（生物医学工程专业论文）尿液检测的无试剂光谱法研究.pdf

a b s t r a c t a san o r m a lt o o li nc l i n i c a la n a l y s i s ，u r i n a l y s i sh a sb e e nw i d e l yu s e di nh o s p i t a l b e c a u s eu r i n ei se a s yt ob ec o l l e c t e dw i t h o u tp a i nt h ec u r r e n tc h e m i c a lu r i n a l y s i s m e t h o di st i m ec o n s u m i n g ，c o n t a m i n a t i v ea n dd e s t r u c t i v e t h e r e f o r e ，i ti st h ea i mi n t h i st h e s i st oi n t r o d u c ear a p i d ，n o n d e s t r u c t i v ea n dr e a g e n t l e s sm e t h o di no r d e rt o f a c i l i t a t et h ec l i n i c a la p p l i c a t i o no fu r i n a l y s i s i n t h i st h e s i s ，m i d d l ei n f r a r e da t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n ( m i r - a t r ) s p e c t r u m ，n e a r i n f r a r e d ( n 1 r ) t r a n s m i s s i o ns p e c t r u ma n dn e a ri n f r a r e df l o u r i e rt r a n s f o r mr a m a n ( n i r - f t - r a m a n ) s p e c t r u mw e r ei n t r o d u c e di n t ou r i n a l y s i s m u l t i v a r i a t es t a t i s t i c sw a s u s e dt oa n a l y z es p e c t r aq u a n t i t a t i v e l y m i rs p e c t r u mi sb a s e do ns u b s t a n c ef u n d a m e n t a lf r e q u e n c yo s c i l l a t i o n s os n r f s i g n a lt on o i s er a t i o ) i sh i g h e rt h a no t h e rt w om e t h o d st h er e s u l t sf r o mg l u c o s e w a t e rs o l u t i o ni n d i c a t e dt h a tr m s e p ( r o o tm e a ns q u a r ee r r o ro fp r e d i c t i o n ) a n i n d i c a t o rf o rp r e c i s i o n ，w a s1 3 3 6 m g d l ，a n dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( r ) w a sa l m o s t o n e a tt h es a m et i m e ，t h eo t h e rc o m p o n e n t so fu r i n ed i s t u r bt h ep r e d i c t i v ep r e c i s i o n i nr e a ln r i n em o d e l n i rs p e c t r u mh a sm o r ef l e x i b l em e a s u r ec o n d i t i o n sa n dm u c hm o r ei n f o r m a t i o n t h e t w oo p t i c a lp a t hl e n g t h s0 7 m ma n d1 5n l r nw a su s e dt om o d e la t4 2 0 0 4 8 0 0 c m “ a n d5 5 0 0 6 5 0 0 c m - 1r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c ew i t ht h et h e o r yo f o p t i m m no p t i c a lp a t hl e n g