（纺织工程专业论文）再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究[纺织工程专业优秀论文].pdf

再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究摘要 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究 摘要 近年来家蚕丝素由于其独特的理化性能已经被广泛研究作为组织修复用生物材 料。柞蚕丝素蛋白则含有较多的对哺乳动物细胞有特异性相互作用的r g d 序列，有 望在作为细胞培养基质、伤口覆盖膜、人造皮肤及组织工程支架材料和生物医用材料 改性等方面有比家蚕丝素更好的效果和应用前景。本文对再生柞蚕家蚕丝素共混多 孔材料的理化性能、柞蚕家蚕丝素材料的细胞相容性以及e d c 交联柞蚕丝素多孔材 料对s d 大鼠背部真皮缺损的修复作用进行研究。 用l 一乙基一3 ( 3 一二甲氨基丙基) 碳化二亚胺( e d c ) 、n 一羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 和吗啉一乙磺酸( m e s ) 对柞蚕家蚕丝素共混溶液进行交联，柞蚕家蚕的共混比例 为：1 0 0 0 、8 0 2 0 、6 0 4 0 、4 0 6 0 、2 0 8 0 、0 1 0 0 ，并在不同温度条件下( 8 0 0 c 、6 0o c 、 4 0o c 、2 0o c ) 冷冻，最后经真空干燥制得多孔材料。用x 射线衍射、红外光谱等 手段研究了共混比例和交联剂对多孔材料内丝素蛋白结构的影响，结果表明随着家蚕 丝素所占比例的增加，共混材料中无规卷曲和a 螺旋结构的含量降低，而柞蚕家蚕 丝素共混多孔材料添加了交联剂后a 螺旋结构的含量增加，结构更加规整。用热分析 的手段研究了不同丝素比例的共混材料的热稳定性，结果表明柞蚕丝素所占比例越 高，共混材料的热稳定性越好，交联后的多孔材料的热稳定性优于未交联的。本文还 研究冷冻温度对柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的压缩率、吸水率、热水溶失率和孔径、 孔密度的影响。结果表明在冷冻温度相同的情况下，家蚕丝素所占比例较高的共混材 料比柞蚕丝素所占比例高的压缩率小，热水溶失率小，吸水率小；而柞蚕家蚕丝素 比例一定的情况下，冷冻温度越高，共混材料的压缩率越大，吸水率越大，热水溶失 率也越大。柞蚕家蚕丝素多孔材料的孔径随着家蚕丝素所占比例的增加和冷冻温度 的降低而减小，孔密度随着家蚕丝素所占比例的增加和冷冻温度的降低而增大。 通过体外细胞培养，研究了l 9 2 9 细胞在柞蚕家蚕丝素材料上的生长情况、活力 和形态，细胞形态观察和m t t 比色法的结果表明细胞种植天数相同的情况下，柞蚕 丝素膜上细胞的活力大于家蚕丝素膜和胶原对照组，而柞蚕家蚕共混丝素膜上的细 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究 摘要 胞活力基本介于柞蚕丝素膜和家蚕丝素膜之间。共聚焦显微镜观察结果表明l 9 2 9 细 胞在e d c 交联柞蚕丝素多孔材料上增殖情况远远好于p v a 海绵。在细胞接种密度相 同时，相同柞蚕家蚕丝素比例的共混多孔材料上测得的细胞m t t 值均大于对应丝素 膜。 在s d 大鼠真皮缺损部位植入柞蚕丝素多孔材料、家蚕丝素多孔材料和p v a 海 绵，在植入后第5 ，1 0 ，1 5 ，2 5 天分别取材料植入部位及附近组织标本，进行h e 染 色观察其炎症反应、新生毛细血管数量、材料与新生组织的融合情况和新生组织的形 态，并观察p c n a 、0 【一s m a 、c o l l a g e ni 、c o l l a g e ni i i 、t g f - p 、v e g f 、b f g f 和c d 9 0 各项因子表达的免疫组化情况，结果表明柞蚕丝素多孔材料和家蚕丝素多孔材料炎症 反应轻微，能够支持大鼠真皮组织的再生，1 0 天时在多孔材料与组织的交界处就有 较丰富的新生毛细血管，随着时间的延长新生毛细血管的数量也增加。 关键词：柞蚕；家蚕；丝素；共混材料；多孔材料；结构；细胞相容性 作者：吴修芳 指导教师：李明忠 t h es t u d yo f r e g e n e r a t e da n t h e r a e a p e r n y i f b o m b y xm o r is i l kf i b r o i nb l e n dp o r o u sm a t e r i a l sa b s t r a c t t h es t u d yo f r e g e n e r a t e d a n t h e r a e a p e r n y i b o m b y xm o r is i l k f i b r o i nb l e n dp o r o u sm a t e r i a l s a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h eu n i q u ec h e m i c a la n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e