（神经生物学专业论文）大鼠海马、杏仁体和前额叶皮层β受体的分布和在记忆中的作用.pdf

论文独创鬻蠢羹 利豁詈滗协彳滴婺篓噌戴纠雪彭斋蓊翼囊嚣磕矍联潼蠹磷名疆绣，强噶淫曜 要靶外一剐鳎韶酸裾韩；i j ! 妁囊孽：陋溷囊强溯强翟港啭湮唾嘱渊糯净镝渊滋；f j i 茎 雾m 蠢器= 爨殛薷潮塑嚣骋毽蕈嚣嚣潮篓蓑翳荔羹鹦雾秘矍蓍墨薹雪副毒爨苎 萄邗节莉长。 时穗捂移 羹錾雾羹羹冀鋈萋 蠢鬻 蠼嚣酌嚣! 曼雨委羹抑铷荆损喜：依赖于蛋霉喟洞惮嘲：期s 坦霜苗崩渤短 津摧蹦写璀曼晚 期 u 甲和长时程记忆的巩固过程中起关键作用( m a 球 r d 吐a 1 ，1 9 9 5 ，s i l v a e t a 1 ， 1 9 9 8 1 。p k a 、m a p k 抑制剂损害依赖于蛋白合成的晚期u 甲；并且在训练后局 部注射p k a 、m a p k 抑制剂到海马损害记忆( c o l l e ye ta 1 。1 9 9 0 ，h u a n gc ta 1 ，1 9 9 2 ， b l u me ca 1 1 9 9 9 ) 。训练后，海马p k a 活性及c r eb 免疫反应活性增加。这些结 果提示晚期l t p 和记忆巩固过程涉及c a ，的激活以及p k a对c 砌! b 转录因子的 中文摘要 中文摘要 第一部分tp 受体在大鼠海马的分布及在记忆巩固中的作用 海马接受大量的来自蓝斑的肾上腺素能纤维投射，海马内分布着丰富的肾上 腺素能受体。大量研究表明，海马b 受体参与对突触可塑性和学习与记忆的调控。 然而，关于b 受体的两种亚型在海马学习和记忆中扮演什么角色还不是十分清 楚。本部分工作报道了p l 和p 2 受体在海马具有不同的亚细胞分布，p 1 和p 2 受 体都参与调控场景恐惧记忆的巩固过程。在本实验中，我们运用免疫荧光标记和 激光共聚焦扫描的方法，发现p l 和p 2 受体主要分布在海马c a l 和c a 3 区的神 经元，在星型胶质细胞上则没有表达；其中，b l 受体主要分布在神经元的细胞 膜和细胞质，而b 2 受体不仅分布在神经元的细胞膜和细胞质，在细胞核中也有 分布。同时，我们也发现在恐惧条件化训练之后，海马c a 3 区的b 1 受体表达水 平增高，这提示c a 3 区0 1 受体可能参与记忆巩固。为了进一步证实这一点，我 ， 们在c a 3 区注射p 1 受体或p 2 受体的选择性拮抗剂，m e t o p r o l o l 或i c l l l 8 5 5 l ， 观察对记忆巩固过程的影响。结果表明，c a 3 区局部注射p l 受体或胆受体选 择性拮抗剂后，大鼠长时程场景恐惧记忆和空间记忆均受到损害。以上结果表明， 海马c a 3 区p l 和陷受体在记忆的巩固过程中起重要作用。 关键词：p 1 受体，p 2 受体，记忆巩固，海马，大鼠 中文摘要 2 第二部分：肾上腺素能p 受体在大鼠杏仁核基底外侧核的分布及在记 忆巩固中的作用 大量研究表明杏仁核d 受体参与突触可塑性和学习与记忆的调控。然而，关 于杏仁核，特别是杏仁核基底外侧核b 受体的两种亚型在记忆巩固过程中扮演了 什么角色。还不是十分清楚在本实验中，我们首先运用了免疫荧光标记和激光 共聚焦扫描的方法，发现：p l 和p 2 受体主要分布在杏仁核基底外侧核的神经元， 在星型胶质细胞上则没有表达：其中，b l 受体主要分布在神经元的细胞膜和细 胞质，而b 2 受体不仅分布在神经元的细胞膜和细胞质，在细胞核中也有分布。 我们在杏仁核基底外侧核局部注射p l 或d 2 受体选择性拮抗剂，m e t o p r o l o l 或 i c i l l 8 5 5 1 ，大鼠的长时程声音恐惧记忆受到伤害，而短时记忆没有受到影响。 以上结果表明，杏仁核基底外侧核d 1 和p 2 受体在声音恐惧记忆的巩固过程中起 重要作用。 关键词：p l 受体，p 2 受体声音恐惧记忆，杏仁核基底外侧核，大鼠 英文摘要 4 a b s t r a c t p a r tl ： p 1 a n d 胆- a d r e n o c e p t o r si nt h ec a la n dc a 3s u b r e g i o n s o ft h er a th i p p o c a m p u sa n dt h e i rr o k si nm e m o r yc o n s o l i d a t i o n t h ec x i s t e n o fp a d r e n o c 印t o r s ( a r s ) i n 也eh i p l ) o c a m p 憾a n dm ei i i l p o r t a n c e o f 肛a i bi nr e g ：1 1 1 a 曲gs y n a p d cp l a s t i d t ya n dl e 锄i n m 锄o f yf i | i l c t i o na w d l d o e n t e d h o w e v e r l i m ei s 】a 眦m md b o u tn l cd i s 缸b u t i o n s 髓df 1 1 n c t i o n a lr 0 