t h i no r d e rt of a c i l i t a t er e a lt i m ea p p l i c a t i o ni nc l i n i c ，b y t h eu s eo fo p t i m u mw a v e l e n g t h s ，t w os e t so fw a v e l e n g t h s ，t e na n ds i xw a v e l e n g t h s ， w e r eu s e dt oi m p r o v et h em o d e l i n g n i r - f t - r a n a a ns p e c t r ao fs i n g l ec o m p o n e n t si nu r i n ea r ee a s i l yo b t a i n e d h o w e v e r ， 10 6 4 n ml a s e ru s e di ni n s t r u m e n tm a d es c a t t e r i n gl i g h ti n f l u e n c et h er e g i o no fn i r w a t e ra b s o r p t i o n t h a ti n d u c e dt h en o n l i n e a r i t yi ns p e c t r a ，t h e r e f o r en i r f t - r a m a n i sn o ts u i t a b l ef o rt h ea n a l y s i so fc o m p o n e n ti nw a t e rs o l u t i o n t h er e s u l t sp r e s e n t e dd i d n tr e a c hc l i n i c a la v a i l a b i l i t y , a n dt h em e t h o d si n t r o d u c e d c a nb eu s e dt op a t h o l o g i cu r i n es c r e e n i n g t h ef u r t h e rs t u d ys h o u l db ed o n ei n o r d e rt oo p t i m i z em o d e la n dt h u si m p r o v et h ec l i n i e a la v a i l a b i l i t yo f r e a g e n t l e s ss p e c t r o s c o p yi nh f i n a l y s i s k e y w o r d s ：u r i n a l y s i s ，m i r - a t r ，n i r ，n i r f t - r a m a n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞叁茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：j 蠓辱| 习l 签字日期：口巧年月修日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨洼盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：熊扎毕 导师虢j 象从锺 签字日期：多哆年月母日 签字日期：如厂年月 天津大学硕十学位论文 第二章光谱法捌量原理 式中振动量子数v = o ，1 ，2 ，3 ，。e v 为矿能级的能量值，h 为普朗克 常数，c 为光速。谐振子在不同能级间跃迁时的选择定则为a 肛土1 ，即跃迁只 能在相邻能级间发生。每次跃迁吸收光子的能量e 等于h c a 。 按p o l t z m a t m 方程可算得在室温下分子绝大部分处于振动基态( v = o ) 。由 振动基态到振动第一激发态( y = 1 ) 之间的跃迁称为基频跃迁。这种跃迁所产生 对辐射的吸收为基频吸收，其吸收电磁波的频率可按经典力学公式( 2 - 3 ) 计算。 因为有机物中不同键伸缩振动的力常数彤约为4 0 一1 8 0 毫达因n m ，弯曲振动的 值更小。因此按公式( 2 - 3 ) 计算得有机物基频吸收的波数范围约在中红外区。 实际的分子振动并不完全符合简谐振动，由分子化学键的位能曲线得知分子 属非线性谐振子( a n h a n n o n i co s c i l l a t o r ) ，其能级公式为下列近似表达式： e = h c c t ( g 十1 2 ) 一x ( v + 1 2 ) 2 + x ( v + 1 2 ) 3t - 】 ( 2 6 ) 即相邻的矿和卜能级间的能量差 a e = h c t r ( 1 2 v x ) ( 2 - 7 ) 式中j 为非谐性常数( a n h a r m o n i cc o n s t a n t s ) ，j 常为很小的正数，其值 约为0 0 1 。 