（生物医学工程专业论文）基于生物芯片的dna测序以及dna甲基化检测方法的研究.pdf

删 y 17 6 2 型百。 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 出、6 、9 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：扯导师签名：( 蜘同期： i t | 7 中文摘要 中文摘要 论文题目：基于生物芯片的d n a 测序以及d n a 甲基化检测方法的研究 作者姓名：高力 导师姓名：陆祖宏教授 学校名称：东南大学 生物芯片是一种高通量的工具，可以一次性对大量序列进行检测和基因分析，能解 决传统的核酸印迹杂交操作复杂、成本高、效率低等缺点。 人类基因组计划推动了d n a 测序技术的发展，合成测序是其中一种有发展潜力和应 用前景的测序方法。基因芯片与合成测序相结合，可以降低测序成本，并实现快速以及 高通量的测序。目前新一代测序技术还主要存在两方面的问题：( 1 ) 基因组测序模板制 备是以p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 为基础，这种模板制备方法存在扩增的偏性；( 2 ) 测序中核酸的读出采用荧光标记核苷酸的延伸，在每步延伸后需要切除荧光以避免荧光 的累积。但切除步骤较为复杂，成本高、耗时长，并直接影响测序长度。针对上述两个 问题，本研究提出两种解决方案：( 1 ) 以滚环扩增为基础制备模板；( 2 ) 用淬灭剂直接 对测序中的荧光进行淬灭。 d n a 甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，d n a 的异常甲基化是导致癌症发生的 重要原因。d n a 甲基化的检测方法是d n a 甲基化研究的基础，缺少高通量，高灵敏度 的检测技术是阻碍在基因组水平上研究d n a 甲基化功能的关键原因。本研究基于亚硫酸 氢盐测序方法，提出了2 种在芯片上进行滚环扩增制备分子克隆，通过芯片杂交无p c r 扩增偏性高灵敏度检测d n a 甲基化的方法。 1 以d a b c y l 为荧光淬灭剂的d n a 测序研究 荧光淬灭剂d a b c y l 能够吸收荧光素等分子的激发能，通过能量转移实现荧光淬 灭。本论文提出了一种通过d a b c y l 淬灭核苷酸上荧光的合成测序方法，并对荧光淬灭 的条件进行了优化。研究发现，对醛基修饰的玻片用o 1m o l l 的d a b c y l 在4 0 0 c 时进行5 分钟处理，对于4 种常用于核酸标记的荧光( f i t c 、c y3 、c y5 和1 a m a r ) 的淬灭效率都 在9 9 以上；荧光烀灭后再延伸效率在9 0 以上。荧光光谱研究发现在上述4 种荧光基团 殴o。0-嗨gj蔑蛾， 东南大学博士学位论文 中d a b c y l 对于c y5 的淬灭效率最低。实验表明，采用以忸c y l 为荧光婶灭剂的测序 方法可测出1 7 个碱基。 2 以过氧化氢为淬灭剂对基于单引物滚环扩增d n a 测序模板的测序研究 本研究提出了一种以滚环扩增( r o l l i n gc i r c l e a m p l i 删i o n ，r c a ) 为基础的测序模 板制备方法。通过比较丙烯酰胺修饰的玻片、链亲和素修饰的玻片以及醛基修饰的玻片， 结果表明丙烯酰胺修饰的玻片对滚环扩增产物有较高的固定效率，在玻片上固定滚环扩 增产物能够进行在片延伸。过氧化氢作为一种较强的氧化剂，能破坏荧光素的分子结构， 从而淬灭荧光。应用过氧化氢作为荧光淬灭剂淬灭测序中的核酸分子标记的荧光。用 3 0 h 2 0 2 在3 0 0 c 处理5 分钟，对于c y5 的淬灭效率为6 7 左右。过氧化氢处理后核酸的 再延伸效率达到8 0 。荧光光谱研究发现d a b c y l 对4 种荧光( f i t c 、c y3 、c y5 和 影心l a r ) 基团的淬灭效率从低到高的次序为c y3 毋抓必r c y5 f 1 t c 。实验表明，对 于滚环扩增制备的测序模板采用过氧化氢作为淬灭剂能够测出2 7 个碱基。 3 以硫酸铜为淬灭剂对基于超分支滚环扩增制备的d n a 测序模板的测序研究 为进一步提高滚环扩增产物的模板量，提出了在芯片上以超分支滚环扩增 ( h y p e r - b 啪c h e dr o l l i n gc i r c l ea m p l i c a t i o n ，h r c a ) 为基础制备d n a 测序模板的方法。 用丙烯酰胺修饰的玻片固定双引物扩增的滚环产物。实验表明，双引物滚环扩增比单引 物滚环扩增的产物多，并且h r c a 产物制备的测序模板能够进行在片延伸。应用硫酸铜 作为荧光淬灭剂淬灭测序中的荧光，并对淬灭反应的温度、浓度、时间进行优化。研究 表明，用o 0 2m o l 1c u s 0 4 在3 0 。c 时对丙烯酰胺修饰的玻片进行5 分钟的处理，对c y5 的 淬灭效率为9 7 ，核酸的再延伸效率为9 5 。荧光光谱研究发现硫酸铜对用于核苷酸标 记的4 种荧光基团( f i t c 、c y3 、c y5 和t a m a r ) 淬灭效率从低到高的次序依次为 t a m a r c y3 f i t c c y5 。实验表明，对于超分支滚环扩增制备的d n a 测序模板采用 硫酸铜为淬灭剂能够读出4 2 个碱基。 4 基于磁珠的超支滚环扩增的甲基化检测方法 本章发展了基于磁珠的超支滚环扩增的甲基化检测方法，采用超支滚环扩增及固相 核酸扩增技术将均匀分布在固相载体中的不同类型的单个单链模板环原位高效地扩增 出来，并牢固地固定在原来的位置，形成一种高密度的核酸分子克隆微阵列。通过变性 电泳，将微阵列芯片上含有多个相同的核酸片段中未固定的核酸链去除，成功地制备出 i i 中文摘要 单条链分子克隆芯片。把阳性克隆和阴性克隆模板的量分别按照0 ：1 ，1 ：o ，1 ：1 的比例 混合，进行在片扩增，用探针杂交。阳性模板环和阴性模板环对应的红色和绿色的点的 比例分别接近于o ：1 ，l ：0 ，1 ：1 ，这些结果表明该方法能够检测基因甲基化。 5 基于微乳液滚环扩增的甲基化检测方法 在b e _ 气m i n g ( b e a d s ，e m u l s i o n ，锄p l i f i c a t i o n ，觚dm a g i l e t i c ) 技术基础上发展了一种 d n a 甲基化检测和定量分析方法。