1 e so f t h ep - rs u b t ) 节e s ，p l 一粕dp 2 - a 黜，i nt 圭地1 1 i p p o c a n l p i l s h e r e ，w er c p o r tt l l a tp l - 锄d a 鼬i i lt h ec a l 趾dc a 3 g i o l l sl l a _ v ed i 撩撇m a l 删l u l 盯d i s 曲u d o 船 a n d 的l l l 伽os i l b t y p e si nt b cc a 3f e g i o np l a y 粗i m p o r t a i l tm l ei m 锄o r y l i d a t i o n u s i n gd o d b l ei 蛐l l i l o f l u o r e s c e n c cl a b d i l l g锄dc o n f o c a ll 越盯 s c 锄血gn l i c m s c o p y w ef o u r l d 也a ta l i n o s ta no ft h en e i 】_ np o s i t i v ec e l l se x p r e s s e d p 1 - a i l dp 2 - a r s ，w l l i l c 锄vg f a pp o s 砌v cc e i l se x p r e 踮c dt l l 锄i n t e 瑚t i n 羽y p l 拙 i sp r c d o 血n a n t l y 击s 锄b u t e di l lc c i lm c i i l _ b r 蚰e 趾dc y t o p l 勰呱w h 蝴sp 2 一a rn o t o i l l y i i lm 既曲啪ea n dc ”o p l a s n bb u ta l s o i nt l l e u c l e 瑚w ba l s 0f o u n dm 巩 f 0 1 l o w i i l gt l l ec o n t e x t u a l 缅rc o n d 拍o t l i l l g ，m ee x p r 韶s i o no fp l a ri nt l l ec a 3 r e 百o ns i g i l i 丘c a m l y 协c r e a s e d w 毫l h e nl o c a l l yi n f i l s e dt l l ep 1 柚dp 2 一a ra 玎t a g o l l i s b i t of h ec a 3 坞g i o n 锄do b s e r v e d1 h a tb l o c k a g co fe i t l l 盯p 1 a ro rp 2 a ri m p a 砌 1 0 n g - t e 皿c o m e x t lf b a rm 锄o r y 趾dw a t e r - m 毗es p a t i a lm 唧t 址e i lt o g 舶 m c r e s i l l t s 舳g g e s t l l l a tm e p l - 锄d 陀- a 黜i l l m e c a 3r e 西o n a r e 姗o l v e d i n m 锄o r y c o n s 0 1 j d a t j o n k e yw o r d s ：p l - a d r e n o c c p t o r ；p 2 一a d l 铷o c e p t o r ；m e i r l o r yc o n s o l i d a t i o n ；h i p p o c 锄1 p u s ； r a t 第一部分p 受体在大鼠海马的分布及在记忆巩固中的作用 第一节引言 学习和记忆是脑的基本功能。学习是获得新信息或新知识的神经过程，记忆 是对所获取信息的编码、储存和读出的神经过程。动物通过学习或依据经验改变 自身的行为，以适应不断变化的环境而得以生存。多年来，研究者们利用多种动 物模型，从分子、细胞到整体等各个水平对学习与记忆展开了研究r b l i s s 锄d c 0 1 1 m 鲥d g e ，1 9 9 3 ，e i c h b 珊a n do n o ，1 9 9 3 ，s t e v e 璐，1 9 9 8 ，e l g e r s ma l l ds i l u 1 9 9 9 ，m 删ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。记忆形成依赖于突触传递强度的改变。短时记忆只需 对已存在的突触蛋白加以修饰，改变突触传递强度即可实现；而长时记忆需要启 动基因的表达、转录和翻译，需要新蛋白质的合成( d d 、r i s a n d s q u i r e ，1 9 8 4 ) 。 中枢神经系统的各个脑区均接受来自蓝斑的去甲肾上腺素能神经元的投射 ( m 0 0 a n db k l o m ，1 9 7 9 ) 。