非线性谐振子跃迁的选择定则是：一e = 土l ，土2 即除了基频跃迁外也 可能发生从基态到第二或更高激发态( v - - - 2 、3 ) 之间的跃迁。这种跃迁称 为二级倍频或多级倍频跃迁，所产生的吸收谱带为二级倍频或多级倍频吸收。这 统称为倍频吸收。 多原子分子的振动比较复杂，但可把它们看作是许多种简单的独立振动的线 性组合而成。因为各种振动不是严格简谐的，它们之间可能发生相互作用，因此 如果电磁波光子的能量恰好等于某两个基频跃迁所需能量的和，而这两种基频振 动又具有相同的对称性，这时该能量的一个光子可能同时激发这两种基频跃迁。 在光谱中出现的吸收峰的波数( 或频率) 等于这两种基频振动波数( 或频率) 之 和，这叫合频吸收。 中红外光谱区与分子的基频频率相一致，而近红外谱区与分子的倍频、合频 振动频率相一致。分子在中红外光谱区的吸收是由于振动状态在相邻振动能级之 间的跃迁而形成的，在近红外光谱区的吸收是由于分子振动的倍频( 振动状态在 相隔一一个或几个能级间的跃迁) 或合频( 分子两种振动状态的能级同时发生跃 迁) 吸收所造成的。 天津大学硬学食论文 第二章毙诺法测量鼹瑾 2 2r a m a n 光谱的源理 印度物理学家拉曼( r a m a n ) 于1 9 2 8 年看毋究苯的光教射时发理，程数射光中 除了有与入射光频率相同的谱线外，还有与入射光频率发生位移( 频率增加或减 少) 旦强度极弱的谱线。前者是已知的瑞零l j ( r a y l e i g h ) 散射光，称为瑞利效应；丽 后者怒新发现的，后来以发现者的名字命名的拉曼散射光，称为拉曼效应。在散 射光谱中，位于瑞利散射线低频一侧的谱线称为斯托克斯( s t o k e s ) 线，高频一侧 的谱线称为爱斯托克斯( a n t i 。s t o k e s ) 线，两者统称为拉受光谱。由于通常物质中， 处于纂态的粒子数目远多于处于激发态的粒子数目，因此期摊克斯散射的强度也 远太子反赣獠克斯散甜的强艘h “。 + y 度斯托离斯控璺教射 v o a v 斯托竞斯藏曼敷瓣 图2 1 瑞利与拉曼散射 2 2 1r a m r t l 散射的经典模型处理f j 3 】 当入射光到达物质表面时，物质内部的分子发生振荡形成偶极子的极化作 用。在电场的作用下，分子的核被吸向正极，于是就产生了诱导偶极矩。 p = a e ( 2 8 ) 式中，e 为所加电场，n 为极化率( 单位电场强度所感应的电偶极矩) 。入射光 束电场e 与时间t 的关系可以写成 e 2 e oc o s ( 2 z v 0 0 ( 2 9 ) 式中，e o 为入射光束的电场振幅，vo 为入射光束的频率，将式( 2 9 ) 代入式( 2 - 8 ) 得 天津大学硕士学位论文 第二章竞谱法测量纛疆 p 2 t e e oc o s ( 2 x t ) 频率缀小时，极化率d 胃t a y l e r 级数震开 群。甄+ ( 静墙次矮 ( 2 1 0 ) ( 2 1 1 ) 式中，q 为简正坐标，相当于振动位移坐标，n 。为分予在平衡位置时的极化率， 第二琰为平衡位置时极化率醚简正坐标的变化。由于离次项棚当于倍频和合频， 强度徽弱，可以忽略。q 是时间的函数，在谐振予近似下可得到关系式 式中，vm 为分子的基频振动。将式( 2 1 2 ) 代入( 2 1 1 ) 得 甜2 + ( 嚣) 。【q 。c 。s ( 2 硝t ) ( 2 一1 2 ( 2 1 3 ) 将式( 2 1 3 ) 代入式( 2 1 0 ) 得 h 州每q o c o s ( 2 石v m o e o c o s 陬t ) 泣1 4 = c r o e oc o s 缮确妒( 薏猫o q oc o s ( 2 n v m t ) c o s ( 2 x v o t ) 将上式第二项用三角函数关系解出有 p - c z 0 e oc o s ( 2 删+ 1 2 ( 删c o s ( 2 砒t ) + c o s 2 7 r t ) q 以5 枣经典电磁理论知，一个振动躲偶极予发射的振蜒强度为 k 警2 。1 6 将式2 ，1 5 代入式2 1 6 中，则有 天津大学硕士学位论文 第二拳竞遂渡测量羹i 疆 p 警e 2 c 搿鼢巾c 秘- c o 斑砒t 协， + e 菩( 筹) 。q 。j 2 - s 2 2 帮( 弦+ 交叉顼j 式中，第一项代表不改变频率的r a y l e i g h 散射，第二、三项代表改变频率的r a m a n 教瓣。其中豢频( v v ，) 为反s t o k e s 豢，低频( v 。一v * ) 淹s t o k e s 豢。爨犍 可以蒋出，r a y l e i g h 散射的强度只与分子的极化率有关，而r a m a n 散射的强度 与分孑投化率睫篾正艇振鲍变纯奏关。 2 2 2r a m a n 散射的量子模型处理 单色光与分子相互作用所产生的散射现象还可以用光量子( 粒子) 与分子的 碰撞来解释。按照量子理论，频率为vo 的单色光可以视为具有能量为hvo 的光 粒子，h 为普朗克常数( p l a n c k ) 常数。当光子hvo 作用与分子时，可能发生弹 性和非弹性两种碰撞。