（农业昆虫与害虫防治专业论文）两种昆虫血淋巴抑制细胞凋亡及几种caspases活性及其关系的初步研究.pdf

蒜参擘镬稔藏 磁 渤悠掰噶1 ：l 狂添璃， 摘要 细胞凋亡是当前生命科学研究中最热门的领域之一，哺乳动物细胞凋亡的机制 已经有比较深入的研究，可是昆虫细胞凋亡仍有很多问题有待研究。本文对昆虫细 胞凋亡有关方面进行了探讨和研究。 l 两种昆虫血淋巴抑制s l - 1 细胞凋亡 本实验采用心i 染色、流式细胞仪、荧光定量分光光度法、w r e s t 锄b l o t t i n g 等 方法检测了凋亡细胞形态学变化、细胞凋亡率、c a s p 舔争3 活性及细胞色素c ( c y tc ) 的释放，研究了甜菜夜蛾和棉铃虫血淋巴分别对放线菌素d 诱导和病毒诱导的s 1 1 细胞凋亡的抑制作用。 采用分别含有不同浓度的甜菜夜蛾和棉铃虫血淋巴( 1 、3 、5 哆幻的g r a c e s 培 养基( 5 胎牛血清) 处理s l 一1 细胞1 小时，然后用终浓度为2 0 0 n 酌1 1 1 的放线菌素d 处 理细胞，置2 8 恒温培养箱中培养2 4 小时，d a p i 染色结果表明两种昆虫血淋巴均 能抑制凋亡小体的形成，随着昆虫血淋巴浓度的增加，抑制效果越明显。流式细胞 仪检测细胞凋亡率，结果表明昆虫血淋巴明显抑制了细胞的凋亡，昆虫血淋巴浓度 与细胞凋亡率呈负相关。为了进一步证明昆虫血淋巴对细胞凋亡的抑制作用，我们 检测了a c t d 诱导的s 1 1 细胞凋亡中c a s p 弱e 3 活性的变化及细胞质中c y tc 的变化。将 细胞置于含5 甜菜夜蛾血淋巴和5 棉铃虫血淋巴的培养基分别培养1 小时，再用放 线菌素d ( 2 0 0 n 幽 1 1 1 ) 处理s 1 1 细胞2 4 小时后，制备细胞裂解液成份，然后用人工合成 的c a s p a s e 一3 特异性荧光底物a c d e v d a f c 进行酶切反应，荧光分光光度法检测结 果表明两种昆虫血淋巴均能明显抑制c a s p a s e 3 的活性，并且甜菜夜蛾血淋巴的抑制 作用比棉铃虫血淋巴的抑制作用明显。w e s t e mb l o t t i n g 检测细胞质中c y tc 的变化， 结果表明在a c o 诱导的s 1 1 细胞凋亡中存在着c y tc 的释放，两种昆虫血淋巴对c y tc 的释放有明显的抑制作用，并且甜菜夜蛾血淋巴比棉铃虫血淋巴的抑制作用更明 显。同时，用病毒处理细胞后检测c a s p a s e 一3 活性，结果显示两种昆虫血淋巴同样抑 制了c a s p a s e 3 的活性。这些结果表明，两种昆虫血淋巴不仅能够抑制放线菌素d 诱 导的s 1 1 细胞凋亡，而且能够抑制病毒诱导的细胞凋亡。因此，昆虫血淋巴抑制细 胞凋亡可能具有广泛性。 2a 啪v 诱导的s l 一1 细胞凋亡中几种c a s p 嬲e s 活性及其关系 本实验以杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡，检测了c a s p 弱e 一3 、c a s p 私e 8 和c a s p 嬲e 9 的活性及其关系，结果表明c a s p 弱c 8 特异性抑制剂z m t n 胍不能抑制细胞凋 亡以及c a s p 弱e 3 的活性，而c a s p 硒c - 9 特异性抑制剂z l e 皿咖【能够抑制细胞 囊| 要害霎鬻，萎 鏖墨姿藿葫墓；叁霪霎塞；匡舂霉；塞蠢萋垂| 蓁耋霎。 r 薹i 萋! 茎枣蓁= 蓁霉霉霉囊冀i 耄霪薹蚕。匿；! ；! 蒌l i i 箩垂垂甏蓍墅霎萋薹；国藿i 雾霎，y y 篓萎薹! ! 琴| 妻霎薹茎三乏i 雾j 蓬 蚕莛蓁l 蓁雠莛妻亘l 垦蓬霉i 羹荔囊髀g 秦至蚕垦l 匿羹蓑蚕羹；冀；蠢蓄冀善翔警、耋蓁i 霾熏熏羹誊羹堇蕈蓁前_ 荔砉i 霎辇事妻：耄拿霎妻蠖雾一雾蓑雾； 薹霎i 卤薹薹薹囊薅薅薹i 鼠 孽譬耋妻苎雪薹冀；童羹些l 硅；誓雾譬：霎薹勇用霎蠹萋耄主；萋霉萋霎车囊毒i i 矍囊蹦薹薹麦 l 喜茎篓垂季| i | 蓁璧霎薹鏊旃；圣皤羹雾i 粪篓星霪毒i i 妻藿墓室翟藿! 霪摹季耥 苎；争霆鸶；i b l 趸譬燮萎| 羹i | 雾雾；l l 。 雾! 薹! 警霎茎耋i 蠢蚕蓥萋；霎霉霉菲；i 暮| 蓁蓁一薹莩 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：日期：力赵年s 月弓口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：彦任 日期：辨歹月矽日 导师签名： 日期：砂 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c 札i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相 作着签 日期： 日 面糖链、植物血凝素及蛋白受体亦增多，电泳迁移率降低，膜不对称性丢失，磷脂酰 丝氨酸，n - 己酰氨基葡萄糖等残基暴露，便于吞噬细胞识别。凋亡过程中细胞膜一 直保持完整，胞内容物未泄漏，故不引起周围的炎症反应。