（生物医学工程专业论文）疏水改性壳聚糖纳米粒子的制备及抗癌药物的接载.pdf

a bs t r a c t c h i t o s a n ，an a t u r a lp o l y s a c c h a i r i d e ，i s 也eo n l ya n 【a l i n o u sp o l y o s ew h i c hw i d e l y e x i t i n gi i lt h el i v i n gn a n 鹏i ti s 锄n - d e e t y l a t e dd 甜v a t i v eo fc h i 缸nh a s b i o c o m p a t i b i l i 够，h y p o t o x i c i 哆，b i o d e 伊a d a t i o na b i l i 够 髓d h a r d l y h 舔 锄y s e n s i b i l i z a t i o n ，s oi th 硒al o to fm e d i c a l 丘m c t i o n 锄dd u r ga c t i o n b u tc h i t o s 孤i so n l y d i s s o l v e di ns o m e0 r g 锄i ca c 地t 1 1 e r e f o r ei t s 叩p l i c a t i o ni sl i i l l i t e d i no r d e rt 0e x p a n d i t sa p p l i c a t i o n 锄dd e v e l o pn e wc o m p o u 皿d sw h i c hh a v eg o o dn a n 鹏，v a “o l l ss t u d i e s o ft h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fc h i t o s a n 盯en e c e s s a d ， 1 om a k ec h i t o s a nh a v i i l gp hs e i l s i t i v i 妙，i nt h i sp a p e rc h i t o s a nw a sg r a f t e db y s u l f i m e t l l o x y p 徊m i d i n e( s d m ) 、h i c h i sap hs e n s i t i v 时g r o u p f i r s n y ， n - 瞰c c i n y l c h i t o s 卸w a s 驴m e s i z e db yi n g r a r i n gs u c c i n i ca n h y d r i d et 0c h i t o s a n i i l t i l i se x p e r i m e n t ，s u c c i n i c 岫d r i d en o to n i yp l a y e da ni m p o n 锄tb r i d g ep a nb e 觚e e i l c h i t o s 锄舳ds d m ，b u ta l s oi i l c r e a s e dt l l ew a t e 卜s o l u b i l i t yo fc h i t o s 柚t 0p r o m o t et h e f 0 衄o fn a l l o p a n i c l e n e nn s u c c i n y l 一c h i t o s 锄w 豁g r a 知db ys d mt og e to b j e c t i v e p r o d u c th c s h c sw 邪f o n i l e di i l t on 锄0 p 砒i c l ei np h o s p h a t eb u f f e rs a l i i l e ( p h = 9 18 ) b ys e l f - a s s 锄b l ym e t h o d t h ea n a l y s i sm e t l l o d so fh c sw e r ef 吼l r i e ri n d s p e c t r i 瑚。、n u c l e a rm a g l l e t i cr e s o n a n c e 趾de l e m e n t a la 1 y s i s ，也er e s u l t ss h o w e dt 1 1 a t s d m 佻鲫c c e s s 如1 1 y 幻g a n e dt 0c h i t o s 锄t h es u r f a c em n 肚加dp a n i c l ed i 锄e t e f o fh c s n a n o p a n i c l e sw e r e 锄a l y z e dw i t hs c 锄i n ge l e c 仃o nn l i c r o s c o p e 、仃锄s i n j s s i o n e l e c 仃o nm i c r o s c o p e 锄dd y n a m i cl i g l l ts c