（植物病理学专业论文）槭菌刺孢真菌色素产生规律及理化性质研究.pdf

摘要 摘要 沈阳农业大学植病流行研究室在研究细辛新病害一细辛叶桔病病原生物 学过程中发现，该病病原真菌槭菌刺孢( 彤c ，0 印删a c j 加) 属中 国真菌新记录种，在人工培养条件卜能产生鲜艳的玫瑰红色素。本文对浚色 素进行了较深入的研究，主要包括：色素产生规律研究；摇瓶发酵条件研究； 色素提取工艺研究：色素稳定性研究和安全性评价等几个方面。结果如下： l 、槭菌刺孢在不同培养基上培养，不同光源下，不同曝光时间，不同 温度下，产生的色素也是有差异的。试验证明：在大米粒培养基，高粱米培 养基，p d a 上培养产生的色素颜色鲜艳，少量的糖能促进色素的产生；在目 光灯和室内自然光下产生色素的效果比较好，而日光直射不易产生色素；曝 光时间越长，产生的色圈颜色越深；产色素的最适温度为1 5 一2 0 。 2 、槭菌刺孢菌株摇瓶发酵最佳碳源是蔗糖，最佳有机氮源为黄豆粉。 其最佳培养基组成为蔗糖6 ，黄豆粉2 2 6 ，( n h 。) 。s 0 40 1 6 ，c a c o 。0 4 5 ， n a c l0 1 9 。最佳发酵条件为2 0 。c ，l o o r m i n ，起始p h 值为7 0 ，在2 5 0 m l 的三角瓶中加入优化发酵培养基5 0 m l ，发酵培养l o d 。 3 、槭菌刺孢红色素提取的最佳工艺条件为：以三氯甲烷为浸提剂，料 液比为l ：8 ，温度为5 0 。c 、浸提时间5 h 、p h 值为7 0 时的提取效果最好， 并在此综合条件下浸提两次。该色素提取物是由4 6 种分子量在1 8 0 0 至1 9 0 0 且极性非常相近的成分组成。 4 、研究了槭菌刺孢微生物红色素的光稳定性、热稳定性、氧化还原稳 定性和p h 值稳定性，并对常用的几种食品添加剂对槭菌刺孢微生物红色素 的稳定性进行了探讨，结果表明：除强碱( p h 9 ) 、强光照对槭菌刺孢微生 物红色素有不照影响外，其它因素对其无明显不良影响。因此，槭菌刺孢微 生物红色素是一种性能优良的色素。 5 、槭菌刺孢红色素经急性毒理试验和蓄积性毒理试验测试下是安全可 靠的。 综上所述，槭菌刺孢红色素是一种易提取、稳定性较好、安全无毒的天 然色素，具有广泛的应用前景。 关键词：槭菌刺孢；微生物色素；发酵条件；提取工艺；稳定性；安全性 前言 前言 食用色素，属于食品添加剂的。类，通常分为两类：合成色素和天然色 素。虽然合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、配色方便、价格便 宜等优点。但近年来，随着医学毒理学和生物学实验的发展，化学合成色素 由于其大多数种类对人体有毒害作用，其应用正在受到限制，品种正在逐年 减少。天然色素正日益受到人们的重视，研究深度和广度不断增加，成本不 断下降，应用越来越广泛。 目前，经国家批准允许生产和使用的天然色素有4 8 种。我国色素年产 量约为2 5 万吨，天然色素的年增长量为5 ，产值约为合成色素的1 0 倍。 据估算，目前日本的天然色素市场规模达到2 0 0 多亿日元，合成色素约2 0 亿日元，年产量为5 万吨，而美国年产量约为7 万吨；我国的天然色素生产 量与美国、日本及别的一些欧美国家的天然色素生产量相差较远；然而，我 国的天然色素需求量很大，尤其是对黄色素和红色素需求量特别大，其生产 量远远不能满足我国人民的消费需求，这表明我国的天然食品色素生产行业 尤其是黄色素和红色素生产行业具有很大的发展空间。 近年来，微生物源天然色素的开发研究越来越受到人们的重视。微生物 源色素具有无毒、无致畸变、稳定性强的特点，其种类繁多、色彩绚丽。很 多真菌、细菌等微生物在菌体生长过程中能够生成不同颜色和结构的色素， 其中以红曲色素、类胡萝h 素和天然蓝色素等研究最为广泛。 本实验室在研究细辛新病害一细辛叶枯病病原生物学过程中发现，该病 病原真菌槭菌刺孢( m y o o o e n t r o s p o r aa c e r i n a ) 属中国真菌新记录种，在 人工培养条件下能产生鲜艳的玫瑰红色素，本文对色素产生规律研究、摇瓶 发酵条件研究、色素提取工艺研究、色素稳定性研究和安全性评价等几个方 面进行了系统的研究。 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章天然色素研究现状及开发前景 色素是食品添加剂的重要组成部分，它不仅广泛应用于食品工业以改善 食品的色泽，而且还广泛用于医药和化妆品。色素通常分为两类：合成色素 和天然色素。 自1 8 5 6 年英国的p e r k i n s 第一个合成了有机色素苯胺紫后，许多有机 色素相继合成，并得到广泛应用( 凌关庭，2 0 0 0 ) 。这是因为合成色素具有 色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、配色方便、价格便宜等优点。但合成色素 大多是以焦油衍生物为主要原料合成的偶氮化合物或是三苯甲烷的芳烃化 合物，多数对人体健康有危害，甚至有致癌、致畸、致突变等严重后果。此 外，产品中还可能混入色素中间体，或产生有毒副产物。如苯酚、苯胺等， 对健康影响也极大。因而其应用r f 在受到限制，品种正在逐年减少。 