（生物医学工程专业论文）壳聚糖衍生物基因递送系统的构建及其生物安全性初步研究.pdf

a b s t r a c t c h i t o s a nh a sb e e nc o n s i d e r e dt ob eag o o dc a n d i d a t ef o rg e n ed e l i v e r ys y s t e m ， s i n c ei ti sa l r e a d yk n o w na sab i o c o m p a t i b l e , b i o d e g r a d a b l e ，a n dl o wt o x i cm a t e r i a l w i t hh i g hc a t i o n i cp o t e n t i a l h o w e v e r , l o ws p e c i f i c i t ya n dl o wt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y o fc h i t o s a nn e e dt ob eo v e r c o m ep r i o rt oc l i n i c a lt r i a l i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pan e w g e n ed e l i v e r ys y s t e mu s i n gc h i t o s a nd e r i v a t i v e st og a i nh i g ht r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y m o r e o v e r , a ne v a l u a t i o no fb i o s a f e t ym u s tb ec a r r i e do u tp r i o rt oc l i n i c a lt r i a l i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ew o r km a i n l yf o c u so nt h ef o l l o w i n gp o i n t s ： an o v e lm e t h o dt o s y n t h e s i z ec h i t o s a n l - a r g i n i n e w a s d e v e l o p e d f m o c - a x g ( p b f ) - o hw a s 掣a f t c dt oc h i t o s a nb yu s i n gc o u p l i n ga g e n t se d c a n dn h s t h e nf m o cg r o u pa n dp b fg r o u pw e r er e m o v e do n ea f t e rt h eo t h e rb yd e p r o t e c t i o n r e a c t i o n t h u st h ef i n a lp r o d u c t ，c h i t o s a n - l - a r g i n i n e ，w a sy i e l d e d t h ef o r m a t i o no f t h i sp r o d u c tw a sc o n f i r m e db yt h e hn m ra n df t - i rs p e 斌r a c h i t o s a n , n - a l 】【y lc h i t o s a n , c h i t o s a n l - a r g i n i n ew a su s e da sg e n ev e c t o rt o d e l i v e rp l a s m i dd n ai n t ov a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l la n dk 5 6 2c e l l g r e e n f l u o r e s c e n c eo b s e r v e di n d i c a t e dt h a tt h ep l a s m i dd n a w a ss u c c e s s f u l l yd e l i v e r e di n t o c e l l t h ed e r i v a t i v e s d n a c o m p l e xp a r t i c l e sw e r el a b e l e db y9 叮矿t oi n v e s t i g a t et h e i r e f f i c i e n c yo fe n t e r i n gc e l l t h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yw a sf i g u r e do u tb yc a l c u l a t i n g t h ep e r c e n t a g eo fc e l l se x p r e s s i n