在乳液中进行超支滚环扩增，每个乳液中至多含有 一个磁珠和一个模板。阳性模板环和阴性模板环的比例分别为0 ：1 ，1 ：2 ， 1 ：1 ，2 ：1 ， l ：0 ，对杂交扫描后的图像上的点进行统计。阳性和阴性模板环扩增产物对应的红点和绿 点的个数比分别为： 0 ：1 4 9 ，6 7 ：1 3 1 ，9 1 ：9 3 ，1 2 7 ：6 5 ， 1 4 1 ：o ，与模板中阴性模板与 阳性模板的比例是一致，而且至少可以检测到阳性模板环与阴性模板环1 ：1 0 5 的滚环扩 增产物的甲基化状态，该方法成功检测了1 0 例胃癌组织及相应的癌旁组织的p 1 6 基因 启动子区域的甲基化。结果证明该方法能够高灵敏度地检测甲基化。 关键词：生物芯片，滚环扩增，d n a 测序，荧光淬灭，d n a 甲基化 l l i a b s t r a c t a b s t r a c t t i t l e ：d n as e q u e n c i n g 狮dd e t e 嘶o n0 fd n a m e t h y l a t i o nm e t h o d sb a s e d 0 nm i c m a r r a y p h dc a n d i d a t e ：g a ol i s u p e r v i s o r ：p r o i 。uz u h o n g n a i n eo fm eu n i v e 璐i 哆：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y m i c r o a r r a y i sah i g l l - t h r o u 曲p u tt o o lw h j c hc 她d e t e c tal a r g ea m o 岫to fd n a s e q u e n c e s 锄d 锄a l y z et h eg e n e s t f a d i t i o n a lh y b r i d i z a t i o no fn u d e i ca c i d si sc o m p l i c a t e d ， l l i 曲c o s t 觚dl o we f f i c i 伽c y m i c r o a n y ns o l v ct h e s e w ea ：k i i e s s e s i i lt h i st h e s i s ，t h e m e t h o d so fd n as e q u e n c i n ga n dd n am e t h y l a t i o nd e t e c t i o no nam i c m a 玎a yh a v eb e e n s t u d i e d h u m a ng e n o m ep r o j e c tp u s h e dt h ed e v e l o p e m e n to fd n as e q u e n c i n gt e c h n o l o 舀e s s e q u e n c i n g - b y - s y n t h e s i s ( s b s ) i so n eo ft h em e t h o d ss h o w i n gs t r o n gp r o s p e c l sf o raw i d e a p p l i c a t i o n m i c r o a m yc o m b i n e dw i t hs e q u e n c i n 争b y s y n t h e s i sc 锄r e d u c et h e c o s to f s e q u e n c i n g ，a n da l l o wt op e d o mr a p i da n dh i g l l t h r o u g l l p u td n as e q u e n c i n g a tp r c s e n t ， t h e r ce x i s tt w ok e yp r o b l e m si l ld n as e q u e n c i n g ( 1 ) t e m p l a t eo fs e q u e n c i n gi sb a s e do n p o l y m e r 弱e c h a i l l r c a c t i o n ( p c r ) ，、) l 舸c hp r o d u c e sa m p l i c a t i o n b i a s ( 2 ) t 1 l e n u o r c s c e i n - l a b e l e dd e o x 如b o n u d e o s i d ct r i p h o s p h a t c ( d n i 即s p e c i e sa r ci n c 0 1 1 p o r a t e di n c x t e n s i o nr e a c t i o n sw h i c hc 锄b er c a db yt h el e v e l0 ff l u o r e s c e n c e 1 tn e e d st or c m o v et h e n u o r c s c e n c c 锄da l l o wf u n h e re x t c n s i 曲锄df e a d i n ga l o n gt h ed n ac h a i n i nt h e s es t u d i e s ， r o l l i n g c i r c l e 鲫1 p l i f i c a t i o na n dt h r e ek i n d so fq u e n c h e r st h a tc 锄q u e n c ht h en u o r e s c e n c ei n d n a s e q u e n c i n gw e r eu s e dt 0s o l v et h e s et w op r o b l e m s d n a m e t h y l a t i o ni sa ni m p o r t a n tc o m p o n e n to fe p i g e n e t i c s t h ea b e r r a n tm e t h y l a t i o n c 锄l e a dt 0c a n