（生物医学工程专业论文）结合纳米技术的细菌检测分子生物传感器的研究.pdf

浙江大学博士学位论文 0 1 5 7 ：h 7d n a 检测的电化学传感器。创新性地提出基于t a qd n a 聚合酶延伸杂 交的新方法，大大增强杂交复合体对纳米孔中离子电流的阻碍效果。该纳米孔膜 电化学传感器设计新颖，可以结合微电子加工技术实现微型化和集成化 关键词：免疫生物传感器，d n a 生物传感器，分子传感器，纳米生物技术，大 肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ，石英晶体微天平，电化学检测 a b s t r a c t e s c h e r i c h i ac o i l0 1 5 7 ：h 7i so n eo ft h em o s td a n g e r o u sf o o db o r np a t h o g e n s ， a n dt h ei l l n e s sd u et oi t si n f e c t i o ni so f t e nm i s d i a g n o s e da n dg e n e r a l l yn e e d si n v a s i v o a n de x p e n s i v em e d i c a lt e s t sb e f o r ei ti sc o r r e c t l yd i a g n o s e d t h ei n f e c t i o u sd o s eo f t h i sb a c t e r i u mi s p o s s i b l yf e w e rt h a n1 0 0o r g a n i s m s ，a n dp r i m a r ys o u r c e sf o r e x p o s u r e t oi ti n c l u d e c o n s u m p t i o no fg r o u n d b e e f , s p r o u t sl e t t u c e ，s a l a m i ， u n p a s t e u r i z e dm i l l 【a n dj u i c ec o n t a m i n a t e db yp a t h o g e n s t r a d i t i o n a lm e t h o d sf o r d e t e c t i o no ft h i sb a c t e r i u mi n v o l v ep l a t i n ga n dc u l t u r i n g , e n u m e r a t i o nm e t h o d s , b i o c h e m i c a lt e s t i n g , m i c r o s c o p y , a n df l o wc y t o m e t r y , b u tt h e s em e t h o d sh a v en o t b e e ns a t i s f i e dw i t ht h en e e d so fr e a la p p l i c a t i o n s i n c et h el o s sc a u s e db y 最c o l i 0 1 5 7 ：h 7i se n o r m o u si nt e r m so fm e d i c a lc o s ta n dp r o d u c tr e c a l l ，i ti se x t r e m e l y u r g e n tt od e v e l o ps o m er a p i da n ds e n s i t i v em e t h o d st od e t e c tt h i s 垴n do fb a c t e r i ai n f o o do rw a t e r s u p p l i e s o u rr e s e a r c hh a sd e v e l o p e ds o m em o l e c u l a rb i o s e n s o r sf o r0 1 5 7 ：h 7d e t e c t i o n b a s e do nt h ei m m u n o r e a c t i o na n dd n a h y b r i d i z a t i o ns e n s i n g f i r s t l y , w ea d o p t e dt h e q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c 旧i n t e g r a t e dw i t ht h es e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) a n da d v a n c e dn a n o b i o t e c h n o l o g i e st of a b r i c a t et h eq c mi m m u n o b i o s c n s o r a n dq c md n a b i o s e n s o r s e c o n d l y , i no r d e rt oe x p l o r et h en o v e ls e n s o ra n di m p r o v