gg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n a p r e l i m i n a r ys t u d yo nb i o s a f e t yo ft h e s et h r e ek i n d so fg e n ev e c t o r sw a sc a r r i e d o u t a ne v a l u a t i o no fc y t o t o x i c i t yw a sp e r f o r m e db ym t fa s s a y c y t o t o x i c i t yc a u s e d b yc h i t o s a nd e r i v a t i v e sw a so b s e r v e d t h ec y t o t o x i c i t yo fc h i t o s a n l a r g i n i n ew i t h d i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t sw a sa l s ot e s t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e r ei sa c o r r e l a t i o nb e t w e e nm o l e c u l a rw e i g h ta n dc y t o t o x i c i t y k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，a r g i n i n e ，n o r l v i r a lg e n ev e c t o r , g e n ed e l i v e r y , t r a n s f e c t i o n ，b i o s a f e t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期：? 力节乡年月 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：陟垃导师签名： 签字日期：石年月7 日 签字日期： 压乒 日 7 厶侈， 月 1 事徊年 天漳天学硕士学盘论文第一章综述 第一章综述 1 1 基因治疗的现状、基本程序及所存在的问题 人类疾疼，除单基戮遗传蠹终，许多鬻髭疾癍翔恶佳瓣癣、蹇赢压、耱尿痍、 嚣。按瘸等熬发生，都怒繇境因子羹纯学豹疆、瘸毒或其它赣生纺、营养，苏及体 内的备种因素，包括精神因素、激素或中间产物等内外因素作嗣于人体基因的最 后结聚。至于传染病，照由外源病原体如病懑、细菌及其它微绒物引起的疾病， 而这般病原体是通过它们的遗传物质及其袭达产物作用于人体而致病。同时，这 些瘸蹶体的遗传物质还霹叛在人体内不断复制。所以，入的疾瘸的发生，都是入 缀熬本身戆基霆毅交或囊终源病嚣薅熬基嚣及产携与入体稳重终麓戆最嚣结栗。 为此，长期以来科学家们想象人类能否最终依靠遗传物质，无论怒入本身的或外 源的，来治疗疾病，包括纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进 展，杀灭病变的细胞或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗的目的。 灏此，基因洽疗成为i 踵年来医学上热阉盼研究领域。生物体懿一切生命活动， 获滋黧成长、鬟窭瑗疾痰、衰老壹至死亡帮奄蒸嚣有关，基因调控萋缨夔戆各耪 功薇：生长、分化、老化、死亡。目前己发现，人类与疾病相关的基露约有5 0 0 0 多个，迄今已有1 3 被分离和确认。科学家利用基因工程技术，消除、修饰“坏” 的致瘸蒸因，如导致结肠瘸的基因；注入或增强“好”的基因，如防止动脉阻塞 的基因，达到治疗疾病嬲鼹鲍，这就是基因治疗或基因疗法。基因治疗目前已取 得不少成果。 1 1 1 基因治疗的现状 自从1 9 9 0 年美国f d a 正式批准第一个熬因治疗临床试验以来，世界各国都 掀越了基因治疗的研究热潮。但截止到1 9 9 5 颦，全世界共有1 0 0 多个基因治疗 整臻方案，在美蓬n i h 主持戆译襞孛发瑷囊聂毒效戆方寨仅忍个，获瑟提窭盛 须热谥基舜治疗中的关镳簇础润题的碜 究，嬲强了对基因治疗稳床试验方案的审 批和j | 矗管力度。从此，撼阂治疗从狂热转入耀性化的正常轨道，并一直在稳健地 发展。掘统计，截至2 0 0 4 年6 月底，全世界范围内基因治疗的临床试验方案已 有9 8 7 个，表明基因治疗爨有良好的发展盼祭。 天津犬学颈士学建论文 第一章综述 在所有的临床试验方案中：( 1 ) 恶性肿瘤占全部基因治疗1 瞒床试验方案的首 位，占总数的6 6 ；( 2 ) 心血管疾病占全部麓因治疗临床试验方察的8 1 ；( 3 ) 单基阂疾病占全部基因治疗临床试验方案的9 4 ；( 4 ) 感染性疾病，主要是艾 滋瘸( a 国s ) 占全部綦瓣治疗临床试验方繁豹& 6 ：( 5 ) 其镳疾疯占全部基 毽渗疗貉痣试验方案豹2 9 ；( 6 ) 基嚣零踩占全熬基嚣治疗稳藤试验方案静 5 - 3 。目前这些基因治疗娲床方案大多数缝予i ，期临床试骏阶段，其中i 期临床方案有6 2 4 个，i 期2 0 4 个，l i 期1 3 1 个，i i ，i i i 期1 1 个，期 1 7 个。