（生物医学工程专业论文）泥鳅抗菌蛋白maap的分离、纯化、表征及生物活性研究.pdf

华中科技大学博士学位论文 是一个新发现的蛋白质。 用聚l 。赖氨酸构象模型法、r a m a n 二阶导数谱法、f t - i r 去卷积拟合法和概率 模型法研究了m a a p 的二级结构。研究结果表明：m a a p 中a 螺旋含量约为2 5 ： p 折叠约4 9 ，p 转角约1 6 ；无序结构含量在1 0 左右。研究结果提示m a a p 内部存在一个主要由a 螺旋和d 折叠形成的高度有序的疏水核心，疏水核内的肽链 通过c y s 形成的二硫键相互交联从而形成了稳定的空间结构。 采用比浊法和平板抑菌实验研究了m a a p 的抗菌活性，实验结果表明m a a p 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用且量效关系明显：采用 连苯三酚自氧化体系研究了m a a p 的抗氧化活性，结果表明m a a p 能有效清除连 苯三酚自氧化过程中产生的超氧阴离子。这些结果表明m a a p 是抗菌药物开发中 一个有潜力的先导化合物分子。y 关键词：泥鳅蛋白质纯化表征生物活性抗菌肽 、 、，。一 ，。、。一，7 i i 华中科技夫学博士学位论文 = = = = = ；# = = = ；# # ；= ；# ；= _ = ；# = 自 a b s t r a c t l o a c hi sak i n do ff i s ht h a tb e l o n g st ot h ef a m i l yo fm i s g u r n u sa n g u i t l i c a u d a t u s c a n t o r i ti sr e c o r d e di n ad i c t i o n a r yo fc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e t h a ti t sm e a t o r w h o l eb o d yc a l lb eu s e da sc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e t h em a i np h a r m a c e u t i c a l f u n c t i o n so fl o a c hs e e ni nf o l kr e c i p e sa r et on o u r i s hs p l e e na n de n r i c hv i t a le n e r g y , t o r e l i e v ei n t e r n a lh e a ta n dd e t o x i 魏t oe l i m i n a t ec a r b u n c l e sa n dl o o s e ns c a b s ，t op r o t e c t l i v e ra n db r i n gd o w n j a u n d i c e c h i n e s ep e o p l e h a v eb e e nu s i n gf l e s hl o a c hh o m o g e n a t e t oc u r e m y e i i t i sa n db r e a s t c a r b u n c l ef o rt h o u s a n d so fy e a r s t h e r a p e u t i cp r a c t i c e s s u g g e s t e ds o m ep r o t e i n p o l y p e p t i d e l i k es u b s t a n c e st h a tr e a c t e di nl i v i n gl o a c h h o w e v e r ， l i u l ei s r e p o r t e d o ns u c he f f e c t i v es u b s t a n c e s t h i st h e s i s r e p o r t s h e r ean o v e l a n t i m i c r o b i a l p r o t e i n ( m a a p ，m i s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u s a n t i m i c r o b i a l p r o t e i n ) i s o l a t e df r o m l i v i n gl o a c h i t sp u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n ，m o l e c u l a r s t r u c t u r ea n d b i o a c t i v i t i e sw e r ea l s od e s c r i b e di nt h i sp a p e r , t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： an