（微生物学专业论文）高效氯氰菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究.pdf

山东农业人学硕士学位论文 摘要 拟除虫菊酯类农药高效氯氰菊酯是目前全世界生产和销售量最大的 杀虫剂之一，由此带来的环境污染问题也受到人们的普遍关注。国内外对 拟除虫菊酯的微生物降解进行了较为广泛的研究，对于其主要降解途径有 了初步的了解，目前尚未见到将高效氯氰菊酯完全降解或矿化的高效降解 菌的研究报道。 本研究应用微生物富集驯化方法，筛选、分离到三株高效氯氰菊酯降 解细菌，它们可利用高效氯氰菊酯为唯一碳源与氮源生长并将其完全降 解，对其生长特性、降解能力和降解机理进行研究；并对其细胞表面疏水 性与降解能力之间的关系进行了探讨。主要研究内容如下： 1 从农药厂的污水处理池活性污泥中，筛选获得三株能高效降解高 效氯氰菊酯的细菌j c l 、c h 7 、j c n l 3 ，通过形态学、生理生化和1 6 sr d n a 序列同源性分析，将其分别鉴定为沙雷菌属( s e r r a t i as p j c l ) 、铜绿假单 胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ac h 7 ) 和沙雷菌属( s e r r a t i as p j c n l 3 ) ； 其1 6 sr d n a 基因序列在g e n b a n k 中的注册号分别f j 0 0 9 4 4 5 、f j 0 0 9 4 4 6 和f j 0 0 9 4 4 7 ， 2 纯培养条件下，当接种量为0 1 0 3 9 l ，温度2 0 3 8 ，p h6 9 ，高 效氯氰菊酯2 5 1 0 0 0 m g l 时，三株菌可以有效降解高效氯氰菊酯。通过 b o x b e h n k e n 法设计试验，响应面分析法来优化菌株的降解条件。发现菌 株j c l 最优降解条件为：生物接种量：0 1 5 9 l ，温度：3 1 ，p h 值：7 6 ； 菌株j c n l 3 最优降解条件为：生物接种量：o 1 5 9 m ，温度：3 4 ，p h 值： 8 0 ；菌株c h 7 最优降解条件为：生物接种量：o 1 5 9 m ，温度：2 9 4 ， p h 值：7 0 。 3 运用紫外可见分光光度法( u v - s ) 、薄层层析法( t l c ) 、高效 液相色谱( h p l c ) 法，气相色谱法( g c f i d ) 和气相色谱一质谱联用法 ( g c m s ) 分别测定了各株菌对高效氯氰菊酯的降解率。菌株c h 7 在最 优条件下，4 天内能将1 0 0 m g l 高效氯氰菊酯降解6 5 以上，1 2 天能降 解9 0 。菌株j c l 在最优条件下，1 0 天内能将1 0 0 m g l 高效氯氰菊酯降 解9 2 ，1 2 天基本完全降解。而菌株j c n l 3 降解效率更高，4 天能降解 8 9 的高效氯氰菊酯( 1 0 0 m g l ) ，一周之内能将其基本完全降解。 高效氯氰菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究 4 经质谱分析，发现在菌株对高效氯氰菊酯的降解过程中存在氯氰 菊酯异构体的转化。菌株并不是直接将高效氯氰菊酯降解，而是将高效氯 氰菊酯转化为氯氰菊酯的两个低效体，然后一同降解，这意味着高效氯氰 菊酯的微生物降解和转化是同时存在的。 5 在检测菌株生长和高效氯氰菊酯降解的同时，我们也绘制了茵体 细胞表面疏水性随时间变化的曲线。发现沙雷菌j c l 和j c n l 3 的细胞表 面疏水性与菌体生长和高效氯氰菊酯的浓度和毒性有一定相关性。菌株 j c n l 3 与菌株j c l 相比，不但有较高的细胞表面疏水性，而且有较强的 高效氯氰菊酯降解能力。研究结果表明高细胞表面疏水性与强的高效氯氰 菊酯降解能力有直接关系。 关键词：生物降解高效氯氰菊酯降解菌细胞表面疏水性完全矿化 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t b e t a - c y p e r m e t h r i ni so n e o ft h em o s tw i d e l yu s e di n s e c t i c i d e sb e l o n g i n gt o t h es y n t h e t i cp y r e t h r o i dg r o u p ；i t sw i d ec o n t a m i n a t i o nt ot h ee n v i r o n m e n th a s g i v e nr i s et om u c hp u b l i cc o n c e r n s e v e r a ls t u d i e sh a v eb e e nc o n d u c t e do nt h e m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fb e t a - c y p e r m e t h r i n ；i t sm a jo rp a t h w a yo fd e g r a d a t i o n h a sb e e np r e l i m i m a r i l