目前只有我国的黛组腺病毒p 5 3 抗癌注射液( 商品名“今又生”) 作 为t 堡界士第一个基因治疗产品正式上市，这举仅标志着我国能够农“点”上取得 整癸魏戆鬟菝突薮，凌慧曝羞我莛有藐力程囊镌蔫菝寒产烫豫滋程孛稔占先瓠。 总的来说，在基因治疗旗础研究和福床试验及产业化各个领域，焚国均领先于世 界，其临床方案有6 6 2 个，占世界上总数的6 7 然而，如果我们冷静、公正地 去审视这十几年来在基因治疗研究领域所取得的成绩，我们不得不承认其中还存 在一燎潞题，主要是有效性和安全性。第一，目兹进入期峪臻试验的只有1 7 今，嚣显太多数罄庆试验疗效畜限；第二，法嚣邑黎n e c k e r ，b 塞医院嚣s l i d 接受纂函治疗的患者中露三名出现了类自赢瘸样症状，表明基嚣治疗安全性闯题 有待平进一步解决。 谯我国，深圳的赛酉诺基因技术有限公闭从1 9 9 8 年开始进行重组腺病毒一 p 5 3 抗癌注射液的临床试验，至2 0 0 3 年完成了全部临床试骏，于2 0 0 4 年1 月 获缮我强s f d a 援准瓣鞭莼生产援文( 舞麓名。今又生”) 。鬻羲，我莺基经鸯 7 碣项基因治疗方案遴入了绉床试验阶段，并建立了国家“8 6 3 ”计划生物领域 病毒栽体研发基地，主瓣开展腺伴随病毒载体研发和产业化。弱外，还有5 “ 项基因治疗临床方案正在向国家s f d a 申请临床试验批文，2 0 - 3 0 项研究已完成 或正在进行临床前试验，2 0 个左右项目进入了中试研究阶段，大多数基因治疗 磺突器具有剑薮健h 1 。 1 1 2 基因治疗的基本稷序 一、获得目的基因 骚进行基因治疗，必须首先获得巨的基阂并对其表达调控进行详细研究。耳 懿鏊瓣来源毒多耪，主黉毽据：含嚣豹基瓣黪供薅缨照翦基霞绫d n a 分毒、鬏 先分离宽隆静基因、p c r 扩增的基因及入工会成豹基西。 二、靶细胞的选择 融被应用的靶细胞肖淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、成纤维细 胞、_ | j 千细胞、肌细胞及肿瘸细胞。 天津大学颧士学建论文第一章综述 1 发病器官及位置。可以选择病变本身器甯的细胞，也可以选择痫变器官以 外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。例如：在肝脏病的基因治疗中，可以选择肝 细胞作为基因治疗的靶细胞；在肿瘤基因治疗中，可选择肿瘤组织侵润的淋巴细 胞或艟癯缨艟本身。 2 耱缨藏应容易取爨耪移植。基霾治疗碧矮途径：将氅缨稳麸髂痰取遗，经 基因转化后再移植回入体内。这就要求靶细胞容易从体内取出和德网人体。最容 易取出和移植的细胞当属胤液系统的细胞。 3 靶细胞容易在体外培养。 4 靶细胞容易实现基因转化。将目的基因转移到靶细胞的芋段囊耍有物理、 纯学、皴会及瘸毒载髂嚣大类。 5 靶细胞应有较长的寿命。基因治疗、特别是某些单基因遗传缺陷性疾病的 基因治疗，最终目标是要求外源基因长期、稳定的表达，直至终缴。 兰、基因载体和基因转移系统 霹翦使用的基因载俸脊病毒载体和非病毒载体。 ( 一) 痍毒套导懿蘩嚣转移( 将在嚣文谨述) 。 ( - - ) 病毒食导的鏊潮转移。 该炎方法是以病毒为栽体，将目的基因导入靶细胞或器官，并使之表达。一 般在基湖这些病毒缺失了其自身复制所必需的一些基因，然后将治疗基因、一些 基因的调控成分( 如启动予和增强子) 以及p o l y a 信号等插入，使之成为表达性 载钵。瓣蘸在基因转移孛艨使弱戆病毒载髂鸯荻下蔻秘。 转移中，所使用蠹毫病毒载傣都是经过改建的有复制缺貉的病毒。 1 逆转录病毒( r e t r o v i r u s ，r v ) r v 是目前基因转移中戚用最为广泛的一炎病毒。是一类r n a 病毒。由于 缺失了自身包装所必需的鬣囱( 结构蛋白g a p ，多聚酶p o l ，包膜糖鬣自e n v ) 基 因，毽戴芟复割嚣依赖辕鲂缨戆系。逆转录病毒转染效率毫，理论上搿态达1 0 0 。 转染君，蓠病毒基送缀( 经反转录嚣形成的d n a ) 霄与靶缁魏基因组陵辊 组合，阂而能稳定的表达外源基因。 缺点；( 1 ) 只能转染熊于增殖状态的细胞；( 2 ) 携带的外源熬因不能太大 ( 8 1 0 - 洳) ：( 3 ) 逆转录瘸滗的感染依赖于靶细胞表面适宜受体存在，限制了它 的应用，尤其是体内基匿浚疗驰应用；( 4 ) 壤涂上谫，麸包装细臆释放出静复制 缺陷熬邀转录病毒只有一次镶感染轻缀魏，毽凌莱耱稳嚣下氇会造成努生墅病毒 的爆发。( 5 ) 由于病毒基鞠组是随机整合到靶细胞基因组的，因丽凝有致细胞癌 变的可能；( 6 ) 逆转录病毒不能耐受纯化和浓缁等处理过程，否则会使其感染活 性大大下降。 天津大学硕士学位论文第一章综述 逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程：( 1 ) 目的基因克隆到逆转录病毒 载体上；( 2 ) 带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如磷酸钙介导或电穿 孔法导入已选定的包装细胞；( 3 ) 根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞： ( 4 ) 选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；( 5 ) 重组病毒感染 靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种 以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达 到目的。