so fb o m b y xm o r i 饵m o r i ) s i l kf i b r o i nh a v em a d et h i sp r o t e i np o l y m e rh i g h l ya t t r a c t i v ef o rb i o m e d i c a lu s e s h o w e v e r , t h ea n t h e r a e ap e r n y i 似p e r n y i ) s i l kf i b r o i n c o n t a i n i n g t h e t r i p e p t i d es e q u e n c e a r g g l y a s p ( r g d ) ，w h i c hi sk n o w n t oe x h i b i ts p e c i f i ci n t e r a c t i o n sw i t hm a m m a lc e l l s ， h a sb e t t e rb i o c o m p a t i b i l i t yt h a nb m o r it op r o v i d e ss i g n i f i c a n tf e a s i b l ep r o o f sf o rs t a r i n g s i l kf i b r o i n b a s e dt i s s u eh e a l i n ge n g i n e e r i n gs c a f f o l d s ，a r t i f i c a ls k i na n dt i s s u ei n d u c i n g m a t e r i a l s t h i sp a p e rt a k e sas y s t e m i cr e s e a r c ho nt h e s t r u c t u r e ，p r o p e r t i e sa n d b i o c o m p a b i l i t yo ft h er e g e n e r a t e da p e r n y i b m o r ib l e n dp o r o u sm a t e r i a l sa sw e l la se f f e c t o nt h ed e f e c to fd o r s u mo fs p r a g u e d a w l e y ( s d ) r a t s t h ea p e r n y i f b m o r is i l kf i b r o i nb l e n ds o l u t i o n sw e r ec h e m i c a l l yc r o s sl i n k e do f2 0 e d c ，10 n h sa n d2 0 m e s ( r e l a t i v et ot o t a ls i l kf i b r o i nq u a n t i t y ) ，w h o s em i x e dr a t i o s w e r e10 0 0 ，8 0 2 0 ，6 0 4 0 ，4 0 6 0 ，2 0 8 0a n d0 10 0 ，r e s p e c t i v e l y t h eb l e n dp o r o u sm a t e r i a l s w e r ep r e p a r e db yf r e e z e d r y i n g ，w h i c hf r e e z i n gt h em i x t u r es o l u t i o n so n 一8 0o c ，一6 0o c ， 一4 0o ca n d 一2 0o c ，r e s p e c t i v e l y b ym e a n so fx r a yd i f f r a c t i o na n df t - i rs p e c t r o s c o p y , t h e m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o no ft h ec r o s s l i n k e da n du n c r o s s l i n k e da p e r n y i b m o r is i l kf i b r o i n b l e n dp o r o u sm a t e r i a l sw h i c hp r e p a r e df r o md i f f i e r e n tm i x e dr a t i o s t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ec o n t e n to fr a n d o mc o i la n da - h e l i xs t r u c t u r e si nt h eb l e n dp o r o u sm a t e r i a l s d e c r e a s e da st h ec o n t e n to fb m o r is i l kf i