（生物医学工程专业论文）应用组织芯片研究耐药相关基因在肺癌中的表达及临床意义.pdf

顺l 学位论义 戍用组织芯片i i 究耐药相氓肇蚓n 肺捕中的表达及临床意义 a b s t r a c t a i m ：t o s t u d yt h em e a n i n go fe x p r e s s i o n so fp - g p ，m r p , l r p a n dg s t - i nt i s s u e s m i e r o a r r a y o fl u n gc a n c e r m e t h o d s ：t h e r ew e r e2 2 6c a s e so fl u n gc a n c e r sa n d2 3 c a s e so fn o r m a ll u n gt i s s u e sm a d eb yt e c h n o l o g i c a lo ft i s s u e sm i c r o a r r a y ，a tt h es a m e t i m e ，t h e t i s s u e s m i c r o a r r a y o f l u n g c a n c e r sw e r ed e t e c t e d b y s - p i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw i t l lp - g p m r p , l r p a n dg s t - r e s u l t s ：t h e p o s i t i v er a t eo f p g p m r p , l r pa n d g s t - i n l u n g c a n c e r si s4 6 0 、4 2 0 、5 4 4 、6 24 r e s p e c t i v e l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e e x i s t sb e t w e e nt u m o r o u st i s s u ea n dn o r m a l l u n g t i s s u e s ，p o o r l yd i f f e r e n t i a t e d t y p ea n dd i f f e r e n t i a t e d t y p e ，n s c l ca n ds c l c ( p 5 c m ) 作为对照。男性l5 7 例， 女性6 9 例；年龄3 1 - - 7 5 岁，中位年龄5 5 岁；分型按w h o ( 1 9 8 1 年) 标准，分 期按1 9 9 7 年u i c c 标准，鳞癌1 0 5 例，分化程度：低3 l 例，中、高7 4 例；腺癌 8 1 例，分化程度：低2 6 例，中、高5 5 例；小细胞癌4 0 例。临床分期：i 期4 1 、 i i 期7 3 例、i i i 期9 9 例、期1 3 例，分期检查包括胸部正侧位x 线片、部分术前 纤维支气管镜检查、胸、头颅c t 、腹部b 超和骨扫描；右肺1 1 9 例，左肺1 0 7 例： 中央型6 7 例，周围型1 5 9 例：6 3 例有术前化疗史：2 6 例术后时间短未记入随访， 术后6 个月2 年内复发转移9 7 例，术后出院失访5 9 例。 2 2 主要试剂和仪器 2 2 1试剂 1 ) p - 印鼠抗人单克隆抗体c 4 9 4 ，m r p 鼠抗人单克隆抗体d t x l ，l r p 鼠抗人 单克隆抗体1 0 3 2 ，g s t - n 鼠抗人单克隆抗体3 5 3 1 0 。 2 ) 即用型免疫组化超敏s - p 试剂盒包括：a 内源性过氧化酶阻断剂，b 正常 动物非免疫血清，c ，生物素标记的第二抗体，d 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶。 d a b 显色试剂盒。以上产品均购自福州迈新生物试剂开发公司。 3 ) 柠檬酸抗原修复缓冲液，p b s 缓冲液，苏木素染色剂，中性树胶封片剂， 多聚赖氨酸，石蜡，各种浓度乙醇，二甲苯液，各种浓度甲醛等均由解放军八一 医院病理科实验室提供。 2 2 2 仪器 q p 切片漂烘温控仪：安徽医用科研所生产； l e i t z 一1 5 1 2 型切片机：德国l e i t z 公司： s h a n d o n h y p e r c e n tx p 型病理脱水机：英国t h e r m o 公司： 隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗仪器厂： o l y m p u s c x 4 0 显微镜：闩本o l y m p u s 公司： 硕p 学位论文 应用绁织，“研究耐药相关毕圳矗。