a t t 甜n g ，锄dt 1 1 er c s u l t ss h o w e dt 1 1 a tt h e 印p e a r 髓c eo fn 锄o p a n i c l e si s9 0 0 d 趾dt h ed i s p o s i t i o no fp a n i c l ed i a m e t e ri sm t h e r c c i l t e r e d 1 1 1a d d i t i o n ，t h er e s e a r c ht 0p h y s i c a ls t a b i l 时o fh c si m 叩a n i c l e ss h o w e d t h a tt h ed i s p o s i t i o no fp a n i c l ed i 锄e t e rd i dn o tc h a n g eal o tw h i l et l l ee n v i r o m e n t a l 缸c t o rc h 锄g e d t h er e s u l t so fd i s p o s i t i 伽o fp a n i c l ed i 锄e t e ri 1 1n 龃o p a n i c l e s s o l u t i o nw i t l ld i 髓r e n tp hs h o w e dt h a tt h ep a n i c l ed i a m e t e ri n c r e a s e du n i i l t e m l p t e d l y w h i l e 廿l ep hd o c r e a s e d 1 1 h i sd 锄o n s 眈t e dt h a tt h en a n 叩a r t i c l e sf o l l l l e db y s e l f - a s s e m b l ym e t l l o da r e rs d mw 船i n g m r e dt 0c h i n o s a nh a dg o o dp hs e n s i t i v i t ) ， n a t 盯e e v e n m a l l y5 f uw a s 协k e n 嬲m o d e ld m g ，蛐dm eh c sp h y s i c a l l ye n v e l o p e d t 1 1 ed n 唱t 0n a n o p a n i c l e sb ys e l f _ a s s e m b l yi nt h ep b s ( p h = 9 18 ) t h ee x p e r i m e n t s h o w e dt h a tl o a d i n gc o n t e n t 粕dl o a d i n ge m c i e n c yo fh c sn 加o p a n i c l e si sr e a l l y 9 0 0 d a l s o ，t h eh c sn 卸0 p a n i c l e ss h o w e dg o o dd e l a y e dr e l e a s ee 疵c t ，龃d h a dg o o d p hs e n s i t i v i t ) r t l l ed e l a y e dr e l e a s e e 扫f e c t sw e r ed i 岱：r e n ta td i f f e r e n tp h i n c o n s e q u e n c e ，t l l eh c sn a n 叩a n i c l ei ss u i 诎i l et ol o a d 粕t i c 锄c e rd m g s k e y w o r d ：c h 油s 龃，s u l f a d i m e t l l o x y p 咖1 1 1 i d i n e ，n a n 叩a r t i c l e s ，p h s e n s i t i v i 吼5 - f u 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞墨堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：纠孑廷 签字日期： 矽7 年月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘堂 有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 训叛 签字日期：0 年，月矽日 ， 导师签名：彩锄 第一章文献综述 1 1 壳聚糖 第一章文献综述 壳聚糖( c h i t o s 锄，c s ) ，又名脱乙酰甲壳素，可溶性甲壳素和聚氨基葡萄糖 等，其化学名为b ( 1 ，4 ) 2 氨基2 脱氧d 葡萄糖。它是由甲壳素在强碱性条件下 进行脱乙酰基作用后形成的一种重要的衍生物，呈白色或灰白色无定形、半透明、 略有珍珠光泽，在自然界中产量仅次于纤维素。壳聚糖的化学结构与纤维素相似， 是由多个n 乙酰氨基葡萄糖通过d ( 1 - 4 ) 糖苷键连接起来，但它的性质更为活泼， 表现出多种独特的生物活性和功能，包括止血活性、抗微生物活性、生物降解性 以及与金属离子有强的亲和性【l 】。