（等离子体物理专业论文）大气压下等离子体失活微生物的机理研究.pdf

大连理工大学博士论文 摘要 目前为止，国内外对等离子体失活微生物的研究多是从等离子体产生角度着手，如 采用不同气体、不同放电方式或不同的激励电源等物理角度推理和验证微生物失活的原 因，得出等离子体中起主要作用的活性成份，但观点各不相同。迄今从生物角度解释大 气压等离子体失活微生物机理的报道较少。本文从生物及生物化学角度，对大气压等离 子体失活微生物机理进行了理论和实验两方面研究。 本文首先选用面包酵母菌( s a c c h a r o m y c e sc e r e v 如i a e ) 为生物模型，研究大气压氦 气介质阻挡放电( h ed b d ) 等离子体对其产生的生物化学效应。从线粒体琥珀酸脱氢 酶系的活性、细胞外蛋白质浓度、细胞形貌及酵母菌菌液的状态四方面分析该等离子体 失活酵母菌的原因。采用电子扫描显微镜观察大气压h ed b d 等离子体处理后的酵母菌 细胞，发现细胞严重破裂，破裂程度远大于现有的报道结果。考马斯亮蓝染色法测量细 胞外蛋白质浓度发现，随等离子体处理时间的延长，胞外蛋白质的含量呈上升趋势，证 明细胞内蛋白质发生泄漏。3 一( 4 ，5 二甲噻唑一2 一y 1 ) 一2 ，5 2 苯基一四唑溴盐染色法检测菌体 内线粒体琥珀酸脱氢酶系的活性发现，当大气压h ed b d 等离子体处理时间为1 0 2 5 m i n 时该酶活性陡然下降。酵母菌菌液和培养基的p h 值随大气压h ed b d 等离子体处 理时间的延长而大幅度降低。等离子体处理后立即检测和2h 后检测发现这种p h 大幅 度变化的现象可以维持。该现象在国内外尚未见到有关报道。等离子体改变细胞培养基 的酸性，增强了细胞内外生化环境的失衡性，破坏细胞结构的稳定性，加剧细胞裂，从 而导致细胞死亡。 其次选用大肠杆菌，研究细胞的生理生长阶段和细胞浓度对大气压氦气等离子体射 流( h ea p p j ) 失活效果的影响。光学发射光谱检测到达细胞表面的等离子体射流温度 为室温，大气压h ea p p j 在失活大肠杆菌的过程中无热效应。该等离子体处理2m i n 后， 细胞结构的完整性遭到破坏。本文首次将b a r a n y i 模型应用到对大气压h ea p p j 等离子 体失活大肠杆菌的模拟。大肠杆菌细胞浓度从1 0 7 增加到1 0 ”c m 2 时，h ea p p j 对细胞 的最大失活速率常数。由1 9 5 9 m i n 降到1 0 3 r a i n ：指数生长期、稳定期前期及稳定 中期细胞的岛。依次为6 2 1 m i n 、6 8 0 m i n 和5 4 9 1 m i n 。稳定期前期的细胞比指数期细 胞对大气压h ea p p j 等离子体更敏感，稳定期中期的细胞对该等离子体的抗性最强。细 胞的生理生长阶段和细胞浓度是影响大气压h ea p p j 等离子体失活大肠杆菌效果的两 个重要因素。b a r a n y i 模型模拟的结果与实验结果符合地很好。 关键词：大气压介质阻挡放电：大气压等离子体射流；面包酵母茵：大肠杆菌： b a r a n y i 模型；失活机理 j 压 i - 大气压下等离子体失活微生物的机理研究 a b s t r a c t m e c h a n i s mo fm i c r o o r g a n i s mi n a c t i v a t i o nb ya t m o s p h e r i cp l a s m a t od a t e ，m o s tr e s e a r c h e so nt h ei n t e r a c t i o no fn o n e q u i l i b r i u md i s c h a r g ep l a s m a sw i t h m i c r o o r g a n i s m sh a v ec o n c e n t r a t e do nt h eg e r m i c i d a le f f e c t sa n dv a l i d a t e do nt h ec o n t r i b u t i n g a c t i v er a d i c a l su s i n gd i f f e r e n tw o r kg a s e s ，e n e r g i z e dp o w e r sa n dd i s c h a r g es e t u p sa n d p r o d u c e dav a r i e t yo fc o n c l u s i o n s l i r l ea t t e n t i o ni sg i v e nt ot h eb i o c h e m i c a lm e c h a n i s m w h e nm i c r o b i a lc e l l sa r ee x p o s e dt op l a s m a s t h i sb i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y b a s e ds t u