肺痛中的表达及临床意义 小天鹅b c d 1 9 1 型冰箱：无锡小天鹅公司； a i t i n gd c l i 8 0 0 c y 型微波炉：福建德塞路公司； 孵育盒：福州迈新公司； p h 调试仪选用m e t t l e rt o l e d o3 2 型： 电子天平选用a d v e n t u r e rd h a u s 型； 各种型号移液器和移液枪头购自上海生工公司； 特制带芯穿刺针，内径1 0 m m ；游标卡尺： 免疫组化油笔：福州迈新公司； 不锈钢高压锅：上海不锈钢制品厂。 2 3 方：法 2 。3 1新近收集肿瘤及正常组织标本处理 2 3 1 1 取材：取远离病灶( s c m ) 的f 常肺组织，肿瘤及正常肺组织切成 大小约为l x l x 0 3 c m 组织块： 2 3 1 2 固定：室温下1 0 中性甲醛固定液固定1 5 小时； 2 3 1 3 组织脱水、浸蜡及包埋：室温下，将组织块先后按次序浸入：5 0 乙 醇2 h ；6 0 乙醇2 h ；7 0 乙醇2 h ；8 0 乙醇2 h ：9 5 乙醇( 1 ) 2 h ：9 5 乙醇( 2 ) 1 h ；1 0 0 乙醇( 1 ) l h ；1 0 0 乙醇( 2 ) l h ：1 0 0 乙醇( 3 ) l h ；二甲苯( 1 ) 3 0 m i n ： 二甲苯( 2 ) 3 0 r a i n ；二甲苯( 3 ) 1 5 m i n ；6 0 石蜡( 1 ) 2 h ；6 0 。c 石蜡( 2 ) 2 5 h ， 最后石蜡包埋。 2 3 2 组织芯片制作“2 - ”1 2 3 2 1 芯片的排布设计：从医院病理科档案材料中选取组织蜡块，并调出 相应h e 染色组织切片及病历，将组织腊块分类登记，设计排布顺序。 2 3 2 2 标记靶点：对组织h e 切片作形态学观察选择合适穿刺点范围，并在 供体蜡块上准确标记。 2 3 2 3 采集组织蜡芯：为防止穿刺时供体蜡块丌裂，将供体蜡块放在3 5 。c 温箱中烘1 0 m i n 。然后用穿刺针从组织块选定部位逐个取出组织芯。 2 ，3 2 4 排列：将组织蜡芯小心地按一定顺序转移至预先设计的阵列中，相 邻两柱蜡芯间相距约l m m 。在组织蜡芯样本填入阵列中时应该记录每个样本的二 维阵列中的具体位置，此外还应该在一定位置留下记号，方便辨认组织芯片的方 位。 2 3 2 5 灌制组织蜡块：将经纯化的石蜡7 0 6 c 熔化，小心浇注于排布好的组 硕i 学位论文 应用组织芯h 宄耐药相关皋川订肺擗中的表达驶临床意义 织阵列，待凝固后制成组织芯片阵列蜡块。 2 3 2 6 玻片的准备：载玻片经过清洁液浸泡、充分水洗并烘干，用l o 多 聚赖氨酸处理玻片，烘干备用，可有效防止脱片及折片。 2 3 2 7 切片：组织蜡块冰箱内4 c 预冷，对组织芯片蜡块切片，厚5u m ，切 下的组织通过漂浮捞片平整地粘贴于载玻片上。凉干后6 0 。c 烤片3r a i n ，5 8 c 继续 烤片1 8h ，2 0 保存备用。 2 3 3 组织芯片免疫组化标记 方法步骤：严格按说明书操作，d a b 显色。以试剂盒提供的肠腺癌切片作为 阳性对照，p b s 代替一抗作阴性对照一抗为鼠抗人耐药基因单克隆抗体，显色 免疫组化采用s p 法，二抗链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶，底物选择d a b 。 2 3 3 1 切片脱蜡至水：常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精至水后，浸 泡于蒸馏水中待用。 2 3 3 2 抗原修复：切片加热处理，暴露抗原。取1 0 0 0 m l 左右p h = 6 0 柠檬 酸缓冲液倾于压力锅中，大火加热直至沸腾：将脱蜡水化后的组织切片置于耐高 温塑料切片架上，放入已沸腾的蒸馏水中。盖上金属盖，扣上压力阀，继续加热至 喷汽，1 2 分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温取出玻片，先用蒸馏水冲洗 两次，之后用p b s 冲洗两次，每次3 分钟： 2 3 3 3 阻断内源性过氧化物酶：切片加一滴过氧化物酶阻断液( 试剂a ) ， 室温下孵育1 0 m i n ，以阻断内源性过氧化物酶的活性。p b s 冲洗三次，每次3m i n ： 2 3 3 4 滴加正常非免疫动物血清：去p b s 液。每张切片加一滴正常非免疫 动物血清( 试剂b ) ，室温下孵育1 0 m i n ： 2 3 3 5 滴加一抗：除去血清，每张切片加一滴第一抗体( 试剂b ) 4 c 过夜， p b s 冲洗三次，每次5m i n ； 2 3 3 6 滴加二抗：p b s 冲洗三次。