近年来壳聚糖在各个领域如食品、制造、化工、 环境保护等方面中的运用受到很大的重视。 1 1 1 壳聚糖的结构及性质 壳聚糖是由乙酰氨基葡萄糖多聚物( 甲壳素) 经部分脱乙酰基作用而形成的 衍生物，结构上主要由氨基葡萄糖和乙酰基氨基葡萄糖以氢键方式连接而成的长 链。壳聚糖溶于酸后，这种长链聚合物含有氨基葡萄糖所携带的带正电荷的氨基 和氨基葡萄糖与乙酰基氨基葡萄糖都拥有的带负电荷的羟基。壳聚糖的化学结构 可以通过测定氨基基团的含量以及乙酰基在线性多聚物上的分布来确定，但壳聚 糖长链的构型一直是许多研究者争议的话题。虽然普遍认为壳聚糖在酸性水溶液 中呈螺旋状刚硬状态，但随着氨基基团的增多，对壳聚糖结构的认识产生了分歧， 一种认为壳聚糖随着氨基基团的增多而伸展，刚性增强；另一种则完全相反，认 为随着氨基基团的增多，壳聚糖的折叠程度越大。p e d r o n i 等【2 】用透射电子显微镜 ( t e m ) 观察溶于乙酸( o 5 n l o l l _ ) 溶液中的三种壳聚糖，壳聚糖的编号分别为 t m 8 1 8 、m 8 1 6 和d 啪s ，乙酰基含量分别为1 8 、7 和1 8 ，结果发现在t e m 下，壳聚糖的结构是由非常细的细丝连接着许多粗糙的球形颗粒，即珠串状，并 且这些珠子相互之间不接触。呈线状的可能为完全脱乙酰化的多糖链，由于带正 电荷的氨基基团的静电排斥而被拉伸，并且，壳聚糖的脱乙酰程度越大，分子内 氨基基团含量越多，静电排斥力越大，颗粒之间的问隔越长；而其上的珠子则可 能为乙酰化的多糖，乙酰基由于疏水作用而聚集成团，其他研究者也有同样的发 现【3 j ，而且这些颗粒的大小与壳聚糖的n 乙酰基含量成反比关系，这种现象可能 是因为颗粒中含有脱乙酰的氨基葡萄糖，由于带正电荷的氨基基团的静电排斥作 第一章文献综述 用使得颗粒直径增大，并且氨基含量越大，颗粒的半径越大，反之越小。 1 1 2 壳聚糖的降解性能 壳聚糖有着优异的生物相容度，很重要的一点就是在人体内可进行生物降 解。在体内，壳聚糖是通过酶水解而降解的，起主要作用的是溶菌酶。溶菌酶通 常作用于n 乙酰葡聚胺组分，许多研究结果表明，溶菌酶对壳聚糖的降解活性较 低，降解的产物是不同长度的壳聚糖齐聚物，降解的速度强烈依赖于壳聚糖的结 晶度，而结晶度又取决于壳聚糖的脱乙酰度。脱乙酰度大于8 5 的壳聚糖表现出 低的降解速率，在体内可滞留几个月，而低脱乙酰度的壳聚糖降解得比较快。这 个结论己通过用不同侧链分子的衍生化反应来验证。因为衍生化反应结果改变了 壳聚糖分子链的堆积方式，增加了非晶态组分，因此经过衍生化的壳聚糖降解得 较快。庄造霞掣4 】对壳聚糖膜的生物降解性进行了研究，结果表明经过6 0 天壳聚 糖膜降解3 6 7 0 0 4 并且壳聚糖降解速率受其分子量影响，分子量越小，降解 得越快壳聚糖膜在动物体内降解研究表明，经过2 0 d 壳聚糖膜可降解8 2 。总之， 在生理环境下，壳聚糖能被组织中的酶慢慢吸收而逐渐降解。 此外，壳聚糖的生物相容性还表现在免疫性能【5 j ，抗菌性能【6 ，7 1 ，以及伤口愈 合活性【8 ，9 】等。特别是在近期的研究中发现壳聚糖可以用于运载基因【l o 】以及组织 工程【1 1 12 1 。因此作为新型材料来讲，壳聚糖的研究受到了广泛关注，特别是它优 异的生物相容性和生物利用度。 提高壳聚糖生物利用度的关键在于通过化学修饰引入特殊的功能基团。迄今 为止，已经有许多文章报道了化学修饰壳聚糖的研究工作【1 孓 j 。 1 2 在生物医学方面所作的疏水改性壳聚糖的研究 下面将在生物医学方面疏水改性壳聚糖的研究概括为以下几点： 1 2 1 糖类物质修饰壳聚糖 1 9 8 0 年h a l l 和y a l p a l l i 【1 6 】第一次报道了用糖类修饰壳聚糖的研究。他们用 n a c n b h 3 和未经修饰的糖或者糖醛衍生物通过n 烷基化合成了糖类修饰的壳聚 糖。但当时只将这种产物用于流变学的研究，但是当发现了细胞、病毒、细菌有 特异识别性能以后，这一研究便转向了引入有细胞特异性的糖类物质。m o r i m o t o 等人【1 7 锄】报道了用d 或l 岩藻糖修饰壳聚糖的研究以及这一产物与凝集素和细 胞的特殊相互作用。l o t o 【2 1 】用n 琥珀酰壳聚糖和乳糖合成的荧光素硫代羰基壳 2 第一章文献综述 聚糖衍生物，这种衍生物在小鼠体内可以通过唾液酸糖蛋白受体作为靶向性药物 载体。研究表明n 琥珀酰壳聚糖和乳糖合成的荧光素硫代羰基壳聚糖衍生物可 作为肝脏特效药丝裂霉素c 在肝脏转移中的药物载体【2 2 】。半乳糖壳聚糖是由乳 糖酸与壳聚糖在1 乙基- 3 一( 3 - 二甲氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 与n - 羟基琥珀 酰亚胺烈s c ) 为催化剂的条件下制备而得到的，它可用作肝细胞外的基体【2 引。 s a s h i w a 等人【2 4 】制备了用唾液酸修饰的壳聚糖衍生物，可用作人体红细胞血球凝 集作用的蛋白质抑制剂，如继续引入n 一琥珀酰阴离子还可提高此类衍生物的水 溶性。 