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(水生生物学专业论文)外源fba对鱼腥藻7120光合活性的调控研究.pdf.pdf 免费下载
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论文题目:外源f b a 对鱼腥藻7 1 2 0 光合活性的调控研究 学科专业:水生生物学 学位申请人:王非凡 指导教师姓名:王全喜教授 摘要 光合作用是地球上最重要的化学反应,是所有生命活动的能量的最终来源。在光合 反应一系列复杂的反应中,碳同化反应( c a l v i n 循环) 作为大多数光合生物光合作用调 控的核心环节,一直是整个生命科学研究的方向和重点。确定c a l v i n 循环中的限速点, 提高植物的生产力具有重大的科学研究和生产实践价值。c a l v i n 循环是一个有一系列酶 共同催化的串联反应系统,整个系统共包含1 1 个酶,分为羧化、还原和再生三个阶段, 产生1 3 步催化反应。丙糖磷酸异构酶( t r i o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s e ,t p i ,e c5 3 1 1 ) 和 果糖1 ,6 二磷酸醛缩酶( f r u c t o s e 1 ,6 b i s p h o s p h a t ea l d o l a s e ,f b a ,e c4 1 2 1 3 ) 分别是 再生阶段中的第一个和第二个酶,催化两个相继反应:t p i 催化的是两个三碳糖3 一 磷酸甘油醛( g a p ) 和磷酸二羟丙酮( d h a p ) 之间的可逆异构化反应;而f b a 则可逆 地催化这两个三碳糖缩化形成为六碳糖果糖一6 一磷酸( f b p ) ,是c a l v i n 循环中固定 c 0 2 后的第一个催化3 c 化合物转化为6 c 化合物的酶。由于f b a 和t p i 催化的均是可 逆反应,被认为是“非限速酶”,因而在传统研究中一直没有被重视。近年来,反义转 基因植物研究的应用给c a l v i n 循环的调控研究带来了新的思路。 在这样的背景下,本论文以检测确定水稻胞质f b a 转入鱼腥藻7 1 2 0 后是否确实能够 加速碳同化从而加快光合反应的速度并初步探索其内在原因为目的,对其酶活、生长、 r u b i s c o 活性、光合放氧、细胞干重、低温荧光、荧光动力学、各种光合参数等一系列 生理指标进行测定并分析,实验主要内容和结果如下: 1 转f b a 鱼腥藻在构建成功( 经检测) 后,在生长条件为b g i i ( - n ) ,t r i s - h c l ( 5m m , p h8 0 1 和2 ( v v ) 的二氧化碳通气,温度3 0 * ( 2 情况下,能正常生长,在相 同情况下,转f b a 鱼腥藻比野生型鱼腥藻细胞增长的速率有一定的提高。 2 对转基因f b a 鱼腥藻及阳性对照鱼腥藻以及野生型鱼腥藻中f b a 酶活性比较发现, 转基因藻中f b a 酶活性得到了提高。 3 w e s t e r n 印迹分析显示核酮糖一1 ,5 二磷酸羧化酶( r u b i s c o 活化酶) 在转f b a 鱼腥 藻中大量诱导,由此显示,f b a 酶的增加与r u b i s c o 活化酶量的增加有关。 4 在测量和比较了转f b a 鱼腥藻、阳性对照鱼腥藻和野生型鱼腥藻的光合氧变化与细 胞干重后,同样发现转基因鱼腥藻的这两项指标都有较大程度的提高,再次证实f b a 酶对光合氧起着非常重要的促进作用。 5 室温吸收光谱显示外源f b a 的转入没有改变鱼腥藻的基本色素组成,低温荧光色谱分 析显示了p s i i 和p s i 两者综合作用下转f b a 鱼腥藻光合效率提高的可能性。 6 荧光动力学检测分析得出:转f b a 鱼腥藻的光化学淬灭参数q p 和q l 均高于野生型 鱼腥藻( q l 提高了3 3 7 ,q p 提高了1 9 3 ) ,光能转换效率提高了1 0 7 ,光电 子传递速率e t r 提高了1 7 6 ,实际电子传递的量子效率提高了1 7 7 。转鱼腥藻 p s i i 对光能的吸收、传递、耗散、分配的能力的增强,从“内在性”上解释了转f b a 鱼腥藻在光和调控能力上的优势。 以上结果证明,外源f b a 确实能够在一定程度上提高转基因藻的光合活性。为进一 步研究光合作用的调控机理提供了依据。 关键词:果糖1 ,6 二磷酸醛缩酶( f b a ) ;鱼腥藻7 1 2 0 :光合调控;荧光动力学 论文类型:研究报告 t h e s i st i t l e :s t u d yo nt h ec o n t r o lo fe x t r a n e o u sf b af r o mt h ea n a b a e n as p s t r a i np c c7 12 0 s u b j e c t :h y d r o b i o l o g y d e g r e ep e t i t i o n e r :w a n gf e i f a n t h e s i sa d v i s e r :p r o f w a n gq u a n x i a b s t r a