（微生物学专业论文）利用地衣芽孢杆菌发酵生产细胞分裂素.pdf

摘要 划休 细胞分裂素( c y t o k i n i n ，c t k ) 是目前人们已经知道的六大天然植物激素( 即生 长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯和芸苔素内酯) 之一。其生理作用是： ( 1 ) 对细胞分裂与分化有明显刺激效果；( 2 ) 促进细胞生长：( 3 ) 能解除顶端优 势，促进侧芽生长；( 4 ) 对某些种子和芽有促进萌发打破休眠的作用；( 5 ) 减少 叶绿素的水艇，延迟叶片衰老。细胞分裂素可广泛应用于大田作物，蔬菜、水果等 经济作物，能显著提高产量和改善品质。细胞分裂素在植物体内普遍存在、含量极 微，但它是植物生长所必需的物质。 从北京地区的土壤中分离到一株芽孢杆菌，该菌株经中科院微生物所鉴定，为 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 。该菌株通过发酵可产生细胞分裂素物质。 用苋红素合成法，即利用尾穗苋黄化苗在供给细胞分裂索和酪氨酸的条件下，子叶 能合成苋红素，然后经反复冰冻浸出全部苋红素用于比色测定，来进行活性跟踪定 量，选取玉米粉、棉饼粉、酵母浸提物和c a c 0 3 作为试验因素，采用1 9 ( 3 4 ) r f 交表 设计四因素、三水平的正交试验，确定了最适发酵培养基，其组成为豆饼粉0 8 ， 玉米粉1 ，酵母浸粉o 2 。 本文利用溶剂萃取、薄层层析对发酵液中的细胞分裂素进行了初步提取和分离， 通过薄层层析的相对迁移率( r f 值) 、红外吸收光谱( i r ) 、离效液相色谱( h p l c ) 及核磁共振光谱( n m r ) 得到了该组分的相关信息。其流程为：用薄层色谱法( t l c ) 作先导，采用荧光硅胶g f z 5 。来确定柱层析分离条件。粉剂经过8 0 甲醇浸提后减 压浓缩，再用正丁醇进行萃取，有效成分被分配到正丁醇相中。浓缩正丁醇相，得 到的粗提物上硅胶层析柱，用氯仿甲醇按体积比9 2 ：8 - 9 0 ：1 0 进行梯度洗脱，相同组 分合并得到有效活性流份b ，把流份b 再上一次硅胶柱，按氯仿甲酵体积比9 ：1 的 比例进行洗脱，用苋红素合成法跟踪活性，得到比活性高的细胞分裂素。 为了考察含有此类细胞分裂素的发酵液对黄瓜产量的影响，对发酵液在黄瓜上 进行田间应用试验。黄瓜生长期用发酵液1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 倍液进行叶面喷雾三次， 结果表明对黄瓜安全无药害，不仅有很好的促生长作用，而且还具有很好的防病作 用。其中处理区对对照区分别增产3 4 8 、2 5 3 、1 9 8 ，与对照区差异显著。对 黄瓜霜霉病的抑制率最高可达到3 6 1 ，对黄瓜炭疽病抑制率最高可达6 1 5 ，均 达显著水平。 关键词：地衣芽孢杆菌发酵细胞分裂素分离田间试验 利用地衣芽孢杆菌发酵生产细胞分裂素 a b s t r a c t c y t o k i n i ni sk n o w na so n eo ft h es i xn a t u r a lp l a n th o r m o n e s ，i n c l u d i n gl a a ，g a s c t k , a b a ，e t ha n db r i t sp h y s i o l o g i c a lr o l ei sa sf o l l o w i n g ：1 ) h a v eg o o ds t i m u l a t i v e e f f e c to nc e l lf i s s i o na n dc y t o d i f f e r e n t i a f i o n ；2 ) a c c e l e r a t ec e l lg r o w t h ；3 ) p r o m o t ea t e r a l b u d s ；4 ) b r e a kd o r m a n c yo fs o m es e e d sa n db u d s ；5 ) r e d u c et h eh y d r o l y s i so fc h l o r o p l a s t a n dp o s t p o n eb l a d ea g i n g i tc a nb ea p p l i e de x t e n s i v e l yi nc r o p ss u c ha sv e g e t a b l e ，f r u i t s a n do t h e re c o n o m i cc r o p s t h i ss u b s t a n n c e ，f o ri n c r e a s i n gt h eo u t p u ta n di m p r o v i n g q u a l i t yn o t a b l y ，e x i s tg e n e r a l l yi nt h eb o d yo fp l a n t t h o u g hl i t t l ei nc o n t e n t ，i si t i n d i s p e n s a b l e ab a c i l l u sl i c h e n l ，。