每次3m i n 。除去p b s 液。每张切片加 一滴生物素标记的第二抗体( 试剂c ) ，室温下孵育1 0 r a i n ，p b s 冲洗三次，每次3 m i n ； 2 3 3 7 加链霉菌抗生素一过氧化物酶：除去p b s 液。每张切片加一滴链霉菌 抗生素一过氧化物酶溶液( 试剂d ) ，室温下孵育1 0 m i n ，p b s 冲洗三次，每次3m i n ； 2 3 3 8 显色：除去p b s 液，每张切片加两滴新鲜配制的d a b 溶液，显微镜 下观察3 m i n ； 23 3 9 复染：自来水冲沈，苏木素复染，0 1 h c l 分化，p b s 冲洗返蓝； 2 3 3 1 0 封固：切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。 倾j 。学位论文应用组织芯片硼究耐药相关幕在肺癌中韵表达及临床意义 2 4 结果判断 染色呈棕黄色为阳性，无阳性细胞或阳性细胞 5 0 者为强阳性( + 十+ ) 。 2 5 统计方法 数据输入s p s s l 2 0 统计应用软件。统计学分析采用x2 检验及相关性分析。 坝i ，学位论文 应用龃l 织匕f | 宄耐药牛日关壮订肺煽中的表然投l j 岛床：c j = 义 3 结果 3 1 组织芯片 得到包含6 3 、8 1 、1 0 5 组织点三套组织蜡块，蜡块完整，肉眼可见组织点排列 整齐，无缺损现象；芯片h e 染色结果：点阵分布均匀，组织点完整，无组织脱片 及折叠现象；免疫组化中分别有6 3 、引、1 0 5 个组织点三种芯片，每个两组，分别 滴加四种不同抗体，完成全部实验共用2 4 张芯片。肉眼观察组织芯片中的组织点 排列整齐，外形为圆形或类圆形，显微镜下免疫组织化学染色对比清晰，较少的 皱折现象有个别组织点脱片，在全部1 9 9 2 个组织点有3 2 例组织点脱片，由于采 取每个检测指标标记两张切片方法，脱片部位不同，可选取质量好的无脱片相同 组织研读数据。不影响结果：少部分折片，面积不到1 1 0 ，不影响读片，p g p 、 m r p 、l r p 阳性染色主要在胞膜及( 或) 胞浆，棕黄色颗粒呈现局灶壮或弥漫分 布g s t - n 阳性染色在胞核及( 或) 胞浆，以胞浆为主。见图3 1 3 8 3 2 p - g p 、m r p 、l r p 、g s t - 在肺癌及正常肺组织中表达情况 在2 2 5 例肺癌组织中p g p 、m r p 、l r p 和g s t - 表达的阳性率分别为4 6 o 、 4 2 o 、5 4 4 、6 2 4 ，与正常肺组织具有显著性差异( p 00 5 ) ：非小细胞癌s c l c ) 与小细胞癌之间有显著 性差异( p 0 0 5 ) ：中、高分化与低分化差别显著( p 5 0 掌1 2 95 9 ( 4 5 7 ) 5 4 ( 4 1 9 ) 7 0 ( 5 4 2 ) 8 0 ( 6 2 0 ) 肿瘤大小 3 c m173 80 ( 4 6 2 )73 ( 4 2 2 )9 4 ( 5 4 3 ) 1 0 8 ( 6 2 4 ) 临床分型 周围型 l5 97 4 ( 4 65 )7 0 ( 4 4 o ) 8 4 ( 5 2 8 ) | 0 0 ( 6 2 9 ) 中央型 6 73 0 ( 4 48 )2 5 ( 37 3 ) 3 9 ( 58 2 ) 4 1 ( 6 12 ) t n m 分期 i 期、 4 11 9 ( 4 6 3 )1 7 ( 4 1 5 ) 2 2 ( 5 37 )2 5 ( 6 1 0 ) i i 期、 7 33 3 ( 4 5 2 )3 1 ( 4 2 5 ) 4 0 ( 5 4 8 ) 4 5 ( 6 1 6 ) l i i 期、 9 94 6 ( 4 65 ) 4 2 ( 4 2 4 )5 4 ( 5 4 5 )6 3 ( 6 3 6 ) 期 1 36 ( 4 62 )5 ( 3 85 ) 7 ( 5 38 ) 8 ( 6 1 5 ) 随访 复发转移 9 75 4 ( 55 7 ) 4 5 ( 4 64 )5 6 ( 57 7 )6 9 ( 7 1 1 ) 垂复盏 壁z q2 2f21 ：2 23l2 2 ：123 1f 8 ：13 1 ( ! 。! ：12 3 4 p - g p 、m r p 、l r p 、g s t 一共表达情况 p - g p 与m r p 、l r p 、g s t - 共表达分别有3 1 o 、1 9 o 、2 7 4 ，m r p 与l r p 、 g s t - n 共表达分别2 6 1 、2 7 4 ，l r p 与g s t _ n 共表达3 2 3 ，其中p - g p 与m r p 有 正相关关系( r 。