e t h es e n s i n gm e c h a n i s m , w es u c c e s s f u l l yd e v e l o p e dt h e9 0 l ds e r s o ra r r a ya n da n e l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o rb a s e do na l u m i n u ma n o d i z e do x i d e ( a a o ) n a n o p o r e m e m b r a n e s 硒em a j o rc o n t n b u t i o n so ft h i sd i s s e r t a t i o na r cs u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 1 n h cs e n s i t i v ea n dr a p i dd e t e c t i o no fec o i l0 1 5 7 ：h 7w a sr e a l i z e db yt h eq c m i m m u n o b i o s e n s o rp r o c e s s e d0 1 1t h eh o m e - m a d ed e t e c t i o ns y s t e m ap o l y e l e c t r o l y t c l a y e r - b y - l a y e rs e l f - a s s e m b l y ( l b t s a ) m e t h o dw a sp r o p o s e df o rr a p i ds u r f a c e m o d i f i c a t i o n , w h i c hh a ds h o r t e nt h ef a b r i c a t i o nt i m eo ft h ei m m u n o b i o s e n s o r za g o l dn a n o p a r t i e l e - e n h a n c e do c md n a b i o s e n s o ri s o p e r a t e db yt h e f l o w a n d i n j mm e t h o d t h ei n n e ra un a n o p a r t i c l e sw e r ei m m o b i l i z e do n t ot h e t h i o l e ds u r f a c eo ft h ea ue l e c t r o d e ，t h e nm o r es p e c i f i ct h i o l a t e ds i n g l e - s t r a n d e dd n a 进 浙江大学博士学位论文 ( s s d n a ) p r d b 髓c o u l db ef i x e dt h r o u g ha u s hb o n d i n g t h eo u t e ra v i d i n - c o a t e da u n a n o p a r t i c l e sc o u l dc o m b i n ew i t ht h et a r g e td n a t oi n c r e a s et h em a s st h u sa m p l i f y t h e s i g n a l t h e w h o l e p r o c e s s h a si n d i c a t e dt h a tt h ec o m b i n a t i o no f n a n o b i o t e c h n o l o g i e sa n db i o s e n s i n gi sap o w e r f u lm e a n s t oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo f b i o s e n s o r 3 an o v e le l e c t r o c h e m i c a li m m u n o b i o s e n s o rw a sd e v e l o p e df o rr a p i d m u l t i c h a n n e ld e t e c t i o no fec e l l0 1 5 7 ：h 7b a s e do ng o l de l e c t r o d ea r r a y t h ee f f e c t o fs e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) a n dt h eb a c t e r i al a y e r so nt h ee l e c t r o c h e m i c a l p r o p e r t i e so ft h ee l e c t r o d e sw e r eq u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e di nt e r m so fc o n s t a n tp h a s e e l e m e n t ( c p e ) a n de l e c