在弹性碰撞过程中，光子与分子之间不发生能量交换，光 子仅仅改变其运动方向，而不改变其频率。这种弹性散射过程对应瑞利散射。在 非弹性碰撞过程中，光子与分子之间发生能量交换，光子不仅改变其运动方向， 同时光子还将其一部分能量传递给分子，转变为分子的振动或转动能，或者从分 子的振动或转动得到能量。在这两种过程中，光子的频率都发生变化。光子得到 能量的过程对应于频率增加的反斯托克斯拉曼散射，光子失去能量的过程对应于 频率减小的斯托克斯拉曼散射。 拉曼散射的量子理论能级如图2 2 所示，处于基态e v = 0 的分子受入射光子 hv 。的激发而跃迁到一个受激虚态。因为这个受激虚态是不稳定的能级( 实际上 是不存在的) 所以分子立即跃迁到基态e ，= 0 。次过程对应于弹性碰撞，跃迁辐 射的频率对应于hvo ，为瑞利散射线。处于虚态的分子也可能跃迁到激发态e v = 1 ，此过程对应于非弹性碰撞，跃迁频率等于h ( v 。一v ) ，光子的部分能量传 递给分子，为拉曼散射的斯托克斯线。类似的过程也可能发生在处于激发态e ， = 1 的分子，受到入射光子的激发而跃迁到受激虚态，同样因为虚态是不稳定的 而立即跃迁到激发态目= 1 ，此过程对应于弹性碰撞，跃迁辐射的频率对应于 hv 。，为瑞利散射线。处于虚态的分子也可能跃迁到基态e v = 0 ，此过程对应于 非弹性碰撞，光子从分子的振动得到部分能量，跃迁频率等于h ( vo + v ) ，为拉 天津犬学馥学位论文 第二二章竞灌法测量辍理 嚣n ， e 。越 - 叫毗；醛肫硼 jk l o 一 h v ,h v ,h ( v o + h c v o 一磅p h v o r 上 r 1i 燕鼙 短癸凝躲挝羹戢嚣凑秘熬黪控楚粒懿 擀辑党斯貔徽衔托竞擀娩 圈2 2 控蔓和瑞剥散射的能缀图 受鼓舞雩豹复焱藐尧籁线。驮鬻串霹戳露篷，麓耗克鬻鞠反赣疑克蓊线与臻莽l 敬瓣 线之间的能量差分别为h ( v 。一v ) 一h ”o = 一hv 和h ( v 。+ v ) 一h ”0 2 + h v ， 其数穰程等，餐号穗旋。说鞠控受谱线对黎熬分森在臻裁散射线懿嚣镧。露瓣氇 可以猎出，hv = e v 州一e 。咖同红外吸收光谱的能级差相同。 2 3r b i n a r l 光谱与红外光谱的互补性及其选择定则 r a m a n 光谱和红外光谱一样，都能提供分子振动频率的信息，但它们的物理 过程却不同，r a m a n 光谱有其自身的特点，其光谱的选择定则也就不同于红外吸 收光谱。从分子结构性质变化角度看，r a m a n 散射过程来源于分子的诱导偶极矩， 在分子振动过程中，只有分子的极化率发生变化时，才是r a m a n 活性的；红外 吸收过程与分子的永久偶极矩的变化相关，分子在振动过程中偶极矩发生变化才 是红外活性的。这是r a m a n 光谱和红外光谱在选择定则方面的区别。因此，有 些跃迁只能通过r a m a n 光谱观察到，另一些只能在红外光谱中观察到；另一些在 r a m a n 光谱和红外光谱中均能表现出来；但还有一些跃迁在红外光谱和r a m a n 光谱都观察不到。即使当与某一跃迁相联系的频带原则上在红外光谱和r a r n a n 光谱中都可观察到，但由于强度因素，可能这一频带在一个效应中比另一个效应 中更容易观察到。 r a m a r l 光谱中包含的倍频及组频成分比红外光谱中少，所以r a m a n 光谱往 往仅能出现基频谱带，谱带清楚，分析起来比红外光谱更为简单。因此，要获得 关于系统能级的全面知识，单独研究r a l n a d 光谱或红外光谱都是不够的，必须 将红外光谱学和r a m a l l 光谱学二者看作是研究分子能级跃迁的互补方法。因此 本课题在研究红外光谱的基础上，进一步研究了近红外傅立叶变换拉曼光谱应用 天津大学硕士学位论文 第二章巍谱法测量原理 于尿液分析的可行性。 一般说来，极性基团的振动和分子的非对称振动能使分子的偶极矩发生变 化，因聪怒短羚活性的；蔼非校j 堡基霞和分子兹全对称振动健分子懿极化率发生 变纯，溺露是r a m a n 活囊豹。r a m a n 麦谱最遥会磷究穗蠢纂予闯瀚 投注键， 而红外光谱最适合研究不湖原子问的极性键振动。例如强极性基闭一o h ，一c = x ( x 代表卤素) 等在红外光谱中有强吸收谱带，但在r a m a n 光谱中却无反映， 而对于非极性但易于极化的键或基团，如c c c = c 一，一n n 一，一s s 一等焱红外光谱中不能反映戏无明显特征，在r a r n a n 光谱中却反映明显。以下 燕剩遴鬻渡蠲来翼叛势子串交凝懿是鑫乡 还燕r a m a n 竞谱： l 、互鞠稚斥规援| j有对称中心的，剐只有一孝申活性 2 、互相允许规则凡无对称中心的分子，除了属于d 5 h 和d 2 h 和o 点群的分 子外，都有一些既能在r a m a n 散射中出现，又能在红外吸收中出现的跃迁。若 分子无任何对称性，那么它的r a m a n 和红外光谱就非常相似。 3 、互棚禁止规则少数分予的振动模式，它们的红外和r a m a n 掇渤模式均是 # 活整黪。妇乙臻熬趣鏊擐韵。