d yw i l l c o m p l i m e n ti n a c t i v a t i o ns t u d i e sb a s e do np l a s m ac h e m i s t r yc h a r a c t e r i z a t i o n f i r s t l y ，b a k e r sy e a s t ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) i sc h o s e na sam i c r o b i a lm o d e lt os t u d y b i o c h e m i c a le f f e c t st r i g g e r e db yt h e i re x p o s u r et oh e l i u md i e l e c t r i cb a r r i e rd i s c h a r g e ( d b d ) a ta t m o s p h e r i cp r e s s u r et h ep o s s i b l ei n a c t i v a t i o nm e c h a n i s r r io fp l a s m ao ny e a s ti sg i v e n b a s e do nf o u rk i n d so fb i o c h e m i c a li m p a c t s ，i n c l u d i n gt h em i t o c h o n d r i a la c t i v i t y ，p r o t e i n c o n c e n t r a t i o ni nt h es u p e m a t a n t ，m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so fc e l l sa n da c i d i t yo fb a k e r sy e a s t s u s p e n s i o na n di t sc u l t u r e t h er e m a r k a b l er u p t u r eo ft h et r e a t e dy e a s tc e l l si si n v e s t i g a t e d u s i n gs c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p y a ni n c r e a s eo fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni nt h es u s p e n s i o n ， m e a s u r e db yt h eb r a d f o r dm e t h o d w i ut h e nb eu s e dt oc o n f i r mt h ec e l l u l a rr u p t u r eo ft h i s y e a s te x p o s e d i n p l a s m a m i t o c h o n d r i a la c t i v i t y ，e v a l u a t e db yt h e3 - ( 4 ， 5 - d i m e t h y l t h i a z o l 一2 一y 1 ) 2 ，5 - d i p h e n y l t e t m z o l i u mb r o m i d e ( m t t ) m e t h o d ，d e c r e a s e ss h a r p l y w h i l ec e l l sa r ee x p o s e di nh e l i u md b d p l a s m af o r1 0 2 5m i n t h ep ho fy e a s ts u s p e n s i o n a n di t sc u l t u r ed e c r e a s ew i t ht h ep l a s m ae x p o s u r et i m ee x t e n s i o n t h i sc h a n g ec a nk e e dm o r e t h a n2 ha f t e rp l a s m at r e a t m e n t 1 1 1 es e v e r el o s so fc e l l u l a rs t m c t u r a li n t e g r i t yi sc o n s i d e r e dt o b ed u et ot h eg r e a ta n dd u r a t i v ea c i d i t yc h a n g e so ny e a s tc u l t u r e s e c o n d l y ，t h es u r v i v a lo fe s c h e r i c h i ac o l ik 1 2 ( ec o l