o v e la n t i m i c r o b i a lp r o t e i n ，n a m e dm a a p , w a si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o ml i v i n g l o a c h u s i n ga c e t o n ep r e c i p i t a t i o n ，s e p h a d e xg - 5 0g e lf i l t r a t i o n ，d e a e 5 2 c e l l u l o s e i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，m a a pw a s i s o l a t e ds t e p w i s ef r o ml o a c hp r o t e o m ea n d w a s e v e n t u a l l y o b t a i n e d t h r o u g h a ni m p r o v e d p o i y a c r y l a m i d eg e le t e c t r o p h o r e s i s t o g e t h e rw i t he l e c t r o e l u t i o u a b o u t0 0 2 8gm a a p c o u l db eo b t a i n e df r o mp e r1 0 0g l i v i n gl o a c h 。i nt h ep r e p a r a t i o n o fm a p p , at r o u b l e s o m ep r o b l e mb l o c k e dt h ef i n a l p u r i f i c a t i o no fm a p r t h e r ew a sap r o t e i nv e r ys i m i l a rt om a p rt h et w op r o t e i n s c o e x i s t e di nt h ef r a c t i o n sd u r i n gt h ec o u r s eo fc h r o m a t o g r a p h ya n dt h e ya r ea l m o s tt h e s a m en o to n l yi nm wb u ta l s oi np iv a l u ea n da m i n oa c i dc o m p o s i t i o n t h e r e f o r e ，i tw a s h a r dt os e p a r a t et h e mt h r o u g hs e v e r a lc o l u m n sa n dn o r m a le l e c t r o p h o r e s i st h o u g hw e c a l l d i s t i n g u i s ht h e mb y s d s u p a g ea n dh p l c ，h e n c e ，t h ei m p r o v e dp a g e w a s e m p l o y e d a sa k 磅a p p r o a c ht h r o u g h w h i c hm a a pw a se v e n t u a l l ys e p a r a t e d as e r i e so f p u r i t yd e t e r m i n a t i o np r o c e s s e si n c l u d i n gs d s p a g e ，h p l c ，i e f , t l c c t ci n d i c a t e dt h a tm a a pi sp u r e ， 1 1 1 华中科技大学博士学位论文 d i f f e r e n ta p p r o a c h e sw e r et h e nu s e dt oc h a r a c t e r i z em a p rt h ep r o t e i nc o n t a i n s a b o u t1 11r e s i d u e sc o n t a i n i n g1 0d i f f e r e n ta m i n oa c i d s o fw h i c h c y s t e i n ew a st h em o s t a b u n d a n t ，n oa l k a l i n er e s i d u ew a sf o u n di nm a a rm a a pi sas i n g l e c h a i np r o t e i nw i t l l m wa b o u t11 , 5 3 6d a l t o n ( m e a s u r e db ym a l d i t o f m s ) a n dp ia b o u t4 7 8 ( m e a s u r e d b yi e f ) u vs p e c