t r o nt r a n s f e rr e s i s t a n c eu s i n gp r o p e re q u i v a l e n tc i r c u i t t h e b i o s e n s o rc o u l dd e t e c ts i xd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fb a c t e r i aa tt h es a m et i m e ，w h i c h r e d u c e dt h ed e t e c t i o nt i m et oal a r g es c a l e w i t hg o o ds e n s i t i v i t ya n dh i g he f f i c i e n c y , t h i sg o l da r r a yc o u l db ei n t e g r a t e di n t os o m ee x i s t i n gd e t e c t i o ns c h e m e sf o rp a r a l l e l d e t e c t i o n 4 an a n o - b i o s e n s o rb a s e do ns i n g l e - s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) p r o b e f u n c t i o n a l i z e da l u m i n u ma n o d i z e d o x i d e ( a a o ) n a n o p o r e m e m b r a n e sw a s d e m o n s t r a t e df o rt h eb a c t e r i ad n ad e t e c t i o n a no r i g i n a la n dd y n a m i ch y b r i d i z a t i o n p r o c e d u r ew a sp r o p o s e di nt h ee x i s t e n c eo ft a qd n ap o l y m e r a s ea n dd n t p su n d e r c o n t r o l l e dr e a c t i o nt e m p e r a t u r e t h ep r o b es t r a n d sw o u l db e e x t e n d e da sl o n ga st h e t a r g e td n as t r a n d s ，a n dt h ec a p a b i l i t yt ob l o c kt h ei o n i cf l o wi nt h ep o r e sh a sb e e n p r o m i n e n t l ye n h a n c e db yt h ed o u b l e s t r a n dc o m p l e x t h i sd n a b i o s e n s o rc o u l dn o t o n l yh ea p p l i e df o rr a p i dl a b e l - f r e eb a c t e r i ad e t e c t i o n , b u ta l s ob ei n t e g r a t e di n t oa s e l f - c o n t a i n e db i o c h i pf o rv a r i o u ss s - d n a a n a l y s i s k e y w o r d s ： i m m u n o b i o s e n s o r , d n ab i o s e n s o r , m o l e c u l a r b i o s e n s o r , n a n o b i o t e c h n o l o g y ，e s c h e r i c h i a c o i l 0 1 5 7 ：h 7 ，q u a r t zc r y s t a l m i c r o b a l a n c e ， e l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i s 浙江大学博士学位论文 中英文缩略词表 肠出血性大肠杆菌 聚合酶链式反应 酶联免疫吸附分析法 自组装单层膜 石英晶体微量天平 微型机电系统 循环伏安法 电化学阻抗谱 常相位角元件 量子点 1 6 _ 巯基十六烷酸 1 - 乙基一3 一( 3 一二甲基氨丙酸) 碳二亚 胺 n 羟基琥珀酰亚胺 聚乙烯亚胺 聚丙烯酸 磷酸缓冲液 层层自组装 1 ，昏己二硫醇 透射电子显微镜 3 氨基丙基三甲基硅烷 扫描电子显微镜 e n t e r o h e m o r r h a g i ce s c h e r i c h i ac o l i ，e h e c p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，q c m m i c r oe l e c t r o - m e c h a n i c a ls y s t e m s , m e m s c y c l i cv o l t a m m e t