有的凋亡过程，依赖 鼢队和蛋白质的合成，并受基因调控。 1 1 2 细胞凋亡与细胞坏死的区别 根据起源、性质和生物学意义可将细胞死亡分为六种不同的类型，即程序性细 胞死亡( p r 0 舯衄e dc e l ld e a m ) 、细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 、自体吞噬( a u t o p h a g y ) 、 细胞坏死( n e c r o s i s ) 。大多数学者认为前三种死亡类型不引起炎症反应，统称为细 胞凋亡或程序性细胞死亡。后三种死亡类型会引起炎症反应，统称为细胞坏死。 细胞凋亡和坏死在形态和生物化学特征上有着显著的区别。表1 列举了其主要 区别。 表1 细胞凋亡与细胞坏死的区别 1 1 3 细胞凋亡发生特点 细胞凋亡常见于：胚胎器官发育的过程中；成熟老化细胞的新老交替； 淋巴细胞增殖、分化过程中的免疫选择；激素依赖性器官因激素撤除后；一 些病理性或外源性因素诱导( 高温、放射线、缺血、缺氧、动植物的抗宿主反应、 细胞毒性t 淋巴细胞、抗癌药等) ；肿瘤发生发展过程中。 2 1 1 4 细舱凋亡的重要性 多年来，对细胞凋亡的研究主要集中在神经系统及肿瘤发生上，在无脊椎动物 细胞凋亡尤其是昆虫细胞凋亡的研究较少，但近年来其越来越受到人们的重视。在 正常情况下，凋亡在脊椎动物和无脊椎动物生物器官中均起到重要作用。凋亡最大 的优点之一便是在凋亡发生过程中，细胞膜保持完整，从而避免细胞内容物向胞间 内环境的释放而造成的炎症反应。在发育过程中如组织退化或重塑时，凋亡现象非 常明显。实际上，发育过程中手和足的成形过程就伴随着细胞的凋亡。胚胎时期， 它们呈铲状，以后指或趾之间的细胞凋亡，才逐渐发育为成形的手和足。凋亡在几 乎所有组织的正常细胞中也很重要，特别是具有高代谢率的组织中，例如皮肤、消 化道上皮以及血液和淋巴系统等。一个健康的成人体内，在骨髓和肠中，每小时约 有1 0 个细胞发生凋亡。凋亡对脊椎动物免疫系统功能的维持也很重要，在免疫系统 中，细胞毒性t 细胞的杀灭及记忆行b 细胞的筛选均涉及凋亡过程。细胞凋亡在无脊 椎生物许多其它过程中同样具有重要作用。昆虫从卵到成虫，中间要经过几个蜕变 期，每个时期组织结构以及外形都要发生改变，在这些过程中均有赖于新旧细胞的 生死交替。死亡的细胞是在完成了它的使命之后而被淘汰的，天然有序。蝌蚪变成 蛙时，尾巴自然消失，这种消失的机制是细胞有序凋亡的过程。还有组织内环境的 稳定，以及防御病原微生物的侵袭等细胞凋亡都起到极其重要的作用。另一方面， 细胞凋亡的失调包括不恰当的激活或抑制会导致疾病。 1 2 昆虫血淋巴抑制细胞凋亡 1 2 1 昆虫血淋巴与细胞培养 昆虫血淋巴作为培养基补充成分在早期的昆虫组织培养中广泛使用。然而大量 获取血淋巴是困难的，在2 0 世纪6 0 年代，它成功地被胎牛血清、鸡蛋超滤液、火鸡 血清、甚至鸡血清所取代【3 羽。胎牛血清作为哺乳动物细胞培养物和在商业中的应用 促成它作为昆虫细胞培养的标准f 6 1 。实际上，胎牛血清的应用存在一些问题，包括 高昂的代价，因批次不同有很大变异而导致的不可重复生产，不确定的组分，支原 体污染的危险增加和由于高浓度蛋白的浓缩而造成下游过程的复杂化1 7 j 等。昆虫血 淋巴作为培养基在早期昆虫组织培养中的成功使用使它具有研究价值，特别是昆虫 血淋巴能抑制细胞凋亡的发现使其成为一个重要的研究点。 1 2 2 昆虫血淋巴抑制细胞凋亡 1 2 2 1 昆虫血淋巴的抑制细胞凋亡作用 一些关于血淋巴的实验，特别是关撕甜秘蠢羹巴褡羹蟪强鋈黜塑；霸磐嘉冀； 震割匪啪奏圣蓄墓蓁霾塞辇薹必霭磁圈燃粥鲤然而薹霪i 舞靖耕杉羹孺弦囊缠垂羹 蒸聚季琵奎孵。堑龠垂霞雾羹爨纛；鲥薹萎鍪羹羹简雾猫满篓塞i 羹一虫计骱涩薹 鲤襄羹薹商醚萋雾蓁驴耋生产薹重蓄烈塑墼i 蠢掣一薹虱堇囊菥灌为了生产人红细胞生成素，中国仓鼠卵巢细胞首先被培养在含有胎牛血清的培 养基( 生长培养基) 中，然后在一个含有丁酸钠的无血清培养基( 生产培养基) 中。丁 酸钠增加重组蛋白的生产，但也诱导细胞凋亡，从而减小细胞的存活力和生产力。 以前的研究表明家蚕血淋巴能够抑制昆虫和哺乳动物细胞凋亡。为了克服丁酸钠引 起的细胞凋亡，添加家蚕血淋巴到生长培养基中，这种处理增加了细胞的寿命和生 产人红细胞生成素的能力。结果表明，人红细胞生成素的生产力增加了5 倍。在这 个实验中发现家蚕血淋巴能抑制细胞色素c 从线粒体释放到细胞溶胶，并抑制 c a s p a s e 一3 的激活和其它随后的c a s p a s e 反应f 1 8 】。报道证明家蚕血淋巴抑制细胞凋亡 和增加在中国仓鼠卵巢细胞中生产重组人红细胞生成素的产量。在家蚕血淋巴中抑 制细胞凋亡组分是3 0 k d a 蛋自家族的一个成员。在此研究中，中国仓鼠卵巢细胞系生 产人红细胞生成素是在遗传学上操纵而表达3 0 k c 6 基因的，此基因编码家蚕血淋巴 中的3 0 妨a 蛋白。3 0 k c 6 基因的瞬时表达显著地抑制由血清诱导的细胞凋亡。研究者 建立了带有抗细胞凋亡特质的表达3 0 蛋沁6 基因的稳定的细胞系。