yd e m o n s t r a t e d h o w e v e ln om i c r o o r g a n i s m st h a tc o u l d c o m p l e t e l ym i n e r a l i z eb e t a - c y p e r m e t h r i ne f f i c i e n t l yh a v eb e e nr e p o r t e dt o d a t e i nt h i ss t u d y , t h r e eb e t a - c y p e r m e t h r i n d e g r a d i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e db y e n r i c h m e n tc u l t u r ea n ds c r e e n i n g t h e yc o u l dg r o wo nb e t a - c y p e r m e t h r i na s t h es o l ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e s t h e i rg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ，d e g r a d i n g a b i l i t i e sa n dm i n e r a l i z i n gm e c h a n i s m sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d f u r t h e r m o r e ， t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc e l ls u r f a c eh y d r o p h o b i c i t ya n dt h ed e g r a d a t i o n a b i l i t yw e r ea l s os t u d i e d t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 f r o ma c t i v a t e ds l u d g es a m p l e s ，t h r e eb a c t e r i a ls t r a i n sj c1 ，c h 7a n d j c n13w e r ei s o l a t e d b a s e do nt h er e s u l t so fp h e n o t y p i cf e a t u r e s ， p h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dp h y l o g e n e f i cs i m i l a r i t yo f 16 sr d n a g e n es e q u e n c e s ，t h e s e i s o l a t e sw e r e d e s i g n a t e d a ss e r r a t i a s p j c1 ， p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ac h 7a n ds e r r a t i as p j c n13 t h e i r16 sr d n a p a r t i a ls e q u e n c e sw e r ed e p o s i t e d i n t ot h eg e n b a n ku n d e ra c c e s s i o nn o f j 0 0 9 4 4 5 ，f j 0 0 9 4 4 6a n df j 0 0 9 4 4 7 ，r e s p e c t i v e l y 2 e a c hp u r ec u l t u r ec o u l de f f e c t i v e l yd e g r a d eb e t a - c y p e r m e t h r i nw i t l lt o t a l i n o c u l ab i o m a s s0 1 - 0 3 9 m ，a t2 0 - 38 0 c ，p h6 - 9a n di n i t i a lb e t a c p2 5 10 0 0 m g l b o x b e h n k e nd e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w e r e u s e dt oo p t i m i z ed e g r a d a t i o nc o n d i t i o n so ft h et w os t r a i n s t h e i ro p t i m a l d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n sw e r eb i o m a s s0 15 e 2 i ，t 31 ，p h7 6 ( s t r a i nj c l ) ； b i o m a s so 15 9 l ，t2 9 4 c ，p h7 0 ( s t r a i nc h 7 ) a n db i o m a s s0 15 9 m ，t3 4 。