r y , c v e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y , e i s c o n s t a n tp h a s ea n g l ee l e m e n t , c p e q u a n t u md o t s , q d s m h d a e d c n h s p o l ye t h y l e n i m i n e ，p e i p o l ya c r y l i ca c i d ，p a a p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ，p b s l a y e r - b y - l a y e rs e l f - a s s e m b l y , l b l - s a 1 , 6 - h e x a n e d i t h i o l t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t e m 3 - a m i n o p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e ，a p s s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，s e m 1 铝 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝婆盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权澎鎏盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月 日 签字同期：年月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址l 3 电话： 邮编： 1 1 引言 第一章绪论 大肠杆菌在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群，正常情况下一 般不致病，在肠道内可部分抑制肠道致病菌和其他病原体的繁殖，并能产生某些 维生素供机体需要，对维持肠道微生态起重要作用。但它又是条件致病菌，迄今 为止，能引起人类和动物腹泻的大肠杆菌一般分为价群：在小肠定位繁殖并 产生毒素而引起霍乱样腹泻的产肠毒素大肠杆菌( e n t e r o t o x i g e n i ce s c h e r i c h i ac d 以简称e t e c ) ；具有与痢疾杆菌同样毒力，可侵入到大肠上皮细胞。形成局部 炎症和溃疡的侵袭性大肠杆菌( e n t e r o i n v a s i v ee s c h e r i c h i ac o l i 简称e i e c ) ：肠 致病性大肠杆菌( e n t e r o p a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o l i 简称e p e c ) ：可引起出血性 肠炎的肠出血性大肠杆菌( e n t e r o h e m o r r h a g i ce s c h e r i c h i ac o l i 简称e h e c ) 。 感染e h e c 除能导致出血性结肠炎( h a e m o r r h a g i cc o l i t i s ，h c ) ，还可引起溶血 性尿毒综合症( h a e m o l y t i cu r e m i cs y n d r o m e ，h u s ) 、血栓性血小板减少性紫癜 ( t h r o m b o c y t o p e n i cp u r p u r a ，t r p ) 以及死亡，尤其儿童和老年人感染后的病症更为 严重。该菌能表达志贺毒素( s t x ) ，可导致上皮细胞的粘附与消除( a t ：a c h i n ga n d e f f a c i n g ，a e ) 病变，并具有编码溶血素等毒力因子的6 0 - m d a 质粒。 大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 是e h e c 的一个主要菌型自1 9 8 2 年美国首次发现因该 致病菌引起的食物中毒以来，e h e c0 1 5 7 ：h 7 疫情开始逐渐扩散和蔓延相继在 英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻暴发和流行( r i l e y1 9 8 3 ；w h o1 9 9 6 ； 、 c d c1 9 9 9 ；b l a n c oe ta 1 2 0 0 3 ；b o l d u ce ta 1 ，2 0 0 4 ；s u t c l i f f ec ta 1 ，2 0 0 4 ) 2 0 0 5 年4 月6 日，日本再度发生病原性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 集体感染事件，到1 5 日为止已 有1 2 5 人受到感染( h t t p ：w w w f o o d m a t e n e t ) 。