( 6 ) 如采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达 及治疗效果；( 7 ) 病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控 制。 2 腺病毒( a d e n o v i r u s 。a v ) a v 是一些大的( 约3 8 k b ) 双链d n a 。目前作为基因治疗中所用的a v 载体 通常是一些复制缺陷病毒，其基因缺失位于基因组的e 1 a - e 1 b 或e 3 区。a v 既 能感染增殖期细胞，也能感染静止期细胞。这类病毒比较稳定，且浓缩和纯化对 其感染活性影响不大 其不足之处为：( 1 ) 病毒基因组一般不与靶细胞基因组整合，因而其表达外 源基因是暂时的和不稳定的；( 2 ) 在a v 的生活周期中，有许多不同生物学活性 的蛋白暂时表达，其中也包括一些与细胞恶性转化相关的蛋白；( 3 ) 感染细胞内 大量病毒蛋白的表达，可导致机体对受染细胞的强烈免疫应答。这一毒副作用在 体内基因治疗是必须引起足够的重视。( 4 ) a v 几乎可以感染所有细胞，缺乏特 异性。或许可以通过使用组织特异性启动子来克服这一问题。 3 腺相关病毒( a d e n o - a s s o c i a t e x lv i r u s , a a v ) a a v 属于微小病毒家族成员，是一类小的单链d n a 病毒( 基因组约4 7 k b ) ， 非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒( 常为a v ) 存在时才能复制。a a v 可感 染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。 大部分a a v 基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。a a v 可以整 合进入宿主细胞基因组，但不如r v 的整合效率高。有趣的是，在感染细胞中， 野生型a a v 基因组可高效定点整合于人类第1 9 号染色体长臂的特定位置上，这 种整合可导致染色体基因重排，而这种重排与慢性b 淋巴细胞白血病相关。然 而携带治疗性基因的a a v 载体似乎不象它的野生型亲本，没有定点整合于1 9 号染色体的相同特征。因此从安全的角度来考虑，这种a a v 的定点整合有多大 优越性，尚值得迸一步探讨。 4 单纯疱疹病毒( h e r p e ss i m p l e xv i r u s h s v ) h s v 是一些双链d n a 病毒( 基因组约1 5 0 k b ) ，具有嗜神经细胞的特性， 能在神经细胞内形成“终生隐性感染”。将外源基因导入并使之长久存在于中枢 天津大学硕士学位论文 第一章综述 神经系统是该类病毒载体的一大特点。如果能够选择性地调节目的基因的表达， 而不诱导病毒基因的表达，这将对中枢神经系统疾病的基因治疗大有帮助。 h s v 的缺点：( 1 ) 仅能感染分裂细胞，从而使之在成人脑组织中的应用受 到限制。( 2 ) 这类病毒( 包括无复制能力的病毒) 对靶细胞具有毒害作用，需慎 重。 四、外源基因表达的检测 需用载体中的标记基因对转化细胞进行筛选。在较多的表达载体中都有n e o r 标记基因的存在，若向培养基中加入药物g 4 1 8 ，未被转化的细胞则因不存在n e o r 标记基因而不能存活。 五、回输体内 将治疗性基因修饰的靶细胞以不同的方式回输体内以发挥治疗效果。如淋巴 细胞可以静脉回输入血；造血细胞可采用自体骨髓移植的方法；皮肤成纤维细胞 经胶原包裹后埋入皮下组织中。 1 1 3 基因治疗所存在的问题 基因治疗是一种富有前景的治疗疾病的方法。然而，人类疾病基因治疗的限 制主要是转基因方法的潜在风险，相对低效率和靶基因的细胞内稳定性。因此， 基因治疗作为一种崭新的治疗手段要想应用于临床，必须解决几个关键的问题。 一、基因转染系统的安全性 基因治疗从实验室走向临床面临的第一个问题就是缺乏完善的基因转移载 体系统。众所周知，对临床基因治疗而言，安全性尤为重要。1 9 9 9 年患者j e s s e g e l s i n g e r 的死亡，为基因治疗抹上了一层阴影。德国的华人科学家及其同事在 用反转录病毒基因标记的动物模型中率先观察到白血病诱导作用。2 0 0 2 年法国 基因治疗小组在为一名x 染色体连锁的严重联合免疫缺陷性疾病( x - s c i d ) 患 者进行临床基因治疗试验后，又发现了白血病样副作用。由于病毒整合和病原体 活动，转基因过程中广泛使用的病毒载体或非病毒载体会导致病理或免疫反应如 急慢性毒性、细胞或体液免疫反应。因此，i 临床基因治疗选用载体的第一原则必 须是对患者无病理或毒性作用。例如当前临床基因治疗方法普遍采用的逆转录病 毒载体由于随即整合，有可能导致插入性突变，随即插入的d n a 可明显激活临 近的癌基因。