（生物医学工程专业论文）硅微通道阵列红细胞变形性测量系统及测控技术研究.pdf

重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t r e db l o o dc e l l ( r b c ) h a sas t r o n gc a p a b i l i t yo fd e f o r m a b i l i t yi nf l o wf i e l d , t h e d e f o r m a b i l i t yo f i ti so n eo f i m p o r t a n tb l o o dt h e o l o g yi n d e x e s b e s i d e s ，i th a si m p o r t a n t p a t h o l o g ya n dp h y s i o l o g i c a lm e a n i n g s t h e r e f o r e , t h es t u d yo fr b cd e f o r m a b i l i t yi s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts t u d yf i e l d so fc e l lr l l e o l o g y w i t ht h ed e v e l o p m e n to fc e l l t h e o l o g y , t h ep r e s e n tm e t h o d so fr b cd e f o r m a b i l i t ym e a s u r e m e n tc a nn o ts a t i s f yt h e r e q u i r e m e n to f c e l lr h c e l o g ys t u d y j u s tu n d e rt h i sb a c k g r o u n d ，t h ea u t h o rs t u d i e da n e w t e c h n o l o g yo fs i l i c o nm i e r o e h a n n e la r r a y , a n dp r e s e n ti t am e a s u r e m e n tf o rr b c d e f o r m a b i l i t y a l s o ，t h et e c h n o l o g ya c h i e v e dp a r t i a l l yp r o d u c t i o na r e ro u rg r o u p s h a r d w o r k 1 1 璩a u t h o rs t u d i e da n dd i df l o l n ee m e l i o r a t i o na i ma tt h ep r o b l e m si nt h eo l d m e a s i l l e f f l l e n ts y s t e m f i r s t l y , t h ea u t h o rd i dt h ef l o we m l u a t o ra n a l y s i sf o rt h ec h i pb yt h em i e r o f l u i d i e s m o d u l eo ft h ec o v e n t o r w a r e i no t h e rt oc o m p a r et h ed i f f e r e n c * sb e t w e t h e m i e r o c h a n n e la n dh u m a nm i e r o c i r e u l a t i o n m e a n w h i l e , t h ea u t h o rm e n dt h ec h i p s d e s i g nu s i n gt h et e c h n o l o g yo fs i l i c o nb o n d i n g , a n dm a c h i n i n gi ts u c c e s s f u l l yi nt h e n o 2 4r e s e a r c hi n s t i t u t eo f c f r s e c o n d l y , t h ef l o ws y s t e mw a sa n & o rd e s i g n e da n dp r o c e s s e di nm a t e r i a lo f 舀勰$ n 地i n t e g r a t i o no f t h ef l o ww a ye n h a n c e st h et i g h t n e s so f t h ef l o ww a y s ot h a ti tc o u l d s o l v et h eh e r m e t i cp r o b l e m sb r i n g sb yt h en e g a t i v ep 搦sd r i v e ru s e db yt h es y s t e m b e f