c e r d e t e c t i o no fd n a m e t h y l a t i o ni st h eb a s i s0 fd n am e t h y l a t i o ns t u d y t _ h e h i g h - t h r o u g h p u ta n dh i g hs e n s i t i v i t yt e c h n o l o g y i st h ek e yf a c t o rt 0r e s e a r c hd n a m e t h y l a t i o n 1 1 l i ss t u d yw a sb a s e do nt h eb i s u l f j t ec o n v e i s i o nm e t h o d w eh a da d o p t e dt h e f i x e d a r r a yt e c h n o l o g ya n dt h er o n i n gc i i l et e c h n o l o g yt op r e p a r em o l e c u l a rc l o n i n ga n d v 东南大学博士学位论文 t h e nd e t e c te a c ho ft h ed o n e dm e t h y l a t i o nm a pw i t ht h eh y b r i d i z a t i o n 1 as e q u e n c i n gm e t h o db a s e do nd 岫c y l t h ef l u o r e s c c n c eq u e n c h e r ( d a b c y l ) w 硒u s e dt 0q u e n c ht h en u o r e s c c n c ci nd n a s e q u e n c i i l g d a b c y la b s o r b se n e r g y 锄dd i s s i p a t 骼t h e a b s o r b e de n e r g yf b mt h e f l u o r e s c e i n o nm ea l d e h y d e - m o d i n e ds l i d e s ，t h eb e s tr c a c t i o nc o n d i t i o 璐w e r c0 1m o l l d a b c y lf o r5m i na t4 0 0 c t h ee f ! f i c i e n c yo fq u e n c h i n gw a s9 9 觚dt h ee f ! f i c i e n c yo f e x t e n s i o nw 弱9 0 t h ee f ! f i c i e n c yo fq u e n c h i l l gf o fc l y5 - l a b e l e dd n r pw 豁l o w e s t 锄o n g t h ef l u o r c s c e i i l s ( c y3 ，c y5 ，f i t c 卸d 玑址乱气r ) 一l a b e l c dd n l l p s t h ee x t e n s i o nc 锄c o n t i n u e u n t i l7 t hq u e n c h i n gt r c a t m e n t al e n g t ho f1 7b a s e so nt h ea l d e h y d e m o d i f i e ds l i d 懿b yu s i n g f l u o r c s c e n c eq u e n c h i n gw 勰锄c c e s s f u l l yr e a d0 u t t l l i ss i i i l p l e 姐di n c x p e 璐i v em e t h o dw 弱 p r 0 v e dt ob ef e 嬲i b l ei nm i c r o a 盯a yb 嬲e dd n as e q u e n c 抽g 2 as e q u e n d n gm e t h o db a s e do n1 1 2 0 2a n d 圈江二九 a na p p r o a c hf o rp f 印a r i n gs e q u e n c i i l gt e m p l a t e sb a s e do nr o l l i n g - c i r c l e 踟p l i f i c a t i o n ( r c a ) w 弱r e p o n e d af e wm o d i f i e ds l i d e st h a tw e r ea c r y l 锄i d e m o d i f i e ds l i d e s ， s t r e p t a v i d i n - 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c o a t e db e a d si nt h ew a t e 卜i n - o i lm i c r o e m u l s i o n s i i l 0 r d e rt 0d e m o n s t r a t ew h e t h e f t h en u m b e r 豫t i o so fr e ds p o t st 0g r e e ns p o t sa r ei d e n “c a lt 0t h e r a t i o so fp o s i t i v et e m p l a t e st on e g a t i v et e m p l a t e sp o s i t i v ec i r c l et e m p i a t e sa n d n e g a t i v ec i f c l e t e m p l a t e sw i t ht h er a t i o so f0 ：1 ，1 ：2 ，1 ：1 ，2 ：1a n d1 ：0w e r er e s p e c t i v e l ym i x e d t 1 l er e da n d g r e e ns p o t sw e r ec o u n t e da n dt h er a t i o so fr