c ， p h8 0 ( s t r a i nj c n l3 ) ，s e p a r a t e l y 3 t h e g r o w t h a n d d e g r a d i n g a b i l i t i e so f e a c hs t r a i n sf o rt h e b e t a - c y p e r m e t h r i nd e g r a d a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e db yu v - v i s ，t l c ，t t p l c ， 3 商效氯氰菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究 g c f i da n dg c - m s u n d e rt h e i ro p t i m u md e g r a d i n gc o n d i t i o n s ，s t r a i nc h 7 c o u l dd e g r a d e6 5 a n d9 0 b e t a c y p e r m e t h r i n ( 10 0 m g l ) w i t h i n4d a y sa n d 12 d a y s ，s e p a r a t e l y ； s t r a i nj c1c o u l d d e g r a d e 9 2 b e t a c y p e r m e t h r i n ( 10 0 m g l ) w i t h i n10d a y sa n dm a i n l ym e t a b o l i z ei tw i t h i n 12d a y s ；s t r a i nj c n13h a sh i g h e rd e g r a d a t i o na b i l i t yt h a ns t r a i nj c 1 ，i tc o u l d d e g r a d e8 9 b e t a - c y p e r m e t h r i n ( 10 0 m g l ) w i t h i n4d a y sa n dc o m p l e t e l y m i n e r a l i z ei tw i t h i n7d a y s 4 t h e r ew a saf a c t t h a ti s o m e r st r a n s f o r m a t i o no fc y p e r m e t h r i ni nt h e p r o c e s s o f b e t a - c y p e r m e t h r i nb i o d e g r a d a t i o nb y g c - m s a n a l y s i s b e t a c y p e r m e t h r i nw a sn o td i r e c t l yd e g r a d e db ys t r a i n s ，b u tt r a n s f o r m e di n t o a n o t h e rt w ol o we f f i c i e n ti s o m e r so fc y p e r m e t h r i na n dt h e na l lo ft h e mw a s c o m p l e t e l yd e g r a d a t e d i tm e a n st h a tt h ei s o m e r st r a n s f o r m a t i o nc o e x i s t e d 、析t ht h eb e t a c y p e r m e t h r i nd e g r a d a t i o nb ym i c r o b e s 5 d u r i n gb a c t e r i ag r o w t ho f t h et w os t r a i n sa n db e t a - c pd e g r a d a t i o n ，t h e t i m ec u r v e so fc e l ls u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y ( c s h ) w e r ep l o t t e dr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh y d r o p h o b i c i t yo fs e r r a t i as p p j c1a n dj c n l3 a s s o c i a t e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o na n dt o x i c i t yo fb e t a - c pa n dt h eb a c t e r i a g r o w t h ，o b v i o u s l y , s t r a i nj c n 13n o to