b r o i ni n c r e a s e d ，a sw e l la sm o r e ? - s h e e ts t r u c t u r e w a sf o r m e di nt h ep o r o u sm a t e r i a l sa f t e rc r o s s l i n k e d t h et h e r m a ls t a b i l i t yo fb l e n dp o r o u s m a t e r i a l sp r e p a r e db yd i f f e r e n tm i x e dr a t i ow a se x a m e db ym e a n so fd t ga n a l y s i s ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et h e r m a ls t a b i l i t yo fb l e n dp o r o u sm a t e r i a l sb e i n gs t r o n g e ra st h e c o n t e n to f a p e r n y is i l kf i b r o i ni n c r e a s e d ，a n dc r o s s l i n k e dp o r o u sm a t e r i a l si sm o r et h e r m a l s t a b l et h a nu n c r o s s l i n k e do n e s n l ec o m p r e s s i b i l i t y , e x p a n s i v i t y , w a t e rs o l u b i l i t y , p o r es i z e ， p o r o u s i t ya n dp o r ed e n s i t yo fb l e n dp o r o u sm a t e r i a l sp r e p a r e df r o md i f f e r e n tc o n d i t i o n w e r ei n v e s t i g a t e d t h eo u t c o m ei n d i c a t e dt h a t c o m p r e s s i b i l i t y , w a t e rs o l u b i l i t y a n d e x p a n s i v i t yb e i n gs m a l l e ra st h ec o n t e n to fb m o r is i l kf i b r o i ni n c r e a s ew h e nf r e e z i n ga t 1 1 1 t h es t u d yo f r e g e n e r a t e da n t h e r a e ap e r n y i b o m b y xm o r is i l kf i b r o i nb l e n dp o r o u sm a t e r i a l sa b s t r a c t t h es a m et e m p e r a t u r e ；t h ec o m p r e s s i b i l i t y , w a t e rs o l u b i l i t ya n de x p a n s i v i t yb e i n g l a r g e ra s t h ef r e e z i n gt e m p a r e t u r er i s e i ft h e yh a v et h es a m em i x e dr a t i o w h e nt h ec o n t e n to f b m o r is i l kf i b r o i ni n c r e a s e da n dt h ef r e e z i n gt e m p e r a t u r ed r o p ，t h ep o r es i z eb e i n gs m a l l e r a n dt h ep o r ed e n s i t yb e i n g l a r g e r t h ea t t a c h m e n t ，s p r e a d i n g ，p r o l i f e r a t i o na n d m o r p h o l o g yo fl 9 2 9c e l l o nt h e a p e r n y i b m o r is i l kf i b r o i nb l e n df i l ma n dp o r o u sm a t e r i a l sw e r eo b s e r v e da f t e rc e l l sh a v e b e e ns e e df o rld ，3 d ，5 d ，7 da n d9 db ym i c r o s c o p ya n dm t t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p r o l i f e