我国自1 9 9 7 年在一定范围内开展 监测工作以来，已陆续有十余个省份从市售食品、进口食品、家畜家禽和腹泻病 患者身上分离出大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ，特别是1 9 9 9 年我国江苏、安徽省等地区暴 发流行0 1 5 7 ：h 7 感染性腹泻患者超过2 万例，死亡1 7 7 例，流行时问7 个月 这表明大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的感染已成为威胁人群健康的重要公共卫生问题，必 须引起高度重视( 侯美英，2 0 0 2 ) 。 5 浙江大学博士学位论文 1 2 大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的特性 1 2 1 生物学特性 大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 属革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。 其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。形态见图1 1 。 图1 1 人肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 形态图 最适生长温度为3 3 4 2 0 c ，3 7 0 c 繁殖迅速，4 4 4 5 0 c 生长不良，4 5 5 0 c 停止 生长。其具有较强的耐酸性，p h 2 5 3 0 ，3 7 。c 可耐受5 小时：耐低温，能在冰 箱内长期生存：在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，7 5 。c1 分钟即被灭 活；对氯敏感，可被l m g l 浓度的余氯杀灭。 生化反应与大多数大肠杆菌没有区别，均能快速发酵乳糖。甲基红、靛基质 阳性：氧化酶、侧金盏花醇、v p 、尿素、西蒙氏枸橼酸盐阴性，0 f 试验为f ， 硫化氢阴性，还原硝酸盐，鸟氨酸脱羧酶阳性，赖氨酸脱羧酶阳性。但有较大差 异的是0 1 5 7 ：h 7 多不发酵或迟缓发酵山梨醇和鼠李糖，而其他大肠杆菌9 5 的菌株为阳性( m a r c ha n dr a t n a m ，1 9 8 6 ；c h a p m a n1 9 9 1 ) 。k r i s h n a n ( k r i s h n a n1 9 8 7 ) 和h a l d a n e ( h a l d a n ee ta 1 ，1 9 8 6 ) 分别报道了2 4 株和3 7 株0 1 5 7 ：h 7 菌的生化结果， 其山梨醇均为阴性，而赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、棉子糖和卫矛醇均为阳性， 故以这5 种生化特性作为0 1 5 7 ：h 7 与普通大肠杆菌的鉴别要点。但叶青( 叶青 6 第一章绪论 等，2 0 0 0 ) 分离的0 1 5 7 ：h 7 中2 株为山梨醇阳性、棉子糖阳性，1 株卫矛醇阳性，说 明有的菌株已经发生变异，其部分生化反应也不完全一样。 1 2 2 流行病学特性 ( 1 ) 季节性：多发生于夏秋两季，7 8 月为发病高峰。1 1 月至次年2 月极 少发病。 ( 2 ) 地区分布：多发生于发达国家，主要以散发性感染为主。 ( 3 ) 年龄分布：儿童与老年人的发病率明显高于其他年龄组。最易分离到大 肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的年龄为5 9 岁( o 9 ) 和5 0 。5 9 岁( o 8 9 ) 。( 4 ) 贮存宿主：农场动物，尤其是反刍动物，构成大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 在世界 范围内的主要贮存宿主其中牛的流行范围为0 1 1 6 ，同时羊、猪、鸡、马、 鹿、鸽子、海鸥等动物也均可能为病源携带者 ( 5 ) 传播途径：大肠杆菌的感染可形成直接传播( 动物_ 人，人_ 人) ，也 可以通过间接传播( 食物、水源- 人) 食源性的e h e c 感染中，牛肉、生奶、 鸡肉及其制品，蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染。其中，牛肉是最主要的 传播载体。 ( 6 ) 感染剂量：极低，对人的致病力特强，每次摄入1 0 个活菌就会发病， 而一般的大肠杆菌致病需1 0 6 个菌以上( 于恩庶，1 9 9 7 ) 。潜伏期为3 - 1 0 天，病程 2 - 9 天。通常感染者突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，可 发热或不发热，严重者可导致死亡。 1 3 大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的检测技术 国内外现有的大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 检测方法主要有以下几类：常规培养，分 子生物学检测，免疫学检测以及近年来逐渐引起人们兴趣的生物传感器 1 3 1 常规培养 由于0 1 5 7 ：h 7 绝大多数不发酵或缓慢发酵山梨醇，利用这个特点m a r c h 与r a t n a m ( m a r c ha n dr a t n a m , 1 9 8 6 ) 推荐了一种山梨醇麦康凯琼脂培养基 7 浙江大学博士学位论文 ( s m a c ) ，即把麦康凯琼脂中的乳糖换成1 的山梨醇。