由于这种广泛的投射，内源性递质肾上腺素和去甲肾 上腺素被认为参与调节了中枢神经系统的许多高级功能，包括调节睡眠觉醒周期 ( b e r f i d g e 卸dw 蛐l l s e ，2 0 0 3 ) 、脑电图活动( f o o t ee ta 1 ，1 9 8 3 ) 、失眠( a g c o n j o n 髓 她db l o o 弛1 9 8 1 ) 、体温变化( p h n i p s o l l ，2 0 0 2 ) 以及学习和记忆巩固( k o b a y a s i l ia n d k o b a y a s h i ，2 0 0 1 ) 。 肾上腺素和去甲肾上腺素通过肾上腺素能受体发挥作用。根据药理学特征， a i l l q v i s t ( 1 9 4 8 ) 把肾上腺素能受体分为a 和p 两大类。随着选择性配体的出现， p 受体又分为p l 、p 2 和p 3 三大类( m d o 砌dc ta 1 ，1 9 9 7 ) 。这些受体广泛分布于 外周和中枢系统，行使着多种职能。p l 、p 2 和p 3 受体在中枢神经系统中都有分 布，但是p 3 受体分布极为有限。p 受体( p l 、p 2 和d 3 ) 属于g 蛋白家族受体，与 g s 耦连，激活腺苷酸环化酶( a c ) ，导致胞内c a m p 浓度的升高、p k a 激活、 c r e b 磷酸化等一系列反应，这些分子事件已经被证明是记忆巩固所必需的 ( m a t y i l i ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 海马是内侧颞叶的一个脑结构，在陈述性学习和记忆中起关键作用。海马长 时程增强( l o n g - t e l m p o t e 埘a t i o n ，l t p ) 是突触可塑性的一种，被认为是学习与 记忆的突触机制。已有研究表明，p 受体在海马有大量分布( b 0 0 z ee t “，1 9 9 3 ， m i l n e re ta 1 ，2 0 0 0 ) ，并参与调节海马的突触可塑性及学习记忆相关的高级功能。 m i h l e r 等人报道了p 受体在海马齿状回的分布。他们发现p 受体主要分布在齿状回 颗粒细胞，同时在中间神经元和胶质细胞中也有分布( m i l n c rc ta 1 ，2 0 0 0 ) 。然而， 关于p l 和d 2 受体在海马c a l 和c a 3 区的分布还不甚清楚。 前人的研究表明，海马c a l 区的l t p 受b 受体的调制。l t p 诱导后，3 0 分钟内 给饥渴的大鼠喂水，增强l t p 的维持；u r p 诱导后给予电击，也增强l t p ；而b 受 体拮抗剂阻断喂水和电击对l t p 的增强作用( d i l d a i ，1 9 9 6 ) 。0 节律的脉冲刺激 ( 5 1 2 h z ) 是一种中性频率的刺激，不修饰突触传递强度，但在n e 或d 受体激动 剂异丙肾上腺素存在的情况，却诱导出很大的l 订低a t s u 虹e ta 1 ，1 9 9 7 ，w i n d e r 吐 a 1 ，1 9 9 9 ，b m m le ta 1 ，2 0 0 0 ，g i o v a i l i n ie ta 1 ，2 0 0 1 ，l e ee ta 1 ，2 0 0 4 ) ；而给予p 受体 拮抗剂后，这种效应被阻断哐a t 翻l k ic ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 据报道，海马c a l 区d 受体参与学习和记忆巩固。例如，训练后阻断海马c a l 区p 受体损害场景恐惧化( j ie ta 1 ，2 0 0 3 a ) 、气味- 奖励联合学习( s a r a ，2 0 0 0 ) 、水迷 宫空间学习任务( j i 毗a 1 ，2 0 0 3 b ) 和步下抑制回避任务( b e r | 1 a b e ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 的长 时记忆但是，p 1 和p 2 受体各自扮演什么角色，还不是十分清楚。 在本实验中，我们运用免疫组织化学、w e s t 盯n 杂交以及行为药理学的方法， 研究了p 1 和p 2 受体在海马c a l 和c a 3 区的分布，特别是这两种受体的亚细胞分 布；恐惧条件化训练之后，海马c a 3 区b l 受体在m i a 以及蛋白水平的表达变 化；b 1 受体和d 2 受体在场景恐惧记忆和空间记忆的巩固过程中的作用。 ( 一) 实验药品 第二节材料和方法 ( 士) p r o l o l ：p 1 受体选择性拮抗剂，分子量6 8 4 8 ，购于s i g 玎 1 ac h e i n i c a l c o ；i c i l l 8 5 5 lh y 击0 c 1 1 l 嘶d e ：p 2 受体选择性拮抗剂，分子量31 3 9 ，购于s i g m c h e i n i c a lc o 。药物溶解于无菌生理盐水。 ( 二) 实验动物 雄性s p r a g u e - n a w l e y ( s d ) 成年大鼠( 2 0 0 - 2 5 0 克) ，由中国科学院上海实 验动物中心提供。每笼饲养2 3 只大鼠，每天给予充足的水和饲料。