有关的基因种类，发现在心脏与肝脏，s c n 与肝脏近 日节律表达的基因中，两种组织均表达的只占其总数的1 0 0 4 9 4 9 。其中p e r l ，p e r 2 , p e r 3 ，b m a l l ，c l o c k 基因在多数组织中均有表达【4 8 ，5 3 1 。说明这些基因在近日节律 钟系统中占有重要地位。钟基因究竟是怎样相互作用而产生近日节律的? 全身 各组织的节律又是如何协调一致，而构成整个生物体的近日节律的? 目前研究 发现p e r l 主要通过蛋白问相互作用发挥其生理功能，但其在形成近日节律和维 持正常生理状态上的作用机制还不清楚，还有很多问题待进一步研究。 近日节律基因在昆虫生殖组织存在着明显的节律性，并控制精子节律性的 释放。研究发现舞毒蛾蛹化后从l d l 6 ：8 转移到d d 时，精子仍然节律性地从睾 丸释放到输精管【5 4 1 。雄性黑腹果蝇a r 和t i m 突变体( n ，、t i m o ) 与野生型比 较，精子释放量减少，其生殖力下降约4 0 【”釉】。近来研究表明，在哺乳动物 生物节律及节律基因与生殖功能存在一定的关系。在研究外周组织近日节律功 能方面，鼠齿类动物的睾丸是一个很好的模型，它包含有功能明确的生殖细胞、 s e r t o l i 细胞( 支持细胞) 和l e y d i g 细胞( 生精细胞) 。有几个研究小组都对睾 丸生物钟基因的表达进行了研究。小鼠的近日节律基因在子宫、输卵管、睾丸 和植入前胚胎都有表达【5 7 j 刖。事实上小鼠近日节律基因的突变或敲出可导致其 生殖能力下降 6 9 , 6 0 , 6 1 1 。k e n n a w a y 等1 6 2 1 2 0 0 4 建立了b m a l l 敲出的雄性小鼠模型， 四川大学硕j j 学位论文 初步发现其输精管重量减少，虽然睾丸重量正常但精子异常发生率很高，并且 b m a l l 敲出的雄性小鼠纯合子很少能与正常雌性小鼠成功受精( 约占7 ) 。 c l o c k b m a l l 形成的异二聚体，在近日节律分子振荡中发挥着重要作用。 对c l o c k , d 1 9 突变的雄性小鼠研究发现，突变小鼠睾丸重量正常、精子计数、精 子活力等没有明显改变，但突变小鼠引起雌鼠的胎仔数减少 6 3 1 近来研究发现， 小鼠生精过程中园形精子期的顶体具有明显的c l o c k 蛋白的表达。对小鼠睾 丸近日节律基因的研究发现，近日节律基因c l o c k 、p e r l 、尸e 厂2 、b m a i l 和c r y l 限制性表达在精子生成过程中不同的细胞类型，c l o c k 突变的小鼠r r 表达水 平并未降低，c l o c k b m a l l 异二聚体可能不参与驱动转录的过程中，在睾丸 c l o c k 作为结构蛋白表达在园形精子细胞核外的顶体。这种分离的表达模式与 s c n 中细胞核内的转录、翻译反馈环截然不同 6 4 , 6 5 1 。顶体是膜结合的帽状结构， 它覆盖于精子核表面，其功能是在受精过程中释放透明质酸酶、顶体蛋白酶等 各种酶类，使精子穿透卵细胞的透明带促使精、卵结合而受精。可以说顶体反 应是受精机制的关键之所在。c l o c k 作为表达在园形精子顶体的结构蛋白，有 可能能参与了顶体酶的部分功能或顶体的形成和发育，从而精子的受精能力， 进而影响雄性小鼠的生殖能力。但近日节律基因c l o c k 怎样影响顶体发育和 顶体的功能，需要作进一步深入的研究。 因此本文旨在构建针对h p e r l 的高效r n a 干扰质粒，为进一步研究h p e r l 的功能构建平台，并在此基础上对h p e r l 的功能进行初步研究。利用r n a 干扰 ( r n a i ) 技术，干扰c l o c k 在小鼠睾丸中的表达，为进一步探讨c l o c k 对小鼠生 殖功能的影响构建平台，并在此基础上对c l o c k 对小鼠生殖功能影响进行初步研 究。 9 四川大学硕t 学位论文 参考文献 j o r g e n s e n r a l t e r e d g e n ee x p r e s s i o n i n p l a n t s d u e h o m o l o g o u sg e n e s j t r e n d sb i o t e c h n o l1 9 9 0 ；8 ：3 4 0 3 4 4 2 f i r ea ，x us ，m e l l oc c e ta 1 p o t e n ta n ds p e c i f i cg e n e t i ci n t e r f e r e n c eb yd o u b l e s l 】 a n d e d r n a i n c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s 【j 州a t u r e l 9 9 8 ；3 9 1 ( 6 6 6 9 ) ：8 0 6 8 1 1 3 d u n l a pj c ，l o r o sj j ，m e f f o wm ，e ta 1 t h eg