= o 4 7 2 7 ，x2 = 5 0 5 0 ，p 0 0 0 5 ) ，p - g p - 与l r p 有负相关关系( r n = o 2 4 2 5 ，x2 = 1 3 2 9 ，p 00 0 5 ) ，任意三种共表达4 2 例，四种共表达有1 3 f f 0 。见表 3 3 。 表3 3p - g p ，m r p 、l r p 、g s t 一丌的共表达情况 r n 为列联相关系数 坝i 学位论文 心用组土织苍可耐药辅关摧4 i h 巾蝴中的表达及临床意义 4 讨论 组织芯片是将数十个至上千个小组织排放在一张载玻片上制成的组织切片。 由k o n o n e n ”1 等于1 9 9 8 年在c d n a 芯片基础上发展而来，是针对在原位检测不f i ；司 样本中同一实验指标设计的。我们在研究中常遇到大量具有临床资料和特征明显 的原发性肿瘤组织标本，需要验证检测某些特定指标的生物学特性，以及在肿瘤 发生、发展、临床诊断、治疗和预后预测中的作用。应用传统方法要完成众多操 作，组织芯片技术一次切片、染色便可同时对多个样本进行原位组织学研究，它 较之传统方法可在严格、均一的实验条件下高通量、快速、平行检测大批量组 织样本中的一个或多个实验指标，有利于消除不同批次之间的误差，检测比较的 结果具有很高的代表意义，并有利于统一标准王2 0 川。由于组织芯片的制作需二次 包埋，组织样本面积较小，切片较大块标本平整，褶皱少，影响脱片的因素少， 因此，组织芯片脱片率低。在制作组织芯片时，只是挖取蜡块的一部分，减少了 蜡块的消耗，有利于蜡块的保存，提高蜡块的使用效率1 2 2 】。应用组织芯片技术可 高效收集、比较和分析肿瘤发生、发展过程中检测指标的功能变化及其时相顺序、 相互间作用规律等相关分子病理信息。对于常规免疫组织化学染色中不同标本所 染一抗相同且种类较多的，非常有意义【l 。 我们参照国内李惠等4 j 制作组织芯片的经验，制作出3 套肺癌组织蜡块，考 虑到芯片的制作样本数量越多组织片的面积越小，芯片面积不是越小越好，细胞 数量少组织结构就不容易完全，目前商品化的组织芯片打孔仪内径多为2 0 。06 m m 之间，根据目前国际上常用的组织芯片样本量一般在6 0 1 0 0 个田】，我们应用打孔 针内径1 0 m m ，对2 2 6 例肺癌及2 3 例正常肺组织标本制作了各病理组织在一起的 组织芯片分别有1 0 5 、8 1 、6 3 点阵三套，所得组织芯片显微镜下免疫组织化学染 色对比清晰，排列整齐，外形为圆形或类圆形，只出现较少的皱折和掉片现象 ( 3 2 1 9 9 2 ) 。检测指标为耐药基因蛋白p g p 、m r p 、l r p 和谷光营肽硫转酶g s t - n ，通过综合分析探讨它们在肺癌组织中的表达及意义。 肺癌是严重威胁人们健康的恶性肿瘤，目前以手术治疗为主辅以化疗的综合 治疗措施总的5 年生存率仅为1 0 1 3 眦1 ，出现了所谓的“肺癌治疗瓶颈”这 一状况与肺癌的多药耐药性密切相关，肺癌的多药耐药性是肺癌术后无法控制复 发及转移的主要原因p j 。肿瘤细胞一旦对一种抗肿瘤药物产生耐药，对其他许多结 构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉抗药性，即多药耐药( m d r ) 1 2 4 1 ， 坝l - 学位论文 应用组织芯片研究耐药相关皋曲：舯癌中的表达成临床意义 分内源性和外源性，前者表现为肿瘤细胞对抗癌药物的天然不敏感，而后者为肿 瘤细胞因受药物的诱导或其他因素的激活而产生的抗药性。 目前发现的肺癌耐药机制有多种，多药耐药基因m d r l 是最早发现的抗药性基 因，也是目前研究较多耐药机制，1 9 7 6 年j u l i e a n l 2 5 首先在耐药的中国仓鼠卵巢细 胞中发现跨膜糖蛋白p - g p 。接着r o n i n s o 【26 j 等于1 9 8 4 年由中国仓鼠多药耐药细胞系 基因组中克隆成功m d r l 基因。在人类基因组中，含有m d r l 和m d r 2 两个基因，其中 m d r l 与多药耐药关系密切拉”。m d r l 基因位于7 q 2 1 1 ，全长3 3 0 k b 编码一个分子量 为1 7 0 k d 的跨膜糖蛋白，称为p g p ，由1 2 8 0 个氨基酸残基组成，具有膜转运功能， 由a t p 提供能量，能将多种化疗药物快速泵出细胞外，起药泵的作用，使胞质内的 药物浓度降低，从而避免了化疗药物对细胞的毒性作用表现出耐药性 4 j 。其耐药 谱广，对铂类、烷化剂、抗代谢类药物均耐药。k o o l 5 1 等研究表明p 印对天然的疏 水性抗肿瘤药物有较强的外泵作用，包括长春花碱、蒽环类、泊苷类、放线菌素d 和紫杉醇。 