1 2 小时光照， 1 2 小时黑暗。室温维持在2 5 。所有涉及动物的实验均按照美国国立卫生研究 院( n i h ) 颁布的“实验动物的照料和使用指南”的要求进行。实验中尽量减少动 物的使用数量和它们的痛苦。 ( 三) 实验方法 一、免疫组织化学 1 兔抗p l 和p 2 受体多克隆抗体的特异性检测 1 1p 1 和p 2 受体的c d n a 克隆 型坚握取：2 2 0 一2 5 0 克的雄性s d 大鼠被乙醚深度麻醉后，立即断头，于冰上快速 分离海马，每个样品约为5 0 1 0 0 毫克。将组织在1 毫升t “z o l ( i n v i t d d 聆n ，c a ， u s a ) 中进行机械裂解，室温放置5 分钟。每l 毫升的1 w z o l 匀浆的样品中加入 0 2 毫升的氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡1 5 秒，室温放置5 分钟之后再冰浴5 分钟，4 0 c ， 1 2 ，o o o g 离心1 5 分钟离心后，混合液体分为三层：下层的红色氯仿相、中间层 以及上层的无色水相。r n a 全部转移到水相中。水相的体积大约为所加入的 1 刚z o l 的6 0 。将水相小心转移到新离心管中，再加入等体积的异丙醇，颠倒 差= 整坌g 鐾箜垄盔墼墨曼堕坌查墨童望丝墨旦尘盟堡旦坚 转染前2 4 小时按照每孔2 l 矿个细胞铺板，保证细胞在转染的时候达到 7 0 9 0 的密度。转染过程如下：分别将o 5 微克质粒和1 微升l i p o f e c t a | ：n i n e 加到 预先准备好的装有5 0 微升。两- m e m 的反应管中，混匀之后室温放置5 分钟，再将 含有质粒和l i p o 舭切m i n e 的溶液混合，室温放置2 0 分钟。在等待的时间中，将细 胞上清换成0 3 毫升的o p 吐m e m ，3 7 培养箱放置约1 0 分钟后，将反应好的质粒 和l i p o f e c t a | _ i i i n e 的混合物加到对应的孔中，3 7 培养箱放置5 小时。5 小时后，吸 掉上清，加入含有l o 胎牛血清的d u l b c c c o sm o d i 丘e de a g l e sm e d i u m ( d m e m ) ， 继续培养2 4 小时。 1 3 w s t e m 杂交分析 p b s 小心( 防止将细胞吹起来) 清洗转染好的细胞，按照每孔加入1 0 0 微升 的l 成样品缓冲裂解液，振荡使细胞裂解后全部转移到反应管中，沸水煮1 0 分钟 后，上样进行w b s t e m 杂交检测。 w b s t e m 过程如下：配制1 2 的s d s - p a g e 胶，把蛋白样品直接上样到 s d s p a g e 胶加样孔内，恒压2 0 0 v ，电泳4 5 分钟左右。电泳结束后，将跑好的胶 取出来，放到配好的转膜缓冲液( 含有2 0 的甲醇) 中，按照公司提供的方法安 装好转膜槽，恒流3 0 0 徂，转膜2 小时。转膜结束后，用立春红染色观察转膜效 果。转好的膜用含5 脱脂奶粉的t b s t 室温封闭l 小时。稀释好一抗( b l 受体抗 体稀释度l ：5 0 0 ；p 2 受体抗体稀释度l ：5 0 ) 后，将抗体加入膜的反应槽中，室 温反应2 小时或者4 过夜，之后弃掉抗体，在侧摆摇床上缓慢摇动用r r b s 洗涤5 次，每次5 一l o 分钟。将稀释好的辣根过氧化物酶( 硼m 标记的二抗( 1 ：1 0 0 ) ，加 到膜的反应槽中，室温反应l 小时，二抗反应结束后，用t b s t 洗5 次，每次5 分钟。 之后用e c l ( p i e r c c ) 显色，x 光片显影。 2 免疫荧光化学实验 2 1 溶液配制 生堡垫盛 9 克n a c l 溶于1 0 0 0 毫升双蒸水。 n a 2 珊0 4 1 2 h 2 0 6 1 6 克和n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 5 6 克，溶于适量双蒸水，定容至l 0 0 0 毫升，p h 值7 4 ，室温储存。o 1 m b 由o 2 m p b 稀释而成。 垒塞里醛固定渡 多聚甲醛4 0 克加热( 6 0 ) 搅拌，溶解于适量o 1 m p b ，必要时加入少量n a 0 h 助溶。滤纸过滤，用o 1 mp b 定容至1 0 0 0 毫升( 口h - 7 4 ) ，4 备用。 2 q 竖蓝鲨 蔗糖2 0 克溶于适量o 1 mp b 并定容至1 0 0 毫升配成2 0 蔗糖溶液。 业! 丛曼墨塑q ：q ! 丛娶墨 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 3 0 8 克，n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 2 8 克，n a c l 8 5 克溶于适量双蒸水， 定容至1 0 0 0 毫升( p h = 7 4 ) ，室温储存。o 0 l mp b s 由o 1 mp b s 稀释而成。 