3 沁6 基因的稳定表 达抑制由于血清诱导而导致的细胞凋亡，增加细胞密度达原来的5 倍，并使人红细胞 生成素的效价达到原来的1 0 倍。3 0 k c 6 基因的表达对细胞的生存力和生产力的提高 确有助益，是因为这个基因稳定的保持了线粒体的活性。3 0 k c 6 基因的表达有效的抑 制线粒体膜的去极化，接着平衡at p 的产生消耗【1 9 】。 1 3 c a s p a se s 家族 c a s p a s e s 是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸酶，c a s p 鹞e s 不仅是凋亡过程的起始 者，也是凋亡效应的执行者，同时对凋亡的形态起着重要的作用。 1 3 1 c a s p as e s 的特点 c a s p a s e 具有以下特点：它是一种半胱氨酸蛋白酶，半胱氨酸残基是其催化活 性所必需的：ca s p 硒e 在催化水解底物时，总是在天冬氨酸( a s p ) 残基的c 端裂解 底物，即吣p x肽键断裂；c 嬲p a s e 酶原的活性很低，需要切除氨基端的一段序列才 能被激活；活化的c a s p 弱e 能够特异地水解一套蛋白底物，从而导致细胞凋亡； 正常情况下，细胞 x 3 a 蛋白。3 0 圣沁6 基因的表达抑制细胞凋亡，可与家蚕血淋巴抑制细胞凋亡比较，说 明胞内的基因表达和外部的血淋巴添加都能抑制细胞凋亡。3 0 k c 6 基因的表达导致 c a s p a s e _ 3 在胞内活性的降低。然而，c a s p a s e 3 的体外分析结果显示3 0 k 七6 蛋白并不 抑制c a s p a s e 3 的活性。这说明3 0 k c 6 蛋白抑制细胞凋亡是通过作用在c a s p 弱e 3 的上 游事件上【17 1 。 为了生产人红细胞生成素，中国仓鼠卵巢细胞首先被培养在含有胎牛血清的培 养基( 生长培养基) 中，然后在一个含有丁酸钠的无血清培养基( 生产培养基) 中。丁 酸钠增加重组蛋白的生产，但也诱导细胞凋亡，从而减小细胞的存活力和生产力。 以前的研究表明家蚕血淋巴能够抑制昆虫和哺乳动物细胞凋亡。为了克服丁酸钠引 起的细胞凋亡，添加家蚕血淋巴到生长培养基中，这种处理增加了细胞的寿命和生 产人红细胞生成素的能力。结果表明，人红细胞生成素的生产力增加了5 倍。在这 个实验中发现家蚕血淋巴能抑制细胞色素c 从线粒体释放到细胞溶胶，并抑制 c a s p a s e 一3 的激活和其它随后的c a s p a s e 反应f 1 8 】。报道证明家蚕血淋巴抑制细胞凋亡 和增加在中国仓鼠卵巢细胞中生产重组人红细胞生成素的产量。在家蚕血淋巴中抑 制细胞凋亡组分是3 0 k d a 蛋自家族的一个成员。在此研究中，中国仓鼠卵巢细胞系生 产人红细胞生成素是在遗传学上操纵而表达3 0 k c 6 基因的，此基因编码家蚕血淋巴 中的3 0 妨a 蛋白。3 0 k c 6 基因的瞬时表达显著地抑制由血清诱导的细胞凋亡。研究者 建立了带有抗细胞凋亡特质的表达3 0 蛋沁6 基因的稳定的细胞系。3 沁6 基因的稳定表 达抑制由于血清诱导而导致的细胞凋亡，增加细胞密度达原来的5 倍，并使人红细胞 生成素的效价达到原来的1 0 倍。3 0 k c 6 基因的表达对细胞的生存力和生产力的提高 确有助益，是因为这个基因稳定的保持了线粒体的活性。3 0 k c 6 基因的表达有效的抑 制线粒体膜的去极化，接着平衡a t p 的产生消耗【1 9 】。 1 3 c a s p a s e s 家族 c a s p a s e s 是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸酶，c a s p 鹞e s 不仅是凋亡过程的起始 者，也是凋亡效应的执行者，同时对凋亡的形态起着重要的作用。 1 3 1 c a s p a s e s 的特点 c a s p a s e 具有以下特点：它是一种半胱氨酸蛋白酶，半胱氨酸残基是其催化活 性所必需的：c a s p 硒e 在催化水解底物时，总是在天冬氨酸( a s p ) 残基的c 端裂解 底物，即吣p x 肽键断裂；c 嬲p a s e 酶原的活性很低，需要切除氨 x 对正常细胞造成损伤。 1 3 2 c a s p 舔e 家族及其分类 迄今为止，至少有1 4 种哺乳动物的c a 印a s e 已被鉴定，除了鼠源的c a 印弱e 1 1 和 c a s p 弱e 1 在人体内还没有发现以外，其余在人体内都有相应的同源物。根据它们之 间大小亚单位序列的同源性，可分为3 组：炎症组：c a s p 弱c - 1 、4 、5 、1 l 、- 1 2 、 1 3 和1 4 。凋亡起始组：c a s p 蠲e - 2 、8 、9 和1 0 。凋亡效应组：c a s p 弱e 3 、_ 6 和7 。另有人依据种系发生分析的结果而分为3 个亚家族，c a s p 觞e 一1 亚家族： c a s p 勰c - 1 、4 、5 、1 1 、1 2 、1 3 和1 4 ；c a s p a u s e 一2 亚家族：只有c a s p 勰e - 2 一个成员； c a s p a s e - 3 亚家族：c a s p 2 u s e - 3 、一6 、一7 、一8 、一9 和- 1 0 。 