3 7 。c 培养1 8 , - 2 4 h 后不发 酵山梨醇的菌落呈无色半透明( 图1 2 ) ，而一般大肠杆菌因发酵山梨醇产酸而呈 现红色菌落。此方法简单、直观，但有些非0 1 5 7 ：h 7 大肠杆菌及其它一些革兰 氏阴性菌特别是变形杆菌属( p r o t e u ss p p ) 也会呈现无色菌落。头孢克肟( c e f i x i m e ) 为第三代头孢菌素类抗生素，其对其它大肠杆菌和变形杆菌有较强的抑制作用， 对其它大肠杆菌、气( 邻) 单胞菌、郝曼氏大肠杆菌、摩根氏菌和普罗非登斯菌具 有抑制作用，采用4 1 c 增菌可以排除杂菌生长( d o g a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。c h r o m a g e r 琼 脂是第二代显色培养基，一般大肠杆菌培养后呈兰色，鸡沙门氏菌呈浅紫红色， 鼠伤寒杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌呈无色菌落，而0 1 5 7 ：h 7 大肠杆菌培养后 呈紫红色，菌落颜色持久，4 c 冰箱中数月不变( 俞顺章等，1 9 9 9 ) ，已成为一种特 异的筛检培养基。由于0 1 5 7 ：h 7 具较强致病力，少量细菌便可引起感染，因此 为提高检出率，需在分离培养前作增菌培养。另外，培养法虽然简单、费用低廉， 但不能辨别某些发酵山梨醇的变异菌株，且敏感性、特异性不高，费时、费力，因 此只可用于样品初筛。 图1 2 犬肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的培养：( a ) 朱接种的琼脂平板；( b ) 接种后生长的菌落 1 3 2 分子生物学检测 1 3 2 1 聚合酶链式反应( p c r ) p c r 技术对感染性疾病的分子生物学诊断是一项快速和有效的技术，从单 一p c r ，到多重p c r ，套式p c r 等，该技术在0 1 5 7 ：h 7 检测中的应用非常广 泛。p c r 技术检测细菌的基本原理是应用细菌遗传物质中各菌属、菌种高度保 8 第一章绪论 守的核酸序列，设计出相关引物，对提取到的细菌核酸片段进行扩增，进而用凝 胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果( 侯美英等，2 0 0 2 ) 。 早期只采用一对引物扩增毒素基因，或编码h l t h 一n i n 蛋白的e a c a 或l l l y a 基因，m e n g 等( m e n g e ta 1 ，1 9 9 8 ) 以e a e 基因5 末端附近一段6 8 8 b p d n a 片段( 此 片段编码一个1 5 6 个氨基酸的功能不明的多肽) 为基础设计了一对引物，扩增产 物为6 3 3 b p 的d n a 片段。其退火温度为6 0 c 6 3 c ，检出限为5 p g 。徐建国等( 徐 建国等，1 9 9 5 ) 根据e h e c 特有的h l y a 、b 基因序列设计了p c r 引物，产物为 3 3 8 b p 。由于鉴定0 1 5 7 ：肿血清型不能仅仅依靠简单p c r ，鉴定致病性0 1 5 7 ： h 7 ，还须检测0 1 5 7 、h 7 抗原和v t 毒素，因此目前多应用多重p c r ( n a g a n o e ta 1 ， 1 9 9 8 ；t o u r o ne ta 1 ，2 0 0 5 ；k i l ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。实时p c r 的检测非常迅速，它通过被 修饰上荧光染料的扩增产物所发出的荧光强度来确定扩增产物的浓度，可以避免 凝胶电泳的检测( c a d ye ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 在检测大肠杆菌方面的研究中，科研人员尝试应用各种不同类型的p c r 技 术来达到更好的检测效果。和常规培养相比较，这些p c r 方法一般都可以在5 2 4 h 内得出检测结果，但是这并不包括前面细菌富集和d n a 提取步骤的时间。同时， p c r 检测的另一个局限性就是检测者无法判断样本中检测到的细菌是否依旧存 活，因为无论细菌是死亡还是存活，其遗传物质d n a 都是始终存在的。因此， 逆转录p c r ( r t - p c r ) 逐渐被发展用于活菌的检测( y a r o n ，2 0 0 2 ) ，弥补了这一不 足虽然p c r 检测的灵敏度较高，但是假阳性、容易被污染、操作相对较复杂以 及仪器昂贵等问题一直都是研究者们面临的难题。由于大肠杆菌的种类多，针对 所有大肠杆菌的共同基因片断难以确认，目前该技术主要是针对特定类型的大杆 菌基因检测。 1 3 2 2d n a 探针 目前0 1 5 7 ：h 7 特异的噬菌体上s l t l 、i i 基因、大质粒溶血素基因及染色体上 e a e 基因等都已制成了可杂交检测的特异探针( s h a r m ac ta 1 1 9 9 9 ；y o s h i t o m ie ta 1 2 0 0 3 ) 该菌的毒力大质粒经h i n d 酶裂解，获得一段3 3 k b 的c v d 4 1 9 片段，经 标记后成为大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 特异性d n a 探针，检测的特异性9 9 8 ，敏感性 9 9 ，该探针已被国际公认，在世界上多数实验室使用，成为鉴定e h e c 菌株的 9 浙江大学博士学位论文 关键指标。