t r ao fm a a p s h o w e dac h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a ko f p o l y p e p t i d e a t 19 2 姗w i t ht h ee x t i n c t i o nc o e f f i c i e n to fl0 3x1 0 6l t o o l - t c m m s f i n g e r p r i n ts h o w e d 1 6f r a g m e n t so fm a a p d e g r a d e db yt p c k - t r y p s i n t h en t e r m i n u so fm a a p w a s m e a s u r e da sc y s p h e g l y m a s n n os a c c h a r i d el i g a n d ，l i p o i d l i g a n d a n da s s o c i a t e m e t a lw e r ef o u n di nm a a e s i m i l a r i t ys e a r c h e sb yc o m p a r i n ga m i n oa c i dc o m p o s h i o n ， m s f i n g e r p r i n t a n dt h en - t e r m i n u so fm a a pd e m o n s t r a t e dt h a tn op r o t e i n e x a c t l y m a t c h e dm a a _ pi nd a t a b a s e sa r o u n dt h ew o r t d t h es e c o n d a r ys t r u c t u r ew a ss t u d i e d u s i n gp o l y l - l y s i n e c o n f o r m a t i o nm o d e l ， s e c o n dd e r i v a t i v er a m a n s p e c t r u m ，a n d c u r v e f i t t e df t - i r s p e c t r o s c o p y a f t e r d e c o n v o l u t i o n ，a n dp r o b a b i l i t ym o d e lr e s p e c t i v e l y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ea r e2 5 a - h e l i x ，4 9 p s h e e t ，1 6 p 。m m ，a n d1 0 r a n d o m c o i li nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f m a a p a p p r o x i m a t e l y , s u g g e s t i n gah i g h l yr e g u l a t e dh y d r o p h o b i ck e r n e li nm a a p t h a t w a s c o m p o s e do fa - h e l i x a n dp - s h e e t aw e l l s t a b i l i z e d s p a t i a l s t r u c t u r ew a st h e n c o n f i r m e dp r o b a b l yt h r o u g ht h ea b u n d a n td i s u l f i d eb o n d sb e t w e e np e p t i d ec h a i n si n m a ap t u r b i d i m e t r ya n dp l a t e - a n t i m i c r o b i a la s s e s s m e n tw a sp e r f o r m e dt oi n v e s t i g a t et h e b a c t e r i a i n h i b i t i o no fm a a rr e s u l t ss h o w e dt h a tm a a p g a v eag o o d i n h i b i t i o na g a i n s t v a r i o u sb a c t e r i ai n c l u d i n gb a c i l l u ss u b t i l 括，e s c h e r i c h i ac o l ia n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s w i t hab e t t e rd o s e e f f e c tr e l a t i o n s h i p i na d d i t i o n ，m a p pc o u l di n h i b i tt h ea u t o x i d a t i o no f p y r o g a l l o l w i t hah i 曲e f f i c i e n c y a b o v e - m e n t i o n e de x p e r i m e n t sm a d ei tc l e a rt h a t m a a ph a sa p o t e n t i a lv a l u e t ob eu s e da sl e a dc o m p o u n di na n t i b i o t i c sd r u gd i s c o v e r y k e y w o r d s ：l o a c h ( m i s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u s ) ，p r o t e i n ，p u r i f i c a t i o n ， c h a r a c t e r i z a t i o n ，b i o a c t i v i t y , a n t i m i c r o b i a lp o l y p e p t i d e l v 华中科技大学博士学位论文 1 1 泥鳅的生药学 1 绪论 泥鳅( m i s g u r n u s a n g u i l l i c a u d a t u s c a n t o r ) 又名鳅( 尔雅) 、鳅鱼( 本草拾遗) 、 和鳅( 泉州本草) ，系鲤形目鳅科动物。体细长，约8 一1 5 厘米，前段略呈圆筒形， 后部侧扁，腹部圆。头尖，眼小，吻部向前突出。口小，下位，呈马蹄形。唇软， 具有皱纹和小突起。须5 对，吻须1 对，上下颌须各2 对，吻须和上颌须之长均与 吻长相等，下颌须外侧的1 对其长为上颌须长的l 2 ，而为内侧l 对的2 倍。鳞极 细小，圆形，埋于皮下，侧线鳞1 1 6 1 7 0 左右，头部无鳞。背鳍i i - 7 ，无硬刺，起 点在腹鳍之前或相对。臀鳍i i 5 - 6 ，起点在背鳍末端之后。腹鳍短小。尾鳍圆形， 尾柄上下边缘向外扩展。体背及两侧灰黑色，体部头部和各鳍上均有许多黑色斑点， 背鳍和尾鳍鳍膜上的斑点排列成行，尾柄基部有一黑点，其它各鳍灰白色( 见图1 1 ) 。 图1 1 泥鳅 f i g1 1t h el o a c h ( m i s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u sc a n t o r ) 泥鳅栖于湖泊、沼泽、池塘水田和沟渠中，喜居于静水底层和富有植物碎屑的 游泥表层。对环境适应力强，除西部高原地区外，全国南北各地均有分布。泥鳅的 肠壁薄，肠管直，血管分布广，可进行肠呼吸，一旦遇水中溶氧不足，就时常出水 面吞吸空气，空气入肠行肠呼吸后，废气由肛门排出。冬季寒冷，水又于涸，泥鳅 钻入泥土中，依靠少量水分使皮肤不致干燥，并全靠肠呼吸维持生命。一般2 冬龄 性成熟，产卵期在5 月中至9 月中，以6 7 月最盛。生殖季节，雄鱼胸鳍第2 鳍条 扩大且伸长；背鳍下方的体侧略为凹入。卵黄色，略具粘性。怀卵量约7 ，0 0 0 一1 0 ，0 0 0 华中科技大学博士学位论文 粒。幼鱼刚孵出，具有外露鳃条，以后逐步蜕变而成鳅形。 泥鳅为杂食性底层鱼类，多在晚上出来捕食浮游生物和小型甲壳动物、昆虫、 扁螺和高等植物的碎屑及藻类等，有时亦食取水底腐植质或泥渣。泥鳅是我国重要 的名优经济鱼类，而商品成鳅的获得目前仍局限于稻田、池塘和农家庭院坑塘等水 体的混养或单养，存在着单产低、饵料系数偏高、鱼病防治及成鳅捕捞较困难等问 题。通过人工繁殖和种苗培育能获得批量苗种，可进行规模化人工养殖。随着市场 经济的深化发展，泥鳅的人工养殖和诱捕储运技术日趋成熟。 泥鳅的可食部含水分8 3 ，蛋白质9 6 ，脂肪3 7 ，碳水化合物2 5 ，灰分 1 2 ；又含钙2 8 0m g 瓜g ，磷7 2 0m g k g ，铁9m g k g 。肉的脂肪中，含不饱和的二 十二碳六烯脂肪酸1 3 2 5 0 , 0 ，显著量的十八碳三烯脂肪酸和二十二碳五烯脂肪酸等。 全体1 0 0 克中含维生素a7 0 i u ，维生素a 原9 0 i u ，维生素b l3 0 ug ，维生素b 2 4 4 0 i tg ，尼克酸4 0 m g 。 泥鳅全体或皮肤分泌的滑液入药，甘，平，无毒。其主要功效为补中益气、醒 酒止渴、健脾和胃、清热解毒、祛湿邪，治消渴、水肿黄疽、痔疾、阳痿等症。民 间常用其粘液治痈肿、中耳炎；用活泥鳅捣碎外敷治疗乳癌、骨髓炎等，疗效显著。 近代用于治疗传染性肝炎和消渴病【2 1 ，主要验方如下：( 1 ) 治疗传染性肝炎。取 活泥鳅放清水中养1 天，使其肠内容物排净，然后用干燥箱烘干( 1 0 0 c 为宜) 研 粉，每次1 0 1 5 克，日服3 次。治疗4 0 例，2 4 例自觉症状消失，肝脾肿大消退， 肝功能恢复正常；8 例自觉症状基本消失，肝缘在肋下o 5 1 厘米以内，肝功能基本 恢复正常( 麝浊1u 以下、麝絮“+ ”、脑絮“+ + ”) ；3 例自觉症状基本消失，肝缘 在肋下1 2 厘米以内，肝功能改善：5 例无效。