r a t i o no fc e l l so na p e r n y is i l kf i b r o i nw a ss t r o n g e rt h a nt h a to fb m o r is i l kf i b r o i n a n dc o l l a g e n ，t h e p r o l i f e r a t i o no fc e l l so nt h eb l e n df i l mw e r ea l lb e t w e e nt h ea p e r n y is i l k f i b r o i na n db m o r is i l kf i b r o i n t h er e s u l t sf r o mc o n f o c a lm i c r o s c o p yo b s e r v a t i o ni n d i c a t e d t h a tc e l l sp r o l i f e r a t eb e t t e ro ne d cc r o s s l i n k e da p e r n y is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a l st h a n o np v as c a f f o l d t h em t tv a l u eo fc e l l so np o r o u sm a t r i a lw a sb i g g e rt h a nt h a to ff i l ma s t h e i rh a st h es a n er a t i oo f a p e r n y is i l kf i b r o i na n db m o r is i l kf i b r o i na tt h es a n l ec u l t u r e d t i m e t h ea n i m a lm o d e lu s e dh e r ew a ss p r a g u e - d a w l e y ( s d ) r a t s 、杭也a2 0 - m mx2 0 一埘曲g a p d e f e c ti nt h e t h ed e f e c t sw e r er e p a i r e du s i n ga p e r n y is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a l sa n d b m o r is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a l si ne x p e r i m e n t a lg r o u p ，w h i l et h ep v as c a f f o l d sa s n e g a t i v eg r o u p t h er e c o v e r yo ft h ed e f e c td o r s u mw a se v a l u a t e dp o s t o p e r a t i v e l ya tt h e5 t h ， 10 t h , 15 t h ，a n d2 5 t hd a yu s i n gm a c r o s c o p i c ，h i s t o l o g i c a la n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l i n v i v o ，a t10d a y sa f t e ri m p l a n t a t i o n ，m o r p h o l o g i c a lr e s u l t ss h o w e dt h a tn e o b l o o dv e s s e lw e r e f o r m e di nt h eb o u n d a r yo ft h es i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a l sa n dp v as c a f f o l d ，a n d n e o b l o o dv e s s e lb e c a m em o r ea st h et i m ei n c r e a s e i m m u n o h i s t o c h e m i c a lr e s u l t ss h o w e d t h a ta p e r n y is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a la n db m o r is i l kf i b r o i np o r o u sm a t e r i a lh a v el o w i m m u n o g e n i c i t y ，a n dc a r ls u p p o r th i s t o r e g e n e r a t i o no fd e f e c td o r s u mo fs d r a t s k e y w o r d s ：a n t h e r a e ap e r n y i ；b o m b y xm o r i ；s i l kf i b r o i n ；b l e n d i n gm a t e r i a l s ；p o r o u s m a t e r i a l s ；c y t o c o m p a t i b i l i t y 1 v w r i t t e nb yx i u f a n gw u s u p e r v i s e db ym i n g z h o n gl i 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。