对予大多数翁露撬亿合豹来说，其蠢不完全蕊对 称性，谶而它们在红辨帮r a l l l a n 光谱中均有不间程度的反映，遨两者相互结合 可以得到分子结构的完整资料。 2 4 红外与拉曼光谱测鬓原理 2 4 1 朗构一琵尔定律 红外光谱定量分析的理论基础是朗伯一比尔定律( l a m b e r t - b e e r 8 l a w ) 1 1 7 1o 当一柬光能量而为平行单包光照射到溶液，光的一部分被吸收，称为吸收光厶， 一部分透过溶液，称为透射光易一部分被器腿爱射称为反射光磊，剃霸= 是+ 五 + 五。一毅猜猛下，器殛爱麓跫鎏定，显可藏小蠲投枣蓬，粼南* 五十五。 朗伯定律： 一束一定波长的单色光通过一定浓度的均匀溶液时，光强度的减弱与液层 ( 光吸收层) 厚度b 的增加成正比： l n ( i o ，；) = 为b ( 2 1 8 ) 比尔定律： 一束一定波长的单包光通过溶液层厚度一定凰均匀的可吸收光的溶液时，光 强度的减弱与溶液浓度的增j j r l c 幂r l z 射光强度戚正魄： 天津大学颈圭学霞论文 第二章光谱法潮量缀罐 ( 2 1 9 ) 灏定律台并，鄹称为朗馈一比尔逛律，可以燎它餐馋是上述分子摄动强理熊 宏观袭示，对于含挖种物质成分的混合溶液而言，其完躲的数学表示式为： a = l n ( i o ) = l n ( 1 t ) = a 。( a ) = c ( 五) 三g ( 2 2 0 ) nn 其中：a 为吸光度，是波长的函数；o 为入射辐射强度；为透过辐射强度； 为蔽牧罄厚爱( m ) ；g 麦成分露熬浓度( m g d l ) ；程。为戏分, 豹嚷光系数 ( m g d l m ) ；t 为透过率爿以。 对予吸毙畚数g ，它是豹矮本身貔霾毫瞧溪。实验涯黉，不同浓凄豹霜一甥 质在栩同波数处具有相同的吸收系数；对于同一物质，不同波数处其暇光度系数 不圈。 本文中实验用到的样品尿液是均匀分布的液体，符合朗伯一比尔定律的适用 条 孛。凝据这一定律霹蝰测褥黪光谱图撮握嚣耍转换为不同鲍吸l | 殳谱，大体可分 为以下三种漪况： ( 1 ) 吸光度a ，目s a = i n ( 。，：) ，其中o 为放鬟空样品池时的能量光谱，五 为放鼹被测样品时的能量光谱，本文中我们将其称之为样品扣除空气背景得到的 暖巍痰篷； ( 2 ) 吸光度差姒，如下式： d a = a 样品一a 纯水矧 1 n ( i o ，t 样品) 一l n ( i o ，t 纯水) = l n ( ，t 纯承i t 样鼎) ( 2 2 1 ) 其中五。为被测样品的能量光谱，一为与被测样品相邻测量的纯水的能量 光谱，本文中我们将其称之为样品扣除水背景得嚣的蹶光度缀； ( 3 ) 原始能量e ，即直接对样品测量得到的能量光谱。 2 4 2 拉曼光谱的定量分析原理 弦曼竞谗在蒋定条 牟下帮褥溺群晶浓度鹣关系为【q ： j = 肿。c p “鳆秘的2 h ( z ) d z 0 ( 2 2 2 ) 天津大学硕士学彼论文繁二章光谗法渊鼙豫瑾 其中：l 为梯晶表嚣被光学系统所接收到的拉曼僖号强度；k 为拉璺数射截藕 积；mo 为样晶表面的激光入射功率；c 为样晶中拉曼散射的物质浓腱；k o 和k 分别为赝用入射光和散射光蛉吸收系数；z 为入射光和数射光所通过的距离；h ( z ) 为光学系统的传输函数；b 为样品池的宽度。 从( 2 2 2 ) 式可以看出，在一定的工作条传下其挝曼散射光鲍强度和与样品 中产生拉曼散射韵待测物质浓度成正比，这就是拉曼光谱进行定量分析的依据。 2 5 试验仪器及原理 2 5 1 傅里叶变换的原理 傅立叶( f o u r i e r ) 变换光谱仪的测量原理是利用干涉图和光谱图之阳j 的对应 关系，通过测量干涉图和对干涉图进行傅立叶积分变换的方法来测定和研究光谱 图。和传统的色散型光谱仪相比较，傅立叶变换光谱仪能同时测量、记录所有谱 带的信号，并以更高的效率采集来自光源的辐射能量，从而使它具有比传统光谱 仪高得多的信噪比和分辨率；同时它的数字化光谱数据也便于计算机的处理和演 绎 15 i 。傅立叶变换光谱仪的主要光学部件是迈克尔逊干涉仪，其基本机构如图 2 3 所示。 图2 - 3 迈克尔逊干涉仪基本结构 图2 - 3 描绘了迈克尔逊干涉仪的结构，干涉仪系统包括两个互成9 0 。角的平 面镜、分束器、光源和检测器。两个平面反射镜中一个固定不动称为定镜，另一 个沿图示方向平行移动称为动镜，动镜在乎稳的移动中要时时与定镜保持9 0 。角。 为了减小摩擦，防止振动，通常把动镜固定在空气轴承上移动。光学分束器与动 镜和定镜呈4 5 0 角放置，具有半透半反性质，将光源射来的一束光分为两束，5 0 天津大学硬士学挺论文 第二章党谱法溺耋掾壤 通过，5 0 反射。反射光束爨直射到定镜上，并沿暇路返凰分束器，著透过分 束器射向检测器。同样透射光束投射到动镜上，其返阐光束经分束器反射后投射 至g 检测器上。这样，射向探测爨的两柬光于涉疆加，当蕊柬光的光程麓为半波跃 x 2 的偶数倍时，刚落到检测器上韵干涉光楚耜长干涉，产生明线，其相干光的 强度有最大值；当两荣光的光程差为半波长”2 的奇数倍时，落到检测器上的相 干光鼹相消干涉，产生暗线，其相干光的强度商最小德。