o r e t h i r d l y , t h ea u t h o rs i m p l i f i e dt h ec i r c u i to ft h es y s t e ma n dd e s i g n e daa u t o m a t i c d a t ac a p t u r i n gs y s t e m f o u r t h l y , t h ea u t h o rp r o g r a m m e dt h es o r w a r eo f t h em e a s u r e m e n ts y s t e ms ot h a ti t c o u l dp r o t r a c tt h ef l u x - f i l t r a t ev o l u m ee u l v eo fr b cs u s p e n s i o na u t o m a t i c a l l yb y c o m p u t e r l a s t l y , t h ea u t h o ra n e wd e s i g n e dt h eo b s e r v a t i o n , t h a td og o o dt oc o l l e c tb e t t e r i m a g e i n f o r m a t i o n a l s o t h ed i s s e r t a t i o nv a l i d a t et h en 钾m e a s u r e m e n ts y s t e mf o ri t sr e p e t i t i o na n d r e l i a b i l i t yt h r o u g ht h ep e r t i n e n c ye x p e r i m e n t 砷ee x p e r i m e n t a ld a t aa n dr e s u l t sp r o v e t h ei m p r o v e dm e a s u r e m e n ts y s t e mi sb e t t e rt h a ni tb e f o r e t 1 1 i sw o r kw i l lp u s ht h e d e v e l o p m e n to f t h i s 删r b cd e f o r m a b i l i t ym e a s u r e m e n tm e t h o d a n dw ea l s od r e wa 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 c o n c l u s i o nt h a tt h i sn e wm e t h o d i s 锄e c o n o m i c a l c o n v e n i e n t , a c c u r a t e , m u l t i i n f o r m a t i o na n de f f e c t i v em e t h o do nh e m o r h e o l o g yr e s e a r c h 船w e l l 嚣c l i n i c s t h e s t u d ya l s om a k e st h ef o u n d a t i o nf o r t h ef t l r t h e rd e v e l o p m e n to f t h en e wm e t h o d k e y w o r d s ：r b cd e f o r m a b i l i t y , m e m s ，i _ a b - o n - c h i p ，f l o wm e a s u r e m e n ta n dc o n t r o l t e c h n i q u e h i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庞盔堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：善绚 签字日期：力哆年f 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重庆太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重庆太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位论文作者签名：g - 庙 导师签名：醚 导师签名：嘲尸俺卜 签字日期：岬年月7 日签字日期：纠年月n 日 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 绪论 细胞流变学是研究细胞流动、变形及其他物理学行为的一门学科，它是从宏 观生物流变学发展起来的，是生物流变学向微观深化过程中在细胞层次上的具体 表现。