r m i s ，i s o l a t e df r o ms o i l i nb e i j i n g ，w a si d e n t i f i e db yc h i n e s e a c a d e m yo fs c i e n c e sa n dw a sf o u n dt op r o d u c ec y t o k i n i nb yf e r m e n t i o n n a m e l y ，i f a m a r a n t h u sc a u d a t u sw a sp r o v i d e dw i t l lc y t o k i n i na n dt y r o s i n e ，t h ec o t y l e d o n eo f e t i o l a t i o ns e e d l i n gc o u l ds y n t h e s i z eb e t a c y a n i n ，a l lb e t a c y a n i n s ，s o a k e db yr e i t e r a t i o n f o r s t ，c o u l db em e a s u r e dw i t hc o l o r i m e t r y ，s oi t sa c t i v i t yw a st r a c k e da n dr a t i o n e da tt h e s a m et i m e s t u d i e so nf o u re l e m e n t ss u c ha ss o yb e a nm e a l ，m a i z ep o w d e r ，y e a s te x t r a c t a n dc a c 0 3w e r ec o n d u c t e di nt h r e el e v e l su s i n gt h eo r t h o g o n a lf o r mo fi - o ( 3 4 ) t o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c t so n b i o s y n t h e s i s t h e r e s u l td e m o n s t r a t e dt h e o p t i m i z e d f e r m e n t a t i o nm e d i u mw a s ：0 8 o fs o y b e a nm e a l ，1 o fm a i z ep o w d e r ，0 2 o fy e a s t e x t r a c t s o l v e n t - e x t r a c t i o na n dc h r o m a t o g r a p h yw e r eu s e dt o p r e l i m i n a r i l y e x t r a c ta n d s e p a r a t ec y t o k i n i n i nf e r m e n t a t i o nc u l t u r eb r o t h t h es t m c t u r ew a sa n a l y s i z e d b y c o m p a r i n g t h er fv a l u eo f t h et h i nl a y e rc h r o m a t o g r a m ( t l c ) ，t h eu v - s p e c t r u m ，t h e r e t e n t i o nt i m eo fr p h p l ca n dt h es p e c t r u mo fn m r t l cw a sc a r r i e do u to np l a t e s p r e c o a t e dw i t hs i l i c a lg e l 如4 ，f o rb e t t e rs e p a r a t i n gm e t h o d so fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y p o w d e ro fs p r a y i n gd r y i n gw a se x t r a c t e dw i t h8 0 o fm e t h a n o l ，f o l l o w e db ye x t r a c t i o n w i t hn - b u t a n o la tr o o mt e m p e r a t u r e t h ec o m b i n e de x t r a c t sw e r ec o n c e n t r a t e di nv a c u ot o g i v eac r u d ee x t r a c t ，w h i c hw a sp a r t i t i o n e db e t w e e nh 2 0a n dn - b u t a n o lt op r o v i d e n b u t a n o le x t r a c ta n dw a