n l yh a dh i g h e rh y d r o p h o b i c i t yb u ta l s o h a ds t r o n g e rd e g r a d a t i o na b i l i t yt h a ns t r a i nj c1 t h er e s u l t si n t h i ss t u d y s u g g e s t e dt h a tt h e r ew a sa d i r e c tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nh i g hc s ha n ds t r o n g d e g r a d a t i o na b i l i t y k e y w o r d s ：b i o d e g r a d a t i o n , b e t a - c y p e r m e t h r i n ，d e g r a d i n gm i c r o b e s ，c e l l s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y , c o m p l e t em i n e r a l i z a t i o n 4 英文缩略词 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 山东农业大学硕士学位论文 1 前言 化学农药是现有人类管理的所有具有潜在毒性的化合物中，被有意识 地释放到环境中以实现其价值的物质。通过使用农药，人类获得了更多的 农业产出，有效地控制了有害生物的滋生。但是，农药的长期使用，特别 是高毒、高残留农药的大量使用，不仅污染了农产品，而且破坏了生态环 境。在所使用的农药中，约有7 0 被排入河流和渗入土壤，其它残留在蔬 菜、瓜果等农作物中，对非靶标生物产生毒害，威胁人类健康，破坏生物 多样性，并将最终破坏生态平衡。拟除虫菊酯农药属高效、低毒仿生农药， 占全球农用杀虫剂市场份额的2 0 左右，占我国杀虫剂总施用面积的1 3 以上。随着甲胺磷等五种高毒杀虫剂在我国的全面禁用，菊酯类杀虫剂的 生产、销售量及施用面积将会呈现上涨趋势。 由于人们生活水平的不断提高，其健康意识、环保意识有了明显增强， 环境污染和食品安全问题日益成为普遍关注的焦点，人们越来越青睐无公 害、无污染、安全、优质、营养的绿色有机食品，同时也更加关注日益严 重的环境恶化与污染，向往无毒、无污染的生活环境。因此，如何有效地 减轻避免农药残留对环境及人类健康的损害已成为亟待解决的问题。生物 修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 技术主要是利用生物有机体，尤其是微生物的降解 作用将污染物分解并最终无害化的过程，具有高效快速、经济实用、安全 简便等优点( p i e p e ra n dr e i n e k e ，2 0 0 0 ；s i n g ha n dw a l k e r ，2 0 0 6 ) 。国外不少 研究证实，微生物对农药的降解在农药废水处理和土壤原位生物修复等领 域具有广阔的开发和应用前景。 1 1 拟除虫菊酯类农药概述 有机氯农药如六六六、d d t 等和有机磷农药如甲胺磷、对硫磷、甲 基对硫磷、久效磷和磷胺等都属于高毒农药，这些高毒农药因其长期持久 性、高残留、生物富集和对非靶标生物的毒害而被禁产、禁用，从而逐渐 被高效低毒低残留的菊酯类农药所取代。 1 1 1 拟除虫菊酯类杀虫剂简介 拟除虫菊酯是一类仿生合成的杀虫剂，人们通过改变天然除虫菊酯的 5 商效氯氰菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究 化学结构而衍生的合成酯类。天然除虫菊酯是古老的植物性杀虫剂，是除 虫菊花的有效成分。它具有高效、广谱，对人畜安全，不污染环境，无致 癌、致畸、致突变等不良作用和在体内能迅速降解等优点，故不会发生积 累中毒，是一类十分理想的杀虫剂。但是，其持久性太差，见光容易分解， 药效维持不到一天，难以实现在农业生产的大规模应用。 上世纪2 0 年代，研究鉴定出除虫菊酯的有效成分为除虫菊酯i 和i i ， 其化学结构于4 0 年代被研究确定。1 9 4 9 年，美国的m s 谢克特等合成了第 一个商品化的类似物丙烯菊酯。在5 0 6 0 年代，又有一些类似化合物 陆续研制成功，通称为合成拟除虫菊酯。这些早期品种与天然除虫菊酯一 样，在光照下易分解失效，仅适用于室内条件下防治害虫。在6 0 年代人们 发现：除虫菊酯具有两个光不稳定的中心，一个是在醇部分，另一个是菊 酸乙烯侧链上的二甲基，导致它易于光解。1 9 7 3 年，英国洛桑研究站的 m e l l i o t $ 1 1 他的同事们用苯氧基苄醇取代了除虫菊酯的醇部分，以氯取代 了二甲基，形成了一个残效期长的拟除虫菊酯二氯苯醚菊酯或称氯菊 酯( 薛振祥，2 0 0 2 ) 。它的光稳定性是天然除虫菊酯的1 0 1 0 0 倍，这是第一 次成功合成的能应用于大田的拟除虫菊酯类杀虫剂。从此，开拓了对光解 稳定、残效期长的拟除虫菊酯类杀虫剂的探索之路，也为拟除虫菊酯在农 业上的应用取得了历史性的突破。