其主要意义在于：( 1 ) 在理论上，它既是阐明宏观流变现象机理的理论基础， 又是分子流变学发展的桥梁和必要中间层次；( 2 ) 在生理学上，它能够在更深层次 的细胞水平上定量地解释体液、组织等的生理功能和作用规律；( 3 ) 在病理学上， 它能够在细胞层次上探索体液、组织及其周围环境的病理现象，阐明疾病发生， 发展、治疗及恢复过程中的机制，寻求改善病变过程的新方法、新手段，从而使 生物流变学研究从宏观到微观得以提升，使其在临床上的作用不再局限于辅助诊 断及预前、预后，而能够利用物理学和工程学的方法来解决生物学的问题，达到 治愈疾病的根本目的【”。 1 1 红细胞变形性 红细胞变形性是指红细胞在流动过程中的变形能力，它是血液流变学的重要 指标 2 2 1 。三百多年前，即1 6 7 5 年l e e u w e n h o o k 已经观察到红细胞通过毛细血管 时变形的现象。此后，很多学者对此现象进行了一系列的研究，建立了许多测量 方法，从而加深了人们对红细胞变形性在生理学和临床医学上的重要性的认识【4 】。 1 1 1 影响红细胞变形性的因素 影响红细胞变形性的因素包括内部因素和外部因素以及一些其他的因素。 影响红细胞变形性的内部因素 5 1 a 红细胞膜的粘弹性 红细胞膜的粘弹性取决于细胞膜的分子结构与其代谢状态。一些研究表明， 脂双层具有流动性，膜的坦克履带式运动、氧的扩散及膜上酶系统的活动都可以 影响红细胞的变形性。膜的弹性剪切模量，弯曲模量及表面粘性系数等力学参数 均与膜骨架蛋白直接有关，因此，当红细胞膜的组成和结构发生变化时，均可影 响红细胞的变形性。 b 细胞的几何形状 细胞的几何形状正常红细胞呈双凹盘状，其平均表面积为1 4 0 t t m 2 ，其体积为 9 5 p m 3 ，。红细胞的双凹圆盘形有利于红细胞的变形，这依赖于细胞的表面积( s ) 与 体积( v ) 之比。在正常情况，其表面积( s ) 与体积f v ) 2 - 比高于1 5 ，这有利于红细胞 经历各种变形而不增加其表面积。如果s v 等于1 0 ，红细胞呈星球形；s v 等于 0 7 ，红细胞则呈椭圆形。这两种情况均使红细胞变形性下降。 重庆大学硕士学位论文1 绪论 c 红细胞内粘度 红细胞内粘度取决于血红蛋白的理化特性。红细胞内容物是含有血红蛋白的 溶液，正常红细胞的内粘度是6m p a s 。这样低的粘度对红细胞变形是很有利的。 如果红细胞内粘度升高，则红细胞变形能力随之降低。 影响红细胞变形性的外部因素【5 】 乱切变率对变形性的作用红细胞变形能力是切变率的函数，即其变形能力随切 变率的增加而增加。 b 在相同剪切力下，红细胞浓度增加，变形程度也随即增加；介质粘度增大， 细胞的变形增大；红细胞通过的血管内径变小，变形能力增强。 c 温度对变形的作用加热能使红细胞变形能力下降。温度升高虽然会使脂质液 化，流动性增强，但膜蛋白质因热变性所致的损伤更大，故细胞交形能力还是降 低。研究表明，在5 0 c 3 7 0 c 的范围，用衍射法测量红细胞的伸长指数，伸长指数 随温度的升高而升高，在这一温度范围，红细胞的变形随温度的升高而升高。高 于3 7 0 c ，红细胞变形性降低 6 , 7 , 8 , 9 1 。 d 介质渗透压和p h 值对变形的作用低渗时细胞外液流入细胞内，细胞膨胀而 球形化，使细胞变形能力降低；高渗时细胞内液外流，细胞内粘度升高，使其变 形能力下降。p h 值可改变细胞膜的性质。p h 值降低引起细胞球形化和细胞膜的 硬度增加，变形能力下降。有人测定p h 值降至6 6 时，红细胞变形能力明显下降。 影响红细胞变形性的其他因素 乱钙离子对红细胞变形性的影响【l 川 红细胞内a t p 含量降低或膜上钙泵功能障碍可导致胞浆c a 2 + 增多，后者引起 细胞形态改变和变形能力减弱。这种改变的速度远远快于a t p 耗竭引起的变化， 从中提示c a 2 + 可能可以不依赖于a t p 而直接影响红细胞变形性。红细胞内c a 2 + 增 多可引起复杂的生化改变，包括膜脂质和蛋白质的改变。另外，红细胞内c a 2 + 浓 度增高，亦可通过膜的溶胶凝胶变性而导致红细胞变形性降低。 b 氧化剂对红细胞变形性的影响【l o l 氧化剂与还原剂反应形成自由基，正常红细胞可通过超氧化物岐化酶、谷胱 甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶来解毒。实验表明，将红细胞用过氧化氢处理，发 现红细胞膜硬化，红细胞变形性下降，有膜收缩蛋白红蛋白共价网状复合物出现； 红细胞形态学改变，出现大量棘红细胞；单核细胞对红细胞的粘附及吞噬作用增 强，有脂质过氧化物出现。氧自由基使红细胞的血红蛋白损伤，刺激膜蛋白水解。 其机理可能是直接改变蛋白结构，增强对蛋白水解的敏感性；通过产生脂质过氧 化物反过来再引起蛋白水解，结果使红细胞构型改变，导致变形性下降。 c 生物因素对红细胞变形性的影响【1 1 】 2 重庆大学硕士学位论文1 绪论 在人和动物出现脓毒血症时，革兰氏阴性细菌产生的大量内毒素，可使红细 胞变形性下降，机理之一是通过自由基而起作用，此时自由基的产生是多形核白 细胞中的尼克酰胺腺嘌呤( 核苷酸磷酸盐氧化酶) 经补体成分c 3 a j 秀导的结果。其他 可能的机理是低氧、低p h 、细胞内粘度改变及膜表面蛋白质特性改变。另外，在 感染了疟原虫的红细胞中，由于红细胞内寄生物不断生长，将引起面积体积比值 减小，变形性下降。 d 激光对红细胞变形性的影响【1 2 j 3 】 文献报告，用低强度氦氖激光照射，可降低血浆胆固醇。