ik 1 2 ) d e p o s i t e do nam e m b r a n e f i l t e rs u r f a c ea n ds u b s e q u e n t l ye x p o s e dt oa na t m o s p h e r i ch e l i u mp l a s m aj e td e p e n d so nt h e c e l ls u r f a c ed e n s i t y a st h i si n c r e a s e sf r o m1 0 t o1 0 “c e l l s c m 2 t h em a x i m u mi n a c t i v a t i o n r a t ec o n s t a n tm o d e l l e db yb a r a n y ii n a c t i v a t i o nm o d e ld e c r e a s e sf r o m19 5 9t o1 0 3 m i n ：c e l l s f r o ml a t ee x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s ei sm o r es e n s i t i v et h a nt h o s ef r o mm i d e x p o n e n t i a lp h a s e t ot h ee f f e c t so ft h ep l a s m a o p t i ce m i s s i o ns p e c t r o s c o p yc o n f i r m st h a tt h e r ei sn oh e a te f f e c t w h i l et h i sp l a s m aj e ta c t i n go nc e l l s s e m sr e v e a lt h a tt h ei n t e g r i t yo fec o l ik 1 2c e l l si s d a m a g e d i tc a nb ec o n f i r m e dt h a tt h ee e l ic o n c e n t r a t i o no fe c o l fk 12i sav e r yi m p o r t a n t f a c t o ro np l a s m ai n a c t i v a t i o ne f f i c i e n c y t h er e s u l t sm o d e l l e db yb a r a n y im o d e lc o n s i s tw i t h e x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e l l k e yw o r d s ：a t m o s p h e r i cd i e l e c t r i cb a r r i e rd i s c h a r g e ；a t m o s p h e r i cp l a s m aj e t ；b a k e r s y e a s t ；e c o l ik 1 2 ；b a r a n y im o d e l ；i n a c t i v a t i o nm e c h a n i s m l i 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 彳z 、 作者签名： j 7 日期：型：丛 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者繇童! 二 导师签名：墨膛互导师签名：生理：翌 1 0 1 大连理工大学博士学位论文 1 综述 1 1 引言 ， 。 。； 随着现代医学的发展，越来越多的人造器官如人造晶状体、人工瓣膜、人工肾、 假关节、心脏起搏器等被移植到人体内。这些用于人造器官的生物材料是直接同生命系 统相联系酌，因此材料的加工和使用需要经过严格的消毒灭菌、检测、反复试验之后方 可植入人体。植入物遭到细菌的侵入，经常是手术失败的主要原因。一种能连续释放有 效剂量抗菌药物的植入生物材料，对防止细菌侵入聚合物表面是很有希望的方法。医学 上常用的多孔基质型药物控释作用有限，药物释出较快，不能满足临床上对植入物较长 时间抗菌的需要：低温等离子技术可在完全不影响材料本身的特征和力学性能的状态 下，在多孔抗菌材料表面再加上一道等离予体膜层作为限速屏障，形成的等离子体膜， 相当于材料表面的一件外套，进一步降低药物渗出的速率，是种比较理想的表面改性 方法【l 之1 。等离子体可改变聚合物表面的化学成份与物理形态1 3 。5 】，从而有效改变聚合物 表面的性能。经低温等离子体活化处理后的颗粒型羟基磷灰石，可得到含有氨基结构植 入材料，该材料对骨的早期形成、骨性修复和结合都具有明显促进作用【6 】。 现代医用设备越来越多地使用聚合物材料和生物降解性材料，这些材料不能耐受高 温高压灭菌所需的温度和压力pj 。