美国国立卫生研究院重组d n a 咨询委员会认为，用逆转录病毒为 载体插入靶基因至患者细胞内进行基因治疗，可导致白血病发生，其原因是激发 了失控的细胞生长，从而致癌。 二、目的基因的有效性 目前尝试用于基因治疗实验的目的基因很多，但真币应用于临床的却寥寥无 天津大学硕士学位论文 第一章综述 几，其主要原因之一是转基因至体细胞内适当位点的“低效性”。一方面，对于 有效的基因治疗的体内应用，反转录病毒滴度仍然太低；另一方面，如果治疗性 d n a 未能整合入人体染色体，它在细胞内被终止或分解之前只有短时间内产生 蛋白质，若想满足长期治疗需要，基因必须被嵌入依然未确定整合的染色体，并 随细胞传代。“低效性”的其他原因是大部分的基因治疗是非特异的，对少数特 异的基因治疗，在选择靶基因修复或敲除之前，需要确定哪一个是缺陷或突变基 因；另外，大多数人类疾病是多基因致病( 如癌症) ，因此大部分单个基因转移 的基因治疗往往得不到非常满意的效果。随着功能基因组学研究的开展，各种致 病基因的发现及各种基因功能的迸一步明确，将带动基因治疗的迅速发展。开发 结合2 个或更多基因的嵌合靶基因和嵌合载体的基因治疗是富有前景的。 三、基因表达的稳定性 基因的相对稳定是保持个体健康的关键，进行基因治疗时，不仅应当保持导 入靶细胞或组织的基因自身的稳定性，而且靶基因转入后应能够持续、稳定地表 达，从而产生良好的效果。目的基因表达的组织、时序及水平上的严格调控是这 类基因治疗进入临床前必需解决的问题。为此，可以采用组织特异性启动子，设 计能整合入基因组终末位点的载体，以避免整合至有潜在风险的位点，并使靶基 因在特异的靶组织中长期、稳定地表达，从而满足某些疾病( 如血友病) 的需要。 然而，对于i 型糖尿病，持续、稳定的基因表达只是取得最终目标的第一步，因 为较高或较低的血糖水平对任何患者都是致命的。对糖尿病的一种确切的治疗是 在每日变化的食物摄入中保持正常的血糖浓度。因此，稳定的转基因技术以及如 何在期望的时间( 定时) 和适当的水平( 定量) 转导基因表达系统至靶器官，且 靶基因持续、稳定地表达等问题，是基因治疗成功所必须的条件。研究疾病状态 下基因表达调控的机制，开发及应用能被病理信号诱导的启动子元件表达载体系 统具有临床应用价值。利用体内特定的生理信号实施转染基因生理水平表达的控 制可能成为较理想的方法。 四、目的基因转染的靶向性问题 早期基因治疗的疾病主要选择如肺囊性纤维化、a d a s c i d 等遗传缺陷性疾 病，治疗基因导入体内后即使不进行精确的调控也可获得较好疗效。而在用基因 治疗其它多种疾病时，对目的产物的需要量要求严格，如果目的基因表达由载体 或病毒启动子自发激活，表达不受控制，目的产物表达过度或不适当，不仅对疾 病治疗不利，甚至可能引起致命的副作用。对于理想的肿瘤基因治疗，其目的基 因的表达应能区别正常组织与恶性组织，但同时对恶性组织的类型无特殊选择 性，能在多种癌症和肿瘤组织中表达，即实现所谓肿瘤特异性表达。目前应用于 肿瘤试验性基因治疗载体的启动子可高效启动下游基因的表达，但基因表达缺乏 天津大学硕士学位论文 第一章综述 选择性。 五、基因治疗与社会伦理道德 体细胞基因治疗是符合伦理道德的，但试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗 传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域。从历史上看，科学的 发明创造对人类生存发展的影响极其深刻，故遗传学发展到今天，可以进行基因 治疗，应该说是符合伦理道德的。重要的问题是取得社会的理解配合。首先是病 人及其亲属的配合。因此，宣传基因治疗的科学性与安全性以及人类健康的重要 性，以提高人们的认识，同时建立并完善医疗法制与措施也是必要的。 1 2 非病毒基因载体概述 经改造的病毒载体，转染效率较高，是目前基因治疗的主要手段；但病毒载 体缺点在于制备复杂，有免疫原性，体内不能反复应用，安全性存在隐患以及非 导向性，必须进一步改建。非病毒载体具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几 率低、无基因插入片段大小限制、使用简单、制备方便、便于保存和检验等优点， 在有效性方面，科学家们也应用了多种方法加以改进并取得了令人满意的效果。 非病毒基因载体主要分为以下几类： 一、裸d n a 裸露d n a 是最简单的一种基因治疗形式。它是由编码生物活性物质的基因 及作为其载体的质粒组成。1 9 9 0 年，w o l f fja 等人发现，当将纯化的质粒d n a 直接注射到小鼠骨骼肌细胞中后，该基因能够表达，并且在接种两个月后，编码 的酶仍然具有生物学活性。这是人们首次发现d n a 免疫现象。自此，许多人致 力于开发将可编码蛋白抗原的质粒直接导入动物组织，诱导动物的免疫系统对所 表达的蛋白质产生体液免疫或细胞免疫，这也就是我们常说的基因疫苗。除了导 入编码蛋白质抗原的基因外，也可以导入编码其他具有药理活性的基因分子，如 表达促红细胞生成素( e p o ) ，以用于恶性肿瘤的治疗。裸露d n a 在体外不能转 染细胞，但在体内原位注射时( 尤其是肌肉和皮肤) ，它能有较高的转染效率。 但至今人们对裸露d n a 到底是如何转染细胞，在体内发挥机制的具体过程仍不 清楚。