1 2 2 化学接枝壳聚糖 化学接枝是制备功能性壳聚糖衍生物的一种十分重要的方法。现已发现了很 多不同的接枝路线，如铈离子、格氏试剂、微量辐射和开环反应等【2 5 1 。水溶性接 枝壳聚糖的分子结构已经由原子力显微镜、透射电镜、小角度种子散射分析的方 法表征给出。接枝壳聚糖带有一个短的接枝链所形成的单分子环的直径在4 0 6 0 纳米，而接枝长链分子导致了单分散球形结构。而且，长接枝链分子间的相互作 用将导致较大颗粒的形成。这些研究对调节分子设计和选择引入什么样的接枝链 而制备水溶性壳聚糖是非常有用的。 以乳酸为基础的均聚物和共聚物有良好的生物降解度，广泛用于缝合和药物 释放系统。所以，p h 敏感的聚合水凝胶在胃肠给药系统很有应用潜力。新型p h 一 敏感交联性水凝胶是由d ，l 乳酸直接与壳聚糖中的氨基反应而接枝上的，没有 使用催化剂【2 6 】。p h 敏感性是由于链上的疏水性基团聚集造成的。当p h 和离子 浓度降低时就会使水凝胶的量减少。然而，接枝壳聚糖需要高能量放射或者添加 引发剂如铈( ) 和氧化还原体系，这些方法将导致多糖主链的降解，因此使得到 的接枝产物的结构十分复杂而且难以确定。 1 2 3 环糊精连接壳聚糖 由于环糊精含有疏水性孔洞，可以结合芳香族化合物和小分子有机物，故此 将环糊精与壳聚糖相连接可以在制药、化妆品、分析化学等行业有广大应用前景。 尽管6 位上的羟基很容易进行反应，但2 或3 位才是结合的关键部位。s a k a i r i 【z 7 j 用2 o 甲酸甲基0 【环糊精通过n 烷基化还原剂生成包合p 一硝基酚的主一客合成 方法制备了a 环糊精交联壳聚糖。c h e n 等人【2 9 】报道了用甲苯磺酰基- b 环糊精连 接壳聚糖【2 8 1 。这一聚合物被用来降低1 3 1 1 2 在小鼠体内的放射强度，效果十分明 显。这类化合物也被用作去除水中的纺织颜料。不溶性壳聚糖p 一环糊精交联物是 第一章文献综述 由n 琥珀酰壳聚糖与氨化b 环糊精通过氨酯基连接制备而成【3 0 】。黄怡掣3 1 】采用 酯化反应，以琥珀酸酐( s u c ) 为酰化剂，合成了琥珀酰b 环糊精酯( p c d s u c ) ， 进一步与n a o h 反应生成p 环糊精琥珀酸钠( p c d s u s ) ，并以此为离子交联剂 与阳离子聚合物壳聚糖( c t s ) 复合，制备了含b 环糊精结构单元的壳聚糖复合膜 ( b c d s u s c t s ) 。滴定实验表明了离子间存在着静电相互作用，并决定了膜在 水溶液中具有p h 敏感性。选用喜树碱( c p t ) 为模型药物，通过研究环糊精与c p t 以及环糊精与c t s 间的相互作用，探讨了其药物控制释放机理。 1 2 4 酶修饰壳聚糖 利用酶来修饰壳聚糖的有利之处在于它的特异性结合和环境优势。从健康和 安全的角度出发，用酶来反应有可能消除反应试剂的危害。p a y n e 等人1 3 2 1 在碱性 条件下用酶接枝壳聚糖，使壳聚糖能够在水中溶解。另一个例子是有一种苯醌衍 生物与维生素k 有相似的生理学特点，它有着与壳聚糖快速反应的倾向，能够 增加壳聚糖的亲水性【3 3 】。 1 2 。5 冠醚键合壳聚糖 冠醚有着特殊的分子结构，使其具有对金属离子的配位选择性质。将壳聚糖 和冠醚相链接所得到的聚合物有着双重结构，而且高分子量的增效作用使其与金 属离子的配位能力更强，选择性更好。t 姐g 等人【3 4 】制备了冠醚与壳聚糖相连接 的聚合物，而且这种聚合物的化学结构已经由元素分析、红外光谱、x 射线及固 体”c 核磁等方法表征给出。冠醚键合的壳聚糖聚合物不仅对贵金属离子如p d 2 + 、 a u 3 + 、a g + 有良好的吸附性能，而且还可以将p d 2 + 由c u 2 + 和h r 中高选择性的吸 附出来。冠醚交联壳聚糖【3 5 】的衍生物具有空间网络结构，而每一个网孔的空间容 量是一定的。 这些冠醚键合的壳聚糖衍生物可以广泛应用于从水中分离和富集 金属离子和贵金属离子1 3 6 j 。 总之，由于壳聚糖分子链上的活性基团很多，因此可以在充分保留原有壳聚 糖骨架结构的基础上，对其进行多种修饰改性，从而改进它们的性能，满足一些 特殊的要求。如壳聚糖的几种接枝反应，所得产物多用作药物载体。还有其他修 饰方式所得到的聚合物具有良好的性能，广泛地应用于生物材料等多种领域中。 以下将简单介绍一下疏水改性壳聚糖在生物医学方面的应用。 4 第一章文献综述 1 3 疏水改性壳聚糖在生物医学方面的应用 1 3 1 药物载体 随着药物制剂向“三效”( 高效、速效、长效) 和“三小”( 毒性小、副作用小、 剂量小) 发展，具有无毒、可生物降解、良好组织相容性、缓释和控释的药物载 体( 药物运送系统) 日益引人注目。壳聚糖及其衍生物可用作药物载体，稳定或保 护药物中的有效成分，促进药物的吸收，延缓或控制药物释放，帮助药物送达目 地器官。随着新型给药系统的发展，壳聚糖应用于药物制剂主要集中于设计安全 有效的壳聚糖给药体系，尤其是用于化疗药、多肽、蛋白质类药物制剂。壳聚糖 及其衍生物可以以凝胶、颗粒、片剂、薄膜、微囊等形态包封药物，广泛应用于 药物缓释和定位输送，主要有以下几方面的应用。 1 3 。