因为高温高压可能激活降解过程，使聚合物主要成分 被降解，引起严重的化学或形态学变化，导致物质结构发生改变，从而破坏这些被消毒 物品的功效? 随着人类生活水平的逐步提高，消费者希望食品经过严格消毒灭菌后保持 原有的色、香、。味及营养成分。因此无毒害残留和无工件损坏的消毒灭菌技术成为人类 健康和日常生活中必不可少的技术。传统的物理和化学消毒灭菌方法虽然沿用了相当长 的时间，但是随着聚合材料的大量出现及人们对食品卫生安全的要求不断提高，这些方 法越来越多地表现出应用的限制性和自身无法克服的问题。 、 一 、i 1 +、 一 1 2 传统消毒灭菌法的缺点与局限性 。 ”二 l 通常对医疗、。医药材料及食品消毒采用的湿热灭菌法、紫外高温消毒法、环氧乙烷 化学试剂法以及y 辐射法在处理过程中不可避免地存在缺点，如重要营养成分的改性； 有毒副产物的残留：物品物理、机械和光学性能的改变等1 8 。传统上在移植人造晶状 体时采用乙烯氧化物进行消毒j ，该物质在消毒时扩散到人造晶状体内，移植之后又释 放出来，可能引发病叭的炎症反应【l “。众所周知，臭氧能够杀灭多种微生物。灭菌过程 可顷刻完成，但是浓度过大对人体角膜、皮肤及呼吸道粘膜危害很大【l3 1 。使用原则要求 与人隔绝，不适用于病房这样的总是存在污染源且一直处在工作状态的场合【1 4 1 。另外臭 氧本身具有强氧化性，能够氧化并改变消毒物件表面性质和成分。- 常用的环氧乙烷 ( e p o x y e t h a n e ) 虽具有活性高、穿透力强、不损伤物品及不留残毒等优点，可用于对纸 1 大气压下等离子体失活微生物的机理研究 张、书籍、布、皮毛、塑料、人造纤维和金属品等进行消毒。但是它可引起人体基因突 变，是一级致癌物质。密闭容器或房问消毒后必须经过长时间的通风扩散，并且它的稀 释物氟利昂，破坏臭氧层，不利于环保i l ”。另外使用过程中必须避开明火以防爆。 热法消毒和化学消毒剂不但对食品不适用，而且消毒过程中的湿热蒸汽存留时间过长， 将会使那些精密的仪器生锈钝化，导致灵敏度下降。人们越来越清楚地认识到传统物理 消毒法所用时间长、消毒不彻底、损害消毒物件、需要大量的人力物力等。化学消毒法 的某些消毒剂使用后，必须进行通风和空气循环，并且消毒后毒害残留存在造成新的污 染等局限性和潜在的危害性。因此探索一种易于操作、造价低、快速、高效、无毒害残 留的消毒灭菌技术越来越受到研究者们的重视，也是人类日常生活中迫切需要的技术。 目前各国研究者正在努力研究的等离子体消毒灭菌技术有望实现上述目的。 1 3 低温等离子体基本性质及其消毒灭菌技术优点 等离子体是一种电离度超过0 1 的气体，是由离子、电子和中性粒子( 原予和分 子) 所组成的集合体。等离子体整体呈中性，但含有相当数量的电子和离子，表现出相 应的电磁学等性能，如等离子体中有带电粒子的热运动和扩散，也有电场作用下的迁移。 等离子体有别于固态、液态、气态三种物质状态，是宇宙中存在最广泛的物质状态，称 为物质的第四态。 1 3 1 低温等离子体基本性质 按照带电粒子温度的相对高低，实验室等离子体可分为高温等离子体和低温等离子 体。带电粒子温度t 为1 1 0e v 的称为低温等离子体；t 为0 1 1 0k e v 称高温等离子体。 后者主要研究目的是利用高温下氘氚核聚变反应解决人类未来的能源问题【1 6 1 。低温等离 子体的基本特点是系统主要由带电粒子支配，受外部电场、磁场、电磁场的影响，存在 多种基元过程及等离子体与固体表面的相互作用，具有独特的光、热、电等物理性质。 可产生多种物理、化学过程。该等离子体中含有大量的电子、离子、激发态原子和分子 以及自由基等活性粒子。这些粒子的能量一般为几个至十几个电子伏特，大于高分子材 料的结合键能( 几个至十几个电子伏特) ，完全可以使有机大分子材料的结合键断裂而 形成新键；改变微生物生存的外部环境，使其与外界不能进行营养交换，从而导致死亡 ”。1 8 】。根据热力学状态的不同和中性气体温度的相对高低，低温等离子体按照离子温度 又分热等离子体和冷等离子体。热等离子体为局域热力学平衡( l t e ) 系统，特点是重 粒子( 原子、分子、离子等) 的温度接近电子温度；冷等离子体为非热力学平衡系统， 重粒子的温度低于电子温度。通常消毒灭菌所用的等离子体都是冷等离子体，其中电子 温度远远高于离子温度即t p t i 。按照工作气体的气压高低可分为高气压等离子体和低 气压等离子体。低气压等离子体，需要抽真空，工业化处理过程中需要不断地打开真空 室取出成品，不能连续生产，难以提高效率，在工业应用上有很大的局限性。高气压等 2 大连理工大学博士学位论文 离子体就避免了这个问题，可以直接操作【j ”。 大气压介质阻挡放电等离子体和等离子体射流可直接在大气压下产生，放电方式简 单，不需要建立真空或低压装置、降低能耗、设备成本低。近年来被广泛应用于聚合物、 纺织品的表面改性、消毒灭菌、有毒废弃物处理等方面。等离子体射流发生装置简单可 行，易于微型化或规模化放大，易便携等优点使其在工业化生产及1 7 1 常生活中具有广泛 的应用前景。 f 1 1 介质阻挡放电等离子体 介质阻挡放电( d b d ) 又叫无声放电，是一种典型的非平衡态的交流气体放电，其电 子能量较高。