有人用其治疗脑梗 塞患者，发现有显著性差异，用激光衍射红细胞变形仪测定后发现，红细胞膜胆 固醇与膜磷脂之比明显降低，膜流动性明显提高，红细胞变形性显著改善。其作 用机制是激光刺激并激活胆固醇转移酶，降低红细胞膜胆固醇膜磷脂之比，从而 使病变红细胞形状恢复到正常的双凹圆盘状。血管内照射对红细胞的影响与照射 剂量和照射时间有关，小功率长时间照射对红细胞无影响，大于8 m w 时， 随剂 量增加会出现溶血现象。照射剂量和照射时间至关重要。 e 磁场对红细胞变形性的影响1 1 4 j 研究表明，磁场可影响血液的流变学性质。恒定磁场照射可使血液粘度明显 降低，并使红细胞表面电荷增加。考虑到血液的运动状态受心脏搏动的影响，使 用3 0 r r a i n 的旋转磁场，来观察磁场对运动红细胞的影响。5 0 m t , 加磁组中不同作用 时间的红细胞变形指数、最大变形指数和变形指数曲线面积在各切变率下均有所 提高。磁场强度过强或照射时间过长都不利于改善红细胞的变形能力。 凝集素对红细胞变形性的影响【l 5 】 在血样中加入两种不同凝集素，伴刀豆蛋白和麦胚凝集素，变形系数显著降 低，红细胞变形性减小；加入相应抑制剂后，凝集素的结合位点被竞争抑制，变 形性恢复至接近对照水平。凝集素可使红细胞变形性减小。 g 有害因素对红细胞变形性的影响【1 6 】 有实验报道：甲醛、乙醇及含汞的重金属物质，直接作用于红细胞，在其浓 度很低的条件下，可使红细胞变形性明显降低，并且形成不可恢复的影响，浓度 越大，损害越大。 l l 红细胞老化对红细胞变形性的影响 红细胞老化具有许多新的特点：细胞膜表面积减小；存在着进行性细胞脱水； 膜的弹性下降；作坦克履带式运动的细胞数目减少：镁离子水平下降，钙调素水 平降低及钙的细胞内分布改变，使膜的流动性下降。老化红细胞的这些特点均可 导致红细胞变形性降低。 3 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 1 2 红细胞变形性的病理和生理意义【1 7 , 1 8 , 1 9 1 微循环包括微动脉、毛细血管和微静脉。微动脉壁成份有内皮细胞、基底膜、 内弹力板、平滑肌细胞、外弹力板和外膜。各器官微血管构型、结构和功能各有 独特标志，各级微血管管壁结构亦不相同。许多组织中微动脉含有1 3 层平滑肌 细胞，呈螺旋状环绕排列，到毛细血管起始端的平滑肌，称为毛细血管前括约肌。 微动脉系统是调节血流的阻力血管，口径范围为5 1 0 0 9 m ，包括多层平滑肌的较 大微动脉和单层平滑肌的较小微动脉，和毛细血管前括约肌一起组成毛细血管前 阻力。毛细血管即真毛细血管，由终末微动脉或横贯微动脉或后微动脉分支而出， 无平滑肌细胞，只有单层内皮细胞，口径3 1 0 岫，长度0 5 l m m ，互相连接成 毛细血管网，具有口径小、截面积大、血流慢等特点。毛细血管内的血流速度平 均在o 1 m s 以下，在这里脉动流已经是极其微弱的，因此可以看作是定常流。 毛细血管是供给机体组织氧、营养必需物质及其相应量血液的传送装置。毛 细血管网络承担血液与组织液之问氧、营养必需物质和代谢产物的交换，能量、 信息传输，承担血液流通、分配、组织灌注，以及一系列反馈调节、内环境稳定 机制。因此，毛细血管不仅是整体循环系统的末梢部分，也是许多器官中独立的 功能单位。它在保持人体正常生理功能、各种疾病的发生、发展和药物作用机制 中均占有突出地位。 骨髓中新产生的红细胞直径约7 - 8 p m ，要通过直径为o 3 岬的骨髓窦才能进 入周围血液循环，所以要求此时的红细胞有很大的变形性。红细胞主要功能最直 接的体现是运输氧和二氧化碳，血液通过微循环，在血液和组织液之间进行物质 交换，维持机体新陈代谢和生命活动。当红细胞在全身血管中循环运行时，要多 次经过这些口径比它小的毛细血管和血窦孔隙，必须经过变形才能通过，从而保 证微循环的正常灌流。 血流通过真毛细血管提供血液和组织液之间的气体、溶质交换，称为“营养血 流”，红细胞的可变形性在血液循环中，特别是在毛细血管中起着非常重要的作用。 正是由于这种显著的可变形性红细胞能通过比其双凹圆盘直径还小的毛细血管。 因此，研究红细胞在毛细血管中的变形性具有重要的意义。 高剪变率下的全血粘度高低，主要取决于红细胞的变形性，血液在大中血管 内流动的速度较快血流的剪变率高，红细胞在其中随血液流动时成为有利于流动 的扁平的椭圆形，可以降低血液粘度，减少外周阻力，增加血流量，增加心输出 量。正常红细胞在高剪变率的流场中，膜还可以出现坦克履带样运动，此种运动 可以把其所受剪应力传给细胞内液，有利于红细胞在受到较大剪应力而不易破损， 有利于红细胞变形。 红细胞变形能力的减弱是一些疾病的主要原因或重要的临床表现。常见的红 4 重庆大学硕士学位论文l 绪论 细胞变形能力减弱的疾病有高血压、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、缺铁性贫 血、心肌梗死、休克、再生障碍性贫血、骨髓异常增生综合证、脑血栓、白血病、 恶性肿瘤等。 1 2m e m s 加工技术及微流控芯片的应用 面临2 1 世纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学也正经历着深 刻的变革，其中一个日益明显的发展趋势就是化学分析设备的微型化、集成化和 便携化。