但人们发现，当向小鼠门静脉或尾静脉以较大体积( 1 5 3 0 m 1 ) 注射入质 粒时，能引起较高效率表达，这为我们利用裸鼠研究基因功能提供了一种简单手 段。裸露d n a 作为基因载体的优点是可利用细菌比较廉价地大量生产带有药物 基因的质粒。但其稳定性和转染效率均不高，也很难有靶向性。 二、脂质体 脂质体d n a 复合物又称为l i p o p l e x e s 。应用的转基因脂质体分阳性、中性脂 天津大学硕士学位论文第一章综述 质体、阴性脂质体以及p h 敏感的脂质体。其他新型用于基因治疗的脂质体仍在 不断地被合成，如双四铵化合物( d i q u a t e r n a r ya m m o n i u mc o m p o u n d s ) 【2 】等。 阳性脂质体，体外应用较多，如商品化的l i p o f c c t i n 。在脂质和d n a 的复合 物中加入少量多聚赖氨酸或鱼精蛋白复合物等可形成类似病毒样的颗粒，减少了 复合物间的凝聚，增加了对d n a 的结合力，提高了脂质体在体外的转染效率。 阳离子脂质体结构一般包括疏水基团和氨基基团，增加分子中氨基基团的数目， 以及增加氨基基团与疏水基团之间的距离有利于增加d n a 的释放能力。阳离子 脂质体与d n a 形成的复合物颗粒大小从5 0 n m 到1 | im 不等，体外细胞试验， 大颗粒的转染效率优于小颗粒。脂质体经聚乙二醇( p o l y c t h y l c n eg l y c o l ，p e g ) 修饰后，可降低脂质体d n a 复合物颗粒之间的相互聚集，降低了与血液成分的 相互作用，使脂质体d n a 复合物颗粒由大颗粒变成小颗粒，同时不影响脂质体 与细胞的亲和力。但体外试验，阳离子脂质体聚乙二醇化降低了转染效率。 导向脂质体，将脂质体与配体结合可增加转染效率。如二唾液酸神经节苷脂 ( d i s i a l o g a n g l i o s i d c ，g d 2 ) 的单抗与脂质体偶联，包裹癌基因o - m y b 的反义寡核 苷酸，可特异抑制g d 2 阳性的神经外胚层来源的肿瘤，可使g d 2 阳性的瘤细胞 对反义寡核苷酸的摄取增加4 1 0 倍，而对g d 2 阴性的正常细胞和肿瘤细胞无 抑制作用。叶酸导向的p n 敏感的脂质体，可用于叶酸受体表达增加的许多肿瘤 细胞系。抗转铁蛋白受体单抗偶联的p e g 化的中性脂质体包裹质粒，体内应用， 可广泛转染外周组织和脑。 但有报告体内应用时，脂质体有激起机体对质粒d n a 免疫反应的潜在可能 性，特别是c p g 簇集区。 三、阳离子多聚物 阳离子多聚物d n a 混合物称为p o l y p l e x 。阳离子多聚物( p o l y c a t i o n ) 可浓 缩富含阴离子的d n a ，然后粘附到细胞表面的硫酸粘多糖上，被细胞内吞进入 细胞内，从而使质粒表达。报道的阳离子多聚物种类很多，如聚乙烯亚胺 ( p o l y c t h y l c n i m i n c ，p e i ) ，聚丙烯亚胺树枝状物( p o l y p r o p y l e n i m i n cd c n d f i m e r s ) ， 聚酰胺树突状物( p o l y a m i d o a m i n cd e n d r i m e r ) ，多聚赖氨酸、多聚组氨酸、多聚 精氨酸、鱼精蛋白、壳聚糖等以及上述聚合物的聚乙二醇修饰物。其中研究较早 的是多聚赖氨酸，后来发现聚乙烯亚胺性能更佳，是目前研究的热点，这里重点 阐述p e i 。p e i 可抑制溶酶体，在吞噬泡酸性环境中质子化、正电荷增加，对d n a 提供更大的保护作用，有利于质粒逃离吞噬泡。p e l 分子有分枝形和线型两种结 构，有分子量大小不同的聚合物，以及不同的衍生物如p e i 的聚乙二醇化 ( p e g y l a t c d ) 或糖基化衍生物。分枝形的p e i 体外应用相对偏好，线形p e i 体 内应用较好。体外细胞转染试验，一致认为2 5 k d 的p e i 转染效率较高，但在卵 天津大学硕士学位论文第一章综述 黄磷脂酰胆碱和二棕榈精磷脂酰胆碱脂质体包裹的p e i d n a 混合物中， y a m a z a k i 报道分子量0 6 和1 8 k d 的p e i 较有效，而2 5 k d 的p e i 效果很差1 3 1 。 p e i 糖基化或聚乙二醇化增加了其生物兼容性，阳离子多聚物d n a 混合物经 p e g 修饰后，可形成囊泡状结构，屏蔽表面多余的正电荷，有利于体内应用， 如多聚赖氨酸p e g 囊泡基因载体。阳离子多聚物偶联上配体，通过受体介导的 内吞途径进入靶细胞，可增加转染效率和靶向性。偶联的配体有去唾液酸酸性糖 蛋白( a s i a l o o r o s o m u c o i d 或a s i a l o g l y c o p r o t e i n ) 、半乳糖、甘露糖，内皮细胞生长 因子、纤维细胞生长因子( b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , f g f 2 ) 、转铁蛋白、r g d 肽、叶酸以及各种单抗等。去唾液酸酸性糖蛋白针对干细胞上的去唾液酸糖蛋白 受体，甘露糖针对树突状细胞受体，r g d 肽针对细胞整合素等。 四、多肽基因释放系统 多肽载体是配体区、结合d n a 的阳离子区、核定位信号区、两性分子功能 区，四位一体的合成短肽。