1 1 抗癌药物载体 1 9 9 4 年，o h y a 等【3 7 】首次报道了采用戊二醛交联壳聚糖分子链上的氨基合成 内含抗癌药物5 氟尿嘧啶的壳聚糖纳米微球的方法。实验时，先制得含壳聚糖、 药物的油包水型乳液，然后加人交联剂进行反应，由于所用的5 氟尿嘧啶也含有 活泼的氨基，因此在交联反应时药物被固定在壳聚糖纳米微球上而不是被包埋其 中。这些开创性工作显示了合成稳定性和重现性好、能包埋及释放药物的壳聚糖 纳米药物载体的可行性。此后许多人致力于研究如何利用壳聚糖制备抗癌药物载 体。如l e e 等人【3 8 】用脱氧胆酸修饰的壳聚糖包埋阿霉素( d o x ) 制备载药纳米粒子， 脱氧胆酸在e d c 存在的情况下与壳聚糖发生反应形成自聚集壳聚糖纳米粒子。阿 霉素通过物理吸附进入纳米粒子内部形成载药纳米粒子，然后用动态光散射、荧 光光谱、原子力显微镜等分析手段表征载药纳米粒子的物理特征。该粒子的最大 载药量为1 6 5 ，包封率为4 9 6 ，并且能达到缓慢释放的效果。代昭等人p 州制 备了适用于水体系的紫杉醇的负载载体。其方法为将壳聚糖经烷基改性制得烷基 取代的壳聚糖衍生物，该衍生物在水中可自动形成粒径分布在1 0 0 砌左右的纳米 微球，并在磷酸盐缓冲液( p h = 7 4 ) 中对负载紫杉醇的纳米微球进行了体外释放研 究。该实验所得结果是随着烷基取代度的增加，紫杉醇的体外释放平衡浓度降低， 体外释放的半释放时间延长。其结论是十六烷基壳聚糖纳米微球是一个优良的紫 杉醇的水分散体系。p 砒等人m 】报道了用n 乙酰基组氨酸修饰乙二醇壳聚糖的研 究，n 乙酰基组氨酸在中性条件下是疏水基团，由它修饰的壳聚糖可自聚集形成 直径在5 0 2 5 0 i 皿的纳米粒子。在弱酸环境里，如在内涵体中，纳米粒子就会溶 5 第一章文献综述 解，因为质子化作用破坏了n 一乙酰基组氨酸中的咪唑基团从而导致亲水疏水平 衡的破坏。这就表明这该米粒子是对酸性敏感的，将紫杉醇包埋到纳米粒子中可 达到定点释放的目的。 1 3 1 2 基因载体 壳聚糖分子中的葡糖胺基荷正电，与荷负电的d n a 可产生静电作用凝聚为 多聚复合物( p o b ，p l e x e s ) ，使d n a 压缩成结构相对致密的纳米级粒子，这种纳米 粒子可以克服药物经黏膜吸收的生理学屏障，通过细胞内吞途径，抵达黏膜下淋 巴组织。c s 纳米粒作为基因载体的优点还体现在：在体内能保护d n a 免受核酸 酶降解【4 1 ，4 2 】；荷正电的纳米粒与荷负电的细胞及黏膜黏液中的唾液酸可发生较强 的静电作用而延长疫苗与黏膜的作用时间，提高细胞对疫苗的摄取率【4 3 一。 d n c s 纳米粒的制备条件温和，不需使用有机溶剂，避免了d n a 在制备过程中 的破坏和溶剂残留问题。c s 以其固有的特性，被认为是有应用潜力的非病毒类 基因载体。宗莉等人【4 5 】研究用c s 纳米粒携载编码胆固醇酯转移蛋白的抗动脉粥 样硬化d n a 疫苗( p c r 3 1 x 8 h b c c e t p c ) ，通过鼻黏膜接种，诱导特异性黏膜免 疫和系统免疫应答。研究表明，d n c s 纳米粒进入细胞并表达的能力与c s 的类 型及纳米粒的粒径、电性等性质有关【4 2 蛔，该实验采用复凝聚法制备d n c s 纳 米粒，所得的p d n 刖c s 纳米粒为结构较紧密的不规则球形，平均粒径为 ( 2 4 0 4 士1 3 2 ) n m ，多分散指数为( o 1 7 3 士0 0 5 ) ，z e t a 电位为( 1 8 4 士0 6 ) i n v ，包封率 为( 9 5 2 土1 9 ) ，载药量为( 3 0 7 士0 8 ) 。凝胶阻滞分析结果表明，纳米粒荷正电， p d n a 与壳聚糖之间通过静电作用而完全结合。纳米粒的粒径、z e t a 电位受处方 中的壳聚糖相对分子质量、n p ( 壳聚糖中伯胺基数目p d n a 中磷酸基数目) 比、 p d n a 浓度、n a 2 s 0 4 浓度和p h 值等因素影响。p d n a 保护性试验表明，壳聚糖纳 米粒时p d n a 有保护作用。壳聚糖作为黏膜给药的非病毒基因载体具有应用价 值。h a s h i m o t o 等【4 7 】用乳糖与壳聚糖( 分子量5 3k d ，脱乙酰度9 3 ) 反应，制备乳 糖基取代度为8 和3 3 的乳糖疏水改性壳聚糖。当n p 之3 1 时，乳糖疏水改性壳 聚糖包裹荧光素酶基因质粒形成直径1 4 0 1 7 0 衄的纳米粒。检测它们对h e p g 2 细胞的转染能力，同时以壳聚糖和脂质体转染试剂l i p o f e c t i l l 作对照。结果显示， 各种试剂对h 印g 2 细胞的转染效率依次为：“p o f e c t i i l 8 乳糖疏水改性壳聚糖 壳聚糖 3 3 乳糖疏水改性壳聚糖，与普通壳聚糖相比，8 乳糖疏水改性壳聚糖 对h 印g 2 细胞的转染效率提高了1 6 倍。3 3 乳糖疏水改性壳聚糖的转染效率较低 的原因可能是因为其乳糖基取代度较高，空间位阻增大，与d n a 之间的静电作 用力减弱，导致与d n a 形成复合物的能力减弱。 6 第一章文献综述 1 3 1 3 蛋白质药物载体 壳聚糖也可与带负电荷的蛋白质发生相互作用，可作为蛋白质药物的载体。 