天然色素正日益受到人们的重视，研究深度和广度不断增加，成本不断 下降，应用越来越广泛。天然色素作为重要的食品添加剂，不仅广泛应用于 饮料、糖果、糕点、酒类等消闲食品，以帮助校正色率的偏差或强调食品所 具有的风格；而且，也应用于医疗保健品的生产( 董世林，1 9 9 4 ；b a u e r n f e in d jc ，l a c h a n c epa ，1 9 9 2 ) 。 一、天然色素的性质特点 食用天然色素与食用合成色素相比，具有下列特点( 董世林，1 9 9 4 ； b a u e r n f e i n djc ，l a c h a n c epa ，1 9 9 2 ：刘晓庚2 0 0 0 ) ： 1 、优点( 1 ) 天然色素多来自动、植物组织，特别是从已知食物中分离 出来的，化学结构上又无变化的色素，对人体的安全性较高；( 2 ) 有的天然 色素兼有营养( 如核黄素，胡萝h 素) 或药理作用( 如强肝，利尿等) ：( 3 ) 天然色素能更好的模仿天然物的颜色，着色时色调比较自然。 2 、缺点( 1 ) 溶解性差。除辣椒红素和叶绿素为脂溶性外，其余都为水 溶性，溶解度低，使用时不易拍得均匀，常发生沉淀，且不易调色和着色： 第一章天然色素研究现状及开发前景 ( 2 ) 纯度低。因多从天然原材料中提取，常共存有其他成分并伴有特殊异 臭；( 3 ) 色调不稳定，受周围环境影响较大( 如p h 值、金属离子、溶剂、浓 度等) ，特别是p h 值改变时，色素结构发生变化，所呈颜色也随之而变( 甜 菜红除外) ；( 4 ) 耐光性、耐热性弱。 二、天然色素的分类 ( 1 ) 按原料来源不同可分为植物色素、动物色素、微生物色素和矿物 色素。但通常我们并不把矿物色素列入天然食用色素的范畴讨论。 ( 2 ) 按色调不同，天然色素可分为红紫色系列、黄橙系列及蓝绿系列。 ( 3 ) 按化学结构式不同，可分为：类胡萝h 素类、花色苷类；查尔酮 类、黄酮类、花青类、双酮类、其它类等八类( 中国食品添加剂生产应用工 业协会，1 9 9 6 ；金时俊，1 9 9 2 ；胡隆基，1 9 9 3 ) 。见表1 1 三、天然色素的提纯、分离精致 l 、提取 天然植物色素的提取主要有溶剂提取、压榨、熬煮、化学处理、粉碎等 方法，其中溶剂提取是最常用的方法( 王桃云，万承永，王飞，2 0 0 1 ；戴宝 和，1 9 9 3 ；董世林，1 9 9 4 ) 。 ( 1 ) 溶剂提取法：常用的溶剂提取方法有浸渍、渗漉、回流及连续回流 等。选用的溶剂要对色素成分溶解度大，对杂质溶解度小。脂溶性色素用亲 脂性有机溶剂提取，水溶性色素用水或亲水性有机溶剂乙醇、甲醇、丙酮等 提取，如b 一胡萝h 素用脂溶性溶剂二氯甲烷、石油醚等提取，而花色甙类 色素多用水或乙醇提取。水是提取水溶性色素最常用的溶剂，为了提高色素 的提取率，常用酸水或碱水。如碱水提取液可用来提取黄酮、蒽醌、酚类等 色素成分，酸水或酸性乙醇常用于提取花色素类。 沈阳农业大学硕士学位论文 表1 一l 天然色素的分类 t a b e 1ic l a s s if i c a t i o no ft h en a t u r a lp i g m e n t 化学结构类别 c h e m is t r ys t r u c t u f ec a t e g o r y 主要成分 m a i nc o m p o s iti o i l 辣椒色素 类胡萝h 素类 安娜红色素 栀子黄色素 胡萝h 素 玉米色素 紫苏色素 葡萄色素 花色甙类 红甘蓝色素 越桔红色素 查尔酮类 卟啉类 黄铜系 双醺类 甜菜花青类 醌类 萝h 红色素 玫瑰茄色素 黑豆红色素 红花黄色素 红花红色素 菊花黄色素 叶绿素色素 高粱色素 甘草色素 可可色素 姜黄色素 甜菜红色素 胭脂虫色素 胶虫色素 茜草色素 紫草根色素 红瞳色素 辣椒、胡萝h 胭脂树种子 山栀子果实 胡萝h 、柑桔皮 玉米 紫苏叶 葡萄果皮 红甘蓝 越桔浆果 萝h 玫瑰茄花萼 黑豆皮 红花 红花 大金鸡菊花 蚕纱、藻类 高粱壳 甘草 可可豆皮 姜黄根茎 红甜菜 雌胭脂虫 树脂胶虫 茜草 紫草根 红曲霉菌丝 辣椒红素、辣椒玉红素 胭脂树橙素、降胭脂树 素 藏花素、藏花酸 1 3 一胡萝h 素 矢车菊素一3 一葡萄糖甙 矢车菊双甙 锦葵花素一3 一葡萄糖甙、 飞燕草素 矢车菊素一3 一r 一5 一g i 一甙 越菊花青甙等 天竺葵一葡萄糖甙、矢车 菊素一3 一葡萄糖甙 飞燕草素、矢车菊素 飞燕草菊糖甙 红花黄甙 红花红甙 查尔酮甙 叶绿素铜钠盐 芹菜紫，5 ，77 ，4 一三 羟基黄酮等 异甘草甙 多酚类 姜黄素 甜菜甙 胭脂红酸 胶虫红酸 茜草酸 紫草素 核黄素 其它 焦糖色素 食用碳水化合物 还原糖经脱水缩合物 一 垫菱耋壁塑：萋笠 鳖薹鲞 5 豢 第一章天然色素研究现状及开发前景 ( 2 ) 压榨：利用挤压方法，将粉碎后的新鲜植物的叶、果、皮中色素成 分随植物浆液挤压出来。此法适宜于水溶性色素提取，但压榨成分过于复杂， 需用其它方法精制。 ( 3 ) 熬煮：将本来无色的物质或非需要色的物质，经熬煮转化成需要色 的物质，如焦糖色素、甘薯酱色素。 ( 4 ) 酶反应：通过酶反应产生所需要的颜色，如栀子果实用水提取出的 黄色素，食品加工中经酶处理产生栀于蓝色素、红色素。 ( 5 ) 培养法：将菌株散布于培养基中，培养后干燥、粉碎、浸提，如蓝 藻色素。 ( 6 ) 粉碎：样品干燥后，粉碎制成色素制品，如可可豆色素。 2 、分离精制 精制天然植物色素因含有其它成分，直接影响色素的稳定性、染看性及 应用范围，必须进一步加以分离精制( 中国食品添加剂生产应用工业协会， 1 9 9 6 ) 。 ( 1 ) 溶剂分离，根据色素与杂质在不同溶剂中溶解度的差异，以不同溶 剂，由低极性到高极性分步进行提纯分离，除去杂质。如色素水提液中常含 蛋白质、树胶、粘液质等，可加入一定量乙醇，沉淀这些杂质：还可以利用 不同酸碱进一步分离。 ( 2 ) 两相萃取：利用色素与杂质在两相溶剂中分配系数不同加以分离。 如水提取液中的脂溶剂杂质，可用亲脂性溶剂石油醛、正己烷等除去；提取 黄酮色素时，多采用乙酸乙酯水两相萃取；提取亲水性强的甙类则采用 正j 醇水两相萃取。为了提高分离效果，可采用逆流连续萃取和逆流分 配。 ( 3 ) 酶精制：利用酶催化分解作用，使杂质通过酶反应除去。如蚕纱提 取叶绿素，利用酶精制方法，可除去令人不快的气味，得到优质叶绿素。 ( 4 ) 膜分离：利用色素与杂质分子大小的差异，采用纤维素超滤膜和反 沈阳农业犬学硕士学位论文 渗透膜，可阻留各种不溶性大分子如多糖、蛋白质等。膜分离工艺简单，效 能提高，如可可色素、红曲色素、白苏红色素的分离。 ( 5 ) 柱层斩：利用不同吸附剂或固定相通过柱层析分离提纯色素。如离 子交换树脂柱层析纯化葡萄皮色素，可除去糖，有机酸等杂质；聚酰胺层析 适用于黄酮类、醌类、酚类色素的分离，如红花黄色素、红色素：硅胶柱层 折适用于小分子日旨溶性色素( 如黄酮醇) 的分离。 一些先进技术，如微波提取、超临界c o 。提取精制辣椒色素、胭脂树脂 红、冷冻技术制取桔子黄色素等。 四、天然色素的研究范畴及趋向 天然色素是- - l l 综合性学科，涉及面广，其科学研究、生产和应用的主 要内容涉及生物学、化学、生物工程、化学】：程、食品工程、药学等学科范 畴。天然色素产业的发展，即与上述各学科的研究成就相互交叉促进密切有 关。现将天然色素的研究内容和动向概述如下： ( 一) 生物学研究 1 资源研究 调查含有色素的生物资源的品种、分布和蕴藏量。传统用作食品、药品 的材料安全性高，开发难度较小。一些品种是传统的食品着色刹，色素含量 高，开发价值较大；有些品种可通过综合利用提高经济效益，也有开发价值。 随着天然色素的应用需求增加，需要继续筛选资源丰富或易于发展，色素含 量高，色调齐全，性能优良，成本低的天然色素资源。微生物色素资源易于 发展，有利于工业化生产，如胡萝h 素的微生物资源有较大的开发价值( 姜 文侯，1 9 9 4 ) 。 2 、育神 选育优良的微生物、植物或动物品种，以获得抗逆性强、高产、色素含 量高、杂质低的品种，对色素的生产有重要的经济价值。红曲色素菌株( 傅 第一章天然色素研究现状及开发前景 亮等，1 9 9 6 ) 、胡萝h 色素菌株( 姜文候，1 9 9 4 ) ，花青甙细胞株系( 李树敏， 1 9 9 2 ) 的选育丁作已取徂一定的进展。 3 、引种栽培( 养殖) 天然色素自然资源一般有限，适应不了集约化、规模化生产的需要。植 物资源需引种栽培，研究光、温、湿、土、肥、微量元素、激素等因素的调 节和运用，以及农业工程技术如立体农业、棚栽、无土栽培。喷灌、微灌、 滴灌等技术的运用，研究病虫害防治，是提高产量和色素含量，提高机械化 水平，降低成本的重要途径，并为集约化、规模化生产刨造条件。良种的快 速繁殖也是一项研究内容。对藻类植物、动物色素资源，需研究其高产、高 效养殖技术。 4 ，天然色素的生物合成机制、代谢控制与调节方面的研究 开展这方面的研究将更有效地掌握天然色素的形成规律，有利于进行定 向的生物合成，以达到提高产量的目的，对以生物技术生产的天然色素尤有 意义。目前，对胡萝h 素、花青贰、紫草色素等( 周立刚等，1 9 9 1 ；周守例 等1 9 9 1 ) 的研究已取得一定的进展。对生物合成各个阶段的各种特异性酶的 研究，有可能在将来采用一系列固定化酶，在无细胞条件下合成色素。 5 细胞和组织培养研究 组织培养简单地说就是将植物的某一部分，如：根、茎、叶、花、甚至 果实切下- - + 块组织，将其移植到固体或液体培养基上，供给其所需的营养 成分，以达到生长的目的。用细胞和组织培养的生物工程方法以获取植物色 素，不受地区、气候、季节、病虫害等因素的影响，易调控、周期短、占地 小，有利于大量生产所需要的色素，降低成本。此外，通过组织培养，可以 快速繁殖良种种苗。日本己用此法生产紫草色素投放市场( 周守例等1 9 9 1 ) 。 6 毒性、药理和药效研究 食用天然色素与人们身体健康密切相关。按食品卫生有关法规，食用天 然色素新资源需经毒理学试验确认安全性( 李鸿英，1 9 9 2 ) 。天然色素资源 沈阳农业大学硕十学位论文 大多为传统治疗药物，色素的药理、药效、f 临床研究有助于了解色素的保健 和治疗功效，为推广天然色素的应有，扩大应用范围，开辟前景广阔的医药 应用市场提供依据。胡萝h 素、花青甙、蓝藻色素、紫草色素、茜草色素、 茶色素等天然色素都证明有较好的药效。 ( 二) 化学方面的研究 1 、化学成分研究 为食用天然色素的寻找、分类、提取、应用提供依据。