t e rs o l u b l ef r a c t i o n t h en - b u t a n o le x t r a c tw a sc o n c e n t r a t e da n d s u b j e c t e dt oc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ye l u t e dw i t hs o l v e n tm i x t u r eo fm e t h a n 0 1 c h l o r o f o r m ( 9 2 ：8 - 9 ：1 ，b yv 0 1 ) t o 舀v et h r e ef r a c t i o n s f r a c t i o nb ，w h i c hh a de f f e c t i v ea c t i v i t y ，w a s c o n c e n t r a t e da n ds u b j e c t e dt oc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ( m e t h a n o l c h l o r o f o r m9 ：1 ，b yv 0 1 ) a g a i n ，g e tc y t o k i n i n ，w h i c hs h o w e dah i g hs p e c i f i ca c t i v i t y i i 华中农业大学硕：l 学位论文刘仲 t h ec u c u m b e lt h eb i o a c t i v ec o m p o n e n to b t a i n e dc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho ft h e c u c u m b e ra n de n h a n c et h ed i s e a s er e s i s t a n c eo fc u c u m b e r c o m p a r e dw i t ht h e i rc o n t r o l ， t h eo u t p u tw a si n c r e a s e db y3 4 8 ，2 5 3 ，1 9 8 ，r e s p e c t i v e l y ，r e a c h i n gn o t a b l ee f f e c t o ni n c r e a s i n gc u c u m b e ry i e l d m o r e o v e r ，e f f i c i e n c yo fi n h i b i t i o nt oc u c u m b e rd o w n y m i l d e wa n da n t h r a c n o sc o u l db eu pt o3 6 a n d6 1 5 ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ；f e r m e n t a t i o n ；c y t o k i n i n ；f i e l dt r a i l s ；i s o l a t i o n i i i q 用地在芽孢杆藏艇醇生产细腿分裂豢 缩略语( a b b r e v i a t i o n l a b aa b s c i s i ca c i d a r c ka r o m a t i cc y t o k i n i n a p r ta d e n i cp h o s p h o r i b o s y l t r a s f e r a s e b a p b e n z y l a d e u i n c b rb r a s s i n o b i l ee p 南r a s s i n o l i b e c b p c y t o k i u i nb i n d i n gp r o t e i n c c y o k i n i n d od i s s o l v e do x y g e n e t h e t h y l e n e g a g i b b e r e l l i n g c g a se h r o m o t o g r a p h y h p l c h i 醇p r e s u r el i q u i dc h r o m o t o g r a p h y i p a l s o p c n t e n y l a d e n i n e i s c k l s o p e n t e n y lc y t o k i n i n k tk i n c t i n m t 6 - ( 3 - h y d f o x y b e n z y l a m i n o ) p u f i n e n m rn u c l e a rm a g n e t i ci e $ o n a l l c o 0 d o p t i c a ld e n s i t y t l ct h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 脱落酸 芳环细胞分裂素 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 苄基腺嘌呤 差苔索内酯 细胞分裂索结合蛋白 细胞分裂素 溶氧 乙烯 赤霉素 气相色谱 嘉效液相色谱 异戊烯基腺苷 异戊烯基细胞分裂素 激动素 6 ( 3 羟苄基氨基) 嘌呤 核磁共振 光密度值 薄层色避 华中农业大学硕士学位论文刘俅 第一章文献综述 1 1 细胞分裂素及产生菌的研究进展 1 1 1 前言 2 1 世纪的农业生产，将用新农业生物技术从根本上改造传统农业，为农业带 来新一轮的革命。