m r p 基因是c o l e l 2 8 等于1 9 9 2 年发现的，当时从无p g p 过度表达的人小细胞肺癌 耐药细胞系h 6 9 a r 中分离出一种过度表达的m r n a ，并克隆出其e d n a 。m r p 的 m r n a 长6 5 k b ， m r p 基因位于1 6 q 1 3 1 ，m r p 是m r p 基因编码的糖蛋白，分子量 为1 9 0 k d ，由1 5 3 l 氨基酸组成，也属于膜转运蛋白，其生理功能与细胞内解毒、氧 化应激反应和炎症等有关，在化学致癌物质侵袭时对机体有保护作用h i 。m r p 与 p g p 在一级结构上有1 5 的同源性【6 】，也是依赖于a t p 供能的药物m - = t b 泵，引起的 药物外排需谷胱甘肽参与，除使药物泵出细胞外还能在细胞内隔离药物，影响药 物的重新分布，发挥耐药作用。m r p 在人体组织中的表达有一定差异性，其中在 肺组织中表达较高【2 9 1 ，与肺癌多药耐药性的关系更为密切。有研究认为m r p 在肺 癌耐药中的作用有可能大于p g p l 3 0 】，参与介导肿瘤对阿霉素、长春新碱、v p i 6 、 顺铂等的耐药一1 。 肺癌耐药性相关蛋白是s c h e p e r l 9 1 于1 9 9 3 年在人非小细胞肺癌中首先发现，因 此被命名为肺癌耐药性相关蛋白( l u n gr e s i s t a n c ea s s o c i a t e dp r o t e i n ，l r p ) l r p 基1 7 7 i 定位于1 6 p 1 3 1 1 6 p 1 1 2 ，靠近m r p 基因位置，编码的肺癌耐药性相关蛋 白l r p 含8 9 6 个氨基酸，分子量为1 1 0 k d ，为构成人体穹隆蛋白( m v p ) 的主要成份， l r p 广泛分布在人体与外界相通的体腔上皮、血脑屏障、巨噬细胞和分泌性器官中， 因此认为l r p 的功能可能是清除机体有害物质。在肿瘤耐药中通过障碍胞质向核内 的药物进入，并依赖a t p 供能，将进入细胞核的药物转运到细胞质中同时以胞吐的 方式排到细胞外，使靶点药物有效浓度下降而产生耐药【1 0 】。i k e d a i 3 i j 等发现l r p 与顺铂敏感性有关，与足叶乙甙、阿霉素、长春新碱无关：而v o l m 3 2 l 等却认为其 坝 一学位论文 应用组织芯”究耐药相关皋川相。肺擒中的表达投临床意义 与阿霉素刚药有关：b e r g e r ”】等对1 6 种n s c l c 细胞进行体外研究认为l r p 对铂类药 物为内源性耐药，而对柔红霉索、博莱霉索、阿霉索为获得性耐药。有关i 。r p 的研 究是月前多药酬药热点，有待进一一步深入探讨。 谷胱苷肽硫转酶g s t 是一组生物转化酶，分布在泌尿、消化和呼吸上皮g s t - n 是最常见的一种同工酶，约占9 0 。以催化方式降解药物，参与毒素药物的代谢， 并且非特异结合化疗药物，协助药泵对药物的外排，具有代谢、转运药物及解毒 等功能，因而对耐药的产生起一定的作用】。一般表达g s t - n 阳性肿瘤对顺铂、 氮芥、环磷酰胺、瘤可宁、阿霉素等药物疗效不佳。d e f i l e 3 4 1 等研究显示g s t - n 含 量增加是阿霉素耐药因素之。a r a i 等p5 】认为g s t - n 阳性可作为化疗疗效的预测因 素之一。另外，在多种肿瘤恶变形成过程中，g s t - n 的表达会异常升高，被认为 是一个典型的癌前病变标志酶p 。 本组2 2 6 例肺癌组织标本进行p g p 、m r p 、l r p 和g s t - n 检测初步结果显示， 阳性表达率分别为4 6 0 、4 2 o 、5 4 4 、6 2 4 。2 3 例正常肺组织阳性表达1 7 4 、 1 3 0 、1 7 4 、2 1 7 。结果显示无论肿瘤组织还是正常肺组织均有定程度的阳 性表达，说明这些指标在正常生理功能中也发挥作用，可能与人体保护屏障有关 在清除有害物质及细胞内代谢方面发挥一定的生理功能。同时发现部分共表达现 象，其中p g p 与m r p 表现出萨相关性，- 与n a r a s a k i 等口0 l 研究一致，p g p 与l r p 表现 负相关性，表明一种共变关系，为进一步研究提供线索。以上结果提示肺癌耐药 由多基因及多途径参与并可能通过一定的协同发生作用，与有关报道相符【3 b 】。具 体机制尚待进一步阐明。 本试验显示p g p 、m r p 、l r p 和g s t - n 的阳性表达均与性别、年龄、肿瘤大小、 临床分型、i 临床分期无关，提示这些临床指标中耐药的几率相等，这里t n m i i 右床 分期只代表肿瘤进展程度，各期别均可发生耐药，不能以性别、年龄、临床分型、 临床分期判断化疗的敏感性。