汪一娟掣4 印制备了一类可生物降解肝素钠两性壳聚糖复合物( h p a c s ) ，并探索 将其用于蛋白药物p h 响应释放。两性壳聚糖是由壳聚糖与丙烯酸加成反应得到， 丙烯酸取代度可通过丙烯酸壳聚糖投料比调控；用胶体与p h 浊度滴定研究了肝 素钠与两性壳聚糖的复合作用，发现两组分在一定p h 范围内能通过静电相互作 用形成复合物，复合转变临界p h ( p h p ) 与两性壳聚糖中丙烯酸取代度有关，取代 度越低，p h 9 值越高。以牛血清白蛋白( b s a ) 为模型，测定了其在复合物中包埋 及不同p h 介质中的释药行为。结果表明，b s a 可以在非常温和条件下有效包埋 于复合物中，包埋率接近1 0 0 ；b s a 从复合物中释放具有很高的p h 响应性，释 放转变在很窄的p h 范围内( 0 4 p h 单位) 完成，释放转变临界p h ( p h q ) 可由两性壳 聚糖中丙烯酸取代度调控。复合物形成和蛋白质释放在对p h 依赖性上存在很好 的相关性。同时还发现，在中性介质中( p h 7 4 ) ，复合物对b s a 具有很好的缓释 作用，b s a 持续释放时间可达1 5 天左右。徐淑芳等【4 9 】用n 一( 2 羟基) 丙基3 甲基氯 化铵壳聚糖( q c ) 与三聚磷酸钠( t p p ) 离子交联制各了一种新型的纳米粒子，粒径 约为1 1 0 1 8 0 衄。经傅立叶红外光谱表征，发现该纳米粒子与q c 的结构比较发 生了较大改变，形成了较强的分子间氢键，且t p p 连接到了纳米粒子q c 上的铵基 位点，以牛血清白蛋白( b s a ) 为模型药物，增加b s a 的初始浓度可提高纳米粒子 对b s a 的包封率。交联剂的浓度从o 5g l - 1 增加到0 7g l - 1 时，纳米粒子对b s a 的 包封率可从4 6 。7 提高到9 0 ，且载药q c 纳米粒子体外释放实验在初期的突释量 明显减小( 从4 3 减至2 8 ) ，载药纳米粒子突释之后均呈现缓慢而持续的释放。 1 3 2 组织工程中的应用 细胞大规模培养技术的日臻成熟和生物相容性材料的开发和研究，使得由活 细胞和生物材料组成人造组织和器官成为可能。组织工程材料的研究希望应用生 命科学与工程原理及方法构建生物装置，利用细胞培养恢复受损组织或器官的功 能，达到制造生物仿生材料进而制造人造器官的目标。组织工程的核心技术便是 反应了正常的细胞生长环境的三维立体培养技术。 王迎军等1 5 0 】制备了壳聚糖一胶原角膜组织工程支架，考察了复合膜支架的光 学性能、力学强度、结晶性、吸水率、亲水性、微观形貌及细胞亲和性，发现支 架内胶原与壳聚糖两种分子间存在较强的相互作用，且具有良好的相容性，支架 表面平滑均一，内部呈现层状有序结构。壳聚糖胶原复合膜具有优异的透光率 第一章文献综述 和适宜的湿态力学强度。细胞培养实验中，人角膜缘上皮细胞能在支架上较好地 粘附和增殖分化，显示复合膜支架具有良好的细胞亲和性，结果表明壳聚糖胶原 复合膜有望成为一种性能良好的角膜组织工程支架。 陈光等【5 l 】采用不同粒度的硅胶粒子作为致孔剂，按硅胶和壳聚糖重量比9 ：l ， 制备了三组不同孔径的壳聚糖多孔支架，以无孔壳聚糖支架为参照，对多孔支架 的有效孔径、吸水性进行了比较。结果表明：孔径大小由硅胶尺寸控制，吸水性 随孔径增大而增大，为研究支架孔径大小对其生物相容性的影响，在系列支架上 进行了人胚肺成纤维细胞的培养。细胞种植l d 后，多孔支架上的细胞粘附较多， 而无孔支架上的细胞伸展情况较好；细胞培养5 d 后，所有支架上细胞伸展情况良 好，孔径越大的支架上细胞增殖越多。该研究结果将为天然生物材料壳聚糖作为 组织工程支架材料的应用提供有益的指导。 1 3 3 医用缝合线 外科手术离不开缝合线，但一般缝合线在的伤口愈合后必须拆除，而壳聚糖 纤维制成的手术缝合线，在体内有良好的适应性，尤其是经过一定时间，壳聚糖 缝合线能被溶菌酶所酶解，从而被人体自行吸收当伤口愈合后不必拆线，并且壳 聚糖缝合线的缝合和打结性好，在预定的时间内在血清、尿、胆汁、胰液中能够 保持良好强度。因此，它们作为手术缝合线具有应用前景。n o g a t a 【5 2 j 等将壳聚糖 同丝胶蛋白共混制成功能化纤维，作为外科手术用的可吸收缝合线，不仅能够促 使伤口愈合，抗溃疡等，还能弥补壳聚糖医用纤维在体内环境中抗张强度损耗快 等缺陷，避免较大的组织反应发生。 1 3 4 人造皮肤 壳聚糖人工皮肤不致敏、无刺激、无吸毒中毒及占位排斥现象，透气性好， 可促进皮肤生长，且有止血和抑制疤痕生长的效果。用壳聚糖将i 型胶原、i i 型 胶原及糖胺聚糖交联后制成了一种多孔的支架，然后将人的皮肤成纤维细胞接种 再此支架上，得到了适应于上层细胞的类真皮层。培养的角质层细胞可迅速贴附 于这种类真皮层上，经过有丝分裂后，形成一层连续的上皮层。培养两周后，进 行组织切片，可以看到一层附着与类真皮层上的柱状基底层细胞和几层生长旺盛 的发生曾在内的细胞。这种皮肤从形态上与人正常皮肤相当，所以它作为治疗皮 肤深度烧伤的医用材料具有应用前景。将人的成纤维细胞接种于由壳聚糖与胶 原、黏多糖交联成的基质材料上，制备成一种离体皮肤模型【5 3 1 。