d b d 等离子体为低温非平衡等离子体，能在很大的气压和频率范围内产生， 常用的工作条件为1 0 4 1 0 6p a ，频率为5 0h z - 1m h z 。d b d 通常由两平行电极组成，其中 至少一个电极被绝缘电介质层覆盖。介质层既能起到限流作用又能阻止放电空间形成局 部火花或向弧光放电过渡，可实现高气压气体放电。典型的d b d 和间隙结构如图1 1 。 交流高电压发生器 = ( a ) 单个电极覆盖介质 ( b ) 取电极覆盖介质 3 大气压下等离子体失活微生物的机理研究 = ( c ) 两电极问插入介质 图1 1d b d 放电装置图 f i g i ic o n f i g u r a t i o no f t h ed b d ( a ) 实用的放电型，通常用以制造臭氧发生器。特点是结构简单，金属电极可将放电 产生的热量散发掉。( b ) 两介质问发生放电，避免放电等离子体直接与金属电极接触。该 结构的特点是非常适用于腐蚀性或高纯度气体放电产生等离子体。( c ) 介质两边可同时生 成两种成分不同的等离子体。两电极间的气压p 与气隙宽度d 的乘积范围很大，可从几 百p a c m 到几万p a c l t i 。d b d 等离子体两极间所加正弦或方波的频率可从几十赫兹到 几百千赫的交流电( 正弦波或方波) 。当电压超过帕邢击穿电压时，气体会被击穿形成 d b d 放电等离子体。对于低p d 值或所加电压稍高于击穿电压时，气体的击穿放电属于 汤森放电。对于高p d 值和气隙过压条件下，放电为流光模式【l ”。放电间隙中出现大量 随机分布的微放电通道( 也称放电丝) 。这些微放电通常在时间和空间上无规则地分布 在整个放电空间，微放电中平均电子能量较高( 1 1 0e v ) ，而离子能量不高，即非平衡的 低温等离子体。微放电持续1 0n s 左右，圆柱状细丝的半径约为0 1m m ，其放电通道几 乎是圆柱对称的，平均看来貌似均匀的辉光放电。微放电形成的机理是：初始电子雪崩 通过放电间隙的过程中出现相当数量的空间电荷，并形成很高的本征电场。因与外电场 的叠加作用，雪崩中的高能部分电子加速逃逸，形成的击穿通道使电子电荷以比电子迁 移更快的速度向阳极方向返回，这样就会有一个更强的电场波向阴极方向传播过来。在 传播过程中，原子和分子得到进一步电离，并激励起向阴极传播的电子反向波。这样的 导电通道能非常迅速地通过放电间隙造成气体击穿。电子通过通道时，一些激发态原子 和分子会自发地发射紫外辐射，有助于导电通道的建立和加速气体的击穿。由于极间介 质的存在，气体在被击穿、导电通道建立之后，空间电荷在放电问隙中输运，并积累在 介质上。介质表面的电荷形成电场消弱外电场，限制放电电流的自由增长，中断放电电 流，阻止极间火花或弧光的形成【2 。 4 大连理工大学博士学位论文 在大气压条件下，d b d 通常以丝状放电形式存在，即放电外观为大量随机分布的 丝状通量，每根细丝的直径大约为1 0 0g m ，其中电子温度为1 0 一1 0e v ，浓度为1 0 1 4 c m 3 左右，而离子与中性成份温度则为室温，故是典型的冷等离子体。放电中具有一定能量 的电子与放电气体分子或原子碰撞，产生的离子、激发态成份、原子和其它分子碎片等 活性成份可引发化学反应。放电功率密度与介质层厚度、外加电压形态( 主要为过电压) 、 气体间隙以及工作气体等因素有关【2 ”。采用介质阻挡放电不需要昂贵的真空系统或低压 装置，能够在大气压条件下工作，因此越来越广泛地被应用到提高聚合物表面亲水性和 结合力强度、薄膜沉积、废气处理、生物消毒等方面【2 。”】。 ( 2 ) 等离子体射流 大气压冷等离子体射流( a p p j ) 具有传统高气压放电体系载能粒子密度高、发生系 统空间结构大、经济和工艺处理速度快的优点，又具有低气压辉光放电等离子体的介质 温度低和空间均匀的优点f 3 0 】。因此成为近年来兴起的一种新型大气压类辉光等离子体 发生技术。大气压下辉光放电等离子体在传统应用领域如材料制造、j j a i 和改性【3 u ，以 及环境工程和等离子体化工等领域都具有较好的应用前景【3 2 3 3 1 。目前已经实现的大气压 辉光d b d 模式，工艺上存在等离子体发生空间狭小的弱点，要将其广泛应用于工业生产 还有一定的限制。因此发展新型、经济且易于规模化放大的大气压辉光等离子体发生技 术仍是目前低温大气压等离子体研究的目标。a p p j 是近年来兴起的一种大气压类辉光等 离子体发生技术，其均匀、低温和易控性使其在应用领域表现出某些优势。 目前，a p p j 的应用主要集中在如下领域：( 1 ) 利用化学活性气体( 如：h e 0 2 ，a r 0 2 混合气) 产生的a p p j 对聚合物、纺织物、高分子等材料表面的亲水性和染色性进行改 良【3 。( 2 ) 利用氩气的a p p j 进行铜、铝、硅等金属、非金属材料、聚合物材料等的表 面刻蚀成型加工【3 ”。这是物理刻蚀过程，可以实现较高程度的定向刻蚀，抑制旁刻。 a p p j 的微型化，将使之在m e m s 的微机械部件加工领域大有作为。