研究生签名：虹日期：坦3 笙显竺目 l r t 。 磐，1 。， 7 z 八中f 柏。，、 到i ：究生签名：务。2 v 日期：沙 望 盼f d 目 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论义外，允许论义被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：跹日 导师签名：槛日 期：? 叩争f 印号 期： 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究 第一章引言 第一章引言 一家蚕、柞蚕丝素的组成与结构 蚕( s i l k w o r m ) 分为家蚕( 桑蚕，b o m b y xm o i l ) 和野蚕( t u s s a h ) 两类。野蚕 有柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、樟蚕和柳蚕等数种，其中柞蚕( a n t h e r a e a p e m y i ) 是最常见 的野蚕品种。 蚕丝是蚕五龄后期合成并分泌的蛋白质，由绢丝腺内壁上的内皮细胞合成后分 泌进入后部丝腺，并贮藏在那里直到形成纤维。蚕丝主要由丝素( f i b r o i n ) 和丝胶 ( s e r i c i n ) 两种蛋白质组成。丝素蛋白是蚕丝中主要的组成部分，在家蚕丝中约占 7 0 ，在柞蚕丝中约占8 5 ；丝胶包裹在丝素蛋白的外围，在家蚕丝中约占2 5 ，在 柞蚕丝中约占15 。蚕丝丝素纤维由若干根微纤维和巨原纤维平行排列而成，截面呈 三角形，这样的形态与构造是蚕丝具有优雅的光泽、柔软的手感和良好悬垂性的重要 原因之一。蚕丝丝素分子的凝聚能大，具有适度的结晶度，因此机械性能优良，断裂 强度可与铁丝匹敌i 1 】。 1 家蚕、柞蚕丝素的氨基酸组成 家蚕丝素是一种纤维状蛋白，由2 0 种氨基酸组成，丝素复合体的分子量约为2 2 8 6 k d a ，由重链( h 链，分子量3 5 0 k d a ) 、轻链( l 链，分子量2 5 8k d a ) 及糖蛋白p 2 5 ( 分子量2 8k d a ) 组成，三者比例为h ：l ：p 2 5 = 6 ：6 ：l ，重链和轻链由各自c 一末端的二 硫键相互连接形成复合体，p 2 5 糖蛋白以非共价相互作用加入复合体中，有助于形成 稳定的轻重链复合【2 1 。h 链包含1 5 1 个氨基酸残基长度的非重复n 一末端序y u ( 信号肽) ； 5 0 5 4 个氨基酸残基长度的核心区域，在此区域中11 个短的无定形区( 重复序列编码 4 3 个氨基酸) 和1 2 个长的结晶区交替出现；以及5 8 个氨基酸残基长度的c 一端序列。 h 链大部分序列是低复杂度的，由2 3 7 7 个g l y x ( g x ) 二肽重复单元组成，是非常 容易结晶的肽链【3 1 。l 链由2 6 2 个氨基酸残基组成，前1 8 个氨基酸是信号肽。l 链中 含有3 个半胱氨酸残基，其中2 个半胱氨酸形成分子内二硫键，第三个胱氨酸残基位 于c 一末端较亲水区域内，与丝素蛋白h 链第5 2 4 4 号氨基酸形成链间二硫键，组装 成丝素蛋白【4 1 。p 2 5 蛋白是一种糖蛋白，由p 2 5 链和3 个寡糖链组成。p 2 5 链基因由 2 2 0 个氨基酸残基组成，前1 7 个氨基酸是信号肽。p 2 5 链中含有8 个半胱氨酸，形成 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究第一章引言 4 个分子内二硫键。主要控制丝素蛋白的折叠，透过疏水作用、氢键诱导丝素蛋白进 行伊折叠，形成规整的结构，可能与蚕液晶纺丝机理有关【5 j 。 柞蚕丝素蛋白仅由h 链组成，h 链的总长度是2 6 3 9 个氨基酸残基，分子量2 1 6k d a 。 柞蚕丝素头部( n 末端) 为1 5 5 个残基的氨基酸序列，最头部为1 4 个氨基酸残基编码 序列( m r v i a f v i l c c a l q ) 。头部的保守氨基末端序列将可能成为探索丝素蛋白分 泌的重要信号肽。在组成柞蚕丝素的所有氨基酸中，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸这三种 氨基酸的含量约占总量的8 1 ，含量分别为4 3 0 8 、2 7 2 8 和1 1 2 5 。但是在头部 这三种氨基酸的含量不是很丰富，因此头部区域的疏水性与其他区域显示出不同的特 性。除了头部1 5 5 个氨基酸，柞蚕丝素内部含有8 0 个富含丙氨酸的基序，这部分是亲 水区域与疏水区域交替排列。