该结果与国外有关文献报道一致f 4 0 4 ”。 本试验p g p 、m r p 、l r p 和g s t - n 的阳性表达结果与肺癌组织病理类型显示出 如下的关系特点：阳性表达集中在非小细胞肺癌( n s c l c ) ，小细胞肺癌( s c l c ) 表达非常低，两者差别显著，小细胞癌虽以继发耐药为主，但本组资料显示化疗 前小细胞癌标本中也有一定比例的检出率及共表达率。结合目前临床治疗小细胞 癌化疗疗效虽较非小细胞癌高，但仍有部分患者未能达完全缓解效果，提示患者 中小细胞癌常非单一细胞类型，小细胞癌组织具有异质性，并可能存在一定的固 有耐药性a p g p 、m r p 、g s t - n 的阳性率由高到低为腺癌、鳞癌、小细胞癌，其 结果相对应i 临床化疗敏感性由低到高：在非小细胞肺癌分化程度越高，p g p 、m r p 、 l r p 年i g s t - n 阳性表达率越高，与l 临床j _ = 恶性度高的肿瘤反而对化疗敏感的现象相 硕i 一学位论义应用组织芯 l j 究耐药相关壮相m 掮中的表选发临床意义 符合。n o o t e r i b 】的试验也证实了同样结果，他通过免疫组化方法检测，发现肺鳞 癌6 e m r p 染色和肿瘤细胞分化程度存在相关性。以上结果说明小细胞肺癌及分化 程度低的非小细胞肺癌对化疗药物的耐药性低，相对应临床上对化疗敏感，对此 类肺癌应积极化疗。目前已有人建议由于耐药表型相关基因的表达与化疗疗效明 显相关。故为了提高患者的有效生存期对肺癌患者有必要检测癌细胞中的耐药 基因，对指导临床制定合理化疗方案，减少盲目用药有重大意义，可有效提高化 疗疗效【3 9 】。 试验中术前未化疗的肺癌组织p g p 、m r p 、l r p 和g s t - n 阳性表达率分别为 3 1 3 、3 44 、4 8 5 、5 0 3 ，与d e e r 等1 4 4 j 手道结果相似。提示：部分肺癌细胞 存在着较高的原发性耐药。同时化疗组比未化疗组阳性率高，差别显著，说明肺 癌耐药既有内在性，又有获得性。这可以解释临床上部分肺癌患者开始时就对化 疗不敏感，同时一些患者对首次化疗反应性高，而对相续化疗敏感性逐渐降低的 现象。 另外部分病例术后随访6 个月2 年，发现肺癌术后复发转移的患者癌组织中 p g p 、m r p 、l r p 、g s t - n 各指标阳性率明显高于无复发转移者，说明这些检测指 标不仅是病情发展过程中肿瘤细胞自身基因扩增以及化疗后肿瘤细胞产生了获得 性耐药的结果，而且还可能是肿瘤细胞生物学恶性行为的标志，预示蓿不良后果。 不难想像肿瘤的多药耐药机制势必影响术后化疗效果，导致患者术后肿瘤无法控 制的复发转移。一些实验研究也支持某些不同的肿瘤中多药耐药基因的表达水平 与肿瘤的侵袭性、复发、转移等不良后果呈j f 相关或负相关。女l j k a t s a r o sp 7 】等认为 l r p 阳性表达预后差，l r p 与预后关系密切。o s h i k a l 4 2 1 等对】0 7 例非小细胞肺癌患 者的表达情况进行了检测，发现m r e i j t 性患者的化疗效果较阴性差，认为m r p 的 高表达引起的耐药性影响非小细胞肺癌患者的预后；m a r r e 怕1 等应用r n a 斑点杂交 技术对4 l 例白血病患者进行研究，结果表明m d t l 表达与化疗敏感性和预后相关： s o i n i i i 等发现p g p 阳性病人在临床上比阴性病人缓解期和生存期明显缩短： k r i s s n a m e c h a r y 等也报道m r p 基因过度表达者预后差；m u r r a y 4 6 】等通过对一组神 经细胞瘤患者的研究还发现，多药耐药相关基因表达与化疗效果、生存期有相关 性。 本试验采用组织芯片技术联合免疫组织化学染色对肺癌及正常肺组织标本同 时检测多个多药耐药指标，取得了满意的结果，得出肺癌细胞耐药为一多途径多 基因参与的过程的结论，并提示联合检测多个多药耐药指标，可以对检测结果进 行综合判断，全面了解肺癌的耐药情况，有利于揭示肺癌耐药的原因，估计化疗 效果和预后，并且可指导i 临床依据其所表达出来的固有耐药机制制定化疗方案， 硕卜学位论文 f 、t 用组织芯片硎究耐药相关皋川n 刊巾鼎中的表达及临床意义 合理选择化疗药物，正确配伍，避免无效化疗药物引起的副作用；还可根据其产 生耐药机制的不同，应用或联合应用相应的逆转剂，以增强化疗疗效，改善预后， 提高生存率。在本试验中仅用2 4 张组织芯片即完成了全部实验，极大节约了研究 经费和降低了劳动量，在最短的时f b j 内获得了耐药基因蛋白p g p 、m r p 、l r p 和谷 胱苷肽硫转酶g s t - n 在肺癌组织中表达的全部数据。