我国的粮食问题再次成为举世注目的焦点和热点，引起了一场世 界性的大辩论。新的农业技术革命，为解决十几亿人的食物，充分有效地利用可再 生的生物资源，更好地满足日益增长的人口对食物的需求，推动本世纪的经济向更 高水平发展提供了保障。 在未来世界范围内的竞争中，生物技术占有举足轻重的地位，它的成败对于以 农业为主的发展中国家所产生的影响将更是生死攸关，尤其像我国这样以传统农业 为主要出口产品的国家，随着生物技术的迅速发展，非生物技术的传统农产品将在 产量、质量和价格上，纷纷失去竞争力。在世界新技术革命浪潮的推动下，我国农 业加快了科技革命的进程，生物工程的研究与发展呈现出蓬勃发展的势头，并取得 一批很有显示度的成果，几十年来，我国农业生物工程经历一个从无到有，从跟踪 模仿到有所创新，从实验室到大田的发展历程，生物技术的应用极大地促进了我国 农业的发展。 利用生物工程发酵生产细胞分裂素，可调节作物的生长，使粮食增产，促进农 业的发展。天然细胞分裂素广泛存在于高等植物中，但在植物体内细胞分裂素含量 很低，一般为1 0 4 1 0 冉g ，并且含量极不稳定，随植物生育期、生长季节和植株部 位的不同而变化。目前商品化细胞分裂素主要来源于有机化学的多步合成，因其产 率低、价格昂贵，生产规模仅能满足试剂级水平，并且有些种类我国目前尚不能合 成，依赖进口，严重影响了人们在农业生产和生活上的需要。而微生物具有生长速 率快、生产周期短、培养条件易控制不受季节限制等特点，故用微生物生物合成、 发酵生产细胞分裂素已引起各国学者的兴趣和重视，并开展了微生物源细胞分裂素 的研究。 1 1 2 细胞分裂素及其产生菌的发现 早在5 0 年代初期，美国人s k o o g f 在培养烟草髓部组织时，发现在培养基中 加入酵母提取液，可促进烟草髓的细胞分裂( s k o o gf ，1 9 5 3 ) 。同年，m i l l e r 等从高 雁灭菌后的d n a 中提取出一种物质，因为它能使多核细胞发生胞质分裂，经分离 提纯后命名为激动索( m i l l e r ，1 9 6 1 ) 。激动素并不是天然的植物生长调节物质，而 是d n a 的降解产物。1 9 6 3 年l e t h a m 从玉米成熟种予中分离出了玉米素( z e a t i n ) ， 利用地农芽孢杆菌发酵生产细胞分裂索 这是第一个分离出的天然细胞分裂索( l c t h a m ，1 9 6 3 ) ，后来，人们又从黄羽扁豆未 成熟种子中分离出了二氢玉米素；从土壤农杆菌中分离出了2 异戊烯腺苷即z i p a ( 蔡 可，1 9 8 4 ) 。 6 0 年代，尹莘耘对5 4 0 6 菌肥作用机理进行过一系列的研究( 尹莘耘，1 9 6 5 ) 。 1 9 7 5 年，辽宁省林业土壤研究所报道了从5 4 0 6 中提取3 种不同成分的刺激物质： 苯乙酸、琥珀酸和一种未知物质，但这种刺激物质具有明显的细胞分裂素的生物活 性：刺激细胞横向伸长：刺激细胞分裂；打破休眠。1 9 7 7 年，杭州大学生物系报道 了从5 4 0 6 发酵液中提取出具有生物活性的嘌呤嘧、啶环类物质。 1 9 8 9 年，张靖溥等从泾阳链霉菌的突变株及其融合子中提取出细胞分裂素和 z i p ( 张靖溥，1 9 8 9 ) 。1 9 6 8 年，c o p p o l a 等从浅黄链霉菌的培养液中纯化出细胞分裂 索( g r e e n e ，1 9 8 0 ) 。 不仅放线菌能产生细胞分裂素，某些细菌、真菌亦能产生细胞分裂素。例如 c o r y n e b a c t e r i u m f a s c i a n s ，r h i z o b i u ms p ，a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ，r h i z o p o g o n r o s e o l u s ，r u s s u l ad e l i a 等等，能产生细胞分裂素。 t h i m a n n 于1 9 6 6 年首先证明了c o r y n e b a c t e r i u m f a s c i a n s 产生细胞分裂素 ( t h i m a n nc ta 1 ，1 9 6 6 ) 。同年，k l a m b t ( k l a m b te ta 1 ，1 9 6 6 ) 等从该菌的培养液中 检测到3 种具有细胞分裂索活性的组分，并获得各自的结晶。这3 个组分分别被进 步确定为z i p ( h e l g e s o ne ta 1 ，1 9 6 6 ) 、顺式玉米素( s c a r b r o u g he ta 1 ，1 9 7 3 ) 和 甲硫基顺式玉米素( a r m s t r o n g e ta 1 ，1 9 7 6 ) 。