柞蚕丝素蛋白内部由高度的重复序列组成，在1 5 6 - - - 2 5 5 5 氨基酸之间，共有7 8 个重复，丰富的丙氨酸序列( a 1 a ) 。易形成1 2 , 螺旋结构。家蚕丝素 的结晶区中主要含有重复序列( g l y x ) n ，其中x 为丙氨酸、丝氨酸或酪氨酸；而柞蚕 丝素结晶区中含有大量的( h l a ) 。重复序列。组成非晶区的大部分是较大侧链和极性的 氨基酸残基，这在柞蚕丝素蛋白的非晶区更为突出。结晶区与非晶区氨基酸组成和结 构的差异使得家蚕和柞蚕丝纤维的理化性质有较显著差异【6 】。 柞蚕丝素中的酸性氨基酸( 天门冬氨酸和谷氨酸) 和碱性氨基酸( 赖氨酸、组氨 酸和精氨酸) 残基的含量较高，酸性氨基酸残基的含量为8 6 6 ，碱性氨基酸残基的 含量为7 4 2 ，具有极性侧链的氨基酸残基总量约为3 7 。同时，柞蚕丝素蛋白中含 有大量带有极性和侧基可电离的氨基酸残基，这些都是化学反应的潜在反应位点，因 此柞蚕丝素的化学活性较强【8 以们。同时，由柞蚕丝素的氨基酸序列可见，其中含有较 多的精氨酸甘氨酸天门冬氨酸( r g d ) 三肽序列，它与哺乳动物细胞有特异相互作 用，有利于其用作生物医学材料时细胞在材料上的黏附和生长，这是其具备优良的生 物学性能的重要的结构原因之一【1 1 1 。 2 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究第一章引言 表1 各种丝素的氨基酸组成1 7 】 注：a 指未检测出。 2 家蚕、柞蚕丝素的聚集态结构 家蚕丝素纤维中包含结晶区和非结晶区，两者交互排列，h 链交替穿过结晶区和 非结晶区。对于家蚕丝素的结晶形态，清水正德首先发现家蚕丝素的两种结晶形态： 仅型和d 型。在其后，k r a t k y 证明了两种结晶形态的存在，并指出丝素仪型的分子结构 并非一般蛋白质中的仅螺旋结构。为避免混淆，通常把丝素的型和p 型称为s i l ki 和s i l ki i 。s i l ki 的晶体结构模型由b l o t s l l 2 1 提出，另外平林洁、小西孝等【1 3 】也对其 进行过研究，其立体构象呈曲柄型，是介于仅螺旋和d 折叠之间的一种中间形态。s i l k i i 的晶体结构模型由m a r s h t l 4 】根据x 一射线衍射结果提出，是反平行p 折叠层结构， 属斜方晶系，肽链链段排列整齐，抵抗外力拉伸的能力强，难溶于水。r e g i n a 等人【1 5 】 在丝素溶液与空气界面上中发现了丝素i i i 结构，这种结晶内部丝素蛋白大分子的构 象比较特殊，呈3 折叠螺旋结构。 柞蚕丝素蛋白分子的构象比较复杂，通常同时含有多种构象，目前证实的三种构 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究第一章引言 象为无规卷曲、仪- 螺旋和p - 折叠( 主要为反平行p 折叠) 结构。柞蚕丝素蛋白中的多 种构象在一定条件下可以互相转化。三种结构的示意图如图所示： 姿 銎 o k ，一h _t f - - o “一r m o - 峥 卜- 蚋 hr 嚏晰c t 卜- - 一_ 一一一 _ 一 t，一h 咖 ，j _ - ，气一 竹_hm “r ”， - j h ， ，- 一 ( a ) 无规卷曲( b ) o - 螺旋( c ) p - 折叠 天然柞蚕丝素蛋白溶液可以从柞蚕熟蚕的后部丝腺( 吐丝前一天) 中获得。据报 道，直接从柞蚕后部丝腺取出的天然丝素蛋白质的分子量为2 1 6k d a 【1 6 1 。溶液状态下 的天然柞蚕丝素蛋白为a 螺旋结构，将天然丝素蛋白溶液延流成膜，该膜的分子构象 主要为a 螺旋和无规卷曲，经热或者甲醇等有机溶剂处理之后，分子构象发生了仅 螺旋向p 折叠结构的转变1 他o l 。j u nm a g o s h i a l 2 1 】等人报道在差热扫描分析曲线上看出 家蚕丝素绢丝液的。卜p 构象转变温度为5 1o c ，而柞蚕丝素绢丝液和天蚕丝素绢丝液的 铲p 构象转变温度分别为为6 7o c 和5 9o c 。 二家蚕、柞蚕丝素的理化性能 从熟蚕体内后部绢丝腺收集的丝素蛋白只能满足实验室少量制备的需要，不能满 足大规模生产的要求。天然丝素纤维由于分子链中的疏水键以及结构中大量的b 折叠 结构使得结晶度高，难被生物降解，不能直接用于制备组织工程支架、药物控制释放 载体等需要可被生物降解的生物材料。所以，需要采用化学溶解的方法将丝素纤维溶 解、纯化后获得再生丝素蛋白水溶液，再用此水溶液制备所需要的形态、结构和功能 的生物材料，例如多孔材料、凝胶、膜、纤维、粉末等。 目前已有研究者成功地完成了对家蚕和柞蚕丝素纤维的溶解。家蚕丝素主要用 l i b r 、l i s c n 、c a c l 2 等盐的浓溶液溶解，经透析除盐后得到的丝素水溶液由于溶剂 的作用而使部分分子链断裂，其分子量比天然丝素的分子量有所降低。h a ey o n g k w e o n 等【2 2 】将脱胶后的柞蚕丝素纤维用熔融的四水合硝酸钙溶解，发现丝素纤维的 溶解性与硝酸钙的浓度、溶解温度和时间有很大关系。