当前，主要为了适应生命科学发展的需要，分析仪器的发展正在出现一 个以微型化为主要特征的、带有革命性的重要转折时期。4 0 年前微电子技术在信 息科学的发展中引发了一场革命，并对2 0 世纪的科技发展起了重要的推动作用。 最近的发展表明，2 0 世纪9 0 年代初由瑞士的m a n z 和w i d m e r 提出的以微机电加 工技术( m i c r o - d 咖o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 为基础的“微型全分析系 统 ( m i n i a - e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，或m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t 即坞p t a s ) 硎预计在 未来1 0 年内也将对分析科学乃至整个科学技术的发展发挥相似的作用。 1 2 1m 髓i s 加工技术 t t t a s 的目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验 室的功能转移到便携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上。由于这种特 征，本领域的一个更为通俗的名称“芯片实验室 ( 1 a b - o n - a - c h i p ，l o c ) 已经被日益 广泛地接受。 微流控芯片要在所选用的材料基板上构建出微米给通道和其他组件，内壁光 滑度要求很高，需要采用特定的微细加工技术。微细加工技术是将图形高精度转 移到芯片上的技术，已经广泛应用到半导体和集成电路芯片制作中。 用于制作芯片的材料有单晶硅片、石英、玻璃以及有机聚合物，如聚甲基丙 烯酸甲酯( p o l y m e t h y l m e t h a c r y l a t e , p m m a ) 、聚二甲基硅氧烷( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e , p d m s ) 、聚碳酸酯( p o l y c a r b o n a t e , p c ) 和水凝胶等。硅片、玻璃、石英的微细加工 技术比较成熟，而有机聚合物芯片的制作技术则与芯片类芯片有很大的区别。 硅、玻璃和石英芯片的加工 光刻腐蚀技术是较早应用在微流控芯片制作上并且较为成熟的技术。其原理 来自半导体的印刷电路板的制作。即制作出含有图形信息的掩膜板后，通过曝光 在芯片上留下图形信息，再经过腐蚀从而得到有一定深度的通道。主要包括五步： 掩膜的制作，感光膜的沉积光刻，蚀刻和去胶。首先在基片上构建一薄膜层，按 性能不同可分为器件工作区的外延层，限制区域扩张的掩蔽膜，起保护，纯化和 绝缘作用的绝缘介质膜，用作电极引线和器件互连的导电金属膜等。接着利用图 形发生器或高精度打印机做出含有图形信息的掩膜，然后在基片表面涂一层光敏 5 重庆大学硕士学位论文1 绪论 剂，然后用适当波长的光经掩膜对芯片进行曝光，再用适当的腐蚀液除掉已暴光 的光敏剂和金属膜，然后对基片进行腐蚀。 腐蚀工艺分为湿法腐蚀和干法腐蚀两大类：一类湿法腐蚀是通过化学刻蚀液 和被刻蚀物质之间的化学反应将被刻蚀物质剥离下来的刻蚀方法。大多数湿法腐 蚀是不容易控制的各向同行腐蚀。其特点是选择比高、均匀性好、对基片损伤少， 几乎适用所有的金属、玻璃、塑料等材料，也适用对于硅等半导体材料的细微加 工。缺点是图形保真度不强，横向腐蚀的同时，往往会出现侧向钻蚀，以致刻蚀 图形的最少线宽受到限制。一类干法刻蚀是指利用高能束( 气态的原子或分子) 与表 面薄膜反应，形成挥发性物质，或直接轰击薄膜表面使之被腐蚀的工艺。其最大 的特点是能实现各向异性刻蚀，图像保真性好。缺点是材料选择性差、设备价格 昂贵。 微通道蚀刻完成后，将芯片表面剩余的光敏剂和金属膜除掉。钻出芯片通道 与外界连接的缓冲液池，最后将已刻蚀完成的芯片同另一片空白芯片键合起来， 就可形成一个完整的芯片。通常采用加热的方法直接进行键合，即将玻璃或硅加 热到一定的温度，一般为五百度，使两芯片之间的表面粘接在一起，几个到十几 个小时后冷却。图1 i 是光刻蚀法的原理图。 芒! ! ! 竺! ， “芒竺竺! ! ! ! ， 。芒= = 竺! = ， c = = = 3 三= c = = = - e 三三圣三i 鼙龋鞠蔷津l _ h 燃啦 ，r c ：= 3t j 图1 1 光刻蚀法的原理图 f i 9 1 1 s k e t c hm a po f l a s e r 砌 高分子聚合物芯片的加工 a 热压法f 2 1 】 热压法是一种应用比较广泛的快速复制电泳微通道的芯片制作技术。模具可 以使直径在5 0 h m 以下的金属丝或者刻蚀有凸突的微通道硅片阳模。热压法的制作 过程十分简单，将聚合物基片与模具的相对位置调整好，放入加热装置中，加热 6 重庆大学硕士学位论文1 绪论 到聚合物的玻璃化温度后，在二者之间施加压力，压力的大小与基片的面积有关， 保持3 0 6 0 s ，继续维持压力大小不变，降低温度至室温时撤除压力，脱模，即可 在基片上制作微通道结构，将盖片与基片封接在一起，就可以得到微流控芯片成 品。 