在纯化顺式玉米素的过程中，还分离 出少量的玉米索( r a t h b o n ee ta 1 ，1 9 7 2 ) 。该菌的培养液种还能检测出z i p a 和玉米 素核苷。该菌产生的细胞分裂素中，生物活性最强的是z i p 和玉米素。 k l a m b t 于1 9 6 7 年首先报道了a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s 产生细胞分裂素。他是 从菌株b 6 的培养液中检测出来的，并经纸色谱确定为z i p 。他的这一结论被u p p e r 等于1 9 7 0 年用气液色谱证实了( u p p e r e ta 1 ，1 9 7 0 ) 。k a s s c h a p m a n 等于1 9 7 7 年报 道了该菌株c 5 8 的培养液中分离出了玉米素( k a l s s c h a p m a n n e ta 1 ，1 9 7 7 ) 。 g i a n n a t t a s i o 等于1 9 6 9 年从p , h i z o b i u ml e g u m i n o s a r u m 的培养液中检测到3 种具 有细胞分裂素活性的化合物，其中之一确定为z i p 。p h i l l i p s 报道了从r h i z o b i u m l e g u m i n o s a r u m 和r j a p o n i c u m 的培养液种检测出玉米素核苷( p h i l l i p se ta 1 ，1 9 7 0 、 1 9 7 2 ) 。俄罗斯的凡位研究者从l 屯m e l i l o t i 的几个菌株的培养液种检测出具有细胞分 裂素活性的嘌岭。 m i l l e r 于1 9 6 7 年首先报道了从菌根真菌r h 妇o p o g o nr o s e o l u s 的培养液种检测出 两种具有细胞分裂索活性的化合物玉米素和玉米索核苷( m i l l e r ，1 9 6 7 ) 。g o g a l a 于 1 9 7 1 年报道了从b o e t u se d u l i s v a r 、p i n i c o l u su i t t 的菌丝、子实体和培养基中分离出 一种细胞分裂素活性的化合物。1 9 8 8 年，李玉萍等从树木菌根真菌美味红菇菌丝体 和发酵液中提取出了细胞分裂索( 李玉萍，1 9 8 8 ) 。从菌丝体中提取出的玉米素浓 2 华中农业大学硕士学位论文刘伟 度为1 5 3 3 m g l ，从发酵液中提取出的玉米素浓度为2 6 m l ，激动索浓度为3 m l ， 而且提取回收率只有5 0 。 从人们已经分离出的天然细胞分裂素的结构式发现，他们都是腺嘌呤在n 6 位 置上取代的衍生物。因此，称这类物质为细胞分裂素。人工合成这类化合物只要腺 嘌呤上任何没有代替和n 6 位置上的n 没有代替，同样具有细胞分裂素的生理活性， 而且，可获得较天然细胞分裂索生理活性更强的合成化合物。 表1 已检测到分泌细胞分裂素的微生物 t a b l e1 m i c r o b ep r o d u c e dc y t o k i n i n s 利用地衣芽孢杆菌发酵生产蜘f 胞分裂豢 1 1 3 微生物细胞t r n a 中的细胞分裂素 c t k 还存在于各种生物的t r n a 上。表2 列出了微生物细胞t r n a 中的c t k 种 类。t r n a 具携带和输送特定的氨基酸功能。( 结合在紧靠t r n a 反密码子3 - 端 处。但并不是所有的t r n a 都结合有c t k 。只有编码氨基酸的密码碱基顺序以u ( 尿 嘧啶1 为起始密码子的t r n a 才有，而且也不是所有以u 为起始氨基酸编码的t r n a 上都带有c t k 。例如大肠杆菌的t r n a 在六种以u 为起始的t r n a 中都结合着c t k ， 即苯丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氮酸和色氨酸的t r n a 带有c t k ，但 在酵母菌中，只有亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的t r n a 有c t k 。微生物细 胞t r n a 中的c t k 只有当细胞裂解、t r n a 降解后方能释放。表2 为微生物的t r n a 中的c t k ，主要是z i p a 和核糖基细胞分裂素以及这两种化合物的甲基硫衍生物关 于c t k 结合在t r n a 上的意义，有人认为游离的c t k 可能来源于t r n a 分子的降 解，c t k 与t r n a 脱离以后，才具有植物激素活性。但存在于细胞t r n a 上的c t k 量极少而游离c r k 的量相比之下要多得多，这就无法解释这一推测。亦有人认为 游离c t k 与t r n a 的c t k 无关系，因为已有证据表明c t k 合成途径中并不涉及 t r n a 。此外还有人认为游离c t k 具有抑制t r n a 中c t k 降解的作用。总之关于 c t k 与t r n a 结合的意义是有争论的，有待以后的研究来阐明。 