化学成分研究， 关键在于色素的分离、纯化和鉴定。近年来，化学分离、纯化新技术的应用， 使复杂天然色素的组分分离和纯化取得了飞跃性的进展，如液滴逆流色谱 法、大网格树脂吸附色谱法、凝胶色谱法，高效液相色谱法的应用。在化学 结构鉴定方面，应用高磁场核磁共振新技术和新的质谱技术，高极性大分子 天然色素的真正化学结构测定取得突破。核磁共振新技术包括高磁场( 4 0 0 6 0 0 h z ) 1 h 、1 3 c 、d e p t 、d i f n o e 、h o h a h a ( e d m a r d se t a l ，t 9 8 6 ) 等一维谱 和c o s y 、c o l o c 、h n i b c 、h m q c 等二维谱，质谱新技术有f a b m s 、s i m s 、离子 喷雾质谱等( 周荣汉，1 9 8 8 ；n a k a t a n ine t a l ，1 9 9 5 ) 。应用新方法、新 技术和先进的仪器设备研究食用天然色素的化学成分很有价值。 2 理化性质研究 为食用天然色素的提取、精制、生产、贮藏、检测、应用提供依据。色 素的理化性质涉及色素的形成、变化、反应动力学( 王华兴等，1 9 9 2 ) 、色 素与其他物质的相互作用。光、热、金属离子、微生物、食品基质对色素的 影响、光谱特性等内容。近年来，国外用先进手段研究了色素的稳定、增色、 变色、消色的机制，从分子水平揭示色素的理化性质是个值得注意的研究 方向。 3 天然色素的改性 通过改造天然色素的结构，以获得新的色调或改善色素的稳定性、溶解 第一章天然色素研究现状及开旋前景 性、着色力，有很大的应用价值。栀子黄色素经生物化学技术处理可得到蓝 色的桅子蓝色素、红色的桅子红色素( 楚福增等，1 9 9 1 ；刘成伦等，1 9 9 6 ) ； 红曲色素化学处理，水溶性及对酸碱和光的稳定性增加；叶绿素铜钠盐是叶 绿索经化学处理而改性的色素( 李鸿英，1 9 9 2 ) 。 通过加入添加剂或将天然色素混合使用，也可增加色素的稳定性或增加 溶解性。花色甙加入黄酮类化合物可增加稳定性；类胡萝b 素色素与v c 、v 。 等并用，可大大提高光稳定性；茶色素与甜菜红色素混合，可络合成稳定性 较高的色素。脂溶性的姜黄、辣椒色素加人添加剂可调制成水溶性色素。 4 食用天然色素的检测 天然色素的定性、定量检测，是测定色素理化性质的基础，也是食品卫 生检测的基础。定性检测一般由色谱、光谱、化学反应特征来确认，定量检 测一般由比色法测定，需要选择适当的比色条件。食品中使用的色素检测是 食品卫生监督的一项重要内容。 ( 三) t 艺和工程技术方面的研究 研究色素的生成、提取、精制、浓缩、干燥等过程的工艺选择及因素优 化、设备设计、选择及操作，以提高生产能力及效能、降低能耗和成本，提 高工艺稳定性，使过程连续化、自动化。 微生物色素通过微生物发酵生成。培养基、培养条件、发酵设备有很多 研究内容。一些植物色素是在对植物原料的加工中生成的，加工工艺和设备 的研究是一项重要内容，如茶色素。 色素原材料多种多样，色素的提取要根据物料的性质、色素的理化性质、 化工原理来选择溶剂及其用量、温度、p h 、时间等工艺条件。化工提取新技 术、新设备在天然色素提取中值得作应用研究，如加酶提取、超临界c 0 ：提 取、连续逆流提取、电磁、脉冲、超声提取等新技术及设备。 在对提取液处理的过程中，需要进行液固分离操作，设备的选择和现代 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 化对生产有一定价值。可供选择的技术和设备有压滤、吸滤、离心过滤等过 滤设备，沉淀、离心等沉降分离技术和设备。应用高分子絮凝剂对改善过滤 性能和效果可能有一定价值。 色素提取物成分复杂，会对染眷眭、溶解性有不良影响，甚至引起异臭、 异昧、沉淀等缺点，可通过精制加以改善。近年来，超滤、反渗透、电渗等 膜分离技术、大网格树脂吸附、凝胶色谱技术的发展和应用，为天然色素的 精制提供了经济、有效的方法( 刘成伦，1 9 9 6 ) 。 为获得便于运输、贮存、使用的色素，要对天然色素进行浓缩干燥。天 然色素多为热光不稳定物质，要避免长时间加热和曝晒。可供选择的浓缩方 法有真空浓缩、升膜、降膜、多效、离心等薄膜浓缩、刮板蒸发、膜分离浓 缩等等。干燥方法有真空干燥、喷雾干燥、刮板干燥、微波干燥、惰性载体 流化床干燥、喷雾造粒干燥等等。 各种方法、设备的适用性、技术、经济效果的研究对天然色素的生产有 重要的价值。 ( 四) 应用研究 研究食用天然色素的适用范围、使用力式、复方应用、调色及着色效果， 为天然色素的推广应用提供依据。天然色素的系列化、配套化、分类应用指 导，使天然色素的应用更加方便可行( 伍广发，1 9 9 1 ) 。天然色素直接作为 药品用于临床有广阔的市场前景。 五、微生物色素的开发与应用 近年来，微生物产天然色素的开发研究越来越受到人们的重视。微生物 色素具有无毒、无致畸变、稳定性强的特点，其种类繁多、色彩绚丽，除红、 橙、黄、绿、青、蓝、紫、褐和黑色之外，还有介于它们之间的多种颜色。 微生物色素有产生于细胞内的，有在细胞外的；有自身合成的，有转化培养 基中的某些成分而形成的。一般微生物色素可以分为两类，菌苔本身呈色而 第一章天然色素研究现状及开发前景 不渗入培养基，称为非水溶性色素：菌苔本身呈色或不呈色，但使培养基呈 色，称水溶性色素。 ( - - ) 微生物色素资源 很多真菌、细菌等微生物在菌体生长过程中能够生成不同颜色和结构的 色素，其中以红曲色素、类胡萝h 素和天然蓝色素等研究最为广泛。 在色素资源中，人们最为熟知的当属能产生红曲色素的红曲霉。红曲霉 是腐生真菌，它属真菌门( e u m y c o p h y t a ) ，子囊菌亚门( a s c o m y c o t i h a ) ， 不整囊菌纲( p 1 e c t o m y c e t e s ) ，红曲科( m o n a s c a c e a e ) ，红曲霉属( m o n a s c u s ) ( 张纪忠，1 9 9 0 ) 。月本报道该属有4 0 多种( h a w k s w o r t hdl ，p i t tj ，1 9 8 3 ) ， 国内报道有1 7 种，中国科学院微生物菌种保藏管理委员会正式编目的重要 红曲霉有8 种4 8 个菌株。 几乎所有光合微生物都可产生类胡萝h 素，如光合细菌( 王业勤，李勤 生，1 9 9 7 ) 等。许多非光合微生物也含有类胡萝h 素，如红酵母菌、分枝杆 菌、藤黄八叠球菌和嗜盐菌( 薛梅，1 9 9 4 ) 等。类胡萝h 素也广泛分布于所 有主要真菌类群中，例如接合笄霉( c h o a n e p h o r ac o n u n e t a ) 、三孢布拉氏 霉( b a k e s l e at r i s p o r a ) 、好食链孢霉( n e u r o s p o r as it o p f l i l a ) 以及菌核青 霉( p e n i c i l l i u ms c l e r f i o r u m ) 等，此外某种链霉菌即s t z e p t o m y c e s c h r e s t o m y c e t i c u s 在菌丝中也形成大量的类胡萝h 素。目前，国内外关于各 种类胡萝h 素的微生物资源的研究已相当广泛和深入。 高产黑色素的微生物种类也很多，如链霉菌、嗜麦芽假单胞菌等( 彭方 等，1 9 9 6 ) 。许多假单胞菌和一些放线菌可以产生各种颜色的吩嗪类色素， 如紫色的碘菌素、蓝绿色的绿脓杆菌素、金黄色的金色菌素等。在蓝色素产 生菌的找寻过程中，放线菌成为研究工作者们关注的焦点，其中链霉菌属就 包含有多种蓝色素的产生菌。 ( 二) 微生物色素生物学性质与研究现状 微生物色素是一种次生代谢产物，一般是在菌体生长后期开始形成，其 些塑查些查兰竺兰堡丝茎 形成过程可能是在培养基中缺乏某种营养物质，菌体的生长过程受到限制时 被启动的。次生代谢作用在微生物的生命活动中仅占次要地位，因而所受到 的选择压力较少，便造成这种作用的多样性和复杂性。 微生物色素是由色素基因编码的酶决定的，具有种的特性。色素合成作 用的酶对底物的特异性不高，某一种酶的催化活动被外界因素或内部因素抑 制时，就会产生完全不同的色泽。其中培养基成分对色素产生影响很大，不 同种类的菌株可能需要不同的适合于产色素的培养基( 李友荣等，1 9 8 9 ) 。 近年来国际上对色素形成的有关基因进行了较深入的研究。自从 w a c k e t t 和g i b s o n 报道含有克隆的假单胞杆菌双加氧霉基因片段的大肠杆 菌可以合成靛蓝后，细菌法生产靛蓝已为世人所关注。我国的吴云等将含有 双加氧酶基因的萘降解质粒转移到含有色氨酸酶编码基因的大肠杆菌中，获 得了接合子和转化子，既能降解萘又能合成靛蓝，证实了这种重组后的共同 作用。孙国萍( 孙国萍，1 9 9 5 ) 等采用c o s m i dp l ，a r f l 构建了完整的2 一萘 酸代谢菌2 一n a t 菌株的基因文库。通过分析基因文库中产生蓝色色素的克 隆验证了2 一萘酸代谢基因在大肠杆菌体内得到表达，并导致重组细菌产生 靛蓝。从产生靛蓝的克隆抽提重组的c o s m i dd n a 进行酶鳃分析，发现所有 能产生靛蓝的克隆均含有一大小相同的d n a 片段。用重组细菌进行靛蓝生物 合成的试验展示了微生物法生产靛蓝的美好前景。 1 9 9 0 年，日本麒麟啤酒公司等首先报道了噬夏孢欧文氏菌( e r w i n a u r e d o v o r a ) 的类胡萝h 素合成基因的核苷酸顺序，并在世界上首次克隆成功 全反式0 一胡萝h 素和番茄红素等黄色、橙黄色的类胡萝b 合成酶基因群 ( m i s a w an e ta l ，1 9 9 0 ) ，导入大肠杆菌，酒精生产菌运动发酵单胞菌 ( z y m o n o n s sm o b i l i s ) 等进行类胡萝h 素发酵生产获得成功。国际很多生物 技术单位都加紧开展类胡萝b 素生物合成基因组的研究工作，这一领域的竞 争很激烈。目前已从细菌、植物、藻类和真菌中分离出1 5 0 多种带有2 4 种 不同类胡萝p 遗传酶编码的基因( h ir s c h b e r gj ，c o h e nm ，h a r km ，p ca ， 第一章天然色素研究现状及开发前景 1 9 9 7 ) ，这些基因可被用于重组微生物基因工程化生产各种结构不同的类胡 萝h 素。