与传统方法所得结果基本一 致，显示应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的，具有快速、方便、 经济、准确的特点，组织芯片技术与传统的病理学技术方法相比，更加具有重要 的实际意义和广阔的应用前景。 坝：学位诧义应用组织芯川d 究耐药相关毕札怖搞中的表达及临床恋义 5 结论 ( 1 ) 应用组织芯片大规模高效检测肺癌组织样本是可行的，具有快速、方便、 经济、准确的特点，在肿瘤研究领域，组织芯片技术与传统的病理学技术方法相 比，更加具有重要的实际意义和广阔的应用前景。 ( 2 ) p g p 、m r p 、l r p 和g s t - n 的阳性表达均与肺癌患者性别、年龄、肿瘤 大小、临床分型、临床分期无关这些临床指标中耐药的凡率相等，不能以性别、 年龄、临床分型、临床分期判断化疗的敏感性。 ( 3 ) 肺癌术后复发转移的患者癌组织中p - g p 、m r p 、l r p 、g s t - n 各指标阳 性率明显高于无复发转移者，说明这些阳性指标可能是肿瘤细胞生物学恶性行为 的标志，预示着不良后果。 ( 4 ) 术前未化疗的肺癌组织中存在p - g p 、m r p 、l r p 和g s t - n 阳性表达， 同时化疗组比未化疗组阳性率高，说明肺癌耐药既有固有性，又有获得性。 ( 5 ) 本试验提示p g p 、m r p 、l r p 和g s t - n 的阳性表达与病理类型、分化 程度相关，非小细胞肺癌的表达明显比小细胞肺癌高，分化程度越高，表达率越 高，说明小细胞肺癌及分化程度低的肺癌对抗癌药物的耐药性低，其结果与l 临床 上恶性度高的肿瘤反而对化疗敏感的现象相符合，对此类肺癌应积极化疗，建议 对肺癌患者有必要检测癌细胞中的耐药基因，对指导临床制定台理化疗方案，减 少盲目用药有重大意义，有助于临床上提高化疗疗效。 ( 6 ) p - g p 与m r p 的阳性表达表现出正相关性，p g p 与l r p 表现负相关性， 表明一种共变关系- 提示肺癌耐药是多基因及多途径并可能相互通过一定的协同 作用来参与的埘药过程。 ( 7 ) 肺癌耐药为一多基因多途径参与的过程，联合检测肺癌组织中耐药相关 基因的表达有助于判断化疗疗效及预后。应用组织芯片大规模高效检测临床肺癌 组织样本是可行的。 倾1 一学位论空成用组皇只芯j 卅f 究耐药相关基闶在肺癌中的表达艟临床意义 致谢 本课题和论文的顺利完成，首先要感谢我的导师陆祖宏教授，感谢他的培养 和指导，他渊博的知识、忘我的工作精神和积极向上的生活态度使我无论在研究 还是生活中受益非浅。感谢东南大学生物医学工程系唐祖明教授、王进科副教授、 李同祥博士，他们的指点丌拓了我的科研思路，并从他们那里学到了许多科学方 法。 感谢解放军4 5 5 医院胸心外科段德溥主任在整个学习期间提供的时间和物质 上的大力帮助，使我能顺利完成学业。感谢解放军八一医院叶玉坤副院长，在我 入学时给予关心照顾。感谢解放军4 5 5 医院胸心外科汪栋主任的大力帮助，使我 能顺利完成学业。 感谢解放军八一医院病理科乐美兆主任在解决实验场地、试验材料、试验 条件上给与的大力支持。感谢病理科张佃乾副主任、王春淑副主任在实验中给予 的精心指导以及提供的设施保障，让我学到了许多实验以外的知识和研究方法。 感谢病理科李桂梅主治医师、张缨主治医师、潘素梅医师、殷正进医师、涂频医 师在实验中对我的耐心帮助，不厌其烦地解决我实验中的种种问题，为我在实验 过程中提供了极大的便利。他们真诚和无私的帮助使我能顺利地克服实验过程中 的种种困难，本论文的完成还要感谢南京理工大学计算机系的赵建老师和系办公 室的张老师，感谢他们对我在校期削学习和生活上的帮助。 衷心感谢我的家人和所有关心我的人的支持，特此感谢我的导师、汪栋主任 及所有帮助过我的人! 倾t 一学位论文 应用组织芯 ! j f 究耐药相关摹神肺擒中的表达及临床意义 参考文献 1 、m o r i m o t oe ，l n a s en ，m l y a k es ，e ta 1 a d e n o v i r u s m e d i a t e ds u i c i d eg e n et r a n s f e r t os m a l l c e l ll u n gc a r c i n o m au s i n gat u m o r s p e c i f i cp r o m o t e r a n t i c a n c e rr e s 2 0 0 1 ， 2 1 ( 2 ) ：3 2 9 - 3 3 2 2 、t a n a k am ，i n a s en ，m l y a k es ，e ta 1 n e u r o ns p e c