夔逃越兰赳 甘油和0 0 1 mp b s 以l ：l 的体积混合，再加入2 5 的d a b c o 。 2 2 实验操作 将2 2 0 2 5 0 克的s d 雄性大鼠用戊巴比妥钠( 4 0 毫克，毫升) 腹腔注射，深度麻 醉后，经主动脉灌流，相继灌入预热的生理盐水( 3 7 ) 3 0 0 毫升及预冷的多聚 甲醛固定液( 4 ) 5 0 毫升，随后减慢灌流速度维持灌注3 0 分钟多聚甲醛固定液 约2 0 0 毫升。灌注完毕后，取出大鼠脑部，依次置于l o 、2 0 以及3 0 蔗糖溶液 直至标本沉至容器底部。取出标本用冰冻切片包埋剂包埋后于冰冻滑动切片机 ( l e i c a g e n m n y ) 进行海马冠状切片，片厚为3 0 微米。 切片完毕之后，放入o o l m p b s ( 磷酸缓冲液) 中漂洗1 0 分钟，然后将切片 浸入含6 正常驴血清( n d s ) 、1 牛血清白蛋白( b s a ) 以及o 2 蹦t o l l ) ( 1 0 0 的o 0 1 mp b s 中，于4 封闭过夜以降低非特异性背景染色。为了研究p l 和p 2 受 体在大鼠海马的分布情况，我们分别使用了兔抗p l 和p 2 受体的多克隆抗体( p l 受体抗体的稀释度为l ：5 0 0 ；d 2 受体抗体的稀释度为1 ：5 0 ，s 锄t ac n l z c 褂狙的表达，来作为细胞质和细胞核成分的特异性标记物。在该实验中，我们 也使用了p 1 和d 2 受体的特异性阻断肽，来证明这两种抗体的特异性 二、恐惧条件化训练后c a 3 区p l 受体的表达变化 1 场景恐惧条件化任务 1 1 实验设备和环境 实验设备为美国s a l ld i e g oi n s m 皿e n t 公司产品。 训练箱：箱壁由透明有机玻璃组成。长3 6 厘米、宽2 3 厘米、高1 8 厘米。底部 由1 4 根不锈钢管组成，可以通电流。不锈钢管直径为o 5 厘米，两条不锈钢管之 间的间距为1 2 厘米。在训练箱顶壁安装一扬声器，可以产生2 2 0 0h z 、9 6d b 的声 音。 计算机及相应软件：红外线光束监测大鼠的活动情况，由计算机控制和记录。 声音刺激和电击刺激是由程序控制的声音发生器和电刺激器产生。 实验环境：房间明亮、安静，每次训练之前都用9 5 的酒精擦净训练箱，保 持空气干燥，无异味，以免对大鼠的行为产生干扰。 1 2 训练 将大鼠轻轻放入训练箱，允许其自由探索3 分钟。3 分钟后，给予声音刺激 ( 2 2 0 0h z ，9 6d b ；条件刺激) ，声音持续3 0 秒。当声音持续至第2 9 秒时给予足 部电击刺激( 非条件刺激) ，电流强度为1 毫安，电击时间为1 秒。1 分钟后再重 复这一过程声音电击配对刺激。电击刺激结束后，大鼠在训练箱中再停留2 分钟 训练结束 i 1 j i - j 462 4h 取海马c a 3 区 r t p c r w 色s t e mb l o t i m m u n o h i s t o c h e m i s 仃y 图1 2 海马c a 3 区取材测定流程图 2 2r t p c r 检测c a 3 区b 1 受体m 】r n a 水平变化 斟墅攫：同上( i 1p l 和胆受体的c d n a 克隆) 。 壁盥厦整：同上( 1 1p l 和p 2 受体的c d n a 克隆) 。 2 3 w e s t e m 杂交检测c a 3 区p 1 受体蛋白水平变化 亟蛋自地握：训练之后取不同时间点将大鼠断颈处死，于冰上快速取出海马体， 于- 8 0 保存。实验当天，每8 0 毫克组织加入l 毫升组织裂解液，机械匀浆1 0 秒， 冰上放置3 0 分钟，再次匀浆l o 秒，冰上静置3 0 分钟后离心，转速3 4 0 0 r p m ，1 0 分 钟，取上清储存于- 8 0 备用。 监皇曼地型盘奎盆扳：同上( 1 3w e s t e m 杂交分析) 。 3 免疫组织化学检测c a 3 区p 1 受体的表达变化 训练之后取不同时间点将大鼠大鼠用戊巴比妥钠( 4 0 毫克毫升) 腹腔注射， 深度麻醉后，经主动脉灌流，相继灌入预热的生理盐水( 3 7 ) 3 0 0 毫升却丽钟 重蚓哆声冀墅需鬟i 雾嚣! i i 摆瑁景烈影骤型靼崾嗯湾曩曜淳l 随鉴羹壁箭囊 囊蘑灌喱；蠕m 僚；缓璀晖哆；型蓁穗嘈涤刑； l ； 必多觅! 塞毒，l l 妊匿圆自营强灞 羽尚弓准r 搿嗓俪甬氆隔俺孳。褊翱酲韬冀塑萋氧剥潮编海疆追馐瀑僮陔锗僻壤 厦堵i 穗j 喜臻鬻雾羹蹁5 霆w 练后繁善岛圳；堵点器。劬1 )；训练后6 小时，b l 受体表达量 较训练后4 小时组有所降低，但仍显著高于对照组( p o o5 v s c o n n d l ) ，和对照组相 比没有显著差异。将场景对照组( c c ) 8 l 受体的表达量标准化为l ，则其它组 p 1 受体的相对表达量分别为：电击对照组，1 0 1 士o 0 l ；训练后4 小时组，1 3 8 士0 0 5 ； 训练后6 小时组1 2 0 士o 0 3 ：训练后2 4 小时组，1 0 l 士o 0 2 ( 如图1 1 5 ) 。其中， b - t u b l l l i n 的表达量作为内参。 