c t p h o t o s y n t h e s i si st h em o s ti m p o r t a n tc h e m i c a lr e a c t i o na n d i st h ea c t i v i t yo fu l t i m a t e s o u r c eo fe n e r g yf o ra l ll i v e so nt h ee a r t h i nas e r i e so fc o m p l e xp h o t o s y n t h e t i cr e s p o n s e s , c a r b o na s s i m i l a t i o nr e a c t i o n ( c a l v i nc y c l e ) p h o t o s y n t h e s i sh a sb e e nt h ef o c u so fs c i e n t i f i c r e s e a r c ha st h em a j o r i t yo fb i o l o g i c a lc o n t r o lo ft h ec o r ea s p e c t so fp h o t o s y n t h e s i s i ti so fag r e a tp r a c t i c a lv a l u ei ns c i e n t i f i cr e s e a r c ha n dp r o d u c t i o nt od e t e r m i n et h el i m i t p o i n t sa n dt oi m p r o v et h ep r o d u c t i v i t y o fp l a n t s , i nc a l v i nc y c l e c a l v i nc y c l ei sas e r i e so f c o - e n z y m e - c a t a l y z e dt a n d e mr e a c t i o ns y s t e m ,t h ew h o l es y s t e mc o n t a i n s at o t a lo f1 1 e n z y m e s ,i n c l u d i n gc a r b o x y l a t i o n ,r e d u c t i o na n dr e g e n e r a t i o ni nt h r e es t a g e s ,r e s u l t i n gi n 13 一s t e pc a t a l y t i cr e a c t i o n t r i o s ep h o s p h a t ei s o m e r a s e ( t r i o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s e ,t p i ,e c 5 3 1 1 ) a n df r u c t o s e - 1 , 6 - d i p h o s p h a t ea l d o l a s e ( f r u c t o s e 一1 ,6 - b i s p h o s p h a t ea l d o l a s e ,f b a , e c4 1 2 。13 ) w e r et h ef i r s ta n d s e c o n d - e n z y m et oc a t a l y z et w os u c c e s s i v er e a c t i o ni n r e g e n e r a t i o np h a s e :t p ic a t a l y z e st h er e v e r s i b l ei s o m e r i z a t i o nb e t w e e nt w ot h r e e c a r b o n s u g a r 一3 一g l y c e r a l d e h y d ep h o s p h a t e ( g a p ) a n dd i h y d r o x y a c e t o n ep h o s p h a t e ( d h a p ) w h i l e f b a c a t a l y z e st h r e e c a r b o ns u g a rt of o r ms i x - c a r b o ns u g a r s - f r u c t o s e - 6 p h o s p h a t e ( f b p ) , i st h ef i r s te n z y m ec a t a l y z e s3 cc o m p o u n d si n t oc o m p o u n d so ft h e6 ca f t e rc 0 2f i x a t i o ni n c a l v i nc y c l e s i n c ef b aa n dt p ia r ee n z y m e sc a t a l y z i n gr e v e r s i b l er e a c t i o nt h a