4 c o l i ) 嗜酸乳杆蘸 ( l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s ) 植物乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 表皮葡萄球菌 ( s t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m i d i s ) 带化病棒杆蘸 ( c o r y n e b a c t e r i u m f a s c i a n s ) 大豆根瘤药m j a p o n i c u m ) 豌豆根瘤菌 ( r h i z o b i u m l e g u m i n o s a r u m ) m s - z i p a 2 i p a z i p a z i p a ，m s - z i p a z i p a ，m s - z i p a 顺式一核糖纂玉米素 反式核糖基玉米素 顺式一i r i s 核糖基玉米 素 核糖基玉米素 m s 核糖基玉：米素 m s - z i p a 顺式- m s 核糖基玉米 素 铜绿假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 鼠伤寒沙门氏菌 ( s a l m o n e l l ar y p h i m u r i u m ) 根癌农杆菌 0 9 r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 解淀粉欧文氏菌 叭跏缸a m y o l o v o r a ) 酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s a e ) 樱外囊菌( t a p h r i n ac e r a s i ) m s 核糖基玉米 素 m s - z i p a i n s z i p a z i p a ，m s z i p a 反式核糖基玉 米索 m s 核糖基玉米 紊 顺式m s 一核糖 基玉米素 m s - z i p a 2 i 队 核糖基玉米索 1 1 4 细胞分裂素常见种类 目前，从植物、微生物材料中发现和已经鉴定的嘌呤型c t k 有3 0 多种，如果 加上人工合成的和苯基脲型c t k ，那就更多了。常见的c t k 有激动素( k i n e t i n ， k t ) 、玉米素( z e a t i n ) 、= 氢玉米素( d i h y d r o z c a t i o n ) 、异戊烯基腺( i s o p e n t c n y l a d e n i n e ， i p a ) 、苄基腺嘌呤( b e n z y l a d e n i n c ，b a p ，6 - b a ) 、玉米素核苷( t r a n s z e a t i nr i b o s i d e ) 、 噻重氮苯基脲( t h i d i a z u r o n ，t d 动。 利用地农芽弛杆菌发酵生产细胞分裂素 尊r 髫。一嘉 。努一一g 塞米素 邴一娇一“g $ 一一科2 1 p a疆 玲：r $ 7 f i g1 c h e m i c a l s t r u c t u r e so fc y t o k i n i n sf r o mm i c r o b e s 1 1 5 细胞分裂素的生理功能 嘌呤型c t k 的生理作用是多方而的，但主要有如下三个方面。 促进细胞分裂和扩大人们在做细胞培养试验时，在满足细胞生长的其他一切 条件之后，细胞分裂和生长仍然很少，但补充c t k 之后，细胞就进行分裂，组织增 大，产生愈伤组织。c f k 还可使细胞体积增大，这种增大是横向的，即增粗。这一 点与生长素不同，生长素是加长。 延缓植物的衰老。这是细胞分裂素特有的功能。对延缓衰老的解释有两种原因 第一种原因是，c t k 能阻止核酸酶和蛋白酶的产生，从而保证了核酸、蛋白质和叶 绿素不被降解。第二种原因是，c r k 不仅能阻止营养物质外流，而且可以使营养物 质向c t k 所在部位运输。 诱导芽的分化。c t k 在愈伤组织的培养中，能诱导芽的分化。苯基脲型的c t k 除了具有上述功用外，还具有促进种子萌发、打破休眠等功能。 6 华中农业大学硕士学位论文 刘伟 1 1 6 细胞分裂素的作用机理 c t k 在植物细胞中究竟如何起作用，尚末彻底了解清楚。目前只有种种假设， 首先，人们在制备丝氨酸t r n a 时发现，在丝氨酸t r n a 反密码子的邻近部位含有 i p a 所以，人们认为i p a 可能作为t r n a 的一种组分控制着蛋白质的合成后来，人 们对这种假设提出了怀疑。理由是t r n a 上的i p a 是由已在t r n a 上的腺嘌呤加上 异戊烯基侧链而形成的，并不是细胞分裂素i p a 作为组分参加到t r n a 分子上。因 此，t r n a 上的i p a 的作用与细胞分裂素的i p a 没有什么关系。当前，认为细胞分 裂素i p a 与t r n a 中的i p a 也并不是同一物质，但二者有密切联系，当异戊烯基侧 链( i p ) 存在于反密码予邻近部位腺瞟呤( a ) 上时，t r n a 才有活性。如果该部位的 嘌呤缺乏异戊烯基侧链，就缺乏活性。植物细胞内有一种核酸酶，它能使这个侧链 水解掉而使t r n a 失活。