进步，我们用免疫组化的方法观察了场景恐惧条件化训练后，c a 3 区b l 受体表达变化情况。大鼠共分为6 组：没有任何训练的大鼠( 卜a i v e ) ；只进行 场景刺激，而不进行电击配对刺激( c o n t 强c o n 廿o l ，c c ) ；只进行足部电击刺 激，而不给予场景配对( s h o c kc o n 嘶l ，s c ) ；恐惧条件化训练后4 小时取材： 恐惧条件化训练后6 小时取材；恐惧条件化训练后2 4 小时取材。结果显示：和 w e s t e f n 杂交结果相似，训练后4 小时，大鼠海马c a 3 区b 1 受体表达量较对照 组明显增高( p 0 0 1 v s c 傩虹0 1 ) ；训练后6 小时，d 1 受体表达量较训练后4 小 时组较为降低，但是和对照组相比仍显著升高( p o 0 5 v s c o n 仃d 1 ) 。将n a i v e 对照组d l 受体的表达量标准化为l ，则其它组d l 受体的相对表达量分别为：场景对照组， 1 0 5 士o 0 5 ，电击对照组，o 9 6 士o 0 5 ；训练后4 小时组，1 5 4 士o 0 6 ；训练后6 小 时组，1 3 3 士o o6 ；训练后“小时组，o 9 9 士o 0 5 ( 如图1 1 6 ) 三、海马c a 3 区p 1和p 2 受体参与场景恐惧记忆的巩固 1 训练后立即注射m et 叩r o l o l 损害场景恐惧记忆的巩固 次大鼠进入迷宫的位置固定，但平台的位置随机变动。共测试3 次( i t i = 4 0 秒) ， 每次测试时间为6 0 秒。每次测试前，让大鼠在平台上呆3 0 秒，然后，将大鼠从一 个固定的位置放入。若大鼠在6 0 秒内找到_ 甲台，立即从平台上取下，放回笼中休 息4 0 秒；若不能，将其引导至平台并允许其在平台上停留3 0 秒，然后取下大鼠， 放回笼内休息4 0 秒，之后进行下一次测试。记录大鼠找到平台所需要的时间、游 泳轨迹及游泳速度。 3 手术 图l 一6 水迷宫无平台测试( a ) 和可视平台测试( b ) 示意图 大鼠用戊巴比妥钠( 4 0 毫克公斤体重，腹腔注射) 麻醉后，将头部固定在立 体定位仪上( n a r i s i l i g es n 一2 ，j 印a 1 1 ) 。在背侧海马的c a 3 区双侧埋植不锈钢引导管 ( 外径6 5 0 微米，内径4 0 0 微米，长8 o 毫米) ，位点为：b r e g m a 点向后3 4 毫米； 旁开中线3 o 毫米：颅骨平面向下2 5 毫米。手术后，引导管内插入实芯不锈钢管 作为塞子，以防感染。大鼠苏醒后，送回动物房饲养。动物恢复一周，进行行为 实验。 4 给药和动物分组 在场景恐惧条件化和m o r r i s 水迷宫行为任务中，给药分别在训练后5 分钟或 训练后6 小时进行。经引导管c a 3 区双侧注射m e t 叩r o l 0 1 ( 6 0 n m ) 、i c i1 1 8 5 5 l ( 3 0 n m ) 或无菌生理盐水。注药时，取出引导管内的塞子，插入不锈钢注射管 ( 外径，o 3 0 毫米) ，其尖端超出引导管1 5 毫米，即注药位点为颅骨平面下4 o 毫米( 如图1 7 ) 在大鼠自由活动的状态下，以o 1 微升份钟的速度，每侧注入 o 5 微升。注射完毕后，注射管在引导管中停留3 分钟然后取出，重新插入塞子。 在行为学实验中，大鼠分为生理盐水组、m c t o p r 0 1 0 l 组和i c i l l 8 5 5 1 组。 5 组织学检查 5 1 溶液配制 海马e a 3 区： b r e g o m a 点向后3 4 m m 左右旁开3 0 m 引导管长8 0 雌 手书颅骨平面向下2 ，5 雌 打药管长9 5 图1 7 。海马c a 3 区埋管模式图 整流速： 生理盐水：o 9 克氯化钠溶解于1 0 0 毫升蒸馏水 糊多聚甲醛固定液：4 9 多聚甲醛溶解于l o o 毫升0 1 m 的p b ，p h 值7 4 q ：z 丛里堡卫丛z ：g ； n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 05 8 0 2 克 n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 5 9 3 克 d 2 h 2 0加至1 0 0 0 毫升 调节p h 值至7 4 ，灭菌后使用 2 q 竖蘸越置拯渣i3 0 克蔗糖溶解于1 0 0 毫升o 1m p b l 丝生丝红渣澶( ! q q 壹吐2 ： 中性红l 克 蒸馏水9 8 毫升 o 2 m 醋酸缓冲液( p h 4 8 ) 2 毫升 使用前过滤 壁：2 丛醋酸缓挫渲： a o 2 m 醋酸( o 1 2 毫升冰醋酸l o 毫升d d h 2 0 ) b 一- o 2 m 醋酸钠( o 1 “克无水醋酸钠1 0 毫升圳2 0 ) c d d h 2 0 每1 0 0 毫升缓冲液中：a 液2 0 毫升+ b 液3 0 毫升+ c 液5 0 毫升 q ：q 量丝筮堇渣泣： 硫堇0 0 5 克 d d h 2 01 0 0 毫升 必要时过滤 5 2 组织学检查 灌速塑卮固定：行为学实验结束后，用过量的戊巴比妥钠( 腹腔注射，5 0 毫克 公斤) 麻醉，打开胸腔，暴露心脏，夹闭腹主动脉，注射针头插入左心室进到 升主动脉，剪开右心耳。