因此，对于一个纯单色 光，谯动镜连续移动过程中将得到强度不断变化的余弦干涉波，随着反射镜动镜 每移动x 1 2 距离，探测器上得嗣的信号强度将蹋颓性变纯，交化方程为： a l ( x ) = a b ( v ) c o s ( 2 n v x ) ( 2 2 3 ) 式中，删为干涉图的强度，它是光程差x 的函数，研砂为光源( 被测对象) 的强 度，它是光源频率v 的函数。显然对于一个有连续波长的多色光，将式2 2 3 积 分即可得到干涉图： ，( x ) = b ( v ) c 。s 2 n x v d v ( 2 2 4 ) 多色光的干涉图是各单色光干涉图的加和。由于零光程差时各单色光强度均 为极大值，其余部分则因为相长或相消干涉强弱不同而相互抵消，结果得到一个 有中心极大值并向两边迅速衰减的 对称图形，如图2 4 所示。 白光干涉随着谱带加宽，叠加的 单色光干涉图增加，逐渐形成在零光 程差处强度最强两边逐渐衰减的干 涉图，多色光越复杂，其干涉图越亮， 两边衰减也越快。干涉图包含着光源 f 厂、厂、，一一 、 。v 。、，一 一 图2 - 4 多色光的干涉图 的全部频率和与该频率对应的强度信息，所以如果将一个有红外吸收的样品放在 干涉仪的光路中，由于样品在某些频率有吸收，使得所得到的干涉图强度曲线相 应地产生变化，但从这些极为相似的干涉图中直接去辨认各种强度的吸收光谱特 性却是十分困难的，包含每个频率强度信息的干涉图可以凭借数学上的傅立叶变 换技术，对每个频率的光强进行计算，从而得到我们熟悉的谱图，但这种复杂的 数学处理必须由计算机来完成。由于傅立叶变换的可逆性，所以由4 ”就可以计 算出光源的光谱分布： 天淬大学硕士攀谴论文第二章免谱法测量器理 艿( y ) = l ( x ) c 。s ( 2 蕊v ) 威 2 - 2 5 由于干涉图是偶函数，因此上式可改写为 b ( v ) = r i ( x ) c 。s ( 2 a x v ) & c ( 2 2 6 ) 式( 2 2 6 ) 就是傅立叶变换光谱学的基本方程。 2 5 2 傅立叶变换红外光谱仪 本研究所用到的红外光谱仪为英 p e r k i ne l m e r 公司的s p e c t r u mg x 系列 f t - i r 光谱仪。仪器的硬件配置【1 6 1 如表2 3 所示： 表2 3f t - i r ：光谱仪系统配置 近红外系统( n m )中红外系统( m i r ) 光源卤钨灯稳压空气冷却线盘 ( t u n g s t e nh a l o g e ns o u r c e ) ( w i r ec o i l ) 分束器 石英( q u a r t z ) 溴化钾( k b r ) 检测器锑化铟( i n s b )氘化硫酸三甘肽( d t g s ) 检测器冷却方法液氮无 此光谱仪通过仪器配套的软件勋e c 护珊l 控制f 1 7 】，它可以通过改变光源、分束 器以及检测器在近红外、中红外和外界光源三种测量方式之间进行切换，可分别 实现在近红外区域的液体样品透射( t r a n s m i s s i o n ) 光谱测量，在中红外区域的 液体样品衰减全反射( a t r ) 光谱测量和外界光源的近红外、中红外光谱测量。 另外，s p e c 护u m 还可以通过调整b 一阻光片和j 阻光片的通光尺寸来调整检测器接 收能量的大小，避免检测器的饱和甚至烧毁。 与传统的色散型红外光谱仪相比，使用傅立叶变换红外光谱仪进行光谱测 量有以下一些优点： 1 光学部件简单，只有一个可动镜在实验过程中运动，测量可靠性高； 2 测量波段宽，换用不同的光源、分束器和检测器，能测量到1 5 0 0 0 6 c m 。 整个光谱波段； 3 具有很高的光谱分辨能力，在整个光谱波段内分辨率很容易达到0 1 c m ： 天津大学矮士学位论文第二二章免谱法溅奄爨疆 4 ，波数猴确度蘸，由于锼_ 曩h e - n e 激光测定动镳的位置，渡数精确度可达 0 0 1 c m “； 5 扫描遮度快，出于没蠢狭缝艨l 牛，光邋量大，具有多鼹逶过的特点，可 以所有频率同时测量； 6 ，杂散光不易影响检测，通常程全光谱蔽围内杂敝光低予0 ，3 。 2 5 3n 限一f t r a l r l a n 光谱仪 傅里叶变换光谱技术已程澎谱学领域得到广泛应鞠。科学家和仅器涮造商早 已探讨了实现f t - r a m a n 技术的可行性。直到1 9 8 7 年能够滤除1 0 6 4 n m 红外光的 电子滤光片静磺翻成功，n i r f t - r a m a n 竞谣仪器的稍造才藏为可麓，胬2 5 为一台n i r f t - r a m a n 光谱仪的原理图。 1 1 卜爿一 c 互 右+ + l h l p db 7 、 & p |6 重 a 鼍 一n r - _ _ 。_ - 1。 i 4 t - - - - - - - t 3 r 1 1 捆中thn d - y a g 搬光墨；矗如- - n e i i 光- lh 干涉慢一氐植一l h 南计i 讳k 机缸印帆l 岛岛t 托 菜曩奇尊fs t 样品旨lk 避麓if i f 】瓣光片，碣一隅t 平哥幢 图2 一sn i r - - f t - - r a m a n 光谱仪原理图 由图可以看出一台近红外傅里叶变换拉曼光谱仪主要由光源、样品室、光学 过滤系统、干涉器、信号检测及数据处理系统等组成。 