这种皮肤模型可 以代替在人体皮肤进行化妆品、家用化工厂品及药物等对皮肤或眼睛的刺激性试 第一章文献综述 验。欧盟关于化妆品性能的测试必须用非动物手段的规定大大推进了这种体外药 物毒性试验模型的研究进展。 1 4 纳米药物载体的研究与的应用 纳米技术对医学领域的不断渗透，由于纳米粒子具有超微小体积，能穿过组 织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管和血脑屏障，因此纳米载体控 释体系在药物输送方面具有其它体系无可比拟的优越性：可缓释药物，延长药 物作用时间；可达到靶向输送的目的；可在保证药物作用的前提下，减少给 药剂量，从而减轻或避免毒副反应：可提高药物的稳定性，便于贮存；可以 建立一些新的给药途径。纳米颗粒作为药物和基因转移载体时，能将药物、d n a 和r n a 等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面 耦联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表 面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物 和基因治疗。 因此，纳米粒子在医学领域的应用极为广泛，在医药领域，纳米级粒子使药 物在人体内的传输更为方便，纳米粒子包裹的智能药物进入人体后，可主动搜索 并攻击癌细胞或修补损伤组织。在人工器官移植领域，在人工器官外面涂上纳米 粒子，就可预防人工器官移植的排异反应。在医学检验学领域，使用纳米技术的 新型诊断仪器，只需检测少量血液，就能通过其中蛋白质和d n a ( 脱氧核糖核酸) 诊断出各种疾病。在膜技术方面，用纳米材料制成独特的纳米膜，能过滤、筛去 制剂的有害成分，消除因药剂产生独特的污染，从而保护人体。在抗癌的治疗手 段方面，德国一家医院的研究人员将一些极其细小的氧化铁纳米颗粒，注入患者 的肿瘤里，然后将患者置于可变的磁声中，使患者肿瘤里的氧化铁纳米颗粒升温 到4 5 4 7 ，这么高的温度足以烧毁肿瘤细胞，而周围健康组织不会受到伤害【5 4 1 。 下面对纳米药物载体及其应用分别加以介绍。 1 4 1 纳米药物载体概述 药物制剂的给药途径与方法对药物作用至关重要。口服药效受到两种首过效 应的影响，即胃肠道上皮细胞中酶系及肝中酶系的生物代谢。许多药物很大一部 分作用因首过效应而代谢失效，如多肽、蛋白质药物等而未获得良好的治疗效果， 通常不得不将口服药改为注射静脉给药途径。由于通过注射途径的非靶向药物可 均匀分布于全身血液循环中，在到达病灶前，要经过同蛋白质结合、排泄、降解 等步骤，只有少量药物才能到达病灶。靶向给药的目的就是提高靶区的药物浓度， 9 第一章文献综述 而提高药物的利用率和疗效以降低药物的副作用一直是医药领域一项重要的研 究课题，纳米药物载体的研究有效地解决了这些问题。因为载药纳米粒静脉给药 后，主要集中在单核巨噬细胞丰富的器官，尤其是肝、脾、骨髓【5 5 】。因而利用纳 米粒体内分布特点，改变药物体内的分布，减少全身毒副作用，提高药物的生物 利用度，可达到被动靶向治疗的目的。而且，纳米粒也可通过连接的单克隆抗体 等药物定位于肝实质细胞，而发挥主动靶向作用。 此外，一种理想的药物载体系统应具有以下特性：( 1 ) 颗粒小( 至少小于 1 卸锄) ；( 2 ) 能够携带多种化学药物；( 3 ) 载体能够携带足量的药物，使靶部位药 物浓度达到治疗浓度，而肌体内载体量并不高；( 4 ) 在靶位点，载体释放活性药 物的释放率必须能够控制并且可预测；( 5 ) 经体外包装过的药物在靶位点释放， 仍应具有足够的生物活性；( 6 ) 具有在靶部位定位的能力；( 7 ) 有足够的循环半衰 期以确保到达靶部位；( 8 ) 载体或其生物学降解产物应能被体内请除；( 9 ) 抗原性、 致热源性小，不易形成血栓；( 1 0 ) 有效期长，便于储存。纳米药物载体就具备以 上诸多优点。 目前，有代表性的纳米载体有如下几个：( 1 ) 纳米磁性颗粒，当前药物载体 的研究热点是磁性纳米颗粒，特别是顺磁性或超顺磁性的铁氧体纳米颗粒在外加 磁场的作用下，温度升高至4 0 4 5 时，可达到杀死肿瘤的目的【5 6 】。( 2 ) 高分子 纳米药物载体，纳米药物载体研究的另一个热点就是高分子生物降解性药物载体 或基因载体，通过降解，载体与药物基因片段定向进入靶细胞之后，表层的载 体被生物降解，芯部的药物释放出来发挥疗效，避免了药物在其它组织的释放。 ( 3 ) 纳米脂质体，用脂质体微囊作为药物载体的研究早已在药物制剂上应用，但 纳米脂质体的研制，还处于进行中，纳米脂质体是人们设计的较为理想的纳米药 物载体模式。( 4 ) 纳米智能药物载体的制备是纳米生物技术的一个分支，智能纳 米药物就是在靶向给药的基础上，设计合成缓释药包膜，采用纳米技术制备纳米 药物粒子，结合靶向给药和智能释药优点，用纳米技术完成制备智能纳米缓释药 的目的，即除能定点给药之外，还能根据用药环境的变化，自我调整对环境自动 给药。 1 4 2 纳米药物载体的应用 1 4 2 1 在癌症治疗方面的应用 癌症是危害人体健康和威胁人类生命的元凶之一，因此，癌症一直是医学工 作者所关注的焦点。癌症药物治疗的一个关键是如何把药物定向输送到癌症细胞 而又以不损伤正常细胞为前提。