m i n g z h o n gl i 等【2 3 】将脱胶后 4 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究 第一章引言 的柞蚕丝素纤维用硫氰酸锂溶解，同样发现丝素纤维的溶解性与硫氰酸锂的浓度、溶 解温度和时间紧密相关。 再生家蚕丝素溶液中丝素的构象为无规卷曲结构，也有报道认为存在部分s i l ki 晶核。常温- 4 5o c 将家蚕丝素溶液中速干燥固化后得到的丝素膜含s i l ki 结构；干燥 温度高于4 5o c 时，s i l ki 晶核破坏，转变为热稳定性较好的s i l ki i 。将液状丝素加水 稀释后将破坏s i l ki i 晶核，其后即使将此水溶液浓缩，也只能得到非结晶丝素。丝素 溶液干燥固化后的结构还与干燥速度、溶液组成有密切的关系。经长时间干燥后，即 使在室温下，也将形成s i l ki ，并最终形成形态稳定的s i l ki i t 2 4 1 。反之快速干燥时，即 使在5 0o c 以上，仍以无定形为主【2 5 1 。另外，若丝素溶液的初期p h 值大于5 ，则形 成无定形丝素；若初期p h 小于5 ，则形成s i l ki i 。在丝素水溶液中若加入甲醇、乙醇 等水合作用较强的溶剂，则形成s i l ki i 。将无定形丝素膜加热，则在1 7 5o c 附近部分 氢键开始断裂，1 9 0o c 附近开始逐渐形成分子形态稳定的s i l ki i ，2 0 0o c 附近完成结 晶化。无定形丝素膜置于热水中处理时，处理温度在0 5 0o c 之间，形成s i l ki ；处理 温度在6 0o c 以上，则形成s i l ki i 。无定形丝素膜在水中拉伸4 倍以上时形成s i l ki i ， 并纤维化。s i l ki 丝素膜于2 7 0o c 加热，则转变为s i l ki i ，于室温下长时间放置，或 经反复吸湿放湿处理后，也将转变为s i l ki i 。 y il i u 等人【2 6 】用延流法制备了一系列丝素与尼龙6 6 的共混膜，d s c 分析结果表 明每个比例的共混膜都在1 5 0o c 有一个大而宽的失重峰。用偏振显微镜观察其熔解 过程发现含1 0 和3 0 丝素的共混膜在其发热阶段出现大的晶粒。进一步研究发现， 含3 0 丝素的共混膜存在两个截然不同的晶粒，在a 部分是较大的晶粒，在b 部分 是一个小得多的晶粒。在较大的晶粒的广角x 射线衍射图谱上出现一个不同于以往 报道的尼龙6 6 和丝素的特征峰，而小的晶粒的x 射线衍射图谱则是正常尼龙6 6 的 三斜晶系。s e m 结果表明，除了5 0 的丝素外，尼龙6 6 能与丝素以任意比例混合。 h a e y o n g 2 7 1 等人用红外光谱来测定家蚕丝素壳聚糖共混膜中丝素构象的变化，结果表 明所有共混膜都有两个分别属于家蚕丝素和壳聚糖的特征峰，只是因共混比例的不同 特征峰强度有所不同，由于共混膜经过甲醇处理，所有比例的共混膜的红外图谱上都 存在p ，折叠特征峰。对壳聚糖成分对共混膜的物理、机械性能的影响的研究发现共混 膜可以作为生物医用材料，比如人工皮肤等。含1 0 4 0 壳聚糖的共混膜的机械性能 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究第一章引言 相当好。拉伸强力、断裂伸长、杨氏模量、膨胀率都受到共混膜中壳聚糖比例的影响。 含1 0 2 0 壳聚糖共混膜的密度低于纯丝素和纯壳聚糖膜，但随着壳聚糖比例的增 大( 2 0 ) ，共混膜的密度也不断增加。透气率系数随着壳聚糖含量的增加呈线性增 加趋势，透气率在1 0 0 0 2 0 0 0 9 m 2 天，与商品化的伤口敷料相当。丝素壳聚糖共混膜 具有很好的透氧性和透气性，特别是含5 0 壳聚糖的共混膜的透氧性达到0 5 7 9 e m 3 ( s t p ) c m ( c m 2s c m h g ) 1 0 1 0 】。无论壳聚糖的比例是多少，在s e m 上都没有发上 相分离现象。b i m a nb 1 4 3 】等人研究了不同冷冻温度对家蚕丝素蛋白三维支架中孔微观 结构的影响。通过s e m 观察发现从2 0o c 缓慢降温到8 0o c 的孔直径为2 0 0 2 5 0 9 m ， 但孔隙率较小，孔连通性较差。与此相反的是，在1 9 6o c 快速冷冻的多孔材料具有 较高的孔连通性，孔隙率达9 6 。结果表明快速冷冻能够产生具有高度连通孔的多孔 材料。f e n gl i n 2 9 】等人直接向家蚕丝素溶液中添加甲醇和戊二醛后冷冻干燥制备3 d 多孔材料，然后置于模拟体液中做羟磷灰石的沉积。x r d 和f t i r 结果显示丝素为d 折叠结构，所以多孔材料具有高热稳定性和机械属性。x r d 和原子吸收光谱显示随 着浸泡时间的延长，丝素多孔材料能够诱导羟基磷灰石晶体的连续生长和强化。在 3 d 内，随着羟基磷灰石的沉积，多孔材料的机械性能也增加；3 d 以后机械性能随之 降低。在整个浸泡过程中，孔隙率和结合水的能力无明显变化，分别保持在8 4 和 8 0 0 。结果表明多孔材料在羟基磷灰石沉积以后细胞相容性提高。e v as e r v o l i 等人 3 0 l 报道在5 0 h z 交流电场下将丝素溶液延流成具有各向异性且不溶于水的膜。用交流电 处理影响了分子内偶极子的排列和定向超分子排列的形成，最终表现出的机械性能、 热学性能与未处理的、甲醇处理的丝素膜都不同，且膜的表面形成条状结构。