如t h a l w h t 寡肽可特异结合气道上皮，共聚焦显 微镜发现标记的t h a l w h t 寡肽与细胞结合后，被吞入细胞内；包含 a m a lw h r c 序列和d n a 结合部分的合成多肽，能有效地将基因转移到气道上 皮细胞内。r g d 三肽基元( m o t i f ) 是多种病毒与细胞整合素结合的配体，介导 病毒内吞；i - i a r b o t t l e 等合成包含r g d 三肽序列和1 6 个赖氨酸残基的线性多肽， 能与d n a 形成压缩复合物，并可导入许多哺乳动物细胞内；其基因表达水平， 与f 蚍d n a 比例有关，加入氯喹、聚乙烯亚胺以及灭活的腺病毒可提高表达水平， 其效率可达商业化的脂质体l i p o f e c t i n 的效率。 多肽载体的d n a 结合部分多是碱性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、组氨酸； 其中精氨酸结合质粒的能力优于赖氨酸；同时发现加入组氨酸可增加转染效率， 其机制可能是组氨酸的咪唑基类似于吞噬泡去稳定剂，有助于载体d n a 复合物 逃离吞噬泡。另外在多肽载体中加入少许色氨酸、半胱氨酸可增加转染效率，其 中半胱氨酸有助于多肽载体之间相互交联。 多肽载体的优势在于可用多肽合成仪合成，便于体内应用和基因工程法生 产，克服了配体寡肽与多聚赖氨酸或p e i 偶联制备的复杂性、不均一性以及系统 误差大的缺陷。与阳离子多聚物相比，多肽载体d n a 复合物补体系统活化作用 弱。多肽载体是非病毒载体小型化的趋势。不足之处在于阳离子负荷相对偏少。 五、嵌合性载体 嵌合性载体即将不同性质的转基因载体联合起来，互补缺陷。主要分两种： ( 1 ) 非病毒载体与病毒载体的联合应用；( 2 ) 非病毒载体之间的联合应用，主 要是脂质体与阳离子多聚物的联合应用。 非病毒载体转染效率低，不易质控和保存，外源基因转移到宿主细胞后表达 天津大学硕士学位论文 第一章综述 时间短。病毒载体转染效率高，而且可促进细胞内吞活性，与非病毒载体同用增 加细胞对非病毒载体的摄入量：病毒载体对溶酶体有抑制作用以及病毒衣壳含有 核定位信号，这有利于非病毒载体携带的质粒d n a 从吞噬泡进入胞浆和转入细 胞核。非病毒载体有靶向性、粘附性和包裹性，可把病毒载体混入非病毒载体 d n a 复合物中，靶向转移。两者结合起来对恶性实体肿瘤的局部注射治疗和腔 内恶性积液可有应用价值。尽管非病毒载体中加入病毒载体，不是一种新生事物； 但可以在非病毒载体的设计中，加入在病毒载体中起作用的寡肽，如病毒载体衣 壳蛋白中r g d 肽序列( 与细胞整合素受体结合和介导内吞) 、腺病毒p e n t o n 或 流感病毒血凝素寡肽( 使溶酶体不稳定) 、腺病毒的h e x o n 蛋白或s v 4 0 病毒大 t 抗原中的核定位序列( 参与核定位) 等。 脂质体与阳离子多聚物的联合应用已有许多报道。应用多聚阳离子浓缩 d n a ，然后用阴离子脂质体、中性离子脂质体或p e g 化的脂质体，包裹浓缩的 颗粒，表面偶联导向配体，进行体内应用。这种方式有利于隔离阳离子多聚物与 非靶细胞的非特异作用，同时减少阳离子多聚物的毒性，延长在血液中的循环时 间。包裹的颗粒类似于病毒颗粒，故又称拟病毒颗粒，也称为脂聚物 ( 1 i p o p o l y p l e x ) 。 1 3 非病毒载体的生物安全性 非病毒载体具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无基因插入片段 大小限制、使用简单、制备方便、便于保存和检验等优点，在有效性方面，科学 家们也应用了多种方法加以改进并取得了令人满意的效果。尽管如此，非病毒载 体的生物安全性依然需要得到系统全面的评估。而且，多数非病毒载体和基因的 复合物为纳米尺度的微粒，由此产生的纳米效应也应得到重视。 1 3 1 非病毒基因载体与毒- 陛 一、载体本身带来的毒性 如今，用作基因传递的载体多种多样，载体本身带来的毒性不可忽视，这种 类型的毒性最为普遍，文献报道也较丰富。毒性反应的表现，毒性产生的原因， 控制毒性的手段，这些都是各国科学家研究的兴趣所在。 1 阳离子脂质体 作为研究最为广泛的非病毒型基因载体，一些阳离子脂质体己经通过美国国 立卫生研究院( n i h ) 和重组d n a 咨询委员会( r a c ) 的批准作为基因载体进 入期临床实验，用于某些癌症的治疗。一般来说，不同种类的脂质体对细胞 1 0 天津大学硕士学位论文 第一章综述 的毒性程度也不同，而且毒性也是针对特定细胞而言的。 阳离子脂质体毒性的表现文献报道较多：有研究显示，在细胞培养过程中， 某些脂质体】d n a 复合体会导致细胞收缩，有丝分裂数减少，细胞质形成空泡【4 】： 对于缺乏蛋白聚糖的细胞，阳离子脂质体有抗细胞增殖活性和特殊的杀伤作用 例。用作介导小分子干扰r n a ( s i r n a ) 的载体时，脂质体s i r n a 复合物可能 诱导i 型和i i 型干扰素反应，同时激活转录活化蛋白s t a t l l 6 1 ，从而在体内应用 时造成潜在的毒性。也有报道指出，某些阳离子脂质体会导致肝坏死川和以内皮 细胞凋亡为特征的肺部毒性反应i s 。w r i g h t 等人发现，动脉内用药后，脂质体 d n a 复合体的聚集造成的微梗塞也会带来组织局部缺血和心肌损伤【9 】。