除c a s p 硒e 1 4 以外，炎症组和起始组c a s p 弱e 酶原都含有长的原域。长原域中包 含有死亡效应域( d e a me 腩c t o rd o m 如，d e d ) 或c a s p 勰e 招募域( c a s p a s e r e c r u j t l l l e n t d o m a i n ，c 蟠) 。d e d 和c 砧m 的结构与死亡域( d e a t l ld 嘞a i l l ，d d 都属于死亡域超 家族。这些区域通过在c a s p a s e 和衔接蛋白之间介导蛋白蛋白的相互作用而在 c a s p a s e 酶原的激活过程中发挥重要作用。效应组c a s p a s e 的原域很短，可能不介导 蛋白蛋白的相互作用。 图1 ：c a s p 舔e s 家族同源性 1 3 3 c a s p a s e 的结构 目前已经发现的c a s p 嬲e 酶原都具有一个分子量在3 0 一5 0 k d 之间、包括3 个区域的 结构：氨基端的原域q r o d o m a 哟、大亚单位( 约2 0 l ) 和小亚单位( 约1 0 k d ) 。在酶原 与酶原之间，原域的同源性低而大小亚单位的同源性很高。 活化的c a s p a s e 1 、3 和8 的三维结构为两个异二聚体( 大亚单位和小亚单位) 以 6 相对的方式形成一个四聚体。两个小亚单位在中间，大亚单位在外周。每个异二聚 体包含一个活性位点，由大小亚单位的氨基酸残基共同组成，它们对结合催化底物 来说都是必需的每个c a s p 嬲e 都有一个保守的活性位点，它是5 肽序列，即 g k 触a c y s - x g 1 y ( q a c x g ) ，x 为r 、q 或g 。q a c x o 含有一个c y s 残基，它是酶催 化活性所必需的。c 唧a s e 是特异性最强的蛋白酶之一，必须在天冬氨酸( a 印，d ) 残基之后裂解底物。由大小亚单位组成的底物结合槽，识别底物酶切位点n 侧的至 少4 个氨基酸残基口4 p 3 p 2 p 1 ) 。在酶的s l 位点，形成天冬氨酸结合槽的氨基酸残基 包括加管1 7 9 、g h 2 8 3 、a 喀3 4 l 和s 盼3 4 7 ，其中前两个来自大亚单位，后两个来自 小亚单位。a 唱1 7 9 和a 曙3 4 1 和底物p l 位点的天冬氨酸残基形成氢键，此氨基酸突 变将导致酶催化活性的丧失。形成s 2 和s 3 位点的氨基酸来自小亚单位，变化比较大， 这与c 砷a s e 对底物p 2 和p 3 氨基酸特异性没有严格限制相一致。c a s p a s e l 和 c a s p 雒e 一3 在s 4 位点的主要差异说明它们底物的特异性：c 弱p a s e 一1 是一个大而浅的疏 水性凹槽，而c 唧a s e 一3 是一个狭窄的口袋；这一结构特点分别与c a s p a s e 1 和 c a s p a s e 3 底物p 4 位点的t y 们却和舡p 相适应【删。 1 3 4 c 嬲p a s e 的激活 c a s p a s e s 在细胞凋亡中是如此的重要，我们要对细胞凋亡有一个正确的理解就 要求我们弄明白c a s p 硒e s 是如何被激活的。就像大多数酶一样，c 弱p 雒e s 是由没有 活性的酶原聚集而成，这些酶原具有3 个共同的结构区域：一个大亚基( p 2 0 ) ，一个 小亚基( p 1 0 ) ，和一个长度可变的原域0 t e n n i i l a m r o d o m a i n ) ，这些结构在成熟的酶 中可以被观察到。就目前的研究来看，成熟的酶是一个杂四聚体包含两个p 2 0 p 1 0 杂 二聚体和两个活性位点【2 l 】。尽管很多研究已经确定具有活性的c a s p a s e s 是二聚体并 包含两个活性位点，但是没有明显的结构原因证明它必须是这一结构，同时也无法 确定在某一特定情况下c a s p a s e s 必须以活性单体存在。到目前为止有三种可能的机 制来解释c a s p 弱e s 是如何激活的：上游c a s p a s e 引起的蛋白质级联反应；诱导结合； c a s p a s e s 重组。大多数c a s p 蠲e s 通过酶原在亚基p 2 0 和p 1 0 或者原域和亚基p 2 0 之 间的水解活化。有趣的是所有的分裂点多发生在天冬氨酸之后，暗示自身催化活化 的可能性【2 2 】。最简单的活化c a s p 嬲e 酶原的方法就是使期自身暴露给其他先前有活 性的c 唧a s e 分子。这种c 唧a s e 活化的“c a s p a s e 层叠 策略在细胞中被广阔的用在 c a s p a s c 3 ，c a s p 嬲e 6 和c a s p a s e 7 这3 种短前域的c a s p a s e 的激活中。这3 种下游的 效应c a s p 弱e 被认是c a s p 弱e 家族中任务最繁重的，它们通常比c a s p 弱e 家族中前域长 的c 唧a s e 含量丰富和活跃。