（生物医学工程专业论文）per1相互作用蛋白rack1的近日节律相关基因.pdf

四川大学顾卜学位论丈 结果： 实验一：采用定向克隆方法构建了h p e r l p a s p g b k w 重组诱饵表达质粒， 同源重组构建了脑c d n a p g a d t 7 - r e c 文库，并通过顺序转染成功构建了酵母双 杂交系统。采用营养缺陷筛选以及b - 半乳糖苷酶检测验证阳性克隆转化子内报 告基因的表达，最终得到2 8 个阳性克隆。p c r 扩增阳性克隆转化子内的插入片 段，筛选得到了编码人r a c k i 蛋白碳端部分氨基酸的阳性克隆，体外转录翻 译p e r l 一p a s b d 诱饵融合蛋白和r a c k i l s l - s o d a d 文库融合蛋白，免疫共沉淀 验证了蛋白间的特异性相互作用。 实验二：对g n b 2 l l 体内的表达研究证实，在光线诱导( 1 2 d 1 2 l 光暗循环) 或仝黑情况下，b a l b c 小鼠脑g n b 2 l lm r n a 水平均呈现近只节律性波动。体 外采用p m a ( 1 0 0 n m ) 成功诱导了n i h 3 t 3 细胞的钟基因近日节律振荡，并发 现了g n b 2 l lm r n a 的近日节律振荡。引起行为节律位相移动的光脉冲刺激诱导 了g n b 2 l l 的光敏感性立早表达。免疫组化显示p e r i 的高表达伴随r a c k i 由 散卸胞浆到聚集于核周的细胞分布改变。 结论； 本实验成功构建了酵母双杂交系统，并筛选得到了脑内p e r l 新的相互作 用蛋白- - r a c k l 。并对r a c k l 进行了近闩节律相关研究，初步探讨了r a c k l 在近同节律分子机制中的作用，提供了新的思路，以供研究近r 节律分子振荡 的信号通路、p e r i 的负反馈调控机制以及近r 节律相关疾病的治疗靶点。 关键词： 时日j 生物学，近日节律，酵母双杂交，p e r i o d l ，r a c k i ，蛋白相互作用， 免疫共沉淀，p a s 结构域，w d 4 0 结构域。 2 l j l ij i l 大学硕l 学位论文 a b s t r a c t o b j e c t s t oi d e n t i f yn o v e lp e r i o d ii n t e r a c t i n gp r o t e i n sb yy e a s tt w oh y b r i ds c r e e n i n g ，a n d f i n dt h ec i r c a d i a nr e l a t e dr o l eo fr a c k l t h e r ea r et w op a r t si nt h er e s e a r c h ：1 s e l e c t i n gn e wi n t e r p l a y i n gm o l e c u l eo fp e r l - p a sd o m a i n ；2i n v e s t i g a t er a c k i f u n c t i o ni nt h ec i r c a d i a nr h y t h m m e t h o d e x p e r i m e n tl ：s e l e c t i n gn o v e lp e r li n t e r a c t i n gp r o t e i n sb yy e a s tt w o - h y b d d e d n af r a g m e n tw h i c he n c o d ep e r l 一p a sd o m a i nw a sd i r e e t i o n a l l yc l o n e di n t o p g b k t 7 b a i t v e c t o rt o c o n s t r u c tr e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n a l p l a s m i d l p 打j p a s p g b k t 7 c o n s t r u c t h u m a nb r a i ne d n al i b r a r y b yh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o na n de s t a b l i s hy e a s tt w o - h y b r i ds y s t e mb ys e q u e n c et r a n s f e c t i o n t h e n s e l e c tp o s i t i v ec l o n e sb yr e p o r tg e n e st e s t s a m p l i f yt h ei n s e r t so fp g a d t 7 - r e c p l a s m i di nt h ep o s i t i v ec l o n e sf o rs e q u e n c i n ga n db i o i n