曾将2 0 例黄疸型传染性肝炎患者分 两组对照观察，结果泥鳅粉治疗组7 例临床治愈，平均治愈天数为2 5 8 天：保肝疗 法对照组4 例临床治愈，平均治愈天数为3 8 天。泥鳅粉对促使黄疸消退及转氨酶 下降比较明显，尤以急性肝炎更为显著：对肝功能其它项目的恢复，也较一般保肝 药物治疗为快：对迁延型和慢性肝炎的肝功能也有较明显的改善作用。辽宁省盖城 县医院用此法治疗传染性肝炎3 5 例( 黄痘型3 2 例) ，疗程1 2 1 6 天，痊愈3 3 例， 显效2 例，有效率1 0 0 。另外，叶朝兴等探讨了活吞泥鳅对乙肝及肝硬化的治疗 2 华中科技大学博士学位论文 俸蠲。( 2 ) 治疗嚣髓炎。滔泥鳅2 条窝鳋薄革3 0 灸共捣烂敷患处，每疆1 次，2 周 为一个疗程，5 6 例患者中有5 1 倒痊愈，有效率9 1 。( 3 ) 治疗小儿盗汗。泥鳅1 0 0 克，浇洚，去疼麓，灌惑歪黄，魏承l 酸，蒸沥藤薤褥食，每天1 次，逡续3 天， 有效率9 7 。( 4 ) 治疗乳痈。取溅鳅条，无斑土豆一个，捣成小饼，贴患处，德 戮1 次，可餍予治疗乳瘸硬结者，如亿脓开日者，先用鬣凡诺尔纱布壤充，再敷药 饼。用药1 次症减，2 次收口，3 次痊愈。或泥鳅1 0 条，洗净，加砂糖半碗，搅拌， 腻滑涎即出，去鳅，用此糖糊敷痈，每目3 - 4 次，可治愈( 动植物民间蓊) 。泥嫌 撼烂，与黑砂糖敷患处w 用于治疗乳癌( 中国蠢毒鱼类秘药用惫类) 。( 5 ) 治消 溻饮水无度。泥鳅1 0 条，阴干，去头尾，烧灰，加等份的干荷叶共碾细为末。每 鞭2 钱，掰汲承濮下，滋簿鞭，簿嚣3 次，簇不慧痰邵业( 圣济慧录沃焦教) 。 ( 6 ) 据泉州本草载：泥鳅炖豆腐，可治黄瘾湿热小便不利；泥鳅醋炙为末， 掺患处，可治久癞不愈：滋鳅台麓、冷饭粒捣敷恚憝，哥浓上下蔽腿凌隆起处瓣瘸。 ( 7 ) 据四川中药志载：泥鳅、鱼鳅串、侧鲜根、蒲公英，熬炖汤服，可治澄 热皮肤超疹发瘁：泥簌、侧耳根、鱼鳅审、老君硕、一支箭，共炖汤服，可治疥癣 发痒；泥缀身上擞白糖，使糙液与糖混会，去鳅用箕涎，一盅兑冷开水暇，可治小 便不通、热淋。( 8 ) 泥鳅同米粉煮羹，可调中收痔( 本筚纲目) 。( 9 ) 煮食泥鳅， 可澹疆攀不起( 濒瀑集麓方) ；霹治疮癣，逶巍琢瑟大於弱分( 滇鸯本葶) ；可 “补中，止泻”( 医学入门) ；“杀虫”( 随息居饮食谱) 。( 1 0 ) 米酒煮泥鳅，用 予体蠹滚汗；混鳜楚大蒜，霆予黎莠不炎淫承髀。 可见，泥鳅的营养价值很高，对许多疾病确商疗效，但目前关于泥鳅药用的有 效成分( 或部位) 以及用现代方法对淀鳅送行逡南瀚e 工窥蓊瑾豌察酶探讨较少。溺 此，泥鳅具有保健功能和治疗作用的物质基础及其药理机制值锝进一步研究。 1 2 泥鳅中的生物活性分子及其功能 近十几年来，对泥鳅的研究圈内外均有些报道，主要内容是涉及泥鳅的营养举 方西较多【4 t 熨，其次是关予它的徽囊元素鹃分橱瓣、艇骀缀戆、缝搦、线粒俸、d n a 臌制性酶切图谱鞠些临床民间治疗验方等。本节就最近有关泥鳅中的生物活性分 华中科技大学博士学位论文 子及荬功熊熬璎究避震传综述，为避一步研究泥嫩豹药效基础积保健作用提供参 考。 1 2 。1 泥鳅多糖( m i s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u sp o i y s a c c h a r i d e ) 钦传光等7 1 首次从泥鳅粘液中分离提取到中性的粗多糖，采用凝胶渗透色谱柱 在嵩效滚褪色谱仪上进嚣分离秘溅定，结鬃表明该多糖由一个毫聚耱( m a p ，1 9 1 ) 和个寡糖( m a o ，8 0 9 ) 组成。用标准的p u l l u l a n ( p - 1 1 2 0 0 0 ，p - 4 7 3 0 0 ，p - 2 2 8 0 0 ， p 1 1 8 0 0 ，p - 5 9 0 0 ，p 。2 7 0 0 ) 作标准藩线，溺得箕耋筠分子爨分裂为1 3 0 2 5 2 ( 约7 2 3 个糖基) 和t 5 3 9 ( 约9 个糖基) 。粗多糖缀s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶楗( 1c m 5 0 c m ) 过滤，分离得到纯化的m a p 和m a o 。经纸层轿和气褶德谱分轿，结栗袋萌混鳜 多糖的主贾单糖缎成为d 一半乳糖张l 一岩潦糖。进步分离出多糖m a p ，经s e p h a d e x g ，l o o 柱滕析和醋酸纤维薄膜电泳法检查筑度，袭明m a p 为单一组分。混鳅多糖 ( m a p ) 宠全酸承鼹蜃，经纸层攒和气提织谱分掇，其主要鲍单糖组成为袋藻糖和 半乳糖。利用高碘酸氧化、s m i t h 降解及r r 数据初步确定m a p 的结构，主链由q 一 ( 1 3 ) 键连接嚣藏。 采用化学发光法和分光光度法在多种化学模拟体系中研究了泥鳅多糖清除活 性鬣静 乍麓，并稿亿学发光法蕊察了泥鳅多耱对o h 导致d n a 链攘伤静季牵若l 律霜。 结果表明，泥鳅多糖能够肖效地清除0 2 ：、o h 、 2 0 2 等活性氧，对d n a 链具有 良好的保护作用。 蠲不嗣裁量魏混鳅多蛰分裂绘小惑灌爨，蔹爨药理实验方法掌秘有关娥定对魄 观察它们对五种抗炎模型的药理作用。