c 唧弱e 级联是增加和整合凋亡前信号的一个有用的方 法，但是它不能解释第一个是怎样激活的，因为大多数上游c a s p 勰e 已经被激活了。 7 c 唧弱e 8 是引起死亡的关键c a s p 弱e ，在配体的连接处死亡受体如c d 9 5c a p 伊1 序哟 聚集并且形成跨膜传导信号的复合体，这些复合体通过一些c a s p 鹤e 8 酶原分子在 局部形成酶原高度集中。诱导的亲和发生在蛋白酶活性较低但c a s p 勰e 8 酶原足够能 使各种酶原分子相互激活并促使分裂的区域【2 3 1 。包括c a s p a s e 2 和线虫c a s p 筋e c e d 3 在内的其它一些c a 印雒e 也采用这种相似的激活方式。虽然在许多情况下被动 的聚集酶原来激活c a s p 弱e 的方式很有效，但是采用这种方法来决定一个细胞的死亡 是很不准确的，但另外水平的校准在微细环境中肯定存在。 到目前为止c a s p a s e - 9 的激活机制是最复杂的，不像其他c a s p 觞e ，c a s p 弱e 9 酶原 的水解对酶的激活仅有很小的作用阻，2 5 】。c a s p 筋e 一9 酶是一个含有其它蛋白质的一个 复杂体，其激活的关键要求是辅因子a p 啦! 蛋白的联合，c a s p 弱e 9 的激活必须a p 啦! 和细胞色素c 【2 6 。们。我们不能简单的把a p 啦l 看作是c a s p a s c 9 激活的催化剂，而是 c a s p 弱c - 9 酶的必需调整亚基。 总的来说c a s p a s e 效应器通常被上游的c a s p 私e 酶水解激活，起始c a s p 觞e 的激活 是通过蛋白质和蛋白质之间的相互作用来完成的，但是酶促活化起始c a s p a s e 的分子 机制到目前还不是很清楚，蛋白质和蛋白质之间的相互作用是细胞凋亡的潜在主 题。每一个c 唧a s e 的长原域多包含一个蛋白质与蛋白质相互作用的模块，这个模块 可以对上游c a s p a s e s 进行限制和结合。c a s p a s e 8 和1 0 包含一个致死域，c a s p a s e 2 和9 含有c a s p 雏e s 激活和募集补充域，这两个不同的域只有在次序上的稍微相同，但是 在其蛋白质四级结构上却很相似，包含六个反向的螺旋结构【3 1 】。在死亡域中也发现 同样的构象，第三个蛋白质交感模块出现在一些细胞凋亡的上游调节者中如c d 9 5 和f a d d 。这些似乎说明致死区域和c a s p a s e 激活和募集补充域有同一个结构域进化 而来。死亡域、致死区域和c a s p 弱e 激活和募集补充域的结构非常的于它们的功能相 适应，反向的螺旋结构深入到中心，表面暴露的是接触面结大并且结构精细的蛋白 质之间的交互感应的结构域，在这精细的表面进行一个接一个的各种蛋白质的交互 作用，这种结构似乎说明死亡调节通常是在家族内部发生的( 死亡域死亡域、致死 区域致死区域和c a s p a u s e 激活和募集补充域c a s p a s e 激活和募集补充域) 。然而结 构分析显示在死亡域、致死区域和c a s p a s e 激活和募集补充域上由充足的空间和其它 蛋白质进行反应，真正的死亡调节模块就像一个综合平台：粘合一些可以导致二聚 作用并启动死亡的不同的蛋白质。 硕士学位论文 m a s _ ：r e r s1 = l h e s i s 酶强 爸攀啼 奉 a 印1 xa 印lx i _ j i ；一 可交区缳守区 图2 ：c a s p a s e s 激活 活性懿 四聚体 傲仡馒赢 1 3 5 c a s p a s e s 对细胞结构的降解 c a s p a l s e s 的一个功能是使抑制凋亡的蛋白失活，如使i c a d 失活从而消除其对 c a d ( c a s p a s e a c t i v a t e dd e o x 曲o n u c l e a s e ) 的抑制作用，c a d 恢复其核酸酶的活性， 特异性降解d n a 。c a s p a l s e s 可直接作用于细胞结构并使之解离，如对核纤层蛋白 ( 1 锄i n s ) 的降解。同时，c a s p a s e s 通过降解一些与细胞骨架调控相关的蛋白质来重 组细胞结构，如对g e l s o l i n ，f a k 及p a k 2 的降解。c a s p a s e s 一个重要功能是使蛋白质 的调控区与功能区相互解离。通过这种方式进行负调控主要参与d n a 修复( 如 d n a p k c s ) 、m r n a 剪接( 如u 1 7 0 k ) 及d n a 复制的灭活。 目前己发现的c a s p a s e s 的底物还包括s r e b p 2 ，1 锄i na ，l a m i nc ，n 心厘a ，d n a t o p o i s o m e r a s ei ，蛋白激酶c 6 ，m d m 2 及r b 蛋白等。c a s p a s e s 在凋亡的执行过程中 以一种很有程序的方式对细胞进行解体。它们切断凋亡细胞与周围细胞之间的联 系、关闭d n a 的复制与修复、阻断r n a 的剪接、降解d n a 、破坏核的结构、诱导 细胞向外发出信号以便被周围的细胞吞噬、最后将细胞解体并包裹形成凋亡小体。 