f o r m a t i e sa n a l y s i st oi d e n t i f y n o v e lp e r ii n t e r a c t i n gp r o t e i n v e r i f yt h ei n t e r p l a y i n gb e t w e e np r o t e i n sb y c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o nw i t ht h ep r o d u c t sf r o mi nv i t r ot r a n s c r i p t i o n t r a n s l a t i o n e x p e r i m e n t2i n v e s t i g a t i o no fr a c k lf u n c t i o n i nt h ec i r c a d i a ns y s t e m ： h a l f - q u a n t i t a t er a c k le x p r e s s i o nb yr t - p c rd e t e c t i n gg n b 2 l lm r n a l e v e lw i t h t h en i h 3 t 3c e l ls a m p l e si n d u c e db yp m aa n dw i t l lt h eb a l b c m o u g gb r a i n s a m p l e su n d e rc o n d i t i o no f1 2 d 1 2 lo rd d r e c o r dt h ef r e er u n n i n gw h e e l i n go f b a l b cm i c es i m u l t a n e o u s l y s t i m u l a t et h eb a l b cm i c ew i ml i g h tp u l s ew h i c h c a ni n d u c ep h a s es h i f to fb e h a v i o r a lc i r c a d i a nt oo b s e r v ep h o t o s e n s i t i z e de x p r e s s i o n o fi m m e d i a t ee a r l yg e n eg n b 2 1 1 o b s e r v ed i s t r i b u t i o no fr a c k ii np e a kt i m ea n d v a l l e yt i m eo f p e r lp r o t e i n r e s u l t e x p e r i m e n tl ：c o n s t r u c t e dh p e r l p a s i p g b k t 7r e c o m b i n a n tb a i tp l a s m i da n d h u m a nb r a i nc d n al i b r a r ya n dt h e ne s t a b l i s h e dy e a s tt w o h y b r i ds y s t e m 3 网川大学顾卜学位论史 s u c c e s s f u l l y o b t a i n e d 2 8 p o s i t i v e c l o n e sc o n t a i nt r a n s f o r m a n t s e x p r e s s i n g i n t e r a c t i n gp r o t e i n sb yg r o w i n g o n s d - a d e - h i s - l e u - t r p m e d i u ma n d 1 3 - g a l a c t o s i d a s ea s s a y b yp c ra m p l i f i c a t i o n ，t h ei n s e r to f p g a d t 7 - r e c r e c o m b i n a n t p l a s m i di nt h ep o s i t i v e c l o n e sw a so b t a i n e da n ds e q u e n c e d b yb i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s ，t h ei n s e r te d n af r a g m e n ti no n eo ft h ep o s i t i v ec l o n e sw a si d e n t i t yw i t ha p a r to fc t e r m i n a la m i n oa c i do fr a c k i t h ei n t e r p l a y i n gb e t w e e nr a c k ia n d p e r i - p a sw a sv e r i f