许多药物控释系统已经运用到这个领域，如脂质 l o 第一章文献综述 体、微胶囊等，而纳米粒子，由于其超微小体积，也日益受到人们的关注。纳米 粒子缓释抗肿瘤药物延长了药物在肿瘤内的存留时间，减慢了肿瘤的生长，与游 离药物相比，延长了患肿瘤动物的存活时间。由于肿瘤细胞有较强的吞噬能力， 肿瘤组织血管的通透性也较大，所以，静脉途径给予的纳米粒子可在肿瘤内输送， 从而可提高疗效，减少给药剂量和毒性反应。于波涛等【5 7 】对制备的氟尿嘧啶类脂 纳米粒的研究结果显示，其在肝脏中氟尿嘧啶浓度从2 9 7 8 增加至6 7 3 0 ，药 物主要集中于肝脏，血液中药物浓度较低。s o m a 等f 5 8 】进一步研究表明，静脉注 射载柔红霉素聚氰基丙烯烷酯纳米粒后，肝脏k 叩f f e r 细胞吞噬大量的纳米粒， 成为一种有效的储药库，降解纳米粒不断地释放出游离的药物至肿瘤组织，同时 被激活的吞噬细胞释放细胞毒性因子，潜在地提高了药物的疗效。而采用磁靶向 化疗具有良好的靶向性和缓释性，并能阻塞靶区血管。实验证实磁性阿霉素白蛋 白纳米粒体内给药后，即被内皮细胞吞噬，但3 0 分钟后可透入血管外问隙，2 4 小时大部分被肿瘤细胞吞噬。而y o o 等人【5 9 】进一步研究发现，将阿霉素装载到聚 乳酸聚乙醇酸共聚物的纳米粒子中，高分子量的聚乳酸聚乙醇酸共聚物更有利 于药物的缓慢释放，从而减慢肿瘤的生长。体内和体外实验均证明，把亲脂性免 疫调节剂胞壁酰二肽或胞壁酰二肽胆固醇包裹到纳米胶囊中，其抗转移瘤作用比 游离态药物更有效。通过对纳米粒子的修饰，可以增强其对肿瘤组织的靶向特异 性。如把抗肿瘤药z n p e f l 6 q n 包裹到聚乳酸( p l a ) 纳米粒子和聚乙二醇( p e g ) 修 饰的p l a 纳米粒子，给小鼠静脉注射后，发现前者的血经浓度较低，因为p e g 修 饰的纳米粒子能减少网状内皮系统的摄取，同时增加肿瘤组织的摄取。也有人把 较新的抗癌药紫杉醇包裹在聚乙烯吡略烷酮纳米粒子中，体内实验以荷瘤小鼠肿 瘤体积的缩小和存活时间的程度来评价药效，结果表明，含紫杉醇的纳米粒子比 同浓度游离的紫杉醇疗效明显增加。有人采用动态法观察阿霉素磁粒子在兔体内 的磁靶向定位结果，发现阿霉素具有超顺磁性特性，在给药部位近端和远端磁区 均能产生放射性富集，富集强度为给药量的6 0 6 5 ，同时其在脏器的分布显 著减少，证实了阿霉素具有较强的磁靶向定位功能。 近年来的研究表明，纳米载药系统不但可提高抗肿瘤治疗的指数，而且有降 低肿瘤耐药性的产生及逆转m d r 的作用。d ev e r d i e r e 等【6 0 j 研制聚氰基丙烯酸异 已酯和聚氰基丙烯酸异丁酯两组纳米粒，观察它们对m d r 的逆转情况，结果显 示对p 3 8 8 细胞，游离的阿霉素和纳米粒载药的阿霉素在细胞内的浓度无差异，而 对于耐药的p 3 8 8 a d r 细胞，聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒在细胞内累积的药物水 平较游离阿霉素高1 5 倍。c u v i e r 等用5 种耐阿霉素的细胞株进行研究，结果显 示，聚氰基丙烯酸异乙酯纳米粒组的i d 5 0 与游离组相比下降了3 0 - 2 5 0 倍。纳米粒 载药系统逆转肿瘤m d r 的机理尚不十分明了，有学者认为聚氰基丙烯烷酯纳米 第一章文献综述 粒阻止p 糖蛋白介导的跨膜转运，增大胞内的浓度，提高细胞毒性作用【6 2 1 。c o l i n d ev e r d i e r e 等【6 3 1 认为柔红霉素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒克服多药耐药是借助 纳米粒与细胞的相互作用，增加细胞内的药物浓度，不是通过肿瘤细胞的内吞作 用。 近年来，随着基因治疗临床研究的发展，基因输送一直是基因治疗和转基因 研究中的一个难题。传统的基因治疗用病毒或非病毒作载体。病毒载体由于其毒 性及免疫原性限制了应用，非病毒载体存在着转染效率较低的问题，而纳米作为 d n a 的载体有望解决上述问题。其特点是具有保护核苷酸，防止降解，有助提 高转染效率，并可起到定位和靶向作用。如有人在明胶和d n a 凝聚形成纳米粒 子的基础上设计出一种新的治疗囊性纤维性变的基因输送体系，使用防囊性纤维 性变的药物载体输送与c f r r 质粒结合药物可以用以治疗囊性纤维病变。被制成 基因载体的d n a 和明胶纳米粒子凝聚体含有氯奎和钙，而明胶与细胞配体运铁 蛋白共价结合，d n a 在纳米粒子中部分避免了被脱氧核糖核酸酶i 的分解，但还 能被高浓度的脱氧核糖核酸酶完全降解。被纳米粒子包裹的d n a ，只有在钙和 包裹运铁蛋白的纳米粒子存在的情况下才能进行最佳的细胞转染作用。利用编码 c f t r 模拟系统可以证明被纳米粒子包裹的d n a 的生物完整性。用包含这种基质 的纳米粒子对人工培养的人类气管上皮细胞进行转染，结果超过5 0 的细胞表 达，转染效率与c f t r d n a 纳米粒子的物理化学性质有关。而且，在氯化物中输 送的c f t r 缺陷的人类支气管上皮细胞，在被包含有c f t r 输送基因的纳米粒子转