i f i ce n o l a s ep r o m o t e rf o rs u i c i d e g e n et h e r a p y i ns m a l ll u n gc a r c i n o m a a n t i c a n c e r r e s 2 0 0 1 ，2 1 ( 2 ) ：2 9 1 2 9 4 3 、k a w a ih ，k i u r ak ，t a b a t am ，e ta 1 c h a r a c t e r i z a t i o no f n o n s m a l l c e l ll u n gc a n c e r c e l ll i n e s e s t a b l i s h e db e f o r ea n da f t e r c h e m o t h e r a p y l u n g c a n c e r 2 0 0 2 ， 3 5 ( 3 、：3 0 5 - 3 1 4 4 、n i s h i ok ，n a k a m u r at k o hy e ta 1 d r u gr e s i s t a n c ei nl u n gc a n c e r c u r ro p i n o n c 0 1 1 9 9 9 ，l l ( 2 ) ：1 0 9 1 1 5 5 、k o o lm ，v a nd e rl i n d e nm ，d eh a s sm ，e ta 1 m r p 3 ，a no r g a n i ca n i o nt r a n s p o r t e r a b l et o t r a n s p o r t a n t i - c a n c e r d r u g s p r o c n a t la c a ds c ius a 19 9 9 ， 9 6 ( 1 2 ) ：6 9 1 4 6 9 1 9 6 、t a nb ，p i w n i c a w o r m sd ，r a t n e rl m u l t i d m gr e s i s t a n c e t r a n s p o r t e r s a n d m o d u l a t i o n c u r ro p i no n c 0 1 2 0 0 0 ，1 2 ( 5 ) ：4 5 0 4 5 8 7 、l o edw ，d e e l e yrg c o l es p c ，e t a 1 b i o l o g y o ft h e m u l t i d r u g r e s i s t a n c e a s s o c i a t e dp r o t e i n e u r c a n c e r 1 9 9 6 3 2 a ( 6 ) ：9 4 5 - 9 5 7 8 、y o u n gl c c a m p l i n gb g , c o l es p , e ta 1 m u l t i d r u g r e s i s t a n c e p r o t e i n m r p 3 ，m r p i ，a n d m r pi nl u n gc a n c e r ，c o r r e l a t i o no fp r o t e i nl e v e l sw i t hd r u gr e s p o n s e a n d m e s s e n g e r r n a l e v e l s c l i n c a n c e r r e s 2 0 0 1 ，7 ( 6 ) ：1 7 9 8 - 1 8 0 4 9 、s c h e p e rr j ，b r o x t e r m a nhj ，s c h e f f e rg l ，e ta 1 o v e r e x p r e s s i o no fam r1 1o ，0 0 0 v e s i c u l a r p r o t e i n i n n o n p - g l y c o p r o t e i n m e d i a t e dm u l t i d m g r e s i s t a n c e c a n c e r r e s 1 9 9 3 ，5 3 ( 7 ) ：1 4 7 5 1 4 7 9 1 0 、i z q u i e r d om a ，s c h e f f e rg l ，f l e n sm j ，e ta 1 b r o a dd i s t r b u t i o no f t h em u l t i d m g r e s i s t a n c er e l a t e dv a u l tl u n gr e s i s t a n