i e db yc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o nw i t ht h ep r o d u c mf r o mi nv i t r o t r a n s c r i p t i o n - t r a n s l a t i o n a s ar e s u l t r a c k lw a si d e n t i f i e d a san o v e l p e r l i n t e r a c t i n gp r o t e i n e x p e r i m e n t2 ：g n b 2 l lm r n a l e v e l ss h o wc i r c a d i a no s c i l l a t i n gi nn i h 3 t 3c e l l s i n d u c e db yp m aa n di nb a l b cm i c eu n d e rc o n d i t i o no f1 2 d 1 2 lo rd d b a l b c m i c et o o ko nac i r c a d i a np r o f i l ei nt h e i rf r e er u n n i n gw h e e l i n g h i g he x p r e s s i o no f i e gg n b 2 l lw a si m m e d i a t e l yd e t e c t e da f t e rl i g h tp u l s ew h i c hi n d u c e dt h ea n i m a l s b e h a v i o r a lp h a s es h i f ts i m u l t a n e o u s l y b yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt e s t ，r a c k lw a s o b s e r v e dt ot r a n s l o c a t e df r o mc y t o p l a s mi n t on u c l e u s p e r i p h e r a li nt h ep e a kt i m eo f p e r ip r o t e i n c o n c l u s i o n i nt h i sr e s e a r c h w ee s t a b l i s h e dy e a s tt w o - h y b r i ds y s t e ms u c c e s s f u l l ya n di d e n t i f i e da n o v e lp e r li n t e r p l a y i n gp r o t e i n - r a c k l t h ep u t a t i v er o l eo fr a c k ii nt h e c i r c a d i a ns y s t e mw a si n v e s t i g a t e dp r e l i m i n a r y o nt h eb a s i so fo u rr e s e a r c h , f u r t h e r s t u d i e ss h o u l db ep e r f o r m e dt oe l u c i d a t et h em e c h a n i s mo fn e g a t i v ef e e d b a c ke f f e c t o fp e r li nc i r c a d i a nm o l e c u l a rl o o p ；t od i s c o v e rn e wi n t r a c e l l u l a rs i g n a l t r a n s d u c t i o nc a s e a d ei n v o l v e di nc i r c a d i a n ；a n dt of i n ds i g n i f i c a t i v et a r g e tf o rt h e t h e r a p ya g a i n s tc i r c a d i a nr e l a t e dd i s e a s e k e yw o r d s ：c h r o n o b i o l o g y ，c i r c a d i a n ，y e a s tt w o - h y b r i d ，p e r i o d i ，r a c k i ， p r o t e i ni n t e r a c t i o n c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，p a sd o m a i n ，w d 4 0d o m a i n 4 p q 川人学顾卜学位论文 第一章前言 生物节律为生物界普遍存在的生命活动基本现象之一。