并且已经从许多具有类胡萝b 素代谢特性的细菌中克隆n t 完整的 类胡萝h 素生物合成遗传基因，噬夏孢欧氏菌的玉米黄质二糖苷合成途径和 红细菌的非环状叶黄素合成途径是最早的两条所有合成酶都被鉴定出来的 类胡萝h 素合成途径( a r m s t r o n g6 a ，1 9 9 7 ) 。我国在这方面的研究中也取 得了一定的突破，如湖北医科大学病毒研究所用接合转移的方法，将萘降解 性质粒( n a h ) 转移到类胡萝h 素产生菌中，获得了在不同培养条件下既能产 生类胡萝b 素，又能产生靛蓝的菌株( 李晖等，1 9 9 8 ) 。 近些年，国内外对黑色素的研究已相当广泛和不断深入。酪氨酸酶基因 ( m e ) 编码的酪氨酸酶又称多酚氧化酶，是合成黑色素的关键酶，存在于细 菌、放线菌、真菌、植物和动物体内，其功能主要是产生黑色素。在我国， 蔡信之等将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的质粒导入类产碱假 单胞菌体内，使后者获得了稳定产生黑色素的能力，增强抗辐射作用，从而 稳定提高其杀虫效果。阮丽芳等将从嗜麦芽假单胞菌a t l 8 中分离到一个新 的编码酪氨酸酶的基因( m e l ) ( 它在g e n - - b a n k 中的登录号为a f 0 6 4 0 7 2 ) ，导 入苏云金芽胞杆菌受体菌株b m ，b 1 7 1 中，并获得稳定表达。这将为l i t 制剂的 应用提供一个新的途径。 ( 三) 具有开发前途的微生物色素 1 红曲色素 红曲色素是以粮食为原料，经红曲霉( m o n o s c u ss p ) 发酵代谢产生的产 物。红曲色素主要有八种，其中四种为黄色素( m o n a s c i n 、a n k a f l a v i n 、y ej l o w i i 、x a n t h o m o n s c i i 1a ) ，两种桔色素( r u b r o p u n c t a t i n 、m o n a s c o r u b r i n ) ， 两种红色素( r u b r o p u n c t a m i t i e 、m o n a s c o r u b r a m i n e ) 。根据菌种、培养条件、 制取工艺不同，可以得到脂溶性、醇溶性和水溶性三类红曲色素，其中水溶 性红曲色素用途最广。红曲色素具有对酸碱稳定性强、耐热性强、对金属离 子稳定性强、耐光性强、对蛋白着色力好及色调柔和等特点。 鲨塑查些查兰坐主兰垡堡壅 红曲色素在食品着色方面应用广泛，除赋予制品诱人的色泽外，还起到 增强食品风味和抗菌、抑菌，提高产品保质期的作用。红曲色素的添加可以 大为降低亚硝酸盐或硝酸盐的使用量，这在健康意识越来越强的消费者中无 疑具有更大的吸引力。而且红曲色素对肉制品中常见的腐败菌抑制能力很强 ( 童群义，高孔荣，1 9 9 7 ) ，根据最近的研究结果，其抗菌活性是由红曲玉红 素( m o n a s c o r u b r i n ) 、红斑红曲胺( r u b r o p u n c t a m f i e ) 两种色素产生的 ( t o s hir ow a t a n a b e ，19 9 9 ) 。 2 类胡萝l 、素 类胡萝h 素是目前国际上开发和应用最广泛的天然色素之一，光合细菌 中含量丰富，在很多真菌、酵母菌和藻类中也存在类胡萝h 素。类胡萝h 素 不仅可以用作食品着色剂和添加剂，并且具有多种功效，能增强特异性和非 特异性免疫功能，提高巨噬细胞、n k 细胞的活性，并有防治血管硬化和抑制 癌细胞的功能，还可用于化妆品的生产，在光电导方面也具有一定的研究价 值( 刘春朝，钱新民，1 9 9 4 ；言世贤等，1 9 9 1 ) 。 过去类胡萝h 素主要是从植物中提取和经人工合成，近些年微生物发酵 法生产类胡萝h 素正广泛展开。利用红酵母发酵生产天然类胡萝h 素是近年 来我国学者研究较多且较具应用前景的课题( 王岁楼，2 0 0 0 ) 。笄霉科 ( c h o a o e p h o r a c e a 曲毛霉目的正和负菌株混合培养物中，所产生的0 胡萝 1 - 素数量如此之大，已用于商业生产，产量曾达每l o o m l 培养基6 天约1 4 0 m g 胡萝h 素( 李姆若h j 著，徐滔译，1 9 7 5 ) 。三孢布拉氏霉( g a k e s e a t r l s p o r a ) 的正和负菌株菌丝中形成大量的f 3 一胡萝h 素，可以用于工业制 造( 柏内特j h 著，刘铴琏等译，1 9 8 9 ) 。轻工部天津制盐科研所利用盐 藻提取b 一胡萝p 系b 获得成功并进行工业生产，已有产品供应市场。 3 其他有待开发的微生物色素 具有重要功效的黑色素一直是国内外研究的重要内容( 王玉洁等， 2 0 0 3 ) 。微生物所产生的黑色素是多种多样的，主要分为胞内黑色素，胞外 第一章天然色素研究现状及开发前景 黑色素。胞外黑色素又有许多种，其功能也各自不同。当前，研究微生物产 黑色素及其应用的文献目益增多。在发掘微生物资源过程中，不断获得高产 黑色素的优良菌种，如嗜麦芽假单胞菌等，应用潜力十分广泛。 在微生物产天然蓝色素等其他的一些微生物色素研究、开发中，应用基 因工程技术和遗传育种技术不断选育适合工业发酵的高产量菌株，为微生物 色素的工业发酵生产开辟广阔的途径。