e n e t i ca n dm o l e c u l a rd i s s e c t i o no fap r o t o t y p i c c i r c a d i a ns y s t e m p r o gb r a i nr e s ，1 9 9 6 ，l l l ：1 1 - 2 7 ， 4 h a l lj c t r i p p i n ga l o n gt h et r a i lt ot h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fb i o l o g i c a lc l o c k s t r e n d s n e u r o s e i ，1 9 9 5 ，1 8 ( 5 ) ：2 3 0 - - 4 0 - 5 杜玉珍生物昼夜节律分子机制的研究进展国外遗传学分册，2 0 0 2 ，2 5 ( 3 ) ：1 8 2 1 8 4 6 赵文会昼夜节律时钟研究的最新进展生命的化学，1 9 9 8 ，18 ( 2 ) ：1 - 3 7 a l b r e c h tu ，e i c h e l egt h em a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c k c t t r ro p i ng e n e td e v ，2 0 0 3 ，1 3 ( 3 ) ： 2 7 1 - 2 7 7 8 r i c h t e rh gt o n e s - f a r f a nc ，r o j a s - g a r c i ap p ，c ta 1 t h ec i r c a d i a nt i m i n gs y s t e m ：m a k i n g s e n s eo f d a y n i g l l tg e n ee x p r e s s i o n b i o lr e s ，2 0 0 4 ，3 7 ( 1 ) ：l l - 2 8 9 b e l lp d u n d e r s t a n d i n gc i r c a d i a nr h y t h m i c i t yi nn e u r i s p o r ac m s s a ：f r o mb e h a v i o rt og e n e a n db a c ka g a i n f u n gg e n e tb i 0 1 ，2 0 0 0 ，2 9 ( 1 ) ：1 - 1 8 1 0 韦芳哺乳动物近日节律相关基因的研究进展癌症，2 0 0 3 ，2 2 ( 4 ) ：4 4 5 “8 1 1 c e r m a k i a nn b o i v i nd b am o l e c u l a rp e r s p e c t i v eo fh u m a nc i r c a d i a nr h y t h md i s o r d e r s b r a i nr e s e a r c hr e v i e w s ，2 0 0 3 ，4 2 ：2 0 4 _ 2 2 0 1 2 徐军童建生物钟基因研究进展生物化学与生物物理进展2 0 0 1 ，2 8 ：1 引1 8 3 。 1 3 m w y o u n g ，s a k a y , t i m ez o n e s ：ac o m p a r a t i v eg e n e t i c so fc i r c a d i a nc l o c k s ，n a t r e v g e n e t 2 0 0 1 ；2 ：7 0 2 - 7 1 5 j c d u n l a p ，m o l e c u l a rb a s e sf o rc i r c a d i a nc l o c k s ，c e l l 1 9 9 9 ；9 6 ：2 7 1 - 2 9 0 1 4 k l e i n r ym o o r e , s m r e p p e r t , s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ：t h em i n d sc l o c k , o x f o r d u n i v e r s i t yp r e s s ，n e wy o r k , 1 9 9 1 y m o o r e ，r s i l v e r , s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u so r g a n i z a t i o n , c h r o n o b i 0 1 i n t 1 5 ( 1 9 9 8 ) 4 7 5 4 8 7 1 0 四川大学硕l 学位论文 16 e f i l i p s k i ，v m k i n g ，x l i ，t gg r a n d a , m c m o r m o n t , x l i u ，b c a u s t r a lm h h a s t i n g s ，fl e