在自然界中从单 细胞到高等动植物以及人类的所有生命活动均存在着按照一定规律运行的、周 期性的生命活动现象，这种生命活动现象通过大量的实验研究表明是明显节律 性活动，称为生物节律。根据其变化周期的长短，生物节律被分为亚只节律、 近只节律，超只节律。这些生物节律既存在于整个机体之中，办存在于器官、 乃至于游离的单个细胞之中，因此生物节律是生命活动的基本特征之- - i ”。生 物节律广泛存在于大自然中生物的生命活动中，是上亿年生物在其发生和进化 过程中，为了与环境影响和环境变化相适应，而逐渐形成的内源性的与自然环 境周期性变化相近似的节律性的生命活动。 在生物体内存在着以近似2 4 小时为周期变化的生物节律，即近同节律。而 且还广泛地存在着其他周期的生物节律1 2 1 。根据这些生物节律的周期长短，生 物节律又分为亚只节律( i t f f r a d i a nr h y t h m ) ，即这类生物节律的周期大于2 8 小时， 振荡的频率低于1 日；另外还有超日节律( u l t r a d i a nr h y t h m ) 这类生物节律的周 期小于2 0 小时，其振荡频军大于1 日。近日节律是生物体内最强的生物节律， 人体的许多生理、生化参数均有近只节律的特点，如睡眠一觉醒、体温、血压、 心率等均表现出明显的近日节律的规律。该节律是内源性的，通常情况下，因 机体生活在以昼夜交替的自然环境中，内源性的自激振荡节律受环境中昼夜交 替的节律影响，表现出以2 4 小时为周期的特点。 从简单的单细胞生物到复杂的哺乳动物均存在近日节律，说明近同节律为 ，物界基本和占老的生理现象。在远古时期，产生生命的地球环境较为恶劣， 如：较强的紫外线等。地球的自转不但引起可见光的交替变化而导致昼夜循环， 而且也可能引起其他环境因素，如：紫外线强度的昼夜变化。这些环境因素的 昼夜变化，可能使远古生物在白昼或黑夜不利于或有利于某些生理生化活动， 如：d n a 的合成。为了适应环境的昼夜变化，机体逐渐形成了与之相适应的呈 近f 1 节律的生理和生化活动，并逐步向高级生物进化。生物体在进化过程中， 不断接受自然选择和淘汰，使更高级的生物存在近日节律。在高等动物，如： 哺乳动物，近同节律不但在适应环境的变化起着重要作用，而且在调节和协调 各个系统的功能等方面也占有及其重要的地位。 时j ”大学硕士学位论文 近r 节律的产生并不需要由多细胞组成的复杂系统就能完成。单细胞生物 仍然能够产生近同节律0 1 ；哺乳动物某些组织的立体细胞，其生理生化功能以 及基因表达仍然存在近日节律，并且能够维持一定的时间1 4 ，5 i 。不同种属生物近 r 节律产生的分子基础类似，都是由时钟基因的转录和转录后调控产生的分子 振荡引起。高等哺乳动物，近同节律系统更为复杂。为了维持近同节律系统的 功能，哺乳动物的近同节律系统有更多的组织和器官参与。一般来说，高等生 物的近同节律系统包括：近日节律系统输入、近日节律系统中枢和近同节律系 统输出。就哺乳动物而言，视网膜、下丘脑视交叉上核( s c n ) 和松果体等器 官在近日节律系统中占有重要的地位。 l 近日节律基因及其分子振荡 近日节律的产生并不需要由多细胞组成的复杂系统就能完成。仅为一个细 胞的单细胞生物仍然能够产生近日节律。在体外，哺乳动物的某些组织的离体 细胞，其些生理、生化功能仍然存在近日节律，并且能够维持一定的时日j 。这 充分说明近r 节律的产生和维持的最低情况可以在单个细胞的完成。就本质而 言，近同节律的产生是由一系列近e l 节律基因的转录和转录后调控所引起的分 子振荡。不同种属生物的近日节律产生的分子基础类似。 u t f i 9 1 it h em o d e lo f m o l e c u l a ro s c i l l a t i o no f c i r c a d i a nc l o c k 6 四川大学硕卜学位论文 通常，c l o c k 和b m a l l 形成的异二聚体在近日节律分子振荡中起重要 作用。c l o c k b m a l i 作为转录因子与一些近同节律基因，如：p e r l 、p e r 2 、 p e r 3 、c r y l 、c r y 2 等的e - b o x 结合，启动这些近同节律基因的转录。 c l o c k b m a l l 的活性高低决定这些c r y 2 等基因的转录增加，其蛋白产物在 细胞浆内增多。通过磷酸化后，进入细胞核。p e r l 、p e r 2 、凡一、c r y l ，c r y 2 等基因的蛋白产物进入细胞核后反馈性的抑制c l o c k b m a l ! 的活性，从而使 心，、尸p 以、p e r 3 、c r y l 、c r y 2 等基因的转录减少，进而解除对c l o c k b m a l i 的抑制，导致p e r l 、凡以、n r 3 、c r y l 、c r y 2 等基因的转录又重新增加，钟基 因表达调控而产生近日节律并得使其得以维持。由于基因的转录和蛋白进入细 胞核需要一定的时日j ，使近日节律的分子振荡的周期正好2 4 h 左右 6 7 1 ( f i g i 1 ) 。 2 近日节律系统的作用 近只节律系统通过多种途径，如：直接的神经投射、交感神经系统和内分 泌系统等调节机体各个系统的功能。