b 模塑澍捌 模塑法主要制作步骤如图所示，首先采用光刻和蚀刻的方法制造出微通道凸 突的阳模，然后在阳模上浇注液态的高分子聚合物，在一定温度下固化后使高分 子材料从阳模上剥离，即可制得带有微通道的基片，与盖片封接后，可以制得高 分子聚合物的微流控芯片。模具和高分子聚合物的选择是模塑法制作微流控芯片 的重点。阳模可以用硅材料、玻璃、硅橡胶( p d m s ) 等制造。可用模塑法制作微流 控芯片的高分子聚合物材料主要有两类：一是固化型聚合物；二是溶剂挥发型聚 合物。 c 注塑法【2 3 】 注塑法的工艺是通过光刻和蚀刻技术在硅片上刻蚀出电泳芯片阴模，用此阴模进 行2 4 小时左右的电铸，得到o 5 c m 厚的镍合金模，再将镍合金模加厚，精心加工 制成金属注塑模，将此模具安装在注塑机上批量生产聚合物微流控芯片基片。所 制得的基片表面附着油污，用含表面活性剂的清洗液清洗，再经双蒸水清洗干净 后晾干，即可与盖片封接。 d 激光烧蚀法凹 激光加工技术是快速制作微管道的一种方法。该方法是在计算机的控制下用 高强度激光射向如p m m a 、聚乙烯、聚碳酸脂等塑料瞬间将塑料片的特定位置烧 蚀，形成所需的形状。该方法制成的微管道垂直、规则、误差小。但是管道表面 较粗糙，不利于产生稳定的电渗流，实用芯片中较少用到。 e 软光刻【2 5 】 2 0 世纪9 0 年代末一种新的微图形复制技术脱颖而出，该技术用弹性模代替了 光刻中使用的硬模产生微形状和微结构，被称为软光刻技术。相对于传统的光刻 技术，软光刻更加灵活。它能制造复杂的三维结构，甚至能在不规则曲面上应用； 用应用于许多材料；它没有光散射带来的精度限制，可达3 0 n m l t t m 级的微小尺 寸；此外，它所需设备较为简单，在普通的实验室环境下就能应用。 软光刻的核心是弹性模印章( e l a s t o m e d cs t a m p ) ，这种印章可以通过光刻蚀和模 塑的方法制得。p d m s 是软光刻中最常用的弹性模印章。软光刻的关键技术主要 包括微接触印刷、在铸模；微传递成模、毛细血管成模、溶剂辅助成模等。 7 重庆大学硕士学位论文i 绪论 1 2 2 微流控芯片的应用 微流控芯片非常适合于系统生物学上的研究，微流控芯片所具有的多种单元操 作灵活组合、整体可控和规模集成的特点和系统生物学的研究思路不谋而合，因 此，它已和纳米技术一起被认为是开展系统生物学研究的最重要的平台1 2 6 , 2 7 1 。 在生命科学领域，随着2 0 0 0 年6 月人类基因组计划的初步完成，迸入后基因 测序时代( 包括单核苷酸多态性分析、基因表达分析、基因变异分析和蛋白组分析) 。 d n a 的分析技术更需要高通量的筛选技术。由于微流控芯片大规模平行处理的能 力，可能使其在人类基因组及刷的进一步研究及后基因组对代发挥核心作用，成 为后基因组时代的支撑性技术。其中，核酸研究是迄今为止微流控芯片应用最广 泛的领域之一。以d n a 测序为例，m a t h i e s 研究组自1 9 9 5 年公布其设计的小矩形 芯片，长度为3 5 e m 的十字通道，测序达1 5 0 碱基【2 射，一直致力于该方向的研究， 2 0 0 1 年p t a s 国际会议上又在直径2 0 0 m m 圆盘玻璃芯片上将通道加密至3 8 4 个【2 9 j ， 具有更长的有效分离通道( 8 o c m ) ，对1 0 0 b p - 1 0 0 0 b p 的基因标准标记物达到优于 1 0 b p 的分辨率。还值得一提的就是d n a 计算机。d n a 计算机的原理就是：以d n a 分子中的基因编码作为存储数据，当d n a 分子在某种酶的作用下瞬间完成某种生 化反应时，可以从一种基因编码变为另一种基因编码。如果将反应前的基因编码 作为输入数据，那么反应后的基因编码就可以作为运算结果。这样，通过对d n a 链进行丰富的精确可控的生化反应，包括标记、扩增或者对原有链的破坏来完成 各种不同的运算结果过程，就可能研制成一种以d n a 作为介质的新型的计算机。 目前，一种基于微流控芯片的d n a 计算机研究工作取得了一定进展。林炳承m 3 1 捌等提出以微流控芯片为基础的d n a 计算机的基本构想，将计算机的基本工程单 元如输入、输出、计算、控制，尤其是存储集成于微流控芯片上，解决数学中的 等腰三角形识别问题，并尝试将微流控芯片d n a 计算机用于疾病诊断和药物筛选。 在医学及药学研究领域，随着现代医学从“系统器官、组织和细胞层次”的第 二阶段医学”向 d n a ，r n a ，蛋白质及其相互作用层次”的僳三阶段医学”的过渡， 也需要微流控芯片为之提供强有力的手段。与传统检测方法相比，微流控芯片可 以在一张芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测；无需机体直接参与免疫应 答反应，能实现早期诊断；能检测病原微生物种类，甚至微生物的亚型等。而且 待测试样用量小，灵敏度和可靠性极高，检测成本低，自动化程度高。这些优点 使得医务人员能够在短时间内掌握大量的疾病诊断信息，从而帮助医生在最短时 间内找到正确的治疗措旄。