泥鳅多糖能明显抑制蛋清致足跖肿胀和毛细 盎管鼢逶邂瞧，降低棒球淡芽瓣斡錾量，述毙捧瀚= 甲苯诱发弱鼙壳瓣袋鄹羧争蘩 纤维素钠敬胸腔渗出液中的白细胞游走。它们的抗炎效果大多与地噻米松组无显著 差异，甚至有的作用还略强子遗曦米松磷酸钠注辩液，并黩皇一定的蠢彀关系。混 鳅多塘是淀鳅及其粘液具脊抗炎传用的活性成分之一，对急性炎癜的抗性较强，对 慢性炎症也有一定的抵抗效果。 爰浞鳅多耱绘小鼠灌霉秘，双察缝 f 】对滔氯化碳、硫代乙酸胺鞠卜萘鼯鹱氟酸 4 华中科技大学博士学位论文 酯致小鼠肝损伤所g l 起肝肿胀、血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶以及血清黄疸指数升 高的影响。结果表明泥鳅多糖能明显降低模型组的血清转氨酶和肝肿胀，而且还能 显著抑制卜萘异硫氰酸酯引起小鼠血清黄疸指数升高。经体内外的实验研究，结果 表明泥鳅多糖对小鼠肝脏的化学性损伤、免疫性肝损伤有显著的抑制作用。此外， 还观察到泥鳅多糖对小鼠具有良好的免疫调节作用，对实验性糖尿病小鼠具有一定 的降血糖调血脂的作用。 1 2 2 凝集素( l e c t i n s ) 泥鳅的粘液提取物能凝聚包括人类( a 型、b 型和a b 型) 、兔、羊等在内的 各种哺乳动物的血红细胞，但不与人类0 型血红细胞反应。在加热和极端p h 值的 条件下，泥鳅粘液提取物的血球凝集活性会遭到破坏，该活性对c a 2 + 的存在是非依 赖性的。交叉吸附实验表明泥鳅粘液提取物中可能含有非血型专一性的凝集素。 g o t o n a n c e ，r 等 8 1 9 9 5 年报道了采用离子交换柱色谱和s e p h a r o s es - 2 0 0 凝胶 柱经多次凝胶过滤，从泥鳅粘液中分离到两种凝集素，分别命名为m a l 一1 和 m a l 2 。m a l 1 是一种糖蛋白，其糖链由d 半乳糖( 1 3 6 ) 、d 甘露糖( 2 1 ) 和l 木糖( 2 5 ) 组成。完整m a l 一1 分子的分子量为3 0 0k d a 以上，并含有不均 匀的亚基( 分别为4 0k d a 和4 1k d a ) 。m a l 1 中有半胱氨酸残基的吸收谱，提示 m a l 1 分子中的各亚基是通过非共价键聚集在一起的。m a l 一1 能与海鳗粘液凝集 素的抗体反应，却不能与藤壶贝类凝集素的抗体反应。m a l - 2 的分子量比m a l - 1 小。此外，y a m a z a k im 等1 】还从泥鳅卵中分离纯化到一种凝集素，并发现它能诱 导小鼠巨噬细胞和骨髓细胞释放细胞毒，能使巨噬细胞介导的肿瘤细胞自溶，而不 影响正常的脾细胞。 1 2 3 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ) p a r kc b 等从泥鳅中分离到一种新的抗菌肽，命名为泥鳅素( m i s g u r i n ) ，并 对其化学结构进行了表征。泥鳅粘液提取物经肝素亲和柱、c 1 3 反相柱和凝胶渗透 华中科技大学博士学位论文 高效液相色谱纯化后，得到种含2 】个氨基酸残基的多肽，其分子量为2 5 0 2 d a 。 全氨基酸序列测定结果表明，泥鳅素的氨基酸顺序为： a r g g i n a r g v a l g l u - g l u l e u - s e r - l y s - p h e - s e r - l y s l y s g l y - a l a - a l a a l a - a r g a r g a r g l y s 。泥鳅素是一种具有5 个精氨酸残基和4 个赖氨酸残基的强碱性多肽，与已知 抗菌肽的氨基酸序列对照，发现泥鳅素是一个新的抗菌肽。泥鳅素对广谱微生物表 现出很强的抗菌活性，其抗菌活性大约是m a g a i r t i n 一2 ( 目前公认的抗菌活性最强的 一种抗菌肽) 的6 倍以上，却没有显著的溶血活性。在扫描电子显微镜下观察，发 现泥鳅素的抗菌机理与m a g a i n i n 2 相似，通过形成微孔的机制引起细胞膜的损伤。 这种损伤作用是在最小抑制浓度( m i c ) 下发生的，但是，若浓度高于m i c 时，它 就使细胞溶解。 1 2 4 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ) 刘煜等h j 的研究发现泥鳅体表粘液中含有超氧化物歧化酶( s o d ) ，活力达 6 5u m l 。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 分析表明该s o d 具有条同工酶带。 用乙醇一氯仿及k c n 处理，该s o d 仍保持一定的催化活力：在变性剂s d s 作用下， s o d 活力完全丧失，这些性质与已发现的c u z n s o d 、m n s o d 、f e s o d 的性质 有一定的差异，表明该s o d 具有其特殊性，但该s o d 的亚基构成及金属辅基组成 与其特性的关系还不明了。该s o d 以胞外酶形式存在于泥鳅体表粘液中，在p h 5 - 1 3 范围内保持催化活性，有较好的热稳定性。 