近日节律系统在机体的生理、生化和行为 等方面起着重要的作用，但其作用方式和机制需要进一步深入研究。 2 1 适应环境 近r 节律系统通过重置作用，使机体的生理、生化、代谢和行为与外界环 境保持一致。外界环境，特别是光暗循环，可能发生变化，例如：跨时区飞行。 当外界环境变化后，外界环境的外在节律与生物的内在节律发生错位，也就是 两者节律的位相不同。生物为了适应环境，其内在节律通过重置机制，调整内 在节律的位相，以达到与外界环境的外在节律同步。事实上，在生物体内，近 r 节律系统的重置作用每天都在进行。由于生物的内在节律不是正好2 4 h 。例如： 小鼠的自由节律为2 3 8 h ，大鼠的自由节律比2 4 h 稍长。而外界的光暗循环为2 4 h 。 经过一天的循环，外界环境的节律和内在的节律总有差别。因此，近只节律系 统通过重置使每天的内在节律始终与外界环境的节律保一致。 2 2 稳定内环境 为了适应环境，机体的不同系统在不同时日j 的功能状态不同。近日节律系 统调节这些系统的功能状态，使之相互协调，达到稳定内环境的目的。另外， 近r 节律系统具有“预期稳态”的作用。在某时相( 如：光照期) 来临之前，近 r 节律系统预先调节各个系统的功能状态，以尽快适应这一时相。 朋川大学硕i 学位论文 2 3 其他作用 近同节律系统的功能远没有达到研究清楚的程度，可能涉及生物节律以外 的许多其他方面。 在哺乳动物，近同节律钟控系统影响着约2 1 0 基因的表达1 8 l 。该系统一 旦失调可能引起一系列严重疾病的发生，如：淋巴瘤、白血病、乳腺癌、卵巢 癌、抑郁症、睡眠障碍等。目l i ，近同节律失调与肿瘤有关已得到证实。对动 物及人体肿瘤进行研究发现，近日节律失调是肿瘤发生和进展的内在因素之一 【9 1 0 i 。大规模的流行病学调查研究发现，经常从事夜班工作的女性患乳腺癌的风 险明显增高( 1 1 - 1 4 i 。啮齿动物持续暴露于光照下引起不规律的节律周期，其肿瘤 发牛率也明显升高i l5 1 。肿瘤细胞的增殖遵循自主的节律模式，正常组织与肿瘤 组织在细胞增殖方面有明显的差别，在此基础上进行的肿瘤时| 日j 治疗能够明显 增加疗效，减少毒性【l ”。 n r 基因是近f j 节律钟控系统的重要组成部分【博i ，并参与机体的生理、生 化活动，包括细胞生长分化以及神经生理活动等。对大规模人群研究发现，p e r 3 基因的多念性与乳腺癌的发生有关，提示节律基因可能传递机体对肿瘤的遗传 易感性1 1 9 l 。有研究证明r o p e r 2 为机体维持正常节律所必需，当其突变后会引起 节律系统的紊乱，表现为周期缩短或失去节律性【2 0 】。节律基因r o p e r 2 在肿瘤发 生中起着重要的作用，r o p e r 2 突变小鼠与野生型小鼠比较发生肿瘤的风险性明 显增高【引1 。m p e r 2 突变小鼠在y 射线照射后，与野生型小鼠相比对射线的敏感 性增加，发生肿瘤的风险更高。r o p e r 2 突变后，c y c l i nd 1 、c y c l i n a 、m d m - 2 等 与细胞周期和凋亡相关的基因表达发生紊乱。对钟控基因( c l o c k - c o n t r o l l e dg e n e s ， c c g s ) 的研究发现，r o p e r l 和m p e r 2 对多种钟控基因发挥复杂精密的调控【2 2 l 。 节律基因可能通过参与调控抑癌基因、细胞周期相关基因、以及编码c a s p a s e s 和转录因子的基因的表达，从而调控细胞增殖与凋亡1 2 ”。 在近日节律系统产生和维持起重要作用的节律基因，也与药物依赖有关。 这是近日节律系统作用于生物节律以外的其他方面的又一例证。重复应用甲基 苯丙胺能够引起小鼠的药物依赖，同时导致m p e r l 表达的增加1 2 4 l 。对d p e r 突变 果蝇的研究发现，d p e r 突变果蝇对重复应用可卡因不形成药物依赖【z ”。在小鼠， m p e r l 和m p e r 2 突变在药物依赖方面，导致相反的效应。m p e r l 基因突变小鼠 对可卡因的成瘾作用消失，而r o p e r 2 基因突变引起小鼠对可卡因的成瘾增强。 8 阴川大学硕卜学位论文 3 本文的目的 时问生物学的研究进展迅速，已经成为生命科学的研究热点。特别是在近 几年，随着节律基因的陆续发现，对近同节律产生和维持的分子机制进行了深 入研究，初步阐明了近r 节律产生的分子机制。但近日节律系统的许多领域需 要进一步研究：例如近日节律分子振荡的输入和输出途径及其机制：近r 节律 系统及其基因与疾病，如肿瘤，的关系；近r 节律系统在机体的地位，对其他 系统功能的作用和影响。 研究证明p e r l 是近日节律系统中的关键性蛋白，主要通过蛋白与蛋白作用 的方式发挥功能。本研究旨在寻找新的与h p e r i 作用的蛋白及其传导通路，通 过对与p e r l 相互作用蛋白的研究，不仅可以进一步阐明近日节律系统的相关信 号传导通路，完善近同节律产生的分子机制，还有可能揭示与节律失调相关疾 病的发病机制进而寻找治疗这些疾病的有效方法。因此，本研究不但有着重 要的学术价值，同样有着明显的应用i ； 景。 