北京食品添加剂技术开发中心和武汉 一轻工业研究所，利用茜草科植物栀子的果实提取物除去藏花素作为黄色素 后的废液，经微生物发酵处理后，得到水溶性的框子蓝色素。这种色素对光， 热和重金属等都比较稳定，安全性也高，可与红、黄色素等调色用于食品工 业等方面。 傅俊范等( 傅俊范，王崇仁，吴友三，1 9 9 5 ) 在研究细辛新病害细 辛叶枯病病原生物学过程中发现，该病病原真菌槭菌刺孢( m y c 口c 朝 埘印d r 日 a c e r i n a ) 属中国真菌新记录种，在人工培养条件下能产生鲜艳的玫瑰红色 素，初步研究表明该色素是一种水溶性光敏色素，具有较大开发价值。目前 本课题组正在对槭菌刺孢真菌色素的产生机制、理化特性以及开发前景进行 深入研究。 ( 四) 微生物色素存在问题及展望 尽管微生物色素的研究和开发已经取得很大进展，但在研究和开发过程 中还存在不少问题：( 1 ) 在发酵过程中，产生色素的同时，也往往产生毒素。 毒素由磷脂、碳水化合物、蛋白质或蛋白质复合物组成，在胞内或分泌到胞 外，使发酵液成分较复杂，提纯色素工艺要求较高，常规方法很难得到较纯 的产品( 俞大绂，1 9 8 5 ) 。( 2 ) 野生菌株色素产量一般都比较低，作为生产 菌不仅增加提纯的困难，而且也增加产品的投资，减少了盈利。( 3 ) 作为一 种新开发的微生物色素不仅纯度要求较高，其毒理学试验要求也较高，产品 不易得到认可。 正因为上述原因，所以开发微生物色素重点应利用遗传育种技术对野生 沈阳农业大学硕l 一学位论文 菌株进行改造，选育适合工业发酵的高产量菌株。应用基因工程技术，把在 食品利医药上有价值的微生物色素基因组，转移到已证明对人类无毒害，要 求培养条件价廉，色素提取技术简便的实验菌株中，以解决在开发过程中存 在的丰要问题。 目前，随着分了遗传学和现代生物技术的迅速发展，国内外已从分离和 筛选微生物色素生产菌深入到色素工程菌的构建。利用基因工程技术提取类 胡萝p 素工程菌株，此项工作已获得专利并处于国际领先水平。可以预期， 随着微生物色素研究的深入，将为微牛物色素的工业发酵生产开辟广阔的途 径和创造美好的前景。 六、天然色素的开发前景 随着我国食品、医药、轻工业的发展，天然色素的市场需求量将大幅度 增加，新产品开发和应用范围的扩大，使得天然食用色素市场具有广阔的发 展前景。天然色素是当今世界上发展的潮流，发展十分迅速。从发展趋势预 测，天然色素研究前景广阔，而且现在正掀起一股色素研究的热潮。我们应 当抓住时机，在可持续发展和永续利用前提下，大力研究开发天然色素，并 不断加强天然色素毒理论实验和稳定性技术研究，积极开发对热、光、氧化 作用稳定，又不容易受金属离子或其他化合物质影响且对人体确无危害的天 然色素，使我国色素资源得到充分利用，增强我国食品工业的国际竞争力。 第二章病原苗的分离与鉴定 第二章病原菌的分离与鉴定 9 8 7 年6 月，在辽宁新宾县首次发现细辛叶枯病。1 9 9 0 年8 月，沈阳 农业大学植保系王崇仁教授在新宾县某林场再次发现该病。该林场细辛面积 2 0 0 亩，5 年生，发病率近1 0 0 ，损失严重，引起重视。当时尚无该病害的 记载，因而开始在辽宁省科委立项进行系统研究，后经王崇仁、傅俊范等研 究确认，该细辛病害与人参黑斑病( a j t e r n a r i ap a n a xw h e t z e l 不同，系 由槭菌刺孢( m y c o c e nl r o s p o r aa c e ，i n a ) 所致，故将原称之为的“细辛黑 斑病”正式定名为“细辛叶枯病”。 一、细辛叶枯病症状特征 细辛叶枯病主要为害叶片，也可侵染叶柄及花果。不能侵染根系。 1 叶片症状 显症初期为2 3 m m 的黑褐色小点，以后逐渐扩展成圆形、椭圆形或不 规则形病斑，直径5 1 8 m m ，浅褐色至棕褐色，病斑相互联合、穿孔、脱落， 造成整个叶片枯萎死亡。细辛植株内膛叶片，发病后未等展叶，即可因病枯 萎。见附录一图版2 1 2 叶柄症状 显症初期为褐色小点，后逐渐扩展成梭形病斑，深黑褐色，长5 2 5 n r n ， 宽3 s m m ，凹陷，病斑边缘红色。严重发病的叶柄腐烂，造成叶片枯萎，危 害严重。 3 花果症状 花果皮受侵可发病。病斑圆形，黑褐色、凹陷，直径3 6 m m 。严重发病 可造成花果腐烂，不能结实。 上述叶斑、叶柄斑和花果斑在高湿条件下均可密生褐色霉状物，为病原 菌的分生孢子梗和分生孢子。 沈阳农业大学硕十学位论文 二、病原菌的分离 ( 一) 材料与方法 1 标样来源 1 9 9 2 年结合细辛叶枯病调查，从辽宁省新宾县等细辛主产区采集病害标 本，采用组织分离法进行病菌的分离与鉴定。 2 供试培养基 采用常规p d a ( 马铃薯葡萄糖琼脂培养基) 培养基，配方如下： 马铃薯2 0 0 9葡萄糖1 5 9琼脂1 8 9水1 0 0 0 m l 将洗净后去皮的马铃薯切成长约1 c m 的正方体小块，用天平称取2 0 0 9 ， 加水1 0 0 0 m l 煮沸半小时。用纱布滤去马铃薯，加水定容至1 0 0 0 m l ，然后加 入琼脂，继续加热，使琼胶完全溶化后，趁热用纱布或脱脂棉过滤，或者用 滤纸和保温漏斗过滤。再次定容至1 0 0 0 m l 。而后分装二角瓶，加棉花塞后灭 菌。每三角瓶约1 5 0 m l 。 