此外， 全身用药后的炎性反应也是阳离子脂质体急性毒性的一种形式，它的特征是补体 激活和一系列细胞因子如肿瘤坏死因子a ( t n f - q ) 、干扰素y ( i f n y ) 、白 介素6 ( i l - 6 ) ，白介素1 2 ( i l - 1 2 ) 的诱导产生【1 0 l 。 通常认为，脂质体d n a 复合体的毒性与两者的电荷比以及复合体使用的剂 量相关，在脂质体d n a 比例较高的情况下，脂质体d n a 复合体超过一定剂量， 后果将是致命的【1 1 j ；脂质体本身的化学结构也在一定程度上决定了毒性的大小， 带正电荷的极性区，非极性的疏水链，以及两者的结合部，均对毒性的产生有决 定作用i l “，因此很早便有学者设计新的脂质体，力求从结构上降低其细胞毒性 【驯；另外，阳离子脂质体产生的活性氧中间产物也可导致毒性和肺部炎症反应 卅；有趣的是，在研究脂质体引起的炎性毒性反应时，单独静脉注射相等剂量的 脂质体或d n a ，毒性并不明显【1 0 1 ，研究表明，在这里阳离子脂质体仅起到了一 个协同作用，真正诱导细胞因子产生的是质粒d n a 中的未甲基化的胞苷磷酸鸟 苷( c p g ) 二核苷酸，这段未甲基化的c p g 序列在诸如巨噬细胞、树枝形细胞 中产生强的免疫刺激效果，使之分泌炎性细胞因子【1 5 】。 怎样控制阳离子脂质体产生的毒性? 对其进行修饰或改变脂质体的结构是 行之有效的手段。在这方面，科研工作者们已经做出了卓有成效的工作【1 6 , 1 7 , 1 8 , 1 9 。 2 阳离子高聚物 d a n i e lg a n d e r s o n 等1 2 0 在研究中发现，注射p e i d n a 复合物至小鼠体内后， 在注射部位附近的肌细胞受到破坏，产生石灰化斑点，同时，他们还测定一些生 化指标，来评价载体d n a 复合物对小鼠器官功能的伤害情况。 对于阳离子高聚物载体，科学家们发现主要是载体制备材料的分子结构和分 子量决定着细胞毒性，另外，支化程度、溶液离子强度、z e t a 电势和形成的粒子 大小也有相当大的影响。对于聚乙烯亚胺( p e i ) ，k u n a t h 认为其毒性随分子量 和支化度的降低而降低1 2 1 1 ，c h o l l e t 考察了分子量为2 2 k d a 的线性p e i 在转染过 程中的副作用瞄1 。聚l 赖氨酸( p l l ) 毒性的变化规律与p e i 类似【2 3 1 。另有研 天津大学硕士学位论文 第一章综述 究表明，介导基因的壳聚糖纳米粒子的细胞毒性随着脱乙酰度和分子量的降低而 减弱，脱乙酰度的影响更为明显1 2 4 1 。而a k i n a k i n c l 2 5 】用2 0 种伯胺或仲胺单体和 7 种二丙烯酸酯单体合成了1 4 0 种可降解的聚氨酯，并作为基因载体进行了平行 实验，发现细胞毒性与所选用的二丙烯酸酯相关，并综合比较后给出了一种相对 低毒性和高转染效率的聚氨酯材料。 既然材料毒性的影响因素已基本确定，为了控制毒性以达到使用效果，我们 就可以通过化学修饰改变其结构来达到目的：韩国科学家用小分子量的p e i 和戊 二醛合成了一种遇酸迅速降解的p e i ，这样，在酸性环境下，该分子可迅速降解 为毒性低的小分子p e i ，但转染效率未改变【2 6 】；p l l 经p e g 和棕榈酸酰基修饰 后，变为双亲性大分子，在转染效率未变的情况下毒性大大降低【卅；壳聚糖经无 毒且生物相容的咪唑丙烯酸修饰后毒性降低，且修饰组分含量越高毒性越低【矧， 51 3 胆酸修饰制备而成的疏水改性乙二醇壳聚糖也是同理【2 9 l ，而季铵化壳聚糖则 是随着季铵化程度的提高而毒性增大【刈。 在一些情况下，材料的大分子量会导致溶解度下降，因此在制备中会用到有 机溶剂，这种由材料间接导致的毒性也应注意p 1 1 。 3 树枝形聚合物 树枝形聚合物也可以用做基因载体，研究发现聚酰胺一胺型( p a m a m ) 树 枝形聚合物的细胞毒性与树枝形聚合物的代数及浓度相关，5 代的树枝形聚合物 在1 0 l im 的浓度下就已经显示出毒性，而7 代的树枝形聚合物在所有的测定浓 度下都会引起细胞的死亡1 3 2 】。 二、载体纳米尺度效应造成的特殊毒理作用 当物质由微米细分到纳米尺度时，即使物质组成不变，其性质将发生根本的 变化，如纳米尺度所引起的尺寸效应，量子效应、巨大的表面效应以及界面效应 等，既不同于宏观物质，也不同于单个孤立原子。目前应用的基因载体多处于几 十到几百纳米这个区间，它的纳米尺度效应不容忽视。在这种尺寸下，纳米粒子 也许会有特殊的生物毒理。随着纳米材料的广泛应用，对纳米毒性的研究也被提 上日程1 3 3 j 。现在对单壁纳米碳管和纳米材料富勒烯( c ) 的毒性已经进行了研 究0 4 , 3 5 1 。对尺寸与前二者相同或相近的基因载体，理应做出类似的研究，而且多 数纳米基因载体都可降解及带有电荷，这使得情况比前二者更为复杂，可降解的 载体还涉及到降解产物的毒性问题，带电荷纳米载体还可能对血脑屏障的完整性 和渗透性造成影响【3 6 j 。 纳米级的基因载体是外源物质，进入体内后会被网状内皮系统( r e s ) 的单 核吞噬细胞系统( m p s ) 摄取，而单核吞噬细胞主要分布于肝、脾、肺、淋巴结， 少量分布于骨髓，因而纳米基因载体将分布于以上器官中，然后被清除掉。如果 天津大学硕士学位论文