1 9 7 4 年日本住友化学公司的研究人员大 野信夫等人发现环丙烷类拟除虫菊酯杀虫剂的功能部分是苯乙酸酯，不用 环丙烷也能合成药效相当的拟除虫菊酯，并于1 9 7 6 年合成了光稳定性的商 品氰戊菊酯，又称杀灭菊酯，它的毒效比二氯苯醚菊酯还高，这是由于在 其醇部分含有一个氰基，据此合成了另一大类的高效杀虫剂，如溴氰菊酯、 氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯( 功夫菊酯) 等等。拟除虫菊酯克 服了天然菊酯持久性差、易光解这一致命缺点，但不幸的是，在克服这一 缺点的同时，使用上却没有了天然菊酯那样的安全性( 王筠，1 9 9 7 ) 。 拟除虫菊酯是一类能防治多种害虫的广谱杀虫剂，其杀虫毒力比老一 代杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类提高1 0 1 0 0 倍。几种拟除虫 菊酯毒性比较如下：无苯氧基苄基醇的拟除虫菊酯( 如丙烯菊酯、胺菊酯) 无氰基的3 一苯氧苄基醇的拟除虫菊酯( 如二氯苯醚菊酯) a 一氰基一 3 一苯氧苄基醇的拟除虫菊酯( 如氰戊菊酯、氯氰菊酯) 。它对昆虫具有强 6 山东农业大学硕士学位论文 烈的触杀作用，有些品种兼具胃毒或熏蒸作用，但都没有内吸作用。其杀 虫机制是引起长时期的n a - 尾电流和n a + 通道的持久开放，严重延迟n a + 通 道的激活、失活和去激活，使神经元持续冲动，由兴奋、痉挛到麻痹最终 导致靶生物死亡。对鱼毒性高，对某些益虫也有伤害，长期重复使用也会 导致害虫产生抗药性( g oe ta 1 ，1 9 9 9 ；h ee ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 自2 0 世纪7 0 年代以来，拟除虫菊酯杀虫剂在农业上推广应用并得以蓬 勃发展。尤其是近些年来，由于有机磷等剧毒农药的中毒事件以及因农药 残留超标而遭遇的“绿色壁垒”事件频频发生，引起世界各国的高度重视， 并纷纷采取应对措施，严格限制高毒农药的使用，同时大力开发新型、高 效、低毒替代产品。于是拟除虫菊酯农药应运而生，成为代替有机磷农药 和其他高毒、长残留杀虫剂的主要农药类型。近十年来，世界拟除虫菊酯 杀虫剂销售额急剧上涨，1 9 9 2 年，为1 3 6 亿美元；1 9 9 3 年，1 4 4 亿美元； 1 9 9 4 年，1 5 6 亿美元；年增长率达到6 - 8 ，至1 9 9 8 年，销售额达到2 1 亿美元，约占世界杀虫剂市场的1 9 ，而且随着农民环保意识的提高和国 家相关政策的进一步实施，拟除虫菊酯的销售额还会继续上涨。目前，拟 除虫菊酯全世界销售量最大的品种有氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯和氟 氯氰菊酯等，它们的销售额每年分别达到1 亿美元以上( d e l p u e e he ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 1 1 2 拟除虫菊酯类农药残留现状 拟除虫菊酯类农药具有对环境相对稳定、降解速度慢的特点，随着拟 除虫菊酯农药广泛、大量的应用和使用时间的延长，有关菊酯类农药的残 留及其危害等问题也日益暴露出来，并引起科研工作者和有关部门的高度 重视。作为一种广谱杀虫剂，菊酯类农药可应用于棉花、蔬菜、果树以及 家庭中多种虫害的防治，与人们的生活息息相关。虽然其毒性相对较低， 但与其他种类农药一样，在杀灭、抑制病虫害，保证农作物的稳定高产中 起着十分重要的作用。同时，也会通过各种途径危害环境安全，损害人体 健康。近些年来，人们越来越关注拟除虫菊酯类农药的危害，发现它对一 些非靶标生物常常是高毒的，如一些经济昆虫和益虫( 家蚕、蜜蜂和赤眼 蜂等) ，对体细胞和生殖细胞d n a 产生不利影响，从而影响动物的生殖 和发育，并且具有一定的遗传毒性，对人体也有较大危害，如神经毒性、 7 高效氯智l 菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究 急性毒性、生殖和发育毒性等等( g a r e ya n dw o l f f , 1 9 9 8 ；s h a f e re t a 1 2 0 0 5 ) ；鲁兴萌等研究发现，即使是低浓度的拟除虫菊酯农药也会对一些 经济昆虫( 家蚕) 造成极大的危害，2 0 0 1 年拟除虫菊酯农药残留问题引起桐 乡和海宁发生桑园中毒事件，调查发现导致家蚕中毒的氯氰菊酯浓度大大 低于目前的检测水平( 周勤e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这些均表明拟除虫菊酯并不像以 前人们所认为的那样对环境和人畜稳定，不会造成污染或中毒，随着高灵 敏度生物检测技术的发明和人们对拟除虫菊酯农药毒理的进一步研究，拟 除虫菊酯农药的危害将会被人们更深入地认识和了解。 早在我国恢复关贸总协定( g a t t ) 缔约国地位和参加世界贸易组织 ( w t o ) 的谈判进行之时，一场非关税壁垒的无硝烟贸易战就已在世界范围 内打响，国外针对我国入关而颁布的农产品中农药最大残留限量( m r l ) 标准就带有明显的“技术壁垒”倾向，这使得农药残留标准的范围扩大并且 标准限制更加严格。以茶叶为例，由于其地位的特殊性而首当其冲。