tc o n s i d e r e d ”n o n - r a t e - l i m i t i n ge n z y m e s ”,t h e yw e r en o tc o n s i d e r e ds om u c hi nt h et r a d i t i o n a ls t u d y i n r e c e n ty e a r s ,t h ea p p l i c a t i o no fa n t i s e n s et r a n s g e n i cp l a n t sr e s e a r c hb r i n g san e ww a yo f t h i n k i n go f t h er e g u l a t i o ni nc a l v i nc y c l e i nt h ec o n t e x t ,t h ea i mo ft h i ss t u d yi st o t e s tt h i st h e s i st oi d e n t i f yw h e t h e rd e e c y t o p l a s m i cf b at r a n s p l a n t e di n t oa n a b a e n a7 12 0c a ns p e e du pt h ep h o t o s y n t h e t i cc a r b o n a s s i m i l a t i o na n de v e n t u a l l yt os p e e du pt h er a t eo fp h o t o s y n t h e s i s s ow em e a s u r e da n d a n a l y z e dav a r i e t yo fp h o t o s y n t h e t i ca n do t h e rp h y s i o l o g i c a lp a r a m e t e r sa st h e i ra c t i v i t y , g r o w t h ,r u b i s c oa c t i v i t ya n dp h o t o s y n t h e t i co x y g e ne v o l u t i o n ,c e l ld r yw e i g h t ,l o w t e m p e r a t u r ef l u o r e s c e n c e ,f l u o r e s c e n c ed y n a m i c s ,a n dr e s u l t so ft h ee x p e r i m e n ta r e a s f o l l o w s ! 1 t r a n s g e n i ca n a b a e n af b as u c c e e di nc o n s t r u c t i o n ( r e 吼e d ) ,t h e nc u l t u r e di nt h e c o n d i t i o n s :b g i i ( - m ,t r i s h c i ( 5m m ,p h8 0 ) a n d2 ( v v ) c a r b o nd i o x i d ev e n t i l a t i o n , 3 0 ,t h et r a n s g e n i ef b ac a l lg r o wn o r m a l l ya n di nt h es a m ec i r c u m s t a n c e s ,f b aa n a b a e n a h a sah i g hg r o w t hr a t et h a n w i l d - t y p ec e l l s 2 t h ee n z y m ea c t i v i t yo ff b ah a sb e e ni m p r o v e di nt r a n s g e n i cf b ab u tn o ti np o s i t i v e c o n t r o lo rw i l d t y p e 3 w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a tr i b u l o s e1 ,5 - b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e ( r u b i s c o a c t i v a s e ) i nt h et r a n s f e rw a si n d u c e dl a r g e l y t h a ti s ,i n c r e a s e de n z y m ea c t i v i t yo ff b a i s r e l e v a n tt ot h ei n c r e a s ei nr u b i s c oa c t i v a s e 4 i nt h em e a s u r e m e n ta n dc o m p a r i s o no ft h et r a n s g e n i ca n a b a e n af