3 分离方法 本试验分别采用组织分离法和单孢分离法进行病原真菌的分离。 3 1 组织分离法 选择典型病斑切取4 - 5 m m 小块，经o 1 升汞或0 5 2 次氯酸钠表面消毒 3 5 分钟，灭菌水冲洗3 次，移至p d a 平板上，2 0 生物培养箱中培养。 3 2 单孢分离法 采用新鲜菌源配成分生孢子稀悬液。用灭菌注射器吸取孢子悬液，滴落 到2 琼胶圆片上( 直径5 m m ) 。置显微镜f 检查确认每个琼胶圆片上只有1 个成熟分生孢子时，移植到p d a 斜面或平板上培养。上述操作过程均在严格 无菌条件下进行。 将组织分离和单孢分离的病菌置2 0 温箱中培养3 5 天，待病菌长出 白色菌丛，然后转移到p d a 试管或平板中照光培养。温度1 52 0 。c ，在上方 第二章病撩菌的分离与鉴定 5 c m 处放置2 支4 0 w 日光灯。逐日观察记载病菌生长状况。 3 3 人工诱发分生孢子 将p d a 或v 8 汁培养基倒成平板。移入新鲜分离菌块。室内1 5 2 0 。c 培养 5 7 天，待菌落呈现明显红色时，用灭菌刀片将平板菌落切割成5 5 m m 菌块， 移到灭菌载玻片上，滴加无菌水后置：大培养腿( 1 5 c m ) 内保湿培养。在室内 光条件下或成长室及日光灯( 4 0 w ) 照射条件下培养4 8 小时。 ( 二) 结果与分析 1 分离培养结果 细辛叶枯病菌在p d a 培养基上，菌落疏展，初期生无色菌丛，3 天后在照 光条件下菌落出现红色素，1 0 天后菌落渐变成褐色至黑褐色。菌落体有隔， 表生或埋生，4 7 um 宽。随着菌落色泽加深，菌落中央菌丝细胞膨大，变深 褐色，形成大量念珠状串生的厚垣孢子。孢子长椭圆形或矩圆形，1 5 3 0 1 5 2 0pm 。在p d a 培养基上正常培养不能形成分生孢予。 2 人工诱发分生孢子结果 培养4 8 小时后，在菌块切割的边缘可产生大量分生孢子，其形态与寄 主病斑上的分生孢予形态相同。分生孢子无色或淡橄榄色，倒棍棒状，光滑， 多隔膜，基部平截，顶部逐渐变细形成长喙，直或弯，分隔处不收缩或稍有 收缩，有或无基部附属刺( 有隔或无隔) 。见附录一图版2 2 由于细辛叶枯病菌在p d a 培养基上不能形成分生孢予，给病菌的鉴定以 及其他研究带来极大困难。为了解决这个问题，曾试用过多种诱发孢子的方 法和措施。如光暗交替、变温处理、紫外光照射以及清洗菌丝等多种处理均 未能成功。在多次探索的基础上，改用p d a 或v 8 汁培养基平板菌块切割、 水滴保湿培养的方法，成功诱发产生大量分生孢子。这一突破性进展，为细 辛叶枯病菌的分离鉴定以及其他研究提供了可靠依据。见表2 1 。 沈阳农业火学硕 学位论文 表2 - 1人工诱发分生孢子结果 t a b l e2l7 h er e s u to fa f t ir i c j a li n c e n t i v et h es p o r e 三小结 细辛叶枯病菌分离成功率的高低与标样采集时间有密切关系。一般5 月 上旬之前病害处于始发期，病菌较纯，极少感染杂菌，采用组织分离法成功 率都在9 0 。5 月中旬以后，随着病斑显症时间加长，杂菌增多，主要是链 格孢菌( d t e r n a r i a 印，) 。因此采用组织分离法后期采集的叶片多不易成 功：而改用单孢分离法成功率在5 0 7 5 。 在p d a 培养基上正常培养不能形成分生孢子。本研究采用“菌块切割水 滴保湿法”成功的诱导产生大量分生孢子，解决了该菌在人工培养基上不易 形成分生孢子的难题。多位研究者( t o n p k in s 和h a n s e n ( 1 9 5 0 ；n e e r g a a r d 和n e w h a ll ，( 1 9 5 1 ；t q b a l 和w e b s t e r ，1 9 6 9 ) 发现，m y c o c e n t r o s p o r aa c 盯扣a 在培养基上不易形成分生孢子，他们在诱导该菌产孢方面曾进行过多种探 索，如翻转菌落、紫外光照射、改变培养基种类等，曾不同程度地诱发出一 定数量的分生孢子，但对细辛叶枯病无效。本研究所用产孢方法说明， 缈c o c e n t r o s p o r aa c e r i n a 产孢与机械切伤和饱和湿度培养有关。新鲜分离 菌易于成功，分离时间过长的病菌不易产孢成功。 2j 第三章槭苗刺孢产生色素规律的研究 第三章槭菌刺孢产生色素规律的研究 在研究细辛新病害细辛叶枯病病原生物学过程中发现，该病病原真 菌槭菌刺孢( m y c o c e n t r o s p o r aa c e r i n a ) ，在人工培养条件下能产生鲜艳的 玫瑰红色素，初步研究表明该色素是一种光敏色素，具有较大开发价值。本 章将对槭菌刺孢在不同培养基和条件下产生色素的规律做迸一步的研究。 一、材料与方法 ( 一) 不同培养基的制备 1 含蔗糖量不同的大米粒培养基 先将大米浸泡两小时，清洗干净，再加水煮至八分熟，捞出后装入2 5 0 m 1 的三角瓶中，每瓶约装5 0 9 的大米。瓶口覆盖高温灭菌塑料膜，用细绳绑好。 使用灭菌器在1 2 l 条件下进行湿热灭菌6 0 m i n ，制成大米粒培养基备用。 包括：( 1 ) 高糖：l o g 蔗糖瓶( 2 ) 中糖：蛆蔗糖瓶( 3 ) 低糖：1 9 蔗 糖瓶(