目前已从放射性3 2 p 标记发展为荧光标记探针，更方便，并避免了同 位素对人体的伤害。国内徐建国( 徐建国等，1 9 9 5 ) 根据溶血素h l y a b 基因序列设计 了鉴定e h e c 的特异d n a 探针，敏感性和特异性达9 9 。但是单一检测上述基因 在e h e c 、e t e c 及非致病性大肠杆菌和其他细菌中也可能出现阳性结果，不足以 区分0 1 5 7 ：h 7 ( w a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 3 2 3 基因芯片 基因芯片( g e n ec h i p ) ，又称d n a 芯片，是指将多个特定的寡核苷酸片段或 基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物( 硅片、玻片、塑料片) 上，然后 与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，通过激光共聚焦荧光检测系 统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检 测。从而迅速得出所要的信息。近年来该技术又常被称作d n a 微阵列( d n a m i e r o a r r a y ) 或d n a 微阵列芯片，基因芯片技术是高效地大规模获取相关生物信息 的重要手段。 快速特异地鉴别食源性肠道病原体特别是0 1 5 7 ：h 7 是流行病和食品卫生监 督的迫切需要，随着前述的基因探针和p c r 技术在0 1 5 7 ：h 7 诊断中的发展，基 因芯片也开始应用于0 1 5 7 ：h 7 ( j i ne ta 1 ，2 0 0 5 ；k i mc ta 1 ，2 0 0 7 ) 。c a l l ( c a l le ta i ， 2 0 0 1 ) 将0 1 5 7 的4 种毒力因子( i n t i m i n ，s l t ia n di i ，h e m o l y s i na ) 的2 5 3 0m e r 寡 核苷酸探针固定在玻片上，模板d 眺择整个细胞或纯化的d n a 或多重p c r 扩 增的d n a 与之杂交，该方法比凝胶电泳法的灵敏度提高3 0 倍，可以检测小于一 个细胞的基因组d n a 的量的p c r 扩增产物( 1 f g ) 。金慧英等( 金慧英等，2 0 0 3 ) 利用0 抗原特异合成酶基因，将p c r 产物与芯片上的特异探针结合，检测0 1 5 7 菌体抗原， 不仅减少了p c r 检测可能出现的假阳性，而且灵敏度比p c r 检测提高了5 0 倍，体 现了芯片检测的高特异性和高敏感性；同时采用了已知序列的阳性探针作内掺， 可以方便地对扫描结果进行判定，使得芯片检测更简便。基因芯片技术的发展， 为鉴别诊断大量肠道病原菌及多个标本的同时检测提供了可能减少了工作量， 缩短了诊断时间，该技术有利于建立快速灵敏的细菌病原体特征和鉴别诊断的自 动分析系统，具有广阔的应用前景。目前关于检测大肠杆菌的基因芯片主要用于 医学领域，集中在致病性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 等的细菌检测，在环境监测领域中应 1 0 第一章绪论 用的较少。 1 3 3 免疫学检测 免疫检测技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应，通过检测标记在反应物 上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。根据标记物质 的不同，目前用于检测大肠杆菌的免疫检测方法主要有以下几种。 1 3 3 1 酶免疫分析技术 酶免疫分析( e n z y m ei m m u n o a s s a y ，e i a ) 在环境领域中应用较为广泛，其中， 酶联免疫吸附分析法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 是最常用的 测定方法。该方法操作简单，特异性强，迅速灵敏，在大肠杆菌的快速检测中应 用较多( b a ie ta 1 ，2 0 0 7 ；n y q u i s t b a t t l ee ta 1 ，2 0 0 7 ) 。p a r k 等( p a r kc ta 1 ，1 9 9 6 ) 采用 多克隆抗体的e l i s a 试剂盒来检测粪便中的大肠杆菌0 1 5 7 ，并与传统的麦康凯 培养基法进行对比，试剂盒的灵敏度及特异性分别为9 1 2 和9 9 5 ，传统法的 灵敏度及特异性分别为8 2 4 和1 0 0 。孙克江( 孙克江等，2 0 0 1 ) 等应用酶联免疫 吸附试验检测0 1 5 7 ：h 7 ，并与常规培养法进行比较，得到的结果检出率较高，敏 感性较强。e l i s a 检测方法操作简单，灵敏度高，但是对于检测所有血清型的 大肠杆菌需要广谱抗体( b r o a ds p e c t r u ma n t i b o d y ) ，商品化的试剂盒可靠性需进一 步检验，标准尚不统一，因此其商品化受到了很大的限制 1 3 3 2 荧光免疫测定技术 荧光免疫测定( f l u o r e s c e n ti m m u n o s s s a y ，e i a ) 是以荧光素作为标记物，将 免疫反应的特异性与灵敏性结合，通过荧光分光光度计测量荧光强度，推算待测 物质的浓度。