e dt og r e e nw e r eo ：1 4 9 ，6 7 ：1 3 1 ，9 1 ：9 3 ，1 2 7 ：6 5 a n d1 4 1 ：0r e s p e c t i v e l y t h er a t i o sa r et h es a m e p o s i t i v ea n dn e g a t i v et e m p l a t ec i r c l e sw e r e v i i 东南大学博士学位论文 - _ _ _ _ - - - _ _ 一 m i x e dw i t ht h em t i oo f1 ：1 0 5t 0t e s tt h es e n s i t i v i t y0 ft h em e t h o d d n am e t h y l a t i o nc a na l s o b ed e t e c t e d 们1 i sm e t h o dt 0e a c hc 1 0 n em e t h y l a t i o np a t t e m 雠a l y s i so fp 1 6g e p r o m o t e rf 研 t e ng 船t r i c 啪c c rs 明1 p l e s 觚dt h ec o l l r e s p o n d i n gn 0 姗a ls 锄p l e sw e r cs u c c e s s f u l l ya p p l i e d 0 u re x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h em e t h o dc o u l dm e a s u r cm e t h y l a t i o np a t t e mq u a n t i t a t i v e l y w i t hh i g i ls e n s i t i v i t y k e y w o r d s ：m i c r o a m y ，r o l l i n g c i r c l ea m p l 妇t i o n ，d n as e q u e n c i n g ， n u o r c s c e n c c q u e n c h i n g ，d n am e t h y l a t i o n 1 l 专用术语注释表 专用术语注释表 s b h ( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n ) ：杂交测序法 d n a ( d e o x 州b 0 加d e i ca c i d ) ：脱氧核糖核酸 d n 盯( 2 - d e o x y n u c l e o s i d e 一5 一t r i p h o s p h a t e ) ：脱氧核苷三磷酸 御：脱氧腺苷三磷酸 d g t p ：脱氧鸟苷三磷酸 d c r p ：脱氧胞苷三磷酸 d t l l p ：脱氧胸苷三磷酸 d u t p ：脱氧尿苷三磷酸 c y 3 ( c y a n i n e 3 ) ：花青素3 c y 5 ( c y a n i n e5 ) ：花青素5 m 蝴r a ( t e t r 锄e t h y l m o d a m i n e ) ：四甲基罗丹明 p b so h o s p h a t cb u 船r e ds a l i n e ) ：磷酸盐缓冲液 a p s ( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) ：过硫酸氨 a p t e s ( 3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l 卸e ) ：3 一氨丙基三乙氧基硅烷 h g p ( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ) ：人类基因组计划 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) ：聚合酶链式反应 r c a ( f o l l i n gc i r c l e 锄p l i c a t i o n ) ：滚环扩增 h r c a ( h y p e r b m n c h e dr o l l i n gc i r c l ea m p l i c a t i o n ) ：超分支滚环扩增法 s b s ( s e q u e n c i n gb ys y n t h e s i s ) ：合成测序 t e m e d ( t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i 锄i n e ) ：n n ，n ，n ，- 四甲基乙二胺 d p i ( d i p h e n y l i o d o n i u mc h l o r i d e ) ：氯代二苯碘 a f m ( a t o m i cf o m em i c r o s c o p e ) ：原子力显微镜 m s o ( m e t h y l a t i o n s p e c i f i co l i g o n u d e o t i d em i c r o a m y ) ：甲基化特异性微阵列 a s o ( a l l e l e s p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d e ) ：等位基因特异性寡核苷酸 d m h ( d j 舭r e n t i a lm e t h y l a t j o nh y b f i d i z a t i o n ) ：差异甲基化杂交法 m i r a ( m e t h y l a t e d - c p gi s l a n dr e c o v e r ya s s a y ) ：甲基化c p g 岛回收检测技术 m e d l p ( m e t h y l a t i o nd n ai m m u n o p r e c i p i t a t i o n ) ：甲基化d n a 免疫沉淀m i r a m s p ( m e t h y l a t i o n s p e c i f i cp c r ) ：甲基化特异的p c r 法 目录 目录 中文摘要一l 专用术语注释表1 第一章绪论1 1 1d n