1 3 6 c a s p a s e 相关的凋亡信号转导通路 与c a s p a s e 有关的凋亡通路至少有三种：线粒体c y tc 通路、死亡受体通路和内 质网通路。 1 3 6 1 线粒体凋亡信号通路 线粒体是细胞内主要的a t p 生产中心，在细胞凋亡、人的衰老、癌症、信号转 导的发生过程中起着非常重要的作用。近年来，线粒体被视为细胞凋亡的关键元件。 越来越多的研究表明，在凋亡信号的刺激下，线粒体的膜电位会丢失，线粒体的通 透性会发生变化，各种凋亡因子会从线粒体释放到细胞质中，它们或激活c a s p a s e ， 或独立地破坏核染色质，从而表现出细胞凋亡的各种形态特征，即胞质浓缩，d n a 的大规模片段化，最后细胞膜内陷形成凋亡小体【3 2 1 。 体死亡结构域结合。啪还含有一个死亡效应结构域( d i d ) 可与酶原形式的 c a s p 勰e8 中类似的回文重复的d d 结构域结合嘲。c a s p 弱争8 的寡聚化导致其通过自 身切割使酶活化。最近的研究表明，细胞内可能存在两条f 舔信号转导通路活化 c a s p 弱骼m 。在f 笛i 型细胞中，有相当数量的c a s p 勰e 8 被活化，活化的c a s p a 8 通过切割c a s p a s e - 3 ，c a s p 勰c - 6 和c a s p 弱e 7 直接激活这些下游的c a s p 舔e s 并引发线粒 体的损伤。在f 弱型细胞中，只有少量的c 唧弱e 8 被激活，活化的c a s p 勰e - 8 可以 通过切割而激活单b h 3 促凋亡b c l 2 族蛋白( b h 3o n l yp m a p o p t i d t i cp r o t e i n ) b i d 。被 切割的b i d 会转移到线粒体引起膜间质凋亡蛋白的释放。通过诱导c y tc 、s m a c 从线 粒体释放活化c a s p 雒e - 3 ，并解除珊对c a s p 筋e 蛋白酶活性的抑制作用，从而促进凋 亡的发生。 1 3 6 3 内质网凋亡信号通路 研究表明内质网在凋亡信号处理过程中发挥重要作用，导致下游c a s p 豁e 和其它 蛋白酶的激活l k a g a w a 等【4 7 1 发现c a s p a s e 1 2 存在于内质网，是内质网应激( 如内质 网钙离子内环境紊乱以及过量内质网蛋白积累) 诱导的凋亡所必需的。当内质网钙离 子动态平衡被破坏或过多蛋白积聚于内质网时可激活c a s p a s e 一1 2 ，同时也导致胞质 中c a s p a s e 一7 转移到内质网表面，c a s p 懿e 7 激活c a s p a s e 一1 2 ，激活的c a s p 觞e - 1 2 可进 一步剪切c a s p 嬲e 3 而引发细胞凋亡。y 0 n e d 等【4 8 】发现内质网应激反应时，c j m n 端 抑制性激酶( j p 活化，继而激活肿【，肿 使t n a f 2 ( t u l l l o rn e c r o s i s f i 地t o rr e c e p t o r 雏s o c i a t e df 配t o r2 ) 磷酸化。磷酸化的t n a f 2 与m e l 形成复合物，导致t n a f 2 从其与 c 唧a s e 1 2 前体形成的复合物上解离，c 唧a s e 1 2 活化，引起细胞凋亡。黜e n 等【4 9 】将神经元细胞经内质网c a 2 + a t p a s e 抑制剂t 1 1 印s i g 嘤i i l ( t g ) 处理后，细胞出 现凋亡内质网中活化的c 唧弱e 1 x 后进行了许多以此为基础的研究，包括凋亡抑制基因p 3 5 、i a p 、p 4 7 基因的发现， 以及p 3 5 蛋白和l 垤蛋白的结构和部分功能的确定等。 我们实验组经过几年的研究，建立了比较稳定的两个凋亡系统，a c m n p v 诱导 s 1 1 细胞凋亡和剐m n p v 诱导的s 1 1 细胞凋亡【5 8 捌。在这两个凋亡系统中，通过d n a 电泳和心i 染色均能很明显的观察到凋亡的特征。在哺乳动物细胞中己经进行了很 多线粒体信号通路方面的研究，确认在哺乳动物凋亡系统中存在线粒体通路。我们 实验小组己证明【印】，在杆状病毒诱导的昆虫细胞凋亡中，c 川c 从线粒体释放到细胞 质中，提示了与哺乳动物细胞的凋亡相同，线粒体也参与了杆状病毒诱导昆虫细胞 的凋亡过程，实验检测到环孢菌素a ( c s a ) 在抑制c y tc 释放的同时，也抑制了 c a s p 雒e 3 的活化及s 1 1 细胞凋亡的形态学变化，证明c a s p 觞e 一3 的活化及s l 一1 细胞凋 亡的形态学变化都依赖于c y tc 的释放，表明c y tc 在此凋亡系统中的重要作用，初步 探究了在昆虫细胞凋亡中c 唧a s e 依赖性凋亡通路。