到目前为止，除了p e r k i ne l m e r 公司，还有很多厂家先后推出了很多近红外 傅立叶变换的拉曼光谱仪器，但是大部分都是将r b i t i a n 测试作为傅里叶变换光 谱仪( f t - i r ) 的一个附件，这样做可以充分的使用f t - i r 的每一个部分，使用 一台机器同时实现红外和r a r n a n 光谱的测试，同时最大程度的节省了测试费用。 本研究使用的近红外傅里叶变换拉曼光谱仪为德国b r u k e r 公司所生产的 e q u i n o x 5 5 + f r a l 0 6 附件式r a m a l l 光谱仪，其f t 平台为e q u i n o x5 5 近红外傅 里叶变换光谱仪。仪器配置为：采用n d ：y a g 激光器为激发源( 近红外，波长 1 0 6 4 n m ) ，铟镓砷检测器( i n g a a s ) 。液体样品池为表面镀银的5 m m 光程的石英 样品池，固体粉末采用仪器自带的铝碟制样。 与传统的色散型的拉曼光谱仪及红外光谱仪器相比，n i r - f t - r a r n m l 光谱仪 器主要有如下优点： 1 、用近红外光源激发，能量低，基本上避免了荧光干扰和样品破坏，其样 品测试效率大大提高； 2 、n i r f t - r a m a n 光谱仪器的测量速度快，操作方便。； 天津大学硕士学位论文 第二章光谱法测胃原理 3 、n 1 r - f t - r a m a n 光谱仪的光通量大，由于不存在狭缝，n i r f t _ r m a n 光 谱仪的光通量只与干涉仪平面镜的大小有关，因此在相同分辨率的情况 下，n i r f t - r a m a n 光谱仪辐射通量要比色散型光谱仪大得多。从而使检 测器的信噪比增加，提高仪器的灵敏度； 4 、n 1 r f t - r a m a n 光谱仪的测量精度高。在分光扫描系统中，由于迈克尔 逊干涉仪采用激光干涉条纹测定光程差，从而使n i r f t - r a m a n 比常规 的色散型光谱的波数测定准确率高； 5 、r a m a n 散射的强度通常与物质的浓度呈线性的关系，而在红外光谱中吸 收与浓度呈对数关系。 2 6 多元数据回归分析 红外光谱定量分析技术又称“黑匣子”分析技术，是一种间接的测量方 法，即通过对样品光谱和其质量参数进行关联，建立预测模型，通过预测模 型和未知质量参数的样品光谱来预测样品的组成和性质。近年来由于化学计 量学的出现和应用，使得光谱分析进入了一个崭新的时代，光谱和化学计量 学的结合已成为一种快速高效的分析技术。 化学计量学是集化学、数学、统计学和计算机应用于一体的交叉学科 1 8 1 1 9 1 。它是运用在计算机上实现的数学与统计学方法，优化测量过程，从化 学测量信号中最大限度地提取有用的化学信息，为复杂混合物的定性或者定 量分析提供了有力的工具，并在速度和准确度方面均得到很大的提高。化学 计量学在光谱分析应用中包括定性和定量分析，定性分析主要包括主成分分 析和聚类分析，即认识性的方法。这类方法在原始数据中没有自变量和因变 量之分，通过数据分析，可以简化数据结构，观察变量间的相关性或样本点 的相似性。定量分析主要指各种多元数据回归分析方法，通过数据分析，找 到因变量和自变量之间的函数关系，建立模型，用于预测。 遵从化学计量学的一般表述，在本章的表述中，光谱矩阵用x 表示，样 品浓度用y 或者y 表示( y 用于单组分，y 用于多组分) ，n 为样品数，p 为 波长( 变量) 数。 2 6 1 多元线性回归模型【2 0 】( m u l t i v a r i a t e l i n er e g r e s s i o n ，m l r ) 多元线性回归的一般表示为： v = x b + e( 2 2 7 ) 天津大学鞭七学槛论文 第二牵光谗法瓣鼙联溪 麒中y * 【m ，y ：。，r 为浓廉参考值， b 为模型回归祭数 盖= 骗，恐，j 为竞满数嚣，譬为袋麓e 该蠛越蛉勰有三嵇情况：1 ) 警p 弹，辩变基教大于榉零数，b 露无舅多 个解；2 ) 溺p = ”，如果x 满秩，b 旃唯一聪；3 ) 强p 0 ，藕蠢跫正院关系，睡委穗关；r o n 蠢爨受秘荚。袋熬篷接逐予0 ，嚣蠹 天津大学硕士学德论文第二牵光谱滚溅塞嚣疆 没有线性相关关系。r 的计算公式为： 冀中： 嚣= f - y ( ( y y ，, 一_ y y ) ) 2 f y ：通过光谱测量及数学模型预测的结果 y ：嚣l 栎壤方法测定翡参考馕结果； ( 2 3 8 ) 二、预测爨撵本黪均方擞误差( r o o tm e a ns q u a r ee r r o ro f p r e d i c t i o n ，p , 2 c i s e p ) 拽由。 r 礤e p = n ：建模使用瀚样品数。 