b a ,p o s i t i v ec o n t r o l a n dw i l d - t y p ea n a b a e n aa b o u tp h o t o s y n t h e t i co x y g e nc h a n g e sa n dc e l ld r yw e i g h t ,w ef o u n d t h e s et w oi n d i c a t o r si nt r a n s g e n i ca n a b a e n ah a v eag r e a t e rd e g r e er a i s i n gw h i c hc o n f i r m e d o n c ea g a i nt h a tt h ee n z y m ef b a p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np h o t o s y n t h e t i co x y g e n 5 r o o mt e m p e r a t u r ea b s o r p t i o ns p e c t r as h o w e dt h et r a n s f e r r e de x o g e n o u sf b aa n a b a e n a h a sn o tc h a n g e dt h ec o m p o s i t i o no ft h eb a s i cp i g m e n t s ,l o wt e m p e r a t u r ef l u o r e s c e n c ea n a l y s i s s h o w e dt h a tb o t hp s i ia n dp s iu n d e ri n t e g r a t e dt r a n s f e ra n a b a e n af b at h ep o s s i b i l i t yo f p h o t o s y n t h e t i ce f f i c i e n c yi m p r o v e m e n t 6 d e t e c t i o no ff l u o r e s c e n c ek i n e t i c sa n a l y s i s :t r a n s g e n i ca n a b a e n af b ap h o t o c h e m i c a l q u e n c h i n gp a r a m e t e rq la n dq pw e r eh i g h e rt h a nw i l d - t y p ea n a b a e n a ( q li n c r e a s e d3 3 7 , q pi n c r e a s e d1 9 3 ) ,e n e r g yc o n v e r s i o ne f f i c i e n c yo f1 0 7 ,p h o t o e l e c t r o nt r a n s f e rr a t ee t r i n c r e a s e d1 7 6 ,t h ea c t u a lq u a n t u me f f i c i e n c yo fe l e c t r o nt r a n s f e ri n c r e a s e d1 7 7 p si i o ft r a n s g e n i ca n a b a e n ao nt h e a b i l i t y o fl i g h ta b s o r p t i o n , t r a n s m i s s i o n , d i s s i p a t i o n , d i s t r i b u t i o no fi n c r e a s e dw h i c he x p l a i n e da n a b a e n af b ac a p a b i l i t i e si nl i g h to ft h e a d v a n t a g e so fr e g u l a t i o na n dc o n t r o lf r o mt h e ”i n t r i n s i c ” t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a te x o g e n o u sf b ad i di n c r e a s et h ep h o t o s y n t h e t i ca c t i v i t yo f a l g a et oa c e r t a i ne x t e n t a n di tp r o v i d e st h eb a s i sf o rs t u d ya b o u tr e g u l a t i o na n dc o n t r o lt h e m e c h a n i s mo f p h o t o s y n t h e s i s k e yw o r d s :f r u c t o s e 一1 , 6 一b i s p h o s p h a t ea