k i t a m o r i 等【3 3 】的微珠床免疫系统可检测癌胚抗原，该 系统分析1 3 个病人的结果与常规e l i s a 方法比较，有良好的相关性，且检测限优 重庆大学硕士学位论文1 绪论 于e l i s a 法，可检测人血清中的超痕量癌胚抗原，分析总时间从4 5 h 减少到3 5 m i n ， 是e l i s a 法的1 。在国内，秦建华，周小棉等以大量的临床实际样品为对象，以 病原体基因检测、基因分型和基因突变检测为基本途径，验证了微流控芯片进行 基因诊断和遗传多态性的可行性。开展了严重急性呼吸系统综合症( s a r s ) 病毒 【3 铂5 1 、高血压易感基斟3 6 1 以及肿瘤相关基因0 1 6 基因) 甲基化p 刀等临床样品的规模 检测。 微流控芯片高通量、大规模、平行性等特点还有助于化学合成、新药筛选和 开发。因为这一技术可大规模比较各种合成路线和条件，筛选催化剂和药物有效 组分，检测病原体、微生物的耐药性，省略大量的合成初步试验和动物试验，从 而缩短时间，加快新化合物和药物研究开发进程。在国外，越来越多的化工、制 药公司开始不同程度地采用微流控芯片技术，寻找催化剂和药物靶标，查验合成 路线和药物的毒、副作用。c a l i p e r 公司开发t c a l i p c r 2 5 0 高通量筛选系统”，采用 所谓s i p p e r 的样品引入( w o d d t o 枷p ) 技术f 3 s 】可用于超高速药物筛选，据称该系统 每天可分析5 0 0 个样品。在国内，叶因楠掣3 9 l 以药物诱导肿瘤细胞凋亡为模型， 构建了一种集成化细胞水平的药物筛选微流控芯片平台。这种芯片系统集药物浓 度梯度生成、芯片细胞培养、细胞受激、标记和洗涤等单元操作与一体，可在一 次运行中获得多个实验参数，不仅简化操作、节省试剂，更亦满足高通量药物筛 选需要。 在检疫、食品、卫生、环境等监督领域，诸如大规模的健康检查( 入学、入伍 等) ，地区性遗传病、传染病的调查分析及研究，污染物质对人群、动植物的作用 机制及作用范围的研究，海关对出入境动植物及商品的生物学检验等，微流控芯 片均有一系列的用武之地。m o l e c u l a rd e v i c e s 公司的硅微生理机( s m ) i 删就是使用 精确的p 8 传感器揭示细胞的新陈代谢，因为细胞的代谢物质能显著改变细胞酸 度，s m 可用于药物检验、日用品、化妆品的毒理分析、筛选细胞毒素等。 微流控芯片首先是一个技术平台，技术平台的出口是应用。微流控芯片在分析 仪器微型化、集成化和便携化方面的巨大潜力为其面向社会各行各业的实际需求， 包括生物医学、药物合成筛选、环境监测与保护、卫生检疫、司法鉴定、体育竞 技、反恐、航天等众多领域的应用提供了广阔的前景。 1 2 3 微流控芯片实验室整体框架 图1 2 是整个微流控芯片研究的整体框图，这个框图基本概括了现在能考虑到 的微流控芯片研究的整体方案。 9 重庆大学硕士学位论文1 绪论 图1 2 微流控芯片研究框图 f i g 1 2 s u u c t u r a im a po f m i c r o f l u i d i cs t u d y 1 3 论文主要内容 本文在细胞流变学与m e m s 加工技术迸一步发展的基础上对硅微通道阵列红 细胞变形性检测系统做了进一步的研究。主要涉及芯片的设计仿真、外围流路的 设计，改进后系统的验证以及应用等方面。 第一章论述了课题的研究意义，综述了相关领域的研究情况。 第二章综述了现有的一些典型的红细胞变形性测量方法的原理和应用，并引 入了论文的理论基础一红细胞通过硅微通道的理论模型。 第三章详细介绍了芯片的设计和仿真。 第四章介绍详细介绍了流路测控系统的设计，也就是流路设计、测控电路及 计算机接口设计等几个部分。 第五章介绍了系统软件部分，包括软件系统工作原理和数据采集、图像采集 的设计。 第六章论述了硅微通道红细胞变形性测量系统的实验研究，并对实验结果进 行了讨论。 第七章对论文所做的主要工作做了总结与展望。 1 0 重庆大学硕士学位论文2 红细胞变形性测定方法和基本原理 2 红细胞变形性测定方法和基本原理 测定红细胞变形性有重要的理论和实际意义，迄今为止已发展了多种测定方 法，这些方法大致可分为直接测定法和间接测定法两大类。前者着重于单个红细 胞膜的力学性质研究，常用的有微孔滤筛法、微管吮吸法、底部附着或纤维拦截 法等；后者主要是利用血液几何系统内，由于流动的红细胞发生变形，引起血液 的某些物理特性( 如粘滞性、透光性、导电性和声传导性等) 的变化，并由此找出应 力与应变之间的关系，从而评估不同状态下红细胞群体的平均变形性，常用的有 粘性测量法、激光衍射法、离心沉降法、电测量法等。 2 1 现有红细胞变形性检测技术的原理及应用 2 1 1 红细胞变形性的几种典型检测技术 粘性测量法【4 1 1 本法是利用细胞悬浮液的表观粘度随剪切率的增高而降低的原理，从粘度上 的差异来估测细胞流变性，在较高剪切率情况下，表观粘度降低越明显，细胞的 变形能力越好。粘性测量法操作方法简单，设备亦不复杂，该方法测得的值为群体 信息，较适用于临床研究，但由于其不能分辨单个细胞的变形能力，故不适宜于基础 研究。 激光衍射法【4 2 】 这一方法是b e s s i s 与m p h a n d a s l 9 7 5 年设计发明的，它是将粘性测定装置和激 光衍射测量相结合，将细胞悬浮液置入一个同心圆柱体粘度计中承受一定的剪切 应力，进而获得不同状态下的细胞衍射图，从衍射图纵轴和横轴方向的大小变化 表示细胞的变形性，即长轴短轴比值越大，则细胞变形性越好。