若能实现纳米射流 并制成等离子体芯片【3 ”，可以想象，其将在微电子、集成光学器件和d n a 芯片的加工 制造领域将会引发一场技术革命。( 3 ) 利用a r 、h e 产生a p p j ，并混合以碳源气体或硅 源气体，进行金刚石薄膜、其他碳质硬膜和硅薄膜的快速生长【37 l ，若混以化学反应性混 合气体，可进行化合物细粉的制备。( 4 ) 目前a p p j 正被应用到微生物失活研究，期望在 不久将来广泛应用到食品工业和医疗事业。真空维持和气压检测系统的省却、能源和成 本的节省使射流等离子体在新兴的环境工程、生物基因工程和等离子体化工等领域都表 现出了独特的工艺优势和良好的应用前景【3 8 1 。 1 3 2 低温等离子体消毒灭菌的技术优点 ? 、 等离子体消毒灭菌技术是一种新代的快速、广谱的高科技灭菌技术 3 9 1 。它能高 效地产生杀死或失活微生物的自由基及活性成份【2 6 i 。浚技术不仅克服了现有灭菌方法的 一些局限和不足，而且具有传统方法无法比拟的优点。该灭菌过程可在室温，相对湿度 5 大气压下等离子体失活微生物的机理研究 只有1 0 一2 0 的情况下快速完成，是真正的低温、低湿消毒灭菌法。它不使用有毒物质、 无残留物污染。因为在消毒结束时，随着外界输入能量的减少，等离子体中的活性成份 形成气体和水蒸汽，可保证人及环境的安全。等离子体以类似于气态的物质状态存在， 适用于各种有孔和无孔表面，能够将器械各个表面的细菌全部杀死，而不会对材料本身 的性质造成多大的影响。等离子体是一种广谱的灭菌技术，它可杀死多种类型的微生物 ( 抗生素、抗性细菌细胞，真菌类病原菌、芽孢、病毒、酵母菌等) ，可杀灭一些抗辐 射细菌。处理所需时间非常短( 几秒一几分钟) ，对最顽固的芽孢也仅需要几分钟至十几 分钟，且可不必进行通风循环，被灭菌物品取出后可立即使用。在减少器械库存的情况 下同样能够应付较多的手术需要，达到降低成本、提高效率、增加收入的目标。全部灭 菌程序可实现自动化，仅需要打开和关闭电源，操作简单。与传统的消毒方法相比，等 离子体消毒技术有其独特之处，对那些高温和辐射敏感材料，不会引起材料很大范围的 温度变化，因此近年来被广泛应用。 等离子体之所以能消毒和灭菌是因为其含有带电粒子( 电子、离子) 和不带电粒子 ( 分子、激发态原子、亚稳态原子、自由基) 以及紫外线和其他一些射线等。利用发射 光谱可以定量给出等离子体中的物种成份及粒子能态分布等。根据所用气体的不同，等 离子体中还存在其它的活性成份。对于空气等离子体而言，微量的水被解离， h 2 0 h + h o ，h 2 0 + 0 2 h 2 0 2 + o ，h o + h o h 0 2 + h 。其中h o 为氢氧自由 基，0 为活化氧原子，h 为活化氢原子。这些活性物质容易与细菌体内蛋白质和核酸发 生反应，扰乱微生物的生存功能。在放电过程中，激发态原子向基态跃迁发出光子。其 中紫外光子亦起到杀菌作用。目前，国内外不同的研究者利用不同气压下不同气体的等 离子体进行消毒灭菌，对于灭菌机理各抒己见，需要进一步的探讨研究。大气压下非平 衡等离子体消毒灭菌技术避免了低压抽真空的繁琐，降低了能耗，成为本世纪非常有前 景的技术。其最突出的优点是低温、高效、无毒害残留以及对工件表面损伤低。因此该 技术很适合在室温、低湿条件下消毒医疗器械、处理食品和改性纺织物等。产生的自由 基等活性成份是大气压冷等离子中主要的灭菌成分。这些活性成份能与微生物细胞反 应，降低它们的活性，最终杀死这些微生物。当供能电源断掉之后，等离子体中的活性 成份失去能量，互相连接变成水蒸汽和中性气体，对环境和操作人员没有危害。 1 4 等离子体消毒灭菌的应用 等离子体消毒灭菌技术在生物材料、外科应用材料和器件、食品加工和生物技术方 面有相当广泛的应用前景。特别是在欧洲，气体等离子体被应用在橡胶制品，医疗设备 的表面灭菌上，该法比传统的环氧乙烷低毒，并且效果比辐照灭菌更有效【j “。大气压下 冷等离子体消毒灭菌法是一种非常有潜力的方法1 4 。 6 大连理工大学博士学位论文 1 4 1 医学生物材料的杀菌消毒应用 生物材料是指用于取代，修复活组织的天然或人造材料。只有当它在植入生物体后 不会引起凝血、毒性、过敏、致癌、免疫反应等，并且与生物体协调且能够执行预期的 功能。这样的材料才具有生物相容性。人工器官及医用高聚物植入制品在人体内发生感 染是现代医学主要问题之一，已成为制约人工器官发展和植入成败的严重问题。鉴定经 等离子体处理的人造晶状体可减少植入过程中对角膜上皮细胞的损伤，前期处理和消毒 可进一步实现，有效地避免了传统乙烯氧化物引发的病人炎症反应。等离子体消毒灭菌 技术具备的低温低湿特性使其非常适用于那些对高温和辐射敏感的材料，如心血管科和 呼吸科的一些塑料、硅橡胶等高分子材料制品。m a s c i a 指出等离子体消毒是一种加工热 敏感材料的理想技术【4 ”。这种不接触式的灭菌技术非常适于烫伤外科中的伤口处理，既 能减轻病人的痛苦，又可防止感染。医院诊所需要反复消毒的大量手术器械和牙科器具， 通常采用水煮或高压蒸汽的传统消毒法。这些消毒法所需的时间太长，每批器械的处理 约需1 5 2h 。这对需用种类繁多医疗器械的牙科医院及条件有限的乡村诊所带来了诸多 不便。