l d o l a s e ( f b a ) ;a n a b a e n a7 12 0 ;p h o t o s y n t h e t i c c o n t r o l ;f l u o r e s c e n c ek i n e t i c s c a t e g o r y o ft h e s i sr e s e a r c h :d r e s e a r c hr e p o r t v 光合作用专用词及缩写表 a t p c y t d h a p e 4 p f b a f b p f b p a s e g a p g a p d h n a d p p e p c 3 p g a p g k p r k p s i p s i i r p e r p i r u b i s c o r u b p s b p a s e s p s t k l t p i 缩写表 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 三磷酸腺苷 c n o c n o m e 细胞色素 d i h y d r o x y a c e t o n ep h o s p h a t e 磷酸二羟丙酮 e r y t h r o s e - 4 - p h o s p h a t e 赤藓糖- 4 磷酸 f r u c t o s e - 1 ,6 一b i s p h o s p h a t ea l d o l a s e 果糖- 1 ,6 一二磷酸醛缩酶 f r u c t o s e 一1 ,6 一b i s p h o s p h a t e 果糖- 1 ,6 - 二磷酸 f r u c t o s e 1 ,6 一b i s p h o s p h a t a s e 果糖一1 ,6 一二磷酸酶 g l y c e r a l d e h y d e s 一3 一p h o s p h a t e 甘油醛3 一磷酸 g l y c e r a l d e h y d e s 一3 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e 甘油醛- 3 一磷酸脱氢 酶 n i c o t i n a m i d ea d e n i n ep h o s p h a t e 磷酸烟碱腺嘌呤,辅酶i p h o s p h o e n o l p y m v a t ec a r b o x y l a s e 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 3 - p h o s p h a t e d g l y c e r a t e3 一磷酸甘油酸 p h o s p h o g l y c e r a t ek i n a s e 磷酸甘油酸激酶 p h o s p h o r i b u l o k i n a s e 磷酸核酮糖激酶 p h o t o s y s t e mi 光系统i p h o t o s y s t e mi i 光系统i i r i b u l o s ep h o s p h a t ee p i m e r a s e 磷酸核酮糖表异构酶 r i b o s ep h o s p h a t ei s o m e r a s e 磷酸核糖异构酶 r i b u l o s e 一1 ,5 - b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e1 , 5 二磷酸核酮 糖羧化力口氧酶 r i b u l o s e - 1 ,5 一b i s p h o s p h a t e ,1 ,5 一二磷酸核酮糖 s e d o h e p m l o s e - 1 ,7 一b i s p h a t a s e 景天庚酮糖- 1 ,7 一二磷酸酶 s u c r o s e - p h o s p h a t es y n t h a s e 蔗糖磷酸合成酶 t r a n s k e t o l a s e 转酮酶 t r i o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s e 丙糖磷酸异构化酶 a m p a m p 。 b p b s a c d n a c m c m 7 c p d n t p e b e d t a e g f h i t f k b k d a k n k n 7 m l n m t - i n e o n e o n t o d o r i p c r p r o u k p t r c 其他缩写表 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a m p i c i l l i nr e s i s t a n t 氨苄青霉素抗性 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清蛋白 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a c h l o r a m p h e n i c o l 氯霉素 c h