本文采用酵母双杂交方法，寻找近日节律分子p e r i o d l 的相互作用蛋白， 以期发现新的近同节律分子振荡的信号通路，明确p e r i 在近同节律基因负反 馈调控中的作用机制。寻找近日节律相关疾病的治疗靶点。 包括二部分： 1 、酵母双杂交筛选近日节律蛋白p e r l p a s 结构域的相互作用蛋白， 2 、p e r l p a s 结构域的相互作用蛋白r a c k l 的近同节律功能研究。 9 i i l i 川人学硕 。学位论文 参考文献 1 h a l b e r gf 。c o r n e l i s s e ng 。o t s u k ake a 1 e s s a y s o nc h r o n o m i c s s p a w n e db y t r a n s d i s c i p l i n a r yc h r o n o b i o l o g y n e u r o c n d o c r i n o ll e t t ，2 0 0 1 2 2 ：3 5 9 - 3 8 4 2 c o m e l i s s e ng ，h a l b e r gf i n t r o d u c t i o nt oc h r o n o b i o l o g y ： m e d t r o n i c h r o n o b i o l o g y s e m i n a r 7 l i b r a r yo f c o n g r e s s ( u s a ) m i n n e a p o l i s ，m n ，m e d t r o n i c ，1 9 9 4 ，i 一5 2 3 d i t t yj l w i l l i a m ss b ，a n dg o l d e n a n n us s ac y a n o b a c t e r i a lc i r c a d i a n t i m i n gm e c h a n i s mr e v g e n e t 2 0 0 3 ：3 7 ：51 3 - 4 3 4 n a g o s h ie ，s a i n ic ，b a u e rc l a r o c h et ，n a e ff ，s c h i b l e ru c i r c a d i a ng e n ee x p r e s s i o ni n i n d i v i d u a lf l b r o b l a s t s ：c e l l a u t o n o m o u sa n ds e l f - s u s t a i n e do s c i l l a t o r sp a s st i m et od a t l g l l t e r c e l l s c e i l 2 0 0 4 ；1 1 9 ( 5 ) ：6 9 3 - 7 0 5 5 n i c o l a sc e r m a k i a n ，d i a n eb b o i v i nam o l e c u l a rp e r s p e c t i v eo fh u m a nc i r c a d i a nr h y t h m d i s o r d e r s b r a i nr e s e a r c hr e v i e w s2 0 0 3 ；4 2 ：2 0 4 - 2 2 0 ， 6 n i c h o l a si u p a u lec e n t r a la n dp e r i p h e r a lc i r c a d i a no s c i l l a t o r m e c h a n i s m si nf l i e sa n d m a m m a l s j o u r n a lo f c e l ls c i e n c e2 0 0 2 ；l1 5 ：3 3 6 9 3 3 7 7 7 h i r o t at f u k a d ay r e s e t t i n gm e c h a n i s mo fc e n t r a la n dp e r i p h e r a lc i r c a d i a nc l o c k si n m a m m a l s z o o l o gs c i 2 0 0 4 ；2 l ( 4 ) ：3 5 9 - 6 8 8 l a u r e n c e c a n a p l e t o m o k ok a k i z a w a , v i n c e n tl a u d e t t h ed a y sa n dn i g h t so f c a n c e r c e l l s c a n c e rr e s e a r c h 2 0 0 3 ；6 3 ：7 5 4 5 - 7 5 5 2 9 ，f i l i p s k i e ，e ta 1 h o s tc i r c a d i a nc l o c ka sac o n t r o lp o i n ti nt u m o u rp r o g r e s s i o n j n a t l c a n c e rl n s t 2 0 0 2 ；9 4 ：6 9 m _ 6 9 7 1 0 h a n s e n ，j i n c r e a s e db r e a s tc a n c e rr i s ka m o n gw o m e nw h o w o r kp r e d o m i n a n t l ya tn i g h t e p i d e m i o l o g y 2 0 0 1 ：1 2 ：7 4 7 7 1 i d a v i s s 。