欧盟 从19 9 6 年1 月1 日起，将检测的农药由1 9 9 3 年的6 种增至6 2 种，且标 准越来越严，特别是2 0 0 0 年7 月起实施的新标准中针对菊酯类农药的残 留限量变动最大，如氰戊菊酯m r l 由原来的1 0 m g k g ，改为0 1 m g k g ， 降低了1 0 0 倍。联苯菊酯从5 m g k g ，改为0 2 m g k g ，降低了2 5 倍( 陈宗懋， 2 0 0 0 ) 。氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯的最高残留限量都改为 0 1 m g k g 。由于我国茶叶中农药残留偏高，导致其出口量由1 9 9 8 年的2 1 7 4 万吨降到1 9 9 9 年的1 9 9 6 万吨，下降了8 2 。除此之外，其它一些具有 很大竞争力的劳动密集型产业，如水果、蔬菜、瓜果等的出口也由于菊酯 类农药残留超标而遭到欧盟国家的拒绝。1 9 9 2 - - 1 9 9 3 年，我国对主要城 市郊区的蔬菜进行了抽样检查，发现上海蔬菜中菊酯类农药超标达8 5 3 倍( 李阳e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。2 0 0 2 年，欧盟因我国农残、监控体系的建立和运行 问题，宣布停止从我国进口蜂蜜，这对我国蜂产业发展提出了严峻的挑战， 这些事件的发生严重影响了我国农产品的出口创汇，给我国经济带来了很 大的损失。 以上数据表明：拟除虫菊酯农药残留问题日益严重，我国的农产品出 口将面临更加严峻的形势，这些已经成为当今亟待解决的问题。 1 1 3 高效氯氰菊酯简介 8 山东农业大学硕士学位论文 高效氯氰菊酯( b e t a - c y p e r m e t h r i n ) 是拟除虫菊酯杀虫剂的一种，化 学名称为2 ，2 二甲基3 ( 2 ，2 二氯乙烯基) 环丙烷羧酸a 一氰基( 3 苯氧 基) 苄酯，化学结构式见图1 1 。1 9 8 6 年由匈牙利h i d a s i 等人首次报道 从氯氰菊酯的8 个异构体中分离出 c i s ( s1 r3 r ) + c 括限1 s3 s ) 1 和 t r a n s ( s 1 r3 s ) + t r a n s ( r1 s3 r ) 两对外消旋体混合物( 图l - 2 ) ，其生物活性较高， 其顺反比约为2 ：3 ( 表1 - 1 ) 。理化性质：原药为无色或浅黄色晶体：溶点 为6 4 7 1 ( 随着异构体比例的不同而变化) ；溶解性：水中9 3 4m g l ( 2 5 ) ，异丙醇1 1 5m g m l ，二甲苯3 4 9 8m g m l ，二氯甲烷3 8 7 8m g m l ， 丙酮2 1 0 2m g m l ，乙酸乙酯1 4 2 7m g m l ，石油醚1 3 1m g m l ( 都在2 0 c ) ； 稳定性：在1 5 0 以下稳定，对空气、太阳光稳定，在中性和弱酸性介质 中稳定，在碱存在下会异构化，在强碱条件下水解。毒性：大鼠急性经口 l d 5 06 4 9 m g k g ，美国环保局( e p a ) 称它具有潜在致癌性，相关报道证 明它具有类似于雌性激素活性产生生殖和发育毒性，另外还具有神经毒性 和引起急性中毒( g a r e ya n dw o l f f , 1 9 9 8 ；s h a r e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 图1 1 高效氯氰菊酯的化学结构式 f i g 1 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so fb e t a - c y p e r m e t h r i n 表1 1 氯氰菊酯的对映异构体和非对映异构体成分 t a b l e1 一le n a n t i o m e r d i a s t e r e o m e rc o m p o s i t i o n so fc y p e r m e t h r i nf o r m u l a t i o n s 9 高效氯氰菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究 c h 3c h 3 + h ， 勺c o o 一卜。r i 嚣船 c 括 ( j 参嚣- a so r 豫3 r a r ) h 饼j 傩j 辩 豫 + 飞r 尹 一p ，r 例 尸 一p r h 3 si s 曲 ( i & 3 s - a ro ri r 3 r a 8 ) r = 。一l | c h 3c h 3 强豫 + h p 蝴一p r h o c ) o h h p - r a 澈塔 n 谊弹s i s - 3 r - a ro rl g - 3 s - a 5 ) h + t r a n s ( i $ - 3 r a so rj r - 3 s - a r ) d 图1 2 氯氰菊酯的对映异构体和非对映异构体化学结构( 对映体成对) f i g 1 - 2s t r u c t u r e so fc y p e r m e t h r i ne n a n t i o m e r s a sd i a s t e r e o m e r s ( e n a n t i o m e rp a i r s ) 1 0 h 罗0 r 饿尸p h 山东农业大学硕士学位论文 1 2 农药残留的生物修复研究概况 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 是指利用微生物或其他生物将存在于土 壤、地下水和海洋的有毒、有害污染物降解为二氧化碳和水或转化为无害 物质的过程。