s o d 能够清除超氧阴离子自由基，在防御氧的毒性、抗辐射损伤以及预防衰老 等方面起着重要作用，是保护机体的重要酶系。近年来的研究还发现s o d 对防治 某些疾病，如肿瘤和炎症等有关，泥鳅体表粘液中s o d 的存在，可能是泥鳅对环 境有较强适应性的物质基础之一。 1 2 5 牛磺酸( t a a r i n e ) 钦传光等【7 1 采用自动氨基酸分析仪对泥鳅中的氨基酸进行了测定，结果表明泥 6 华中科技大学博士学位论文 鳅中含有丰富的牛磺酸，每1 0 0g 泥鳅干粉含牛磺酸1 2 2 1 3 0 m g 。牛磺酸又称a 一氨 基乙磺酸，是一种非蛋白质氨基酸，具有独特的消炎、镇痛、解热、镇静、降血压 等功能。尤其重要的是它参与并保证婴幼儿身高和体重的正常生长发育，有促进大 脑发育、增强视力和机体免疫力、调节神经传导、调节脂肪消化与吸收、参与胆盐 代谢等功能。对成年人的心血管系统、视觉系统、内分泌机能和肝脏组织也有独特 的保护作用，能增强体质、预防疾病、解除疲劳，也作为体内的抗氧剂，有延缓衰 老的作用。研究表明人类内源合成牛磺酸的能力有限，人体所需牛磺酸大多来自膳 食供应。在某些情况下由于供应减少或消耗增加亦会出现缺乏症状。因此，一些营 养学家认为牛磺酸是人体的条件必需营养素。 1 9 7 5 年h a y e s 等报道猫的饲料中若缺少牛磺酸会导致视网膜变性，长期缺乏 终致失明。动物缺乏牛磺酸时，中枢神经发育受阻、智力低下；补充牛磺酸后，不 仅脑发育正常，而且学习、记忆力显著增强。1 9 8 5 年，s t u r r n a n 【i6 】以猫为模型确立 了牛磺酸与动物脑发育的关系。牛磺酸在中枢神经系统中起着神经调质作用，能影 响某些神经递质与其受体间的相互作用，据研究推测牛磺酸可能通过作用于视网膜 代谢型谷氨酸受体6 亚型( m g l u r 6 ) m r n a 而影响视杆双极细胞的超极化状态， 调制视杆通路信号传导【1 ”。1 9 9 6 年，颜崇超等的实验结果表明，抑制血小板的 激活反应和t x a 2 合成酶活性是牛磺酸预防花生四烯酸引起兔急性死亡的机理；张 在香等的研究发现牛磺酸有促进人胚脑神经细胞的生长发育、增殖分化和延缓衰老 的怍用。近来有报道，牛磺酸可改善糖尿病患者的糖耐量，减少尿糖排泄，并对维 持血小板功能有作用。葛慧等的研究证实牛磺酸能显著降低血糖，改善糖尿病症状， 却不能降低糖尿病大鼠的血小板聚集性，表明血小板聚集性可能与血糖升高无直接 关系。 近年来的研究成果表明：泥鳅中还含有其它多种对人体有益的生物活性物质， 如蛋白质、透明质酸【2 0 】、糖蛋白、不饱和多烯脂肪酸、赖氨酸等必需氨基酸、类 胡萝p 素、尼克酸等维生素以及锌、硒等微量营养元素，它们具有提高机体免疫力 的作用，对于人类防病治病、强身健体、延年益寿大有裨益。 7 华中科技大学博士学位论文 1 3 多效、蛋鑫质静磺究技术及萁迸震 多肢和蛋鑫餍楚生命添动中 鬻重要豹一类功麓大分予，它霞参与了艇念活动 的所有基本过程，如在体液中的运输和分子的跨膜转运，信号转导，基因信息的转 录幂珏在核糖体上黼译成氨蒸酸序藏，免疫威答的奔警，蛋囊质( 酶) 衣获( 激素) 在生物合成路线中的控制与调节等。更为爨要的是，蛋白质和多肽通过自身结构功 能的变化能够对许多生理进程产生至关重黉的影响，这便褥它们成为药物歼发中最 为夔要豹类靶分子积功效分子。鼹此，蠢关蛋囟矮和多黢的研究是当前生物化学 与分子生物学领域中最为活跃的内容之一。本节主要针对鬣白质在纯化、搽定、表 徭等过程中掰涉及瓣生纯技零皴一麟述。 1 3 。1 蛋爨蒺躲分离与缝诧 蛋鑫痰窝多默在结穆上具有垂大豹差舞蝗，它髓不仅壤嫠仅鸯几个氨蒸骏组成 的多肽和越过一千个氨基酸残基的大蛋白，还包括非常亲水的球礞白和可以伸展且 赢凄巯水豹貘蛋鑫。一个攀缅麓中霹蔽含裔数子个不霹教攒垂震秘多获，瓣每一秘 蛋白质或多肽又因其物理化学性质的不同而具有相应的乃至独特的分离纯化方法。 因此，蛋| 刍质和多触的分离与纯亿楚一个稽当灵懑甚至艺零的过程。 虽然骚白质缝化的具体过程非常灵活，但多数分离工作中的关键部分、基本手 段仍具有按同性闭。分离器白质的基本原料通常怒细胞内禽物和外分泌物。如果蘩 分离嚣蛋照度是狩已知潺缝款爨鸯震( 熟酶) ，在分离翦应当进行生物学试验， 以测定酶活力为起点。随后在分离的每一步测定所得制剂的比活力。力求增加提纯 步骤中每一步静魄滤力，器量减少总活力鹃援失。 分离的第一步是粗分级。破碎细胞( 原料是细胞外分泌物时例外) ，从细胞内 释放出内含物，然詹对内含锈( 鬣缱织匀浆液) 避行适当稀释， 圭便于活力蒺l 定帮 下一步的提纯。髓后常用离心法将细胞的驻细胞颗粒( 如核、线糍体、微粒体或核 旃钵等) 与溶液分开。如聚已经得到了具有某种活力的酶溶液( 可能是原始抽提液 或经寒心淡辫后鲍上清波) ，就可以采用几静溶瓣发分级法、进彳亍粗分级。比较缀 华中科技大学博士学位论文 = ：= = 皇= = = = = 昌篁= = 篇昌皇= 薯= 皇= = = 昌昌昌= 篁皇薯墨罱；昌罱= = = 耳 典的粗分级方法是硫铵法和等电点沉淀法。其优点是简单而且适用于大量制备，既 能除去大量杂质，又有利于蛋白质溶液的浓缩，使后来的操作更为方便。 样品经粗分级后，下一步就是细分级。