先用生理盐水( 1 0 0 0 毫升) 迅速冲洗血液，再缓慢灌注 1 0 的福尔马林固定液( 3 0 0 0 毫升) 。灌流结束，取出全脑，将其置于4 的多聚 甲醛固定液中进行后固定。 量拯：取脑部前1 佗的脑组织块，放入以o 1m 磷酸缓冲液( p b 液) 配制的2 5 蔗糖溶液中，下沉后换到3 0 蔗糖溶液中，再下沉后即可切片。冰冻切片：脑组 织块适度冰冻后，切片，每片厚度4 0 微米。切下的脑切片用细毛笔从切片刀上拭 去，收集在格子中，每格2 3 片。 照左：载玻片挂好明胶。预先用金刚石笔在载玻片的一面划痕数道，根据划痕 鉴别贴片面与非贴片面。将载玻片斜浸于p b s 溶液中，用毛笔把在p b s 溶液中展 开的切片轻轻拖到载玻片上，整齐排列。贴好的脑片放在3 7 烘箱中烘一昼夜。 蒸虚：在玻片上滴一滴中性树胶，盖上洁净的盖玻片。待树胶干后，在光镜下 观察注药位点，并拍照。 虫丝红鍪鱼：将烘干后的脑片浸入蒸馏水中复水( 约3 0 秒) ，然后再浸入1 中 性红( 1 0 分钟) - + 9 5 乙醇+ 2 滴冰醋酸一7 0 乙醇_ 8 0 乙醇一9 5 乙 醇一1 0 0 乙醇一1 0 0 乙醇一二甲苯一二甲苯一中性树胶封片。染色时 上下移动玻片以便染匀，两次二甲苯透明的时间为3 0 分钟。 煎堇鎏鱼：将烘干后的脑片浸入硫堇染色液中约3 0 秒，然后经过5 0 乙醇寸7 0 乙醇寸8 0 乙醇呻9 5 乙醇斗1 0 0 乙醇一1 0 0 乙醇- 二甲苯啼二甲 苯斗中性树胶封片。染色时上下移动玻片以便染匀，两次二甲苯透明的总时间 为3 0 分钟 6 统计学处理 所有实验数据均采用平均数士标准误( m e a i 吐s e m ) 表示。用非配对t 检验检 测各组之间分子生物学或行为学结果差异的显著性。双侧p o 0 5 定义为差异显 著，p o o l 为差异极显著。 第三节实验结果 一、p l 和p 2 受体在海马c a l 和c a 3 区的分布 1 兔抗p l 和p 2 受体多克隆抗体特异性的研究 为了研究p l 和阢受体在海马的分布，我们购买了兔抗p 1 和p 2 受体的 多克隆抗体。首先设计了阳性对照和阴性对照实验，来证明这两种抗体的特异性。 在阳性对照实验中，我们克隆了这两种受体的d n a 序列，连接进入真核 表达载体，然后转染脏k 2 9 3 细胞，和f l a g ( 标记性的小肽段，用来检测转染 是否成功) 共表达，然后进行w 瓠t e m 杂交检测。实验分为三组( 如图1 8 ，左 图) ，分别是：l ，转染b l 受体f l a g 实验组；2 ，转染空质粒对照组：3 ，转染 贮受体一f 屺实验组。分别用p l 和p c 2 受体的抗体对三组细胞的蛋白抽提物进 行标记，同时也检测了f l a g 和p t t l b u l i n 的表达。结果表明，转染d l 受体- f l a g 和陀受体f l a g 的实验组，都检测到了f l a g 表达而转染空质粒的对照组则 没有检测到f l a g 表达，说明p l 和p 2 受体的克隆及对h e k 2 9 3 细胞的转染是 成功的；p l 受体的抗体只在p 1 受体f l a g 转染组中检测到外源表达的p l 受 体，而p 2 受体的抗体也只在贮受体f l a g 转染组中检测到外源表达的p 2 受体， 二者没有发生交叉反应，说明这两种抗体对抗原的识别具有特异性；三组中都 检测到了d t 曲i l l i n 的表达，说明三组的表达系统是没有问题的。 为了进一步证明p l 和陴受体w b s t e n l 条带的特异性，我们分别用这两种 抗体特异性的阻断肽进行了抗原封闭实验。结果表明，p l 和陷受体的阳性反应 被相应的阻断肽阻断( 如图1 8 ，右图) 。 2 海马即和p 2 受体的免疫杂交 那么p l 和p 2 受体是否在海马中表达呢? 我们将大鼠海马分离，抽提蛋白进 行w b s c e m 杂交的检测。结果表明，海马中有p l 和p 2 受体表达，而且检测到的 单条带也被相应的阻断肽所封闭( 如图1 9 a ) 同时我们进行了免疫组化检测，用p l 和p 2 受体的抗体在背侧海马的冠状切 片上进行标记，来检测p l 和p 2 受体的表达( 如图1 9 b ) 。结果显示，p l 和p 2 受体在海马中都有表达，特别是海马的锥体层和齿状回的颗粒细胞层。不加一抗 只加二抗进行的反应作为检测抗体特异性的阴性对照实验。同样，免疫组化的阳 性反应也被p 1 和p 2 受体相应的阻断肽所封闭( 如图l - 9 c ) 。 3 p l 和p 2 受体在c a l 区的细胞分布 p l 和p 2 受体在海马，特别是海马锥体细胞层有大量分布，接下来我们想观 察p 1 和p 2 受体在海马哪些细胞上表达。我们使用免疫荧光双标和激光共聚焦成 像的方法来研究海马c a l 区p 1 和p 2 受体的细胞分布情况，n e u n 和g f a p 的抗 体分别用来标记神经元和星型胶质细胞。