与物理化学方法相比具有安全、廉价、有效和无二次污染的 特点( a l e x a n d e r , 1 9 8 1 ) 。 生物修复的基础研究最初集中在水体、土壤和地下水环境中石油生物 降解的实验室研究。1 9 7 2 年，在清除美国宾夕法尼亚州的a m b l e r 管线泄 露的汽油时首次实际应用生物修复技术。8 0 年代以后将基础研究成果大 范围的应用于环境污染治理，取得成功，从而发展成为一种新的生物治理 技术( h u b a n ，1 9 9 7 ) 。在美国阿拉斯加石油泄露的生物修复项目中，使用生 物修复技术能够在短时间内消除石油污染并治理环境，作为一个成功的例 证，成为生物修复发展的里程碑( p r i t c h a r da n dc o s t a ，1 9 9 1 ) 。据统计，美国 对有毒废弃物污染场所的生物修复项目费用由1 9 9 4 年的2 亿美元提高到 2 0 0 0 年的2 8 亿美元，六年增长了1 3 倍。综上所述，生物修复将是一项 非常有发展前途和潜力的环境污染治理技术。 几个生物降解方面的相关定义： 1 9 7 8 年化学安全品安全委员会在布鲁塞尔b i o d e g r a d a t i o nt a s kf o r c e s 上为生物降解( b i o d e g r a d a t i o n ) 做了以下定义：即活得生物体在复杂的生 命活动过程中导致有机物分子降解的过程。如果一种物质对环境不利的性 质丧失，那么就认为它被生物降解成了环境可接纳物。生物降解导致的一 些特征功能或性质的丢失则被称为生物转化。 矿化作用( m i n e r a l i z a t i o n ) 又称终极生物降解( u l t i m a t eb i o d e g r a d a t i o n ) 是在土壤微生物作用下，土壤中有机态化合物转化为无机态化合物过程的 总称。复杂的有机物质经微生物酶的一系列作用，使其分解转化，最终生 成c 0 2 和水等简单的无机( 矿质) 化合物，同时释放能量的过程。 共代谢( c o m e t a b o l i s m ) 一些难降解有机物通过微生物的作用能被改 变化学结构，但不能被用作碳源和能源，而必须从其它底物获取大部分或 全部碳源和能源的代谢过程。微生物的共代谢作用又可分为：基质共代谢， 是指靠降解其它有机物提供能源或碳源，或由其它物质诱导产生相应的酶 系发生共代谢；微生物共代谢，是通过与其它微生物协同作用发生共代谢 高效氯氰菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究 而降解污染物。 1 2 1 微生物对环境污染物的降解 1 2 1 1 微生物降解环境污染物的方式 微生物对环境中有毒化合物的作用可分为两大类：一类是微生物直接 作用于化合物，此类反应大多由酶促反应引起。另一类是由于微生物的活 动引起了环境的物理化学变化而导致的间接作用。 1 ) 氧化作用：它是微生物降解农药的重要酶促反应，包括多种形式：羟 基化、脱烷基、羧基化、环氧化、p 氧化、醚键开裂、芳烃或杂环开环等。 羟基化包括烷烃的末端氧化为醇、苯环上加羟基等反应，这些增加了化合 物的水溶性，使其更容易被微生物利用。参与氧化作用的酶包括：单加氧 酶和双加氧酶。单加氧酶又称混合功能氧化酶，一些还原程度很高的化合 物如烷烃、芳烃的氧化反应均由单加氧酶启动，并需要n a d h 或n a d p h 来提供还原力。双加氧酶能够催化邻位带有两个羟基的芳环的开环，开环 反式包括：邻位和间位裂解。 2 ) 还原作用：氯代化合物的生物降解通常发生还原性脱氯。如五氯酚在 厌氧条件下还原脱氯形成2 ，3 ，5 ，6 四氯苯酚，其进一步脱氯形成三氯 酚、二氯酚。厌氧条件下的还原脱氯与氯代程度正相关，氯取代程度越高 越容易还原脱氯( m i k e s e l la n db o y d ，1 9 8 6 ) 。 3 ) 水解作用：在拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机磷和苯酰胺这些含有酯 键、醚健或酰胺的杀虫剂中，水解作用是常见的一种降解方式。参与水解 的酶包括：酯酶、酰胺酶、磷酸酶等。水解酶具有广谱性，在不同p h 值 和温度条件下都较稳定，并且无需辅因子，产生的水解产物毒性和环境稳 定性大大降低。如拟除虫菊酯在羧酸酯酶催化下经第一步水解反应生成酸 部分和醇部分。 4 ) 缩合或共轭：微生物通过这类反应可将有毒化合物与其他物质相结合， 从而使农药失活，而达到解毒的目的。如苯酚或苯胺类化合物可以在微生 物的酚氧化酶和过氧化物酶作用下与土壤中腐殖酸类物质缩合，从而使这 类有毒化学物质结合到土壤的腐殖质中。 1 2 1 2 细胞表面疏水性以及生物表面活性剂对降解环境污染物的影响 疏水性的有机污染物( 包括：疏水性的农药，石油烃类有机化合物和 1 2 山东农业大学硕士学位论文 各种有机废弃物) 由于其水中的溶解度很低，这便导致微生物很难对其降 解。