l o r a m p h e n i c o lr e s i s t a n t 氯霉素抗性 c h l o r o p l a s t 叶绿体 d e o x y r i b o n u c l e o t i d e 脱氧核糖核苷酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r 表皮生长因子 h o u r 小时 i n t e s t i n a lt r e f o i lf a c t o r 小肠三叶因子 k i l o b a s e p a i r 千碱基对 k i l o d a l t o n 干道尔顿 k a n a m y c i n 卡那霉素 k a n a m y c i nr e s i s t a n t 卡那霉素抗性 m i n u t e 分钟 m e t a l l o t h i o n e i n i 小鼠金属硫蛋白 n e o m y c i ns u l f a t e 硫酸新霉素 n e o m y c i nr e s i s t a n t 新霉素抗性 n u c l e o t i d e 核苷酸 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 o r i g i n 复制起点 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p r o u r n 域奠曼s e ,男激酶哆 t h eh y b r i dt r p l a c p r o m o t e ro fe c o l i大肠杆菌t r p l a c 杂合启动子 r m i n s s d s s o d t r i s r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 s e c o n d 秒 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声 明并表示了谢意。 作者签名:e l 期: 砌钞 论文使用授权声明 护卜玉 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有 权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部 或部分内容,可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后 遵守此规定。 储甍刷磁名谢飙州_ 饥 吵硎可 f 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 果糖- 1 乒二磷酸醛缩酶( f r a ) 果糖1 , 6 - 二磷酸醛缩酶( f r u c t o s e 一1 ,6 一b i s p h o s p h a t ea l d o l a s e ,简称f b a ,e c 4121 3 ) 活性功能涉及c a l v i n 循环、糖酵解过程、糖异生过程以及氧化磷酸戊 糖途径等代谢途径,直接调节3 c 和6 c 碳水化合物之间的转换,在生命体代谢 过程中有若非常重要的作用。 l 1 1f b a 的基本结构 图1 - l 古细菌i 娄f b a 的一个亚基的三级结构( l o r e n t z e n ,2 0 0 3 ) f i g 10 1s t r u c t u r e o f o n es u b s t n l e t u r e o f a n c i e n tb a c t e r i a c l a s s i f b a f b a 的亚基为随封l ( 1 3 ) g 桶形折叠结构。在2 1 一a 分辨率下可以看到古细菌 f b a 与d h a p 之间的共价键( 图1 - 1 ) 。活性位点残基与经典的f b a 相比,没 有明显的序列相似性,但是有着相同的整体折叠( s i e b e r s 等2 0 0 1 ) 。 1 1 2 植物中的f b a 的分布和功能 根据催化机理的不同,可把f b a 分为系统发生和结构不相关的两种类型 ( m a r s h 和l e b h e r z l 9 9 2 ) 。第1 类f b a 为同源四聚体,亚基形成随机( p 8 桶形 沂叠,催化过程中在底物d h a p 、果糖1 , 6 一二磷酸( f b p ) 部分和活性位点赖氨 骏 氢基酸之间形成一个共价“s c h i f f 键”中间产物,受硼氢化物的抑制( l e b h e r z 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 和r u t t e r1 9 6 9 ) 。而第1 i 类f b a 是同源二聚体,亚基同样形成随机( 1 3 a ) 8 桶形折 叠,催化过程中利用一个二价金属离子( 常为z n 2 + 或f e 2 + ) 作为亲电子物质, 受e d t a 的抑制( r u t t e r1 9 6 4 ,z g i b y 等2 0 0 0 ) 。 两类f b a 的分布都非常复杂。