包括使用各种层析方法如离子交换层析 ( d e a e 纤维素，c m 一纤维素) 、分子筛层析( s e p h a d e x ，b i o g e l ) 以及吸附层析( 羟 基磷灰石) 等，有时也用抗原抗体法、亲和层析等方法。小规模制备可以在层析之 后使用制备电泳、等电聚焦等方法进一步纯化。如有可能，还可以进行蛋白质的结 晶，以便得到高纯度的天然蛋白质样品。 总的来看，蛋白质和多肽的分离纯化应当以活性监测为中心，同时以维持蛋白 质的生物活性为基本点，以充分利用蛋白质的各种物理化学特性( 如电荷特性，分 子尺寸等) 为基本点。综合运用各种分离纯化方法并经过一些预实验之后，通常都 可以获得一个比较满意的纯化方案。 1 3 2 蛋白质的纯度鉴定 对纯化之后蛋白质进行纯度鉴定的方法主要有以下几种： 层析性质的考查。在进行凝胶过滤( 分子筛层析) 或离子交换层析或高效液相 色谱( h p l c ，h i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 时均一样品应当呈现出单一的洗 脱峰，表现在功能上就是恒定的比活力。对于分子量较小的蛋白质或多肽，用薄层 色谱( t l c ，t h i n 1 a y e rc h o m a t o g r a p h y ) 鉴定纯度也是一种快速有效的方法。 电荷性质的考查。最主要的方法是各种分析电泳，如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰 胺凝胶电泳( s d s - p a g e ，s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ， 等电聚焦( i e f , i s o e l e c t r i cf o c u s i i l g ) ，各种毛细管电泳( c e ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 等。 抗原性的考查。由于蛋白质大多具有抗原性，因此利用蛋白质抗体之间的特异 性可以检测样品的纯度，如果所获得样品不纯，则有可能在免疫动物体内形成多种 抗体j 免疫沉淀实验中会产生多个条带。 结构均一性的考查。常用的方法是n 端分析法，如果所获样品具有整数克分子 的n 端氨基酸，则视为均一：类以地，氨基酸组成分析也可用来鉴定纯度。近年来 9 华中科技大学博士学位论文 质谱法，特别是基质辅助的激光解吸附飞行时间质谱( m a l d i t o f m s ，m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m eo f f l i g h tm a s ss p e c t r u m ) 在蛋白质纯度鉴定中 的作用日益显著 2 3 j 。虽然氨基酸序列是鉴定纯度的最终标准，但由于蛋白质测序存 在固有的困难，因而且前较少用于纯度鉴定中。 1 3 3 蛋白质的表征 蛋白质的表征主要包括以下几个方面： 分子量分子量通常由凝胶过滤色谱法和s d s p a g e 测得，但是这两种方法均 有一定的局限性。凝胶色谱法可以测量完整的蛋白质分子的分子量，但其精度较低， 且易受各种干扰因素的影响；s d s - p a g e 仅能在折散蛋白质亚基的前提下测定分子 量，其误差一般在5 - 2 0 之间。最近较为常用的m a l d i t o f m s 可以测定分子量 在l ，0 0 0 4 0 0 ，0 0 0 范围内蛋白质的分子量，且误差o 0 1 0 1 ，是一个非常有前景的 技术【2 4 1 ，此外，毛细管筛分电泳在测量分子量上也有良好的应用前景 ”1 。 等电点早期常用界面移动电泳法通过测不同p h 下的淌度来测p i ，现在通过 i e f 可以方便地测量等电点，其误有时可以限制在0 0 1p h 单位内且上样量 1 嵋， 最新的毛细管等电聚焦( c i e f ，c a p i l l a r y i s o e l e c t r i ef o c u s i n g ) 则可以进一步的微量化 并求得精确的p i 值州。 光谱蛋白质具有特征性吸收光谱，由于色氨酸在2 8 7n l n 处有特征性吸收光谱， 因此一般蛋白质在2 8 0 i r a 左右处为吸收高峰。早期文献用2 8 0r i m 2 6 0n n l 的比值来 估计蛋白质的纯度，比值越高，表示核酸的含量越少。有些蛋白质含有特殊的辅基， 如还原性细胞色素c ( c y t c ) 在5 5 0n r l t 有特征的吸收峰，可以用该波长的吸光度 来定量表征此蛋白质。 氨基酸组成分析氨基酸组成是表征一个蛋白质的重要指标，蛋白质或多肽在 强酸下加热水解成它们各自的氨基酸，通过对氨基酸种类、含量、配比的分析可以 区分 艮多的蛋白质。最常用的方法是5 7n 盐酸( 恒沸点盐酸) 在1 1 0 c 下水解2 4 小时，并常在水解时加入抗氧化剂如巯基乙酸以防止某些氨基酸侧链的破坏( 如 t 、r ，t r p ，i v l e t 等) 。有时在水解和色谱分析前可以将某些氨基酸转变成其衍生物再 1 0 华中科技大学博士学位论文 遽行分罄芎，魏耀还藤裁楚遴转交魏氨酸或两个半魏氨酸，然轰将拳璇氨酸熬蘸蓥烧 化：或使用过甲酸氧化将半胱氨酸和甲硫氨酸转化成其氧化型等。离子交换色