m i r i c k , d k 。s t e v e n s ，r g n i g h ts h i f tw o r k ，l i g h ta tn i g h t 。a n dr i s ko fb r e a s t c a n c e r j n a t l c a n c e rl n s t 2 0 0 l ；9 3 ( 2 0 ) ：1 5 5 7 _ 1 5 6 2 1 2 s c h e r n h a m m e r , e s ，l a d e n , f ，s p e i z e r , f e ，w i l i e r ，w c h u n t e r , d j ，k a w a c h i ，i ， c o l d i t z , g a r o t a t i n gn i g h ts h i f t sa n dr i s ko fb r e a s tc a n c e ri nw o m e np a r t i c i p a t i n gi nt h e n u r s e s - - h e a l t hs t u d y j n a t l c a n c e ri n s t 2 0 0 1 ；9 3 ( 2 0 ) ：1 5 6 3 - 1 5 6 8 1 3 r a f n e e o n , v ，t u l i n i u s ，h ，j o n a s s o n ，j g h r a f n k e l s s o n ，j r i s ko fb r e a s tc a n c e ri n f e m a l ef l i g h ta t t e n d a n t s ：ap o p u l a t i o n - b a s e ds t u d y ( 1 c e l a n d ) c a n c e rc a u s e sc o n t r 0 1 2 0 0 1 ； 1 2 ：9 5 - 1 0 i 1 0 婴! ! ! 查兰堡三兰竺堡苎 1 4 a n d e r s o nl e 。m o r r i sj e s a s s e rlb ，s t e v e n sr g e f f e c to f c o n s t a n tl i g h to nd m b a m a m m a r yt u m o r i g e n e s i si nr a t s c a n c e rl e t t 2 0 0 0 ；1 4 8 ：1 2 1 1 2 6 1 5 h r u s h e s k y w j t u m o rc h r o n o b i o l o g y j c o n t r o l l e dr e l e a s e 2 0 0 1 ；7 4 ：2 7 - 3 0 1 6 l e v i ，f f r o mc i r c a d i a nr h y t h m st og a n g e rc h r o n o t h e r a p e u t i c s c h r o n o b i 0 1 i n t 2 0 0 2 ；1 9 ： i - 1 9 1 7 r e p p e r t s m w e a v e r , d r m o l e c u l a ra n a l y s i so fm a m m a l i a nc i r c a d i a nr h y t h m s a n n u r e v p h y s i 0 1 2 0 0 1 ；6 3 ：6 4 7 - 6 7 6 1 8 a n d r e t i ci lh i r s hj c i r c a d i a nm o d u l a t i o no fd o p a m i n er e c e p t o rr e s p o n s i v e n e s si n d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r p r o cn a t la c a ds c iu s a 2 0 0 0 ；9 7 ( 4 ) ：1 8 7 3 t 8 7 8 1 9 y o n gz h u ，h e a t h e rn b r o w n , y a w e iz h a n g , r i c h a r dg s t e v e n s ，a n dt o n g z h a n gz h e n g p e r i o d 3s t r u c t u r a lv a r i a t i o n ：ac i r e a d i a nb i o m a r k e ra s s