m r c 5 成纤维细胞在各项异性丝素膜上接种6 小时以后优先向平行于电场方向扩增。 柞蚕丝素纤维经化学溶解后，纯化得到再生丝素蛋白溶液，目前已有研究者利用 再生柞蚕丝素溶液制备了相关的材料，并研究了它们的结构和理化性质。m a s u h i r o t s u k a d a 等【3 l 】对比研究了天然和再生柞蚕丝素膜的理化性质和热力学行为。天然丝素 膜的热转变温度始于1 9 0o c ，而再生丝素膜的始于2 1 4o c ，表明再生丝素膜比天然丝 素膜显示了更高的热稳定性，玻璃化转变温度也较高。h a ey o n gk w e o n 等1 3 2 - 3 4 对硝 酸钙溶解的再生柞蚕丝素溶液制备的丝素膜进行热或者有机溶剂处理后性质变化的 研究。m i n g z h o n gl i 等【3 5 】对硫氰酸锂溶解的再生柞蚕丝素溶液制备的丝素膜进行了 再生柞蚕家蚕丝素共混多孑l 材料的研究 第一章引言 有机溶剂处理的研究。再生柞蚕丝素蛋白可以加工成多种生物材料。但是直接用再生 柞蚕丝素溶液制备的材料由于结晶度低，在水中稳定性及机械性能差，难以实际应用。 通过使用溶剂、热处理或物理拉伸的方法形成b 折叠结构，能够提高其耐水性及力学 强度，但材料却变得很脆，韧性差。 t s u k a d a1 3 6 】等人研究了从柞蚕和家蚕后部丝腺提取的柞蚕丝素和家蚕丝素共混膜 的物理性能和相分离结构，d s c 差示扫描量热法结果表明由于各自无规卷曲结构的 分解，天然家蚕丝素和天然柞蚕丝素在分别在2 8 0o c 和3 5 8o c 有吸热峰，而它们的 共混膜的d s c 曲线上这两个吸热峰的强度基本上与这两种丝素含量的多少成正比； 由于加热导致家蚕、柞蚕丝素构象改变的这种热行为在1 9 0 - 2 3 0o c 范围内有重叠。 热机械性能t m a 和热失重t g a 结果表明共混膜的热膨胀、热收缩和残留重量都介 于纯家蚕和纯柞蚕二者之间。随着共混膜中家蚕丝素组分的增加，储能模量的起始温 度显著降低，逐渐接近家蚕丝素膜。共混膜的红外曲线在2 0 0 0 。4 0 0 c m 。1 范围内分别出 现家蚕丝素和柞蚕丝素各自的特征吸收峰；共混膜的x 射线衍射曲线上都存在柞蚕 丝素的结晶峰( 2 3o ) 和家蚕丝素的结晶峰( 2 1 5o ) ，随着柞蚕丝素比例的增加， 1 1 4o 处的结晶峰强度也逐渐增加。由x 射线衍射曲线计算得到的共混膜的结晶度随 着家蚕丝素比例的降低而减少。在其实验条件下延流法制得的柞蚕、家蚕丝素共混膜 中两种丝素呈现较低的相容性，即存在相分离结构。p a o l at a d d e i a ”】等人将家蚕丝和 柞蚕丝用鞣酸、乙二胺四乙酸二酐改性后用碱性c u 2 + 和c 0 2 + 溶液处理，用衰减全反 射和红外光谱评价金属螯合诱导的结构变化。由于c 0 2 + 的络合作用，所有家蚕丝素 和柞蚕丝素样品的光谱图上酰胺i 强度都有与金属含量成反比的趋势。在所有用鞣酸、 乙二胺四乙酸二酐改性处理的家蚕、柞蚕丝的光谱图分别都观察到与改性关系极大的 改变。特别是在柞蚕丝样品中发现了c u 2 + 络合作用导致的酰胺i 强度的下降。p a t r i z i a m o n t i 3 8 】等人用拉曼光谱研究各种酶对丝素的催化反应，如蛋白质水解酶对柞蚕丝素 膜的降解作用、酪氨酸酶对桑蚕丝的氧化反应和壳聚糖对氧化丝素的接枝顺序。柞蚕 丝素膜置入蛋白质水解酶中不同时间后的光谱显示无定形富谷氨酸区的活泼肽链的 断裂，使各种氨基酸单元减少。降解没有影响d 折叠链分子构象。桑蚕丝素经酪氨酸 酶氧化后，酪氨酸基团的光谱强度降低，但没有消失。i s 5 2 1 8 2 0 强度比值增大表明在 强疏水区不易接触到酶的酪氨酸基团。1 6 4 6 c m 1 处亚胺基团的特征谱带证明壳聚糖能 再生柞蚕家蚕丝素共混多孔材料的研究第一章引言 高效的接枝到氧化丝素上，可能是经过席夫碱反应。壳聚糖接枝丝素接枝产物的蛋白 质组成由d 折叠构象向无规卷曲构象转变。h a e y o n g 等【3 9 】制备了一种柞蚕丝素蛋白与 壳聚糖的共混膜，这种膜是由柞蚕丝素溶液和壳聚糖的乙酸溶液混合液制备而来的， 由于混合液中乙酸的作用使得共混膜中柞蚕丝素蛋白的分子构象为6 折叠结构。共混 的形成是由于柞蚕丝素蛋白的n h 基团与壳聚糖的c = o 和n h 2 基团发生了分子间的 相互作用。热分析表明这种共混膜在2 9 4o c ( 壳聚糖成分) 和3 6 9o c ( 丝素成分) 的 位置显示出两个明显的最大热分解峰，是相分离的明显证据，而s e m 扫描照片也证 实了这点。 三家蚕、柞蚕丝素蛋白材料在生物医用领域的应用研究现状 生物医用材料是一类与生命系统相作用，用以诊断、治疗、修复和替代人体病变 或损伤的组织、器官，或增进其功能的材料。当今的前沿研究领域是组织工程材料和 组织诱导材料，其特征是在分子水平上模拟特定细胞和基因特异性反应，使材料具有 主动诱导、激发人体组织和器官的再生修复能力，能参与人体物质交换并产生相互结 合。 理想的组织工程或组织诱导支架材料至少应具备以下几个条件：( 1 ) 有良好的生 物相容性，其本身及降解产物对细胞和机体无毒性，不会或较少引起炎症和免疫排斥 反应；( 2 ) 良好的表面相容性，即材料表面具有足够的细胞吸