细胞分裂素i p a 的作用，就是和这种酶结合为复合体，抑 制这种酶的作用，保护t r n a ，使蛋白质合成顺利进行。 1 1 7 细胞分裂素作用的分子机理 本部分将从信号的感受，转导和应签阐明细胞分裂素在细胞和分子水平上的功 能。蛋白质作为信号受体起作用，参与芳环细胞分裂素信号的转导。 1 1 7 1 植物体内的a r c k 结合蛋白 对首个a r c k 结合蛋白c b e i 进行了研究( f o xa n de r i o n ，1 9 7 5 ：e r i o na n df o x ， 1 9 8 1 ；b r i n e g a ra n df o x ，1 9 8 5 ；b f i n e g a re ta 1 ，1 9 8 5 ) 后认为，它可能是所有植物激 素结合蛋白中最有特点的。在c b f 1 中有一个氨基酸，类似于豌豆球蛋白种子贮减 蛋白中的氨基酸( b f i n e g a re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。在植物组织内，这种c b p 对b a 有高亲和力 ( 解离常数k t = 1 0 7 m o l l ) ，但对天然i s c k 无活性的细胞分裂素和腺嘌呤的亲和力较 低。在一些植物体内已发现一组相类似的细胞分裂素结合蛋白( c b p l ，分子量4 5 1 8 0 k d a 范围内，与细胞分裂素结合的亲和力在1 0 。5 1 0 m o l l 范围内( b r i n e g a r ，1 9 9 4 ) 。 此外，r o m a o v ( 1 9 9 0 ) 从5 天龄的白化玉米苗中分离得到一个可溶性蛋白质，分子质 量为4 6 k d a ，它对玉米素和活性细胞分裂素有很高的亲和力。而从大豆叶中分离得 到另一种分子最为2 踮3 0 k d a 胞质溶胶蛋白，它对细胞分裂素敏感，既能与结合在 染色质上的一种蛋白激酶共纯化，又能和r n a 聚合酶i 共纯化( s e l i v a n k i n ae ta 1 ， 1 9 8 8 ) 。当细胞分裂素直接加入含有染色质或r n a 聚合酶i 的培养基中，只能促进 蛋白激酶的活性，而不影响鼢i a 聚合酶i 的活性。胞质溶胶c b p 与细胞分裂素的 结合对酶的激活是必需的。最近有结论认为，细胞分裂素刺激r n a 聚合酶i 磷酸化， 能增加酶对转因子( c b p + 细胞分裂素1 的亲和力，转因子可促进r n a 的合成。细胞 分裂素结合蛋白研究说明，a r c k 和i s c k 在应答细胞分裂素结合蛋白的最早期阶 利用地教芽孢杆菌发酵生产细胞分裂豢 段有着明显地差别。其次，在植物体内具有两类相关的c b p s ，一类对细胞分裂索 亲和力很低，但对b a 的亲和力很高：另一类则相反( s i m a d 。1 9 9 7 ) 。 1 1 7 2 细胞分裂素结合的本质 最近研究发现细胞分裂素( c t k ) 对依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶( c d k ) 具有高 度特异性，而c r 剐c d k 2 共晶体的x 光结构确定也阐明了c t k 结合的本质。两者 相互作用的特异性表明，c t k 这个配体位于c d k 2 结合a t p 的位点上，有着十分严 格和特定的定位。使用了大约1 0 0 种腺嘌岭衍生物研究细胞分裂素对c d k 的特异性 抑制作用，发现只有c 2 ，n 6 ，n 9 ，三位取代腺嘌呤对p 3 4 c d c 2 细胞周期蛋白b 和相 关激酶有强烈抑制作用( h a v l i c c kc ta 1 ，1 9 9 7 ) 。对c d c 2 抑制作用进行动力学分析， 发现细胞分裂素是a t p 的竞争性抑制剂和组蛋白h 1 的非竞争性抑制剂( d ea z e v e d o e ta t ，1 9 9 7 ) 。而对a t p ，i p ，o c ( o l o m o u u c i n e ) 和r o s c ( r o s c o v i t i n e ) c d k 2 共晶体分 析则确定了c t k 位于c d k 2 内结合a 即的位置上( s c h u l z e g a h m e ne ta 1 ，1 9 9 5 ；d e a z e v e d v oe ta t 。1 9 9 7 ) 。在这些细胞分裂素中，腺嘌呤的嘌呤环以一种未知的方式定 位，与真正底物a t p 的腺嘌呤碱基定位完全不同。由于细胞分裂索的嘌呤环和侧链 多数是疏水性的，c r k 和c d k 2 的结合是通过疏水和范得瓦尔斯键相互作用于同一 疏水的酶残基，雨a t p 的腺嘌呤碱基位于琉水的酶残基形成的区袭里。由于嘌呤环 有不同的方位，酶和腺嘌岭的不同原子形成接触( s c h u l z e g a h m e ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。与 i p 嘌呤环形成的接触数量和与a t p 嘌岭环形成的接触数量相似，含有3 个氮键，其 中两个氢键是和同一酶残基( g l u 8 1 0 ，l e u - 8 3 n ) 形成的。