微生物降解此类污染物第一步要完成的便是吸附到此类物质的表面， 然后再通过将污染物吸收到胞内，或是通过分泌相关的酶将其降解为小分 子水溶性化合物，然后吸收同化，作为自身生长必须的碳、氮或能源，与 此同时完成了对疏水性有机污染物的降解。 微生物菌体细胞表面疏水性的高低，对菌体吸附到疏水性的有机物表 面( 第一步过程) 起着至关重要的作用。高细胞表面疏水性的微生物更容 易吸附到疏水性有机污染物的表面，也就比低疏水性的微生物更容易完成 紧接的第二步吸收和降解。通常我们研究微生物对污染物的降解，主要集 中在研究微生物如何产生或分泌污染物降解酶，如何对降解酶进行基因工 程的研究与应用，而忽略了限制微生物对疏水性有机污染物降解的第一 步，这也是影响微生物降解疏水性有机污染物的瓶颈。研究发现可以通过 各种方法( 电击法或添加生物表面活性剂) 来提高微生物的细胞表面疏水 性，或选择具有高疏水性微生物将它们应用于原位有机污染物的生物修复 过程中，提高修复效率，加速生物修复过程。这些方法相比使用酶制剂来 说，具有廉价、高效和实用等特点。 生物表面活性剂是生物( 主要是微生物) 生成的低分子量表面活性剂， 包括糖脂、多糖脂、脂肽、脂蛋白以及中性类脂衍生物等。它们的分子结 构由两部分组成，一部分是疏油亲水的极性基团，如单糖、聚糖、氨基酸、 肽和磷酸基等，另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱 和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等。正是由于具有这种既亲油又亲水的两亲 性分子结构，生物表面活性剂才能具有分散、加溶、润湿、渗透等性能，但 它们的生理功能还不是很清楚( l a n ga n dw u l l b r a n d t ，1 9 9 9 ) 。虽然大多数的 生物表面活性剂被看作是次级代谢产物，但它们对微生物的生长却具有 重要作用。例如，烃类的难溶性使得摄取烃类的微生物在生长过程中往往 伴随着生物表面活性剂的生成，它们的作用主要是使烃类在水溶液中有 效扩散，并渗入细胞内部被同化分解。另一方面，生物表面活性剂可以通 过调节细胞表面的疏水性能来影响微生物细胞与烃类之间的亲和力。除此 之外，很多生物表面活性剂具有杀菌活性，并在细菌滑动穿越界面的活动 中以及适应恶劣环境的代谢过程中发挥特殊作用。几乎所有这些生物功能 1 3 高效氯氰菊酯降解菌的筛选、鉴定、疏水性及降解性能研究 均与它们的两亲性分子特征相关。 1 2 2 拟除虫菊酯类农药的微生物降解研究现状 】2 2 1 拟除虫菊酯类农药的降解微生物 高效氯氰菊酯是目前我国使用量最大的拟除虫菊酯类杀虫剂之一，对 鱼类等水生动物高毒，美国环保局( e p a ) 认为它是一种潜在的致癌物， 对人类产生各种急性毒性( a n d e r s o n ，1 9 8 9 ；c a s i d aa n dq u i s t a d ，1 9 9 8 ；m i a n a n dm u l l a ，1 9 9 2 ；v a nw i j n g a a r d e ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。它在自然环境中的半衰期为 9 4 2 1 10 3 天，土壤中的粘附系数为8 2 1 ，因此高效氯氰菊酯对环境和人 类健康具有潜在的危害性。如何有效处理这类有毒有机污染物，一直是环 境领域研究的热点。在目前采用的处理方法中，微生物降解法由于成本低、 适用范围广、不会造成二次污染对环境友好等优点，而成为有毒污染物处 理发展的主要趋势。 目前，国内外很多关于农药残留降解菌的报道，但对降解拟除虫菊酯 类农药的微生物报道相对较少( 表1 2 为目前已筛选到的菊酯类农药降解 菌) ，还未见有微生物特异性降解高效氯氰菊酯的相关报道。并且相关报 道共同特点是都以共代谢( c o m e t a b o l i s m ) 方式降解( 转化) 菊酯，当菊 酯农药浓度超过2 0 0 m g l 时，微生物对其降解率明显下降甚至不降解。许 育新等分析，这一方面可能由于菊酯的疏水性较强，另一方面可能与降解 产物对细菌的毒害有关( 许育新e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。有研究表明拟除虫菊酯在灭 菌土壤中的降解明显低于未灭菌的土壤，从而证明拟除虫菊酯在土壤中的 降解主要是由于生物降解：并发现介质的p h ，温度，组成成分以及农药 的浓度都能影响微生物对农药的降解。 迄今，国内外对微生物降解拟除虫菊酯的研究主要集中在降解菌的筛 选、分离、鉴定，对农药降解率的测定和通过一系列分析化学方法( t l c 、 h p l c 、g c m s 、n - m r ) 对其降解产物进行分析并估测降解途径，及粗酶 液的制备。目前，已有多例在细菌中纯化到拟除虫菊酯水解酶的报道，并 推测这种酶可能是羧酸酯酶( m a l o n e ye ta 1 ，1 9 9 3 ) 。也有关于哺乳动物和昆 虫体内相关降解酶的研究报道，h u a z h a n gh u a n g 等( 2 0 0 5 ) 报道人体肝 中的羧酸酯酶对于人体中拟除虫菊酯的解毒起主要作用。也有报道称对高 效氯氰菊酯农药有抗性的家蝇体内发现有很高的羧酸酯酶活性( c o r b e le t 1 4 山东农业大学硕士学位论文 a 1 ，2 0 0 7 ；c r o we ta 1