第1 类f b a 主要广泛分布于真核生物中 ( g r o s s 等,19 9 9 ;j a c o b s h a g e n 和s c h n a r r e n b e r g e r ,19 9 0 ;l e b h e r z 等,19 8 4 ; m a r c h a n d 等,1 9 8 8 ;p e l z e r - r e i t h 等,1 9 9 3 ,1 9 9 4 ;p l a u m a n n 等,1 9 9 7 ;r u t t e r , 1 9 6 4 ;s c h n a r r e n b e r g e r 等,1 9 9 4 ) ,同时存在于少数蛋白菌中,但功能目前还不 清楚。古细菌和多种革兰氏阳性茵中特有的f b a 与真核生物和蛋白菌中的第1 类f b a 有远缘关系( s i e b e r s 等,2 0 0 1 ) 。红藻、绿藻以及植物中含有两种不同 的第1 类f b a ,一种存在于胞质中,参与糖酵解和糖异生过程;另一种在质体 中,参与卡尔文循环。后者可能起源于基因复制( g r o s s 等,1 9 9 9 ;k r u g e r 和 s c h n a r r e n b e r g e r ,1 9 8 3 ) 。第1 i 类f b a 主要存在于真细菌中,分为a 型b 型两 个亚群。第类a 型f b a 存在于多种真细菌以及子囊真菌和裸藻胞质中( m a r s h 和l e b h e r z1 9 9 2 ;p e l z e r - r e i t h 等1 9 9 4 ;p l a u m a n n 等1 9 9 7 ;r u t t e r ,1 9 6 4 ) ,第 1 i 类b 型f b a 也存在于不同真细菌、几种原生生物和g l a u e o p h y t ec y a n o p h o r a p a r a d o x a 质体中( g r o s s 等1 9 9 4 ;h e n z e 等1 9 9 8 ;n i c k o l 等2 0 0 0 :s a n c h e z 等 2 0 0 2 ) 。 两类f b a 均催化糖酵解中果糖。1 ,6 二磷酸( f r u c t o s e 1 ,6 一b i s p h o s p h a t e ,简称 f b p ) 分解生成g a p 和d h a p : f b p 曼尘专g a p + d h a p 或卡尔文循环中的逆向醛缩反应: g a p + d h a p 里鎏一f b p i 类f b a 对于高等植物卡尔文循环中可逆合成f b p 、s u b p 的反应具有双功 能作用。除催化丙糖醛缩合成f b p 之外,植物中的i 类f b a 以及c y a n o p h o r a p a r a d o x a 蓝质体中的i i 类f b a 还可以催化d h a p 和赤藓糖4 磷酸( e 4 p ) 可 逆缩合生成景天庚酮糖1 ,7 二磷酸( s u b p ) ( f l e c h n e re ta i ,1 9 9 9 ) : e 4 p + d h a p 坠 s b p 1 1 3 植物中f b a 的研究进展 1 1 3 1 植物及部分藻类胞质及叶绿体型f b ae d n a 及基因的克隆 k e l l e y ( 1 9 8 6 ) 首先从厌氧诱导的玉米种子中分离出编码f b a 的全长c d n a , 测序后确认是胞质f b a ( g e n e b a n k 登陆号p 0 8 4 4 0 ) 。此后拟南芥、水稻、菠菜、 豌豆等多种植物中胞质型f b a 、c d n a 及基因相继被克隆出来f 表卜i ) 。1 9 9 3 2 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 年,德国学者p e l z e r - r e i t h 等首次报道了菠菜叶绿体中包含转运肽编码序列的 f b ae d n a 序列( p 1 6 0 9 6 ) ,此后相继从菠菜、水稻、莱茵衣藻、烟草、盐藻中 克隆出叶绿体型f b a c d n a 及基因。 1 1 3 2 水稻胞质f b a 基因的克隆及其表达 1 9 9 6 年,n a k a m u r a 等报道了水稻胞质c 1 型f b a 的基因序列。1 9 9 7 年, 杨春松等用化学合成和从水稻根m r n ar t - p c r 相结合的方法获得了编码水稻 胞质f b a 的整基因,与水稻胞质c 1 型f b a 的基因序列的相应部分只有一个 氨基酸的差异。杨春松首次将在大肠杆菌中表达高等植物f b a 基因,并且分离 纯化后的表达产物显示f b a 酶活力( 陈海宝等,1 9 9 7 ) 。 2 0 0 1 年,唐功利等将杨春松克隆的f b a 基因与来源于菠菜叶绿体的1 p i 基因以及来源于小麦叶绿体的f b p a s e 基因串联起来构建进一个由启动子骶控 制的表达质粒p t r c f a t ,成功地在大肠杆菌中实现了上述3 个基因的活性共表 达。在此基础上换用p p s b a 启动子进一步构建了这3 个基因共表达的大肠杆菌 蓝藻穿梭表达质粒,也在大肠杆菌中实现了活性表达。但在转化蓝藻并没有获 得成功( 唐功利等,2 0 0 1 ) 。 