所获得的衍射图， 是细胞群体衍射的叠加，所反映的也是细胞的平均变形性 这种方法标本用量少，且测定重复性好，可以分析细胞变形性与剪切应力的 关系，也可分析渗透压对变形性的影响。其缺点是仪器昂贵，且只能得到细胞群 体的变形情况，无法了解单个细胞的流变特性。 微管吮吸法t 4 3 该方法是用微管吸吮红细胞使之变形，测量一定负压下红细胞被吸入管内部 分的长度，或测其被吸入一定长度所需的负压，以此来比较红细胞的变形能力， 确定其力学参数。由于该方法对单个细胞进行测量，所以费时、费事，不宣临床 推广，但它可用于测定细胞膜的弹性模量及粘度。 微孔滤膜法 4 4 - 4 6 重庆大学硕士学位论文 2 红细胞变形性测定方法和基本原理 它是利用滤膜、金属筛等具有过滤作用的器具来测定细胞的变形性。目前检 测红细胞变形性较常用的滤膜为核孔滤膜，其孔径有3 t u n 和5 p m 等尺寸，3 t i m 为 正常红细胞所能通过的临界尺寸，而5 9 m 较适宜于变形性明显降低的红细胞。常 用的方法为等压差法。 核孔滤膜法是目前广为采用的评价细胞变形性的方法，该法简单、经济，能 反映细胞亚群的变形性，如能结合扫描电镜观察，则可以更好了解细胞通过微孔 时的变形过程。但该法易受很多因素的影响，如白细胞、血小板聚集性、红细胞 平均比积以及温度、压力、抗凝剂、p h 值等，应引起注意。为了使测定结果更加 可靠且具可比性，1 9 8 6 年国际血液学标准化委员会( i c s 壬i ) 对红细胞变形性的测定 提出了相关要求【4 ”。 电导法【4 s 删 细胞具有变形能力，因此细胞在流场中p h 可发生定向排列从而引起细胞悬浮 液电导率的改变，所以电导率可以表征出细胞的变形性。北京医科大学文宗耀【5 0 1 等研制出用电导法检测红细胞变形性的测量仪，并作了相关研究。 电导法能较好地反映细胞的变形性，且其测量简便，易重复，测速快，而且 与微管吮吸法，激光衍射法所得结论一致。 底部附着法 5 0 - 5 2 1 底部附着法由h o c h m u t h 等人于7 0 年代提出，到9 0 年代，国内外学者还在不 断的使用和改进。这一方法的具体操作过程是，将细胞悬浮液引入两平行平板玻 璃构成的流动渠道，静止1 5 3 0 分钟后，细胞沉降到底部，并附着在底部平板上。 然后用负压吸引，将悬浮液从管道中匀速抽出，在渠道中形成切交流场，通过显 微测量系统可测量附着于底部的细胞随切变率的改变而弓j 起的形态改变。 凝胶过滤法【5 3 】 由r o h n e r 在1 9 9 0 年提出，选用性质稳定，无离子交换性和亲和性的四种凝胶。 他们采用一系列血样分析与分离不同变形性红细胞，表明正常红细胞的凝胶过滤 呈现可重复的洗脱现象，从而证实该法为分析细胞变形性的可靠方法。 除了以上几种典型的方法外，还有纤维拦截法、电子自旋共振频谱法、显微 光度法、核磁共振法等多种方法，可根据不同情况选用。值得注意的是，以上方 法都是以红细胞为检测对象在进行设计和应用，在实际应用中应该根据不同测量 对象( 如：白细胞、肿瘤细胞、上皮细胞、卵子细胞等) 和检测环境作适当改进。 2 1 2 微通道测量红细胞变形性技术 利用硅的特性而建立起的硅微机械加工技术，可以制作出尺寸从亚微米到毫 微米级的微结构，并有很高的加工精度。这种方法具有如下特点：( 1 ) 具有较高的 制作精度；( 2 ) 具有良好的使用性能：( 3 ) 具有良好的检测性能；( 4 ) 可多角度反映红 1 2 重庆大学硕士学位论文2 红细胞变形性测定方法和基本原理 细胞的变形性。 为了模拟红细胞在脾毛细血管中的情况，可以应用硅微细加工技术，在s i 3 n 4 膜片上制作出一个直径小于1 岫的单孔，膜片厚度可以到0 4 i u n ，从而构成一个 超薄过滤器，用该过滤器测量单一红细胞的变形能力，通过测量细胞的通过时间， 给出衡量变形性的参数，平均值和中央辐值，此外还得到通过时间的分布信怠【5 4 l 。 特别值得一提的是，k i k u c h i 5 5 】等于1 9 9 2 年提出在单晶片上形成可视性细胞流 动通道的方法。该方法利用集成电路工艺的光刻腐蚀技术在硅片表面形成微米级 的沟道，再在硅片表面覆盖一块光学玻璃板，从而形成可视的微通道。这种方法 有三种显著的特点：( 1 ) 微通道的尺寸可精确控制，并可达到亚微米级的精度；( 2 ) 通道形状及尺寸可根据实验的目的灵活设计；( 3 ) 可由显微镜直接观察通道附近及 通道中细胞变形及流动情况。这种方法测量简单，并可获得较多的细胞流变信息。 j p b r o d y 等人【碉则设计了一种栅格网状结构，采用了一定组数等长等深但 通道宽度渐变的矩形沟道阵列作为微通道网络，其尺寸结构为：沟道宽度沿一个 方向渐变，从2 5 肛m 到4 1 u n , 步长0 5 p m , 沟道深4 p m , 长1 2 p r o , 每组间间隔1 3 1 u n 。 在他的实验中着重研究了生理生化因素在红细胞变形性现象中的应用，提出了一 种活动骨架理论并认为钙离子活动在其中产生了重要的作用。 t r a c 对翎、s u t t o n i 爨1 等人的实验和研究里又对硅微通道技术在实验系统和