本实验在我们实验室以前研究的 基础上，以杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的凋亡系统为研究对象，检测在昆虫细胞凋 亡中c a s p a s e 3 、c a s p a s e 8 以及c a l s p a s e 9 的活性及其关系，初步探索c a s p a s e s 级联反 应，以及是否存在c 唧a s e - 8 和c a s p a s e 9 介导的信号通路，从而为整个昆虫细胞凋亡 信号通路的研究打下基础。 1 4 实验材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 昆虫细胞、病毒 病毒：芹菜夜蛾核型多角体病毒刖m n p v 由美国农业部卫生室m c i n t o c h 惠赠。 细胞：斜纹夜蛾s 1 1 ( s p o d o p t e r al i 缸h a ) 细胞由中山大学国家生物防治重点实 验室赠与，此细胞是贴壁依赖性生长细胞；粉纹夜蛾t n 5 8 1 细胞由美国康乃尔大学 b tg 瑚a d o s 博士赠与；h e l a 细胞由华中师范大学分子生物学及遗传学实验室赠与。 2 1 2 无血清g n c e ，s 培养基 称取3 9 酵母提取物与3 9 水解乳蛋白溶于8 0 0 m l 去离子水中，搅拌溶解，将一瓶 1 0 魄g r a c e s 粉剂( g m c o 公司) 分几次加入，边加边搅拌，溶解后加入o 3 5 9 n 扭c 0 3 ，充分溶解后，调p h 值至6 5 ，定容使溶液体积达1 0 0 0 m l ；微孔滤膜( 直径 o 5 肛m ) 除菌，过滤后溶液分装至灭菌血清瓶中，4 存放备用，并取少量做无菌试 验，5 天内检验无菌的即可用于实验。 2 1 3 主要药品与试剂 i 强m i - 1 6 4 0 培养基为n e u r o n b c 公司产品 胎牛血清为g i b i c o 公司产品 d a p i 染料为s i g m a 公司产品 碘化丙啶为s i 舯a 公司产品 砌叮a 酶、蛋白酶k 为p r o m e g a 公司产品 琼脂糖为知1 1 r e s c o 公司进口分装 1 0 0 b p d n 越a d d c rm a l 【e r 为t i m g 铋公司产品 丙烯酰胺，双叉丙烯酰胺为加n r e s c o 公司进口分装 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺( 1 i ) 为s i 鲫a 公司产品 过硫酸铵为s i 肿a 公司进口分装产品 s d s 为丸i 玳s c o 公司进口分装产品 c h a p s 为s i g m a 公司产品 丽春红s 为s i 舯a 公司进口分装产品 牛血清白蛋白( b s a ) 为r 0 c h e 公司进口分装产品 二氨基联苯胺盐酸盐( n a b ) 为a 1 r e s c o 公司产品 1 5 徽 二硫苏糖醇( d i - i ) 为s i 鄹蛆公司产品 苯甲基磺酰氟( p m s f ) 为s i 肿a 公司产品 c a s p 弱e 9 兔抗多克隆抗体( h 一8 3 ，s c 7 8 8 5 ) 为s 锄协q u z 公司产品 c y tc 鼠抗单克隆抗体为b d 公司产品 人工合成c a s p a s e 一3 特异性荧光底a c - d l e v d - a f c 为s i 鲫a 公司产品 人工合成c a s p a 渺8 特异性荧光底a c ，r d a f c 为s i 舯a 公司产品 人工合成c a s p a 9 特异性荧光底a c l i ! h d a f c 为c a l b 黏c h e m 公司产品 c a s p a 8 特异性抑制剂z m t d 麟( s c 3 0 8 4 ) 为s 锄t ac r 睨公司产品 c a s p 勰e 9 特异性抑制剂z u ! 如) 觚( s c 3 0 8 5 ) 为s 锄t ac n 】z 公司产品 辣根酶标记的i i 抗为p i e f c e 公司进口分装产品 2 1 4 溶液的配制 d a p i 染液l m g ，滴几滴甲醇助溶，加水至1 0 m l ，等量分装于e p p e n d o 螬内，用 锡箔纸包裹于2 0 冰箱中工作液用p b s 缓冲液稀释至所需浓度( 4 p g m 1 ) ，可保存 数周 苯甲基磺酰氟( p m s f ) 储存液：1 7 4 m gp m s f 溶解于1 以已丙醇中，配制成l 0 l l ：l m 溶液，分装小份于2 0 保存备用 磷酸缓冲盐溶液( p b s ) ：在4 5 呲去离子水中溶解o 1 垂l ，4 斟a c l ， o 1 沓 h 2 p 0 4 ，1 5 9 n a 2 h p 0 4 t e s ：1 0 m m t r i s c l ，1 m m e d t a ，p h 8 o ，l s d s t e r ：l 蝴t r i s c l ， l m m e d t a ，5 0 p 卧n 】r n a a s e a r n a s e a ( s i g m a ) ：2 5m g 溶于2 5 n 儿9g l n a c l 溶液中，煮沸5m i n ，分装，一2 0 保存 碘化丙啶( p i ) ：1 9 溶于l l 9 9 l n a c l 溶液中，4 避光保存，用时以p b s1 0 倍 稀释。 