结果表明，b 1 受体主要分布在海马c a l 区的神经元( 如图1 1 0 a ) ，而在g f a p 阳性的星型胶质细胞没有表达( 如图 1 1 0 c ) ；和p l 受体相似，p 2 受体也主要分布在海马c a l 区的神经元( 如图 l - l o b ) ，而在星型胶质细胞上没有表达( 如图1 1 0 d ) 。 4 p 1 和p 2 受体在c a 3 区的细胞分布 c a 3 区也是海马重要的组成部分。所以我们同样使用了免疫荧光双标和激 光共聚焦成像的方法来研究海马c a 3 区p 1 和陋受体的细胞分布，n e u n 和g f a p 的抗体被分别用来标记神经元和星型胶质细胞。结果显示：与c a 3 区相同，b l 受体主要分布在海马c a 3 区的神经元( 如图1 1 l a ) ，而没有在星型胶质细胞表 达( 如图1 - 1 l c ) ：b 2 受体也分布在海马c a 3 区的神经元( 如图1 1 1 b ) ，而没 有在星型胶质细胞表达( 如图1 1 1 d ) 。 5 p 1 和p 2 受体在海马c a l 和c a 3 区的亚细胞分布 为了进一步研究p 1 和p 2 受体在c a l 区和c a 3 区的分布，我们观察了b l 和b 2 受体在细胞质和细胞核的分布。其中，d a p i 用来作为细胞核的标记物。 结果表明，在海马c a l 区，b l 受体主要分布在神经元的细胞膜和细胞质中，而 在细胞核中则没有表达( 如图1 1 2 a ) ：和p 1 受体不同，p 2 受体不仅在神经元 细胞膜和细胞质有表达，在细胞核中也有分布( 如图1 1 2 b ) ；在海马c a 3 区， 和c a l 区相似，d l 受体分布在神经元的细胞质和细胞膜上，而陷受体在神经 元的细胞膜、细胞质以及细胞核中都有表达( 如图1 1 2 c 、d ) 。 为了进一步证明p 1 和b 2 受体在海马的亚细胞分布，我们分离大鼠海马抽提 蛋白，将细胞质和细胞核成分分离，然后进行w j 咖m 杂交检测。结果表明，在 细胞质组分中检测到了p l 和p 2 受体的表达：而细胞核组分中只检测到了陷 受体阳性，p 1 受体没有表达：我们同时检测了p t u b i l l i n 和c r e b 的表达，分别 作为细胞质和细胞核组分的标记物。其中p 1 和p 2 受体的阳性条带可以分别被其 特异性的抗原肽所封闭( 如图1 1 3 ) 。 二、场景恐惧条件化训练后，大鼠海马c a 3 区b 1 受体的表达升高 那么，依赖于海马的场景恐惧记忆的巩固过程是否需要启动c a 3 区d 1 受体 的表达呢? 对这一问题我们进行了研究。在场景恐惧条件化训练后不同时间点分 离c a 3 区，检测0 1 受体m r n a 和蛋白水平的表达变化。 1 场景恐惧条件化训练后，c a 3 区p 1 受体m r n a 水平升高 训练后4 小时、6 小时和2 4 小时分别分离海马e a 3 区，抽提r n a 检测d l 受体在m i a 水平的表达变化。共有5 组大鼠：只进行场景刺激，而不进行电 击配对刺激( c o i c xc o 曲瑚，c c ) ；只进行足部电击刺激，而不给予场景配对 ( s h o c kc o n 胁i ，s c ) ；恐惧条件化训练后4 小时取材；恐惧条件化训练后6 小时取材；恐惧条件化训练后2 4 小时取材。结果显示：大鼠接受训练后4 小时， 海马c a 3 区b l 受体i n 】赋a 水平和对照组相比显著增高( p 0 0 1 v s c o n 扛d 1 ) ； 训练后6 小时，b 1 受体m r n a 水平仍较对照组显著增高( p o 5 ) 。 训练后，分别给予m e t o 呻l o l 和生理盐水。在场景恐惧记忆的检测中，训练 后l 小时检测，m e t o p r o l o l 组与生理盐水组大鼠相比，僵直时间没有显著差异( 图 1 1 7 b ，生理盐水组，7 5 6 7 1 ；m e t 0 肿l o l 组，7 6 1 6 6 ，p 0 5 ) 然 而，训练后2 4 小时测试时，m e t o d m l o l 组大鼠的僵直时间显著少于对照组( 图 1 1 7 c ，生理盐水组，6 8 1 3 1 ；m 瞰 p r o l o l 组，3 9 7 7 1 ，p o 5 ) 立即检测的结果表明，两组大鼠的僵直时间也没有显著差 异( 如图1 1 7 a ，i m m e d i a e ，生理盐水组，7 1 6 6 1 ；i c l l l 8 5 5 l 组，6 1 1 7 7 ， p o 5 ) 。 训练后，分别给予i c i l l 8 5 5 1 和生理盐水。在场景恐惧记忆检测中，训练后 l 小时检测，i c l l l 8 5 5 l 组与生理盐水组大鼠相比，僵直时间没有显著差异( 图 1 1 7 b ，生理盐水组，7 5 6 7 1 ；i c i l l 8 5 5 1 组，7 0 1 6 7 ，p o 5 ) 。训练 后2 4 小时测试，i c l l l 8 5 5 l 组大鼠的僵直时间显著少于对照组( 如图1 1 7 c ， i c i l l 8 5 5 l 组和生理盐水组比，生理盐水组，6 8 1 3 1 ：i c l l