2 0 0 3 年,马为民在唐功利工作的基础上,将a t f 、a t 分别构建共表达的 大肠杆菌蓝藻穿梭表达质粒p d c a t f 和p r l a t l 和p r l a 疋并用三亲接合转 移的方法将其分别转化入蓝藻中,提高转基因蓝藻光合碳同化效率,并加速了 其生长( m a w m ,2 0 0 4 ) 。 2 0 0 4 年,康瑞娟对马为民构建的p r l a t 2 转基因藻进行优化培养发现,在 较高c 0 2 条件下明显提高转基因蓝藻光合碳同似效率同时也加速了其生长( 康 瑞娟,2 0 0 4 ) 。 1 1 3 3f b a 在其他植物中的转基因研究 2 0 0 2 年,复旦大学博士张小宁等报道了n a c i 诱导的盐藻f b a 基因序列 ( a f 3 2 9 6 7 4 ) ,其与植物叶绿体f b a 基因的同源性为7 3 6 6 。然后用其转化 烟草发现d s a l d p 被整合入转基因植物基因组中并且有效表达,提高了植物的 耐盐性( z h a n gx n ,2 0 0 3 ) 。这是在植物中表达藻类a l d p 基因的第一篇报道。 1 2 蓝藻基因工程 1 2 1 蓝藻基因工程概述 蓝藻( b l u e g r e e na l g e ) 又称蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) ,是一类可以进行放氧 光合作用的原核生物( s t a n i e r ,1 9 7 7 ) 。由于在进化上蓝藻是高等植物中叶绿体 的祖先,因此,在形态、结构、分布和代谢上蓝藻都有其固有的特点: 在形态上,可分为单细胞蓝藻和丝状体蓝藻,而丝状体蓝藻又可分为无分 3 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 化丝状体、具有异形胞的丝状体和具有分支的丝状体( s t a r l i e r ,1 9 7 7 ) 。 在细胞结构上,蓝藻作为原核生物,它没有真正意义上的细胞核,没有叶 绿体及线粒体等细胞器的分化,但却与其它光合细菌不同,具有两个光系统。 蓝藻的细胞壁结构和遗传性质与大肠杆菌非常相似,都具有革兰氏阴性染色的 细胞壁、都具有简单的基因组( s t a n i e r ,1 9 7 7 ) ,但在另一方面,蓝藻又与高等 植物的叶绿体具有很高的同源性( g r a y ,1 9 8 9 ) 。 蓝藻具有极强的环境适应能力,它广泛分布于自然界中,从南极到赤道, 从土壤到湖泊到海洋都有蓝藻生长。这是由于蓝藻可以形成多种形式的细胞以 适应环境的变化,如,形成可以固氮的异形胞( h e t e r o c y s t ) 、几乎处于休眠状态 的厚垣孢子( a k i n e t e s ) 及可以游动扩散的藻殖段( h o r m o g o n i a ) ( 钟泽璞,2 0 0 0 ) 。 在代谢上,蓝藻可以进行以水为最初电子供体的放氧光合作用,这与高等 植物的光合作用很相似。在固碳途径上,蓝藻以卡尔文循环的三碳途径为主, 但有2 0 的碳是以四碳形式固定的,所以蓝藻对c 0 2 的利用效率要比大多数三 碳途径绿色植物高。此外,蓝藻可以吸收代谢无机态的氮,有些还具有固氮和 放氢的功能。这是由于异形胞的分化出现,为固氮酶和氢酶提供了厌氧环境, 使蓝藻在进行放氧光合作用的同时进行厌氧的固氮作用成为可能。因此,蓝藻 可以在缺乏结合态氧和有机碳的环境中有效地利用光能、二氧化碳、水和无机 物,这是其它生物所无法比拟的。 由于蓝藻结构简单便于基因操作,在进化上又处于细菌与高等植物的过渡 期,加之集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 和鱼腥藻a n n a n a e n as p p c c7 1 0 2 基因组全序列测定的完成( k a n e k o ,1 9 9 6 :k a n e k o ,2 0 0 1 ) ,吸引越来越多的 科学家把蓝藻作为模式生物,在分子水平在解释植物光合作用、固氮、细胞分 化等生命现象,甚至用来帮助解释动物体内复杂的信号传导途径。如,许多蓝 藻中参与光合作用的基因被克隆以用作高等植物的探针( h o u m a r d ,1 9 8 8 ) :2 0 0 0 年,c h e n 等人( c h e n ,2 0 0 0 ) ,通过对蓝藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 的研究, 发现h c 0 3 - 是可溶腺苷酸环化酶的唯一调控因子,这一发现,对哺乳动物c a m p 信号传导通路的迸一步研究及对与该传导通路有关的疾病的探索有重大的意 义。 除作为模式生物用于基础理论研究外,蓝藻还可作为外源基因的表达宿主, 用于生产基因工程药物或环保。与常用的表达宿主,大肠杆菌( h o c k n e y ,1 9 9 4 ) 、 酵母( b u c k _ h o ! z ,1 9 9 3 ) 或哺乳动物细胞( l e v i n s o n ,1 9 9 0 ) 宿主相比,蓝藻具 有环境适应能力强、培养成本低、不形成包含体、不含内毒素、本身含有对人 体有益的营养成分等优点。 4 上海师范大学
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