安全、高效的等离子体技术可在短时间内完成这些器械的消毒灭菌工作，保证手 术所用大量器械的周转。因为具有类似气相消毒的优势，所以等离子体尤其适合对体积 小而形状复杂的医疗器械的内壁进行消毒灭菌处理，并无毒害物质残留。它还可以杀灭 那些抗辐射的细菌，用于那些预先包装的物品，可省去某些物理消毒方法必要的充气时 间。因此低温、低湿、高效、简便的消毒灭菌技术等离子体消毒灭菌技术已成为各 国研究的热点。 1 4 2 食品加工和生物技术方面的消毒灭菌应用 食品的腐败变质一般是由微生物的代谢活动所引起，其中某些微生物能够产生很剧 烈的毒素，因此食品若不经过严格的消毒灭菌处理往往会成为重要的传染病源。目前， 工业生产上对食品的杀菌处理普遍采用加热法。工艺上，人们主要采用高温、高压、过 滤、辐射等传统物理方法或是在食品中加入糖( 蜜) 、盐( 腌) 、酒糟及其它各种防腐剂 等传统化学方法杀死微生物。这些方法易引起食品的加热臭，破坏食品原有的色、香、 味、形，引起热敏性物质，如维生素c ( v c ) 等营养成分损失和其它一些难以克服的不 期望变化1 4 ”。另外对于需要预先包装的物品，y 射线虽然可用于消毒，也不会引起大的 温度变化，但是它会在聚合物中产生交键引起降解反应。等离子体技术就不存在改变消 毒物品的组成成份和性质的问题。等离子体消毒灭菌技术安全且能保持食品原有风味与 营养成分，有望部分取代现有的食品热杀菌方式。 1 4 3 航天器及太空设施的消毒灭菌应用 等离子体技术可对航天器进行灭菌处理1 4 3 】。据证明，氧气或氩气等离子体能有效杀 死太空标本上污染的枯草杆菌芽孢。因为外空间气压低，航天器相当于在灭菌器腔内， 7 大气压下等离子体失活微生物的机理研究 发生器可以直接将等离子体发射到航天器外部，可以防止在取太空标本时，把地球菌污 染到空间及太空标本，还可用等离子体对宇航员排泄物及其它废物进行灭菌处理。 与传统方法相比，等离子体消毒灭菌技术有其独特之处，可广泛用于不耐热和不能 使用化学消毒剂的医疗用品、食品、中草药、航天器、外空间标本和粮食种子等。但是 迄今为止，等离子体消毒灭菌机理仍然不是很清楚。国内外诸多研究者对等离子体与微 生物相互作用多是从等离子体产生角度着手，如采用不同气体、不同放电方式或不同的 激励电源等，验证等离子体失活微生物的有效性并尝试着解释等离子体失活微生物中起 主要作用的活性成份，但是观点各异。 1 5 大气压等离子体消毒灭菌机理国内外研究状况 1 5 1 国外研究进展 9 0 年代初，国外的研究者采用等离子体辅助消毒，即将化学气体消毒剂与其他气体 混合作为工作气体。美国食品医疗部门检测了过酸或过氧化氢作为工作气体的低压辉光 放电等离子体消毒系统。这套系统非常昂贵，工件只能在一个几十升的接近室温的腔内， 并且需要1 - 2h 才能完成一个循环。这些工作气体在高能的等离子体环境中产生氧气： 氢氧自由基以及其它活性成份来杀死一系列菌和孢子；近几年，美国研究者们采用电晕 放电、介质阻挡放电、电弧放电及感应等离子体炬等进行等离子体消毒研究。大气压下 的电弧放电和感应等离子体炬，接近热平衡，将中性气体和活性成份加热到高温，并且 其高能密度对薄的或敏感的工件表面造成破坏。目前，美国研究者们主要利用大气压下 辉光放电等离子体( o a u g d p ) 和等离子体射流等进行消毒灭菌研究。其中，大气压下 电晕放电、d b d 或电阻阻挡放电( r b d ) 【4 5 ) 及a p p j l 3 们，这三种放电等离子体被越来越 广泛地应用于失活各种微生物并验证了其有效性【4 7 i 。 由于等离子体中包含电子、离子、激发态原子和分子、活性自由基及射线等多种成 份，因此它对微生物细胞的作用应该是几种作用的综合。1 9 8 9 年n e l s o ne t a l 认为虽然人 们已经知道等离子体失活微生物过程中存在微生物细胞壁的物理刻蚀，等离子体中活性 成份产生的化学降解及u v 引发的物理化学变化，但是人类还没有完全理解整个过程中 特殊的物理化学机理【4 ”。m o i s a ne ta 1 认为等离子体失活微生物的基本机理包括：紫 外辐射直接破坏微生物的遗传物质；紫外辐射使微生物原子形成挥发性物质从而光解 析和刻蚀微生物；等离子体中的氧原子和自由基刻蚀微生物。活性成份和紫外辐射是 否在特定等离子体失活微生物的过程中起主要作用还要根据等离子体工作的气压来确 定。比如说，大气压等离子体产生的紫外光子很容易被自身吸收掉，0 3 相对来晚，在这 种等离子体失活微生物过程中起主要作用。因此紫外光子仅在低，中气压等离子体失活微 生物过程中是非常有效的| 4 ”。m o r e i r ae ta 1 实验中发现低气压等离子体中u v 紫外辐射对 孢子的失活几乎不产生影响，u v 作用可忽略。长寿命的原子和自由基活性成份可刻蚀 8 大连理工大学博士学位论文 孢子，降低孢子的活性，但是不能完全失活孢子。他们将等离子体直接与孢子作用发现， 等离子体中的离子碰撞与中性氧活性成份在失活孢子过程中起主要作用p 。 