o c i a t e dw i t hb r e a s tc a n c e ri ny o u n g w o m e n c a n c e re p i d e m i o lb i o m a r k e r sp r e y 2 0 0 5 ；1 4 ( 1 ) ：2 6 8 - 2 7 0 2 0 z h e n gb ，l a r k i nd w ，a l b r e c h tu ，s u nz s ，s a g em ，e i c h e l eg ，l e ec c ，b r a d l e ya t h e r o p e r 2g e n ee n c o d e saf u n c t i o n a lc o m p o n e n to ft h em a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c k n a t u r e 1 9 9 9 ；4 0 0 ( 6 7 4 0 ) ：1 6 9 - 7 3 2 1 f ul p e l i c a n oh l i uj t h ec i r c a d i a ng e n ep e r i o d 2p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt u m o r s u p p r e s s i o na n dd n ad a m a g er e s p o n s ei nv i v o c e l l 2 0 0 2 ；i1l ( 1 ) ：4 1 _ 5 0 2 2 z h e n gb 。a l b r e c h tu ，k a a s i ki ( s a g em ，l uw ，v a i s h n a vs ，l iq ，s u nz s ，e i c h e l eg ， b r a d l e ya l e ec c n o n r e d u n d a n tr o l e so ft h em p e r la n dr o p e r 2g e n e si nt h em a m m a l i a n c i r c a d i a nc l o c k 2 0 0 1 ；c e l l 1 0 5 ( 5 ) ：6 8 3 9 4 2 3 f ul l e ec c t h ec i r c a d i a nc l o c k ：p a c e m a k e ra n dt o m o u rs u p p r e s s o r n a tr e vc a n c e r 2 0 0 3 ；3 ：3 5 0 _ 6 1 2 4 n i k a i d ot ，a k i y a m am ，m o f i y at ，s h i b a t ass e n s i t i z e di n c r e a s eo fp e r i o dg e n ee x p r e s s i o n i nt h em o u s ec a u d a t e p u t a m e nc a u s e db y r e p e a t e di n j e c t i o no fm e t h a m p h e t a m i n e m o l p h a r m a c o i2 0 0 1 ：5 9 ：8 9 4 - - 9 0 0 7 2 5 a n d r e t i cr ，c h a n e ys ，h i r s hj r e q u i r e m e n to fc i r c a d i a ng e n e sf o rc o c a i n es e n s i t i z a t i o ni n d r o s o 曲i l a s c i e n c e1 9 9 9 ；2 8 5 ：1 0 6 6 - 1 0 6 8 v i i 川人学硕卜学位论文 第二章酵母双杂交筛选近日节律蛋白p e r l 一p a s 结构域 的相互作用蛋白 l引言 1 1 酵母双杂交方法 蛋白质及其相互作用是生命活动的物质基础，是维持生命活动的最基本条 件。体内多种生命活动都依赖于蛋白与蛋白、蛋白与核酸日j 的相互作用。对这 些大分子日j 相互作用的生化及遗传学分析将有助于阐明生命过程中的分子机 制，因此，研究蛋白质之间的相互作用已成为生命科学研究的热点。近年来蛋 白质相互作用研究技术有了长足发展，其中酵母双杂交技术以其简便、灵敏、 高效以及能反映不同蛋白质之日j 在活细胞内的相互作用等特点，在基因功能的 研究中得到了广泛的应用。 迄今为止，由于蛋白质之间或与其他生物大分子间的相互作用依赖于细胞 内环境，因而传统生化方法研究蛋白质相互作用受到较大限制。其效率低且灵 敏度不高，已无法满足大量、快速筛选结合蛋白的需要。1 9 8 9 年s t a n l e y f i e l d s 等 提出并建立了酵母双杂交系统( y e a s t t w o - h y b r i ds y s t e m ) ，能够直接在细胞内检测 蛋白一蛋白之间相互作用，且敏感性、特异性均很高。其最突出的特点是能够 在繁殖迅速、遗传