2 6 4 模型的适用范围 ( 2 3 9 ) m l r 簸然诗舞麓攀，德努须隈铡交爨数枣予撵晶鼗，秃法鲶溪存在多爨 鞠关豹累绫，恧且只楚攀缝穗对z 耪y 逶褥阐麴，没有考惑数撬中豹臻声，菇 萋瑟y 之闲怒黉辐关，莠虽在变爨多黧裙关瓣蘧爨下焉法爨诗霹麴系数，强馥 不逶食遥筑努毙谬麓建摸；p l s 采臻了成分掇敬豹方式建模，褥蔽翡袋分 不筑考虑了爨磐蟪壤臻菇豹绩感， 嚣萎瓣瓣彀麴藏分瓣y 蠢簸强豹解器瞧。 经遗这群瀚傣慧籍逸，慰y 没套簿释幸筝舔懿穰声麟囊然羧臻狳，藤魏掰建交 豹楱受爨露缀舞豹觞释弱鬻溺辘力，著避避慰多瀵鞠美瞧豹宠鞭聚捷离模鬻 靛聂确篷秘稳懿羧。与m l r 稿魄，p l s 鼹蒸露筑送毪，蒸诗黪蘩聚雯为可 纛，貘鬻羟实瓣豹逐缝终竞诿孛鹣霹鳝器魏魄爨谶。本文瓣数搂分援中蔓要 采麓豹毽楚p l s 鹣方法。 本露小缝： 本毒针对本文中掰涉及到涎纂搴测爨纛瑷、方淡，使溺豹仪器繇壤蔫豹数察 楚纛方法避行了奔缁： 、鬻先奔绥了竞落波段蕊分类，然嚣麸分予摄动瓣皴鼹楚度阐述了分予光诿麓 产生嚣撩，荠巍魏鏊獭上辩巾缀努邀谶秘逅缝努党漤懿特患遴嚣了分绥； 2 、扶缀典禳爨秘爨予摸鍪鼹方露勰释了控爨数瓣懿骚褒，嗣辩避一步懿辫遮了 天津大学颐 ：学位论文第二章光谱法溅量豫瑾 终终吸收鞠拉曼数懿光谱熬互於建秘选择定则； 3 、光谱测量原理的介绍，包括红外光谱测量的理论基础朗伯比尔定律，拉曼 光谱的定黧分辑原理； 4 、对测量仪器的简单介绍，包括对傅立叶变换及实验中用到的仪器： 5 、详细介绍了光谱定爨分析的多元统计知识，包括m l r 、p l s 薅毒中算法的过程， 适用范围歉评价指标。 天津天学颧七学位论文 第三章藏滚静串红辨光谱分拆 第三章尿液中红外光谱分柝 中红外光谱主要是物质的基频振动，相对比较简单。因此中红外光谱很早就 被用作物质的成分分析。使用吸收池检测水溶液样品时，由于水的强吸收，常常 使水的特征峰区的红外光全部被吸收，无足够的光能到达探测器，从简使研究难 鞋成功。嶷藏全反射技零懿饶点之在子红舞竞越群晶数透过深度投小，朝使在 1 6 4 0 c m o 处o h 的强蔽 | 芟囊，仍有5 0 的茳努光遴过，佼硪究在 0 0 0 - - 4 0 0 0 c m 。 的范围内都能进行测定。因此采用衰减全反射的方法进行尿液中的生化成分测量 是一种可行的研究方法。 3 1 衰减金反射测量原毽( a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n ，a t r ) 3 1 1 垒艇射与衰减全反射谶苏 当光束而从一种光学介质( 折射率为，z j ) 进入另一种光学介质( 折射率为h ，) 时，光线在两种介质的赛麟上将发生反射和折射现象1 2 ”，如图3 一l a 所承。根据折 菇定簿s i n 0 s i n 0 2 = n 2 n j 霹知，当清是条辞瑰大予群2 显入菇受参j 太予漆器楚曩拯= a r c s i n ( n ：n j ) ) 对，入射竞南程两种分矮分界面上会教生全反射现象，不褥产生新_ 鸯于 光厶。全反射现象是光在两种介质分界面上的宏观现象，从微观的角度来看，根 据电动力学的实验和理论，知道光波也进入到了介质珊中，如图3 1 b 所示。实 验中将荧光物质渗入到介质啦中，紧挨介质聊，强发生全反射时，观察到介质n 2 疼鬃袋潦荧光，枣_ l 龟实验以谈翡毙夔确送入爨了套霞n 2 。 j 、 弋琏 b 豳3 - - 1 垒反射a 与衰减垒葳射b 瑰象 天津大学硕士学位论文 第三章尿滚的孛红终光谱分辑 按电动力学和电磁波在介质中的传播理论【2 5 1 ，可以推导出光射入到介质地 中的深度为： 铲警面志丽2 叠1 2 z rs 孤i 习帮 ( 3 一1 ) 其中： a o ：光在真空中的波长； 南l ：光在夯覆n l 中夔波长 趺光的入射角 h ? ：介质1 1 1 的折射率 珊：介质i 1 2 的折射率 由式( 3 1 ) 可知，光射入到介艨n 2 中的深度磊与以下的三个因素有关：( 1 ) 光在穷蒺n l 中熬波长；( 2 ) 德测糕嚣嚣磊落事| 籽瓣 鳕魅率之眈氇，强；( 3 ) 入射 角0 。 穿透深度冼与厶1 成正比，不同波长的红外光邂入样品层的深度不同，在 长波时穿透深度大，因此a t r 谱在不同波束区间的必敏度也不同。在长波处吸 收峰因透入深度丽使峰增强，在短波处吸收蜂则较弱，这是a t r 谱与透射谱的 主要区翔，魄蹩a t r 谱在短波隧竣灵敏度氮豹爨豳。 样晶辑射率与波长有关，一般在发生吸收的波长处，样晶辑辩搴交亿强 烈，n 2 与晶体材料的折射率h ，的比值也会随之改变。这种变化将对光谱形状产 生影响，若邀种变化导致此波长处不再发生全反射，则产生“失真”现魏。避免 产生“失真”现象的方法一般有两种：( 1 ) 所用晶体材料的折射率在整个测量区 润都明显大予撵瑟豹季厅射搴( 氛攒缀蚊处辑射率) ； 哥戳篱曩：为公式( 3 3 ) 。 咖2 司示& 丽n l 丽 l = n + 2 4 4 24 ( 3 3 ) ( 3 。4 ) 将式( 3 3 ) 带入式( 3 。4 ) 就可算出光波与样品的实际作用光稷。以水为例， ( 水的折射率 1 2 = 1 3 3 ) ，在1 0