丽春红s p o n c e a u s ) 储存液：2 5 9 丽春红s 溶解于5 m l 冰乙酸中，使用时l ：9 稀释 转移b u 臼衙：t r i s 碱1 1 6 2 9 ，甘氨酸5 8 5 9 ，s d so 4 9 ，甲醇4 0 0 m l 封闭液：5 ( w ，v ) 脱脂奶粉，o 0 2 r w e e l l 2 0 溶于p b s 中 一抗稀释液：l b s a ，p b s ，o o l 脚e e n - 2 0 二抗稀释液：1 b s a ，l c i i n mt r i s c 1 ，p h 7 6 ，1 5 0 h mn a c l ，i b s ：1 5 0 i n m n a c l ，5 0 i i l m 嘣s c 1 ，附7 5 显色液：0 0 1 m o 儿t r i s c l ，p h 7 6 ，6 m gd a b ，加入1 m l0 3 ( w ，v ) c o c l 2 细胞裂解液：2 0 0n l m 娜- k o h ，p h 7 5 ，1 0 i i l mk c l ，1 5 l n mm g c l 2 ，l m m 1 6 e d t a - n a 2 ，l m me g 私- n a 2 ，1 m md t t ，0 1 l n mp m s f ，2 5 蜮蔗糖 细胞裂解缓冲液：5 0 m mh e p e s k o h ，p h 7 4 ，1m me d t a - n a 2 ，1m m e g t a - n a 2 ，7 5m mn a c l ，o 1 嘶t o nx - 1 0 0 ，1m m 二硫苏糖醇，lm mp m s f 细胞反应缓冲液：5 0n 吐订h e p 骼k o h ，p h 7 4 ，7 5m 】n ：以l ，lm me d t a ，1 c h a p s ，1 0 蔗糖，2m 】m d t t 放线菌素d ( a c t d ) 溶液：取5 m g a c t d ，加入1 0 0 m l 去离子水，充分溶解，微孔 滤膜( 直径0 2 2 p m ) 除菌，得5 0 n 肛l a c l d 的无菌溶液，4 避光存放备用。 。 2 1 5 实验所用仪器 荧光分光光度计为日立f 一4 5 0 0 蛋白质含量检测仪为e p p e n d o 疗公司的b i o p h o t i d m e t e r n i 】( o n - t e 2 0 0 m s 荧光相差显微镜 2 2 实验方法 2 2 1 甜菜夜蛾人工饲养、感染与病毒的虫体活化 ( 1 ) 甜菜夜蛾采用常规方法人工饲养至二龄初； ( 2 ) 将昆虫移入2 4 孔板，开始喂食芹菜夜蛾核型多角体病毒( c d v ) ，使m o i _ 5 ， 待生长至四龄，约8 2 h 后剪其第二对腹足取其血淋巴； ( 3 ) 将现取的血淋巴离心( 2 0 0 0 印m ，1 5 i i l i n ) 弃沉淀，上清液用o 2 2 p m 的滤器抽 滤除菌，即为b v ，4 保存； ( 4 ) 将b v 接种至粉纹夜蛾t n - 5 b i 中进行病毒扩增。 2 2 2 细胞培养 s 1 1 细胞是贴壁细胞，按常规的贴壁培养方法在2 8 恒温培养箱中进行传代培 养 2 2 3 甜菜夜蛾及棉铃虫血淋巴的收集 甜菜夜蛾及棉铃虫的幼虫在温度为2 8 ，湿度为8 0 ，昼夜光长比为1 4 h - 1 0 h 的环境中饲养，每天用新鲜的饲料喂养。昆虫血淋巴是从五龄幼虫中收集。6 0 热 处理6 m i n ，剪去一对腹足，收集血淋巴，6 0 水浴2 4 n l i n ，离心，上清液o 2 p m 滤 膜抽滤，配制细胞培养基。 2 2 4 细胞固定 取2 0 0 | il 预冷的p b s 重悬的细胞液，慢慢滴入8 0 ，4 ，3 n l l 的酒精中，( 注意 1 7 此步非常关键，必须缓慢加入，一边加入一边晃动直至充分混匀) 。 2 2 5 d a p i 检测 用冰冷的p b s 将细胞洗两次，再用3 7 的甲醛固定3 0 m i n ，7 0 乙醇脱水2 3 m i n ， 取4 n 1 咖ld a p i ( 4 ，6 - d i a i n i d i i 烀2 蛳y l i l l d 0 1 e ) 于2 8 染色3 0 n l i n ，取出盖玻片， 倒扣于载玻片上，荧光显微镜( 激发波长为3 4 m 3 8 0 ，阻隐波长4 3 5 - 4 8 5 ) 下观察拍 照。 2 2 6 碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率 ( 1 ) 按上述方法取生长状态良好的细胞； ( 2 ) 按常规方法将细胞培养至对数生长期，以不同浓度放线菌素d 处理( 或加入 不同浓度甜菜夜蛾及棉铃虫的血淋巴，再放线菌素d 处理) 用0 2 5 的胰蛋 白酶细胞消化成细胞悬液，离心( 1 5 0 0 r 】p m ，1 0 l n i l l ) ，弃上清； ( 3 ) 将上步所得的沉淀用p b s 洗涤两次，然后将细胞重悬于p b s 中，用7 0 冷的 乙