这种技术已被广泛应用。针对其容易被高背景干扰的缺点，时间分 辨荧光免疫分析( t a f l 久) 技术得到了快速发展y u 等o ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 利用该法 来检测苹果酒中的大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ，可在6h 内检测出大肠杆菌 0 1 5 7 ：h 7 ( 1 0 l 1 0 5c 刑m l ) 该法超过了放射性同位素标记所能达到的灵敏度。 且还具有标记物制备方便，储存时间长，无放射性污染，检测重复性好，操作流 浙江大学博士学位论文 程短，标准曲线范围宽，应用范围广泛等优点，是一种新型的免疫标记分析手段， 具有广泛的发展空间。 1 3 3 3 其他免疫分析技术 化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c u a ) 利用化学发光物 质作为标记物，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结 合进行检测。k o v a c s 等( k o v a c sa n dr a s k y , 2 0 0 1 ) 利用化学发光免疫分析法对牛肉 中的大肠杆菌0 1 5 7 进行了测定，敏感度达到1 0 3 - i 0 4 c f u m l t a g i 等( t a g ic t a 1 ，2 0 0 1 ) 利用化学发光免疫分析技术测定食品和水样中大肠菌群，可以在9h 内检 测到大肠杆菌( 1c f u m l ) 。化学发光免疫分析技术目前在环境领域中应用不多。 免疫胶体金标记技术( i m m u n o c o l l o i d a l 2 9 0 l dt e c h n i q u e i c o t ) 是以胶体金 作为示踪标志物，应用于抗原抗体的一种新型免疫标记技术。该法具有快速反应 的特点，但只能作为大肠杆菌的定性或半定量检测，较适用于一些致病性大肠杆 菌的检测。免疫磁珠技术( i m m u n o m a g n e t i cb c a d ，i m b ) 应用磁珠作为抗体载体， 通过抗体抗原结合在磁力作用下发生力学移动，而达到分离特异性抗原的目的。 该法虽然灵敏度不高，但是使用起来比较直接和方便。 1 3 4 生物传感器检测 生物传感器是一种集现代生物技术与先进的电子技术于一体的高科技器件 或装置，由生物识别元件与各类物理、化学换能器组成，用于各种生命物质和化 学物质的分析和检测。生物传感器融生物学、化学、物理学、信息科学及相关技 术于一体，已经发展成为一个十分活跃的研究领域( 王平等，2 0 0 5 ) 生物传感器中生物识别元件有酶、抗体( 抗原) 、微生物、细胞、动植物组织、 基因等；信号转换元件则包括电化学电极、半导体、光学元件( 如光纤、表面等离 子共振) 、热敏元件、压电装簧( 如石英晶体微天平、表面声波) 等。不同的生物 识别元件和信号转换元件组成了不同的生物传感器。它们的命名也因此而得来 其基本原理为：待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生 的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信号，再经仪表放 大和输出，从而达到分析检测的目的( 图1 3 ) 。 1 2 第一章绪论 豢 州帅e 磊 啪瞄唰 ； u s 豢；茹c e l l s 粥；t h 嚣e r m 8 俐融。u l 即t ?i ：”r 两眦a n t i b o c d 雹捌sd 暑a 出删z s t i c 蝴ei ； i 。钿咄，! 粤燮熙一薷翼? 置瞿黑，；卿缈哆岬卿啤 图1 3 生物传感器原理图 用于致病菌检测的生物传感器种类很多，在这方面的应用研究也在不断地 深入。据近2 0 年文献统计分析，生物传感器已经成为一种发展最迅速的细菌检 测技术，将引起人们越来越多的兴趣和关注( 图1 4 ) 。 b i o s e n s o r si st h ef a s t e s tg r o w i n gt e c h n o l o g y f o rp a t h o g e nd e t e c t i o n 盟 a 毫 j g 石 们 ，暑 芝 是 8 蔫 定 s o 。r c ei s i w e o o f s o e n o e 嚣2 5 0 ；蝴h 脚o n p a 口0 卿能嘲咖嗍l t e l a e l 2 0 膨l 图1 4 近二十年米关于生物传感器细菌检测的文献统计 1 3 4 1 主要生物识别元件和固定技术 当生物传感器用于细菌检测时，主要应用了三种生物识别元件，它们分别是 酶、抗体和d n a ( 匿 i 5 ) 。其中，酶一般修饰在抗体( k oa n dg r a n t ，2 0 0 3 ) 或是d n a 探针( l u c a r e l l ie ta 1 ，2 0 0 4 ) _ l ，通过作用底物来放大信号，因此它更类似于一种标 1 3 浙江大学博士学位论文 记物而不是实际的细菌识别元件。 图1 5 三种主要生物识别元件：( a