细胞分裂素的嘌呤环几乎 是平面结构，所以对一些细胞分裂素的晶体研究发现，氢键在嘌呤环的n 9 位形成， 而不是在n ，位形成。此步 ，c i 目c d k 2 共晶体证实了对细胞分裂紊活性结构的研究， 嘌呤的n 7 、n 3 、n 9 位需具有自由取代的能力，因为氢键在这些n 原子上形成。 特别令人感兴趣的是i p a 的异戊烯基侧链和，或b a ，0 c ( 2 - ( 2 羟乙基6 苄基氨 基9 甲硫基腺嗓呤) ，r o s c 分子的苄基环占据了c d k 2 区域，因为这些位置远离结 合区袋。异戊烯基和苄基与c d k 2 酶各自形成8 个和1 6 - 2 0 个范得瓦尔斯键，从而 增加了( 玎到c d k 2 间的相互作用和结合的特异性。此外，c d k 2 和细胞分裂素埋藏的 表面区域表明它们在庞大n 6 侧链周围区域有很紧密的结合，说明这种接触残基对结 合部位具有选择性( s c h u l z e g a h m e ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。n 7 位置的空间排斥作用使n 6 取代 基远离n 7 。由于n 6 位上庞大的异戊烯基或苄基构象，n 7 完全被保护起来了，不可 能成为氢键供体。此外，由于n 6 侧链远离咪唑环，只有在o c 和r o s c 的嘌呤j 不( i p 末发现) 反转后，n 6 氨基团才能形成氢键。最后，细胞分裂素主要的疏水侧链能被 3 羟苄基团取代( m r 的n 6 取代基) ，也能被活性细胞分裂素的其他侧链取代。值得 注意的是。三种细胞分裂素i p ，o c 和r o s c 不仅在构象方面相似，而且在结合上 也相似。甚至它们的共晶体位于a t p 结合区袋的同一空间位置上。因为细胞分裂素 8 华中农业大学硕士学位论文 刘伟 c d k 2 抑制剂都是n 6 位取代，并且有着相似的构象，这些细胞分裂索出现的特异结 合位点可能是这类化合物一个普遍的结构特征。尽管细胞分裂素结合在c d k 2 的a t p 结合区袋是很重要的，但它不能解释细胞分裂素在细胞分裂、衰老延迟等方面所执 行的信号刺激作用。 1 1 8 细胞分裂素的检测 细胞分裂素的测定是细胞分裂素开发和利用的基础，是必不可少的手段。依据 测定时所利用的原理的不同，检测的方法可分为三类。 1 1 8 1 生物测定法 生物测定法是依据植物激素的生理活性，通过某些植物的组织或器官产生的特 意性反应来进行测定。其特点是简单易行，不需要高、精、尖的仪器，在般的实 验室中能建立起这种测试方法。第二个特点是，不仅能反映植物激素的生理活性， 还可以鉴定新的植物激素和生理活性的物质。缺点是植物体内往往存在着许多激素 分子的类似物，从而干扰测定结果；其次是测定周期长，短的需一周，长的可达2 3 个月。 细胞分裂素的生物鉴定法的种类很多，经典的有烟草茎髓和大豆子叶愈伤组织 培养法、萝h 子叶扩大法等。前者很费时，后者准确性和敏感性都较差。现在常用 的是尾穗苋黄化幼苗子叶的苋红素合成法和黄瓜子叶叶绿素合成法。前者的依据是 苋红素在尾穗苋黄化幼苗子叶中的合成与所用细胞分裂素成正相关；后者的依据则 是叶绿素在黄瓜子叶中的合成与所用细胞分裂素浓度成正相关。 1 1 8 2 免疫学方法 免疫学方法是利用抗原与抗体的特异性竞争结合的原理。以植物激素为抗原免 疫动物得到特异性抗体，一定量的标记激素分子a g 与样品中含量未知的激素分子 a g 在同一反应系统内，竞争地与一定量的特异性抗体结合。当反应达到平衡时，可 以测定出标记激素分子存在于抗原抗体复合物a g a b 和游离状态a g + 的比例。据反 应平衡理论可知，如果样品中未标记的激素分子的曩越多，那么形成的标记性复合 物就越少。由此，通过a l g * a g a b 的比值的测定，就可以计算出样品中激素分子的 含量。标记物通常采用放射性同位索，即放射免疫测定法( 简称r i a ) ，也可采用酶 分子标记，即酶标免疫测定法( 简称e l i s a ) 。 该法的优点有：1 ) 检测灵度高，可检测出1 0 - t 2 9 的微量物质；2 ) 专一性强： 3 ) 减少了前处理引起的活性物质豹丧失。有利于定量分析的准确性：4 ) 不需昂贵 的仪器设备。主要仪器为酶联分光光度计。缺点有：1 ) 抗体制备比较复杂，这是因 为植物激素本身没有免疫原性，需通过偶联反应与蛋白质结合才能诱发动物产生抗 体；2 ) 免疫学方法具有一些难以避免的交叉反应；3 ) 不能鉴定化合物结构。 1 1 8 3 物理化学方法 9 利用地衣芽孢杆蕊发酵生产细胞分裂索 分光谱法和色谱法。光谱法包括紫外吸收光谱和红外吸收光谱。它们虽灵敏度 高但专一性差，只能对纯化后的激素分子进行定性和结构鉴定。 色谱法时利用物质在不同介质中的分配原理，包括纸上层析、薄层层析t l c 、 气相色谱、高效液相色谱h p l c 以及气质联用g c m s 等。其特点是分离与测定同 时进行。纸上层析和t l c 应用较早，它们是将激素样品在两相介质中分配后再通过 显色等方法进行鉴定。它们的分离效率和灵敏度虽较差，但需要的设备简单，容易 操作，所以仍是常用方法，并常与生物检测法联用。g c 和h p l c 是在纸上层析和 t l c 的基础上发展起来的色谱方法，自6 0 年代开始在激素的测定中应用。因其专一、 灵敏、准确，这类方法己成为当前激素测定中