v i ，h o s tc i r c a d i a nc l o c ka sac o n t r o lp o i n ti nt u m o rp r o g r e s s i o n ，j n a t l c a n c e rl o s t 9 4r 2 0 0 2 ) 6 9 0 - 6 9 7 17 m rr a l p h ，r gf o s t e r , f c d a v i s ，m m e n a k e r t r a n s p l a n t e ds u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s d e t e r m i n e sc i r c a d i a np e r i o d s c i e n e e2 4 7 ( 1 9 9 0 ) 9 7 5 9 7 8 18 r r e f i n e t t i ，c m k a u f m a n , m ，m e n a k e r , c o m p l e t es u p r a c h - i a s m a t i cl e s i o n se l i m i n a t e c i r c a d i a nr h y t h m i c i t yo fb o d yt e m p e r a t u r ea n dl o c o m o t o ra c t i v i t yi ng o l d e nh a m s t e r s ，j c o m p p h y s i 0 1 【a 】1 7 5 ( 1 9 9 4 ) 2 2 3 - 2 3 2 1 9 r s i l v e r , j l e s a u t e r ，p a t r c s c o , m n l e h m a n , ad i f f u s i b l ec o u p l i n gs i g n a lf r o mt h e t r a n s p l a n t e ds u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u sc o n t r o l l i n gc i r c a d i a nl o c o m o t o rr h y t h m s ，n a t u r e3 8 2 ( 1 9 9 6 ) 8 l o _ 8 1 3 2 0 j c d u n l a p ，m o l e c u l a rb a s e sf o rc i r c a d i a nc l o c k s ，c e l l9 60 9 9 9 ) 2 7 1 - 2 9 0 2 1 s m r e p p e r t , d r w e a v e r ，m o l e c u l a ra n a l y s i so fm a m m a l i a nc i r c a d i a nr h y t h m s , a n n u r e v , p h y s i 0 1 6 3 佗0 0 1 ) 6 4 7 - 6 7 6 2 2 m wy o u n g s a k a y , t i m ez o n e s ：ac o m p a r a t i v eg e n e t i c so fc i r c a d i a nc l o c k s , n a t r e v g e n e t 2 ( 2 0 0 i 、7 0 2 - 7 1 5 2 3 j p - e t c h e g a r a y , c l e e ，e a w a d e ，s m r e p p e r t , r h y t h m i ch i s t o n ea c , e t y l a t i o nu n d e r l i e s t r a n s c r i p t i o n i n t h e m a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c k , n a t u r e 4 2 1 ( 2 0 0 3 ) 1 7 7 - 1 8 2 2 4 n g e k a k i s ，d s t a k n i s ，h b ，n g u y e n ，f c d a v i s ，l d w i l s b a c h e r , d p k i n g , j s t a k a h a s h i ，c j w e i t z , r o l eo ft h ec l o c kp r o t e i ni nt h em a m m a l i a nc i r c a d i a nm e c h a n i s m , s c i e n c e2 8 0 ( 1 9 9 8 ) 1 5 社1 5 6 9 2 5 j b h o g e n e s e h ，y z g u ，s j a i n ，c a b r a d f i e l d ，t h eb a s i c - h