等离子体失活微生物的过程中由于微生物的种类、微生物附着介质种类以及等离子 体处理微生物的方式( 等离子体与微生物直接接触作用还是等离子体远距离处理微生 物) 不同，研究者们得到单一斜率、双斜率及多斜率的不同类型存活曲线，如图1 2 。微 生物被杀死9 0 所用的时间为d 值，它是微生物失活动力学过程中一个重要的测量参数， 根据不同时间段的d 值可清楚地了解图1 2 所示的存活曲线中微生物存活的动力学过程。 其中多斜率存活曲线动力学不适于解释大气压等离子体失活微生物【5 ”。目前大气压等离 子体消毒灭菌技术尚处在研究阶段，人们对其失活微生物的机理根据实验结果提出了一 些假说，推测多于实证。 ( a ) 单斜率存活曲线( b ) 双斜率存活曲线( c ) 多斜率存活曲线 图i 2 微生物失活动力学曲线 f i g i 2k i n e t i c so f t h ei n a c t i v a t i o np r o c e s s ( 1 ) 电晕放电消毒灭菌研究 据记载，第一个用等离子体失活微生物的是s i e m e n s ，他建议用电晕放电产生臭氧对 水进行消毒1 5 “，并认为等离子体产生过程中可释放出大量紫外线，紫外线破坏d n a 使其 丧失复制能力而起到杀菌的作用。自1 9 6 8 年m e n a s h i 首次在大气压下用脉冲射频放电产 生氩气电晕等离子体，在不到1s 的时间内杀死玻璃瓶表面4 1 0 6 个微生物孢子以来 5 3 】， 利用低温等离子体技术消毒灭菌的研究日趋活跃。y a m a m o t oe ta 1 采用h 2 0 2 作工作气 体产生电晕放电等离子体，远距离处理玻璃片上的bg l o b i g i i ( 干样) 、玻璃片上和悬浮液 中的e c o l i ，发现细菌的致死曲线为单一斜率的直线。他认为有h 2 0 2 的电晕放电比单纯 的气体放电效率要高1 0 0 多倍，正离子和1 0 一1 0 0n m 大小的h 2 0 2 液滴是灭菌的有效成份， 但是紫外辐射在该等离子体灭菌中不起主要作用【5 ”。b i r m i n g h a me ta l 采用如图1 3 所示 的电晕放电装置产生大气压等离子体失活b a c i l l u sg l o b i g i ( b g ) 和t 一2m y c o t o x i n 。实验发 现纯氩气等离子体与空气等离子体失活微生物的效果基本相同。他们认为该等离子体失 活微生物的过程中，起主要作用的是等离子体中的活性成份，并不是氧成份【5 5 l 。 9 大气压下等离子体失活微生物的机理研究 图1 3 气相电晕放电装置图 f i g 1 3g a sp h a s ec o r o n ar e a c t o rs c h e m a t i c 采用掺有化学气体的等离子体杀灭微生物时，化学气体在等离子体环境中高能电场 及活性成份的作用下，在灭菌过程中起主要作用。严格意义来说，这种灭菌方式不能称 为等离子体消毒灭菌技术。 ( 2 ) 介质阻挡放电( d b d ) 消毒灭菌研究 许多研究者用d b d 等离子体成功地失活多种革兰氏阴性和阳性菌。美国u n i v e r s i t y o ft e n n e s s e e 的u t k 等离子体科学实验室，j r e e c er o t h 的课题组在2 0 0 0 年左右曾报 道过不少大气压下辉光放电等离子体( o a u g d p ) 表面和材料消毒的信息。他们摸索出 产生等离子体的最优条件是电压4 - 6k v 和频率5 - 6k h z l 5 “。他们定义的m o di v o p 【u g d p 发生器，实际上是d b d 装置，如图1 4 。根据最优放电条件，可得到均匀的 辉光放电。实验的最优空气湿度为1 5 。r f 电源驱动下可避免产生介质放电细丝，获 得均匀稳定的大气压均匀辉光放电等离子体( o a u g d p ) 。利用该装置处理大肠杆菌的 悬浊液发现1 0s 的等离子体曝光可使悬浊液的光密度o d 值在2 6 0n l t l 处增加0 6 0 单位， 3 0s 后增加1 o 单位。他们认为细胞经等离子体曝光后其完整性发生破坏，细胞内的物 质泄漏到细胞外，导致茵悬液的吸光度发生改变。电子扫描显微镜观察并确定细胞发生 破裂。用该放电等离子体处理不同培养基( 液体和琼脂固体) 中的革兰氏阴性菌、阳性 1 0 大连理工大学博士学位论文 菌、细菌孢子和酵母菌，实验发现细菌的失活情况与细菌的种类、处理菌体的附着物及 曝光时间有关。5 0 9 0s 范围内，细菌以5l o g 对数皂级减少，1 0 2 0s 时观察到大分子泄 漏及菌体碎片。 、广 1 l e n c i - o s u r e 图i 4m o di v 大气压下辉光放电等离子体( 0 a u g d p ) 发生器示意图 f i g 1 4s c h e m a t i co f o a u g d p m o di vr e a c t o r m o n t i ee ta 1 利用图1 4 所示的装置产生d b d 等离子体直接处理玻璃片上、琼脂上及 聚丙烯上的e c o l i 和b s u b t i l i s ，得到双斜率( 两阶段) 存活曲线。他们认为第一阶段中d 值由微生物的种类决定