（微生物学专业论文）植物内生菌来源具有抗肿瘤及抗菌增效活性物质的筛选.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：舞认 日期： 论文使用授权声明 协以茸s _ 8 j 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作糍名：本轨导师签名侮呔伽： 译_ f 上海师范人学顶十：学位论文 中立摘要 中文摘要 本研究对6 6 0 株植物内生菌通过不同的四种培养基发酵所得到的共计5 2 8 0 份样品，通过抗肿瘤模型a 5 4 9 ，l o v o 及抗菌增效剂等模型进行筛选，最终得到 了来自h c c b l 5 4 6 ，h c c b l 7 7 8 ，h c c b l 9 2 7 ，h c c b l 7 9 1 ，h c c b l 9 0 7 ，h c c b l 5 4 0 等6 份酯相样品及h c c b l 6 0 1 ，h c c b l 6 2 2 ，h c c b l 6 6 4 等3 份发酵液的水相样 品是具有抗肿瘤活性的成分。同时发现h c c b l 0 7 2 的酯相样品呈现抗菌增效作 用的抑菌圈。 对具有较强抗肿瘤活性的植物内生菌h c c b l 6 2 2 进行了更深入的研究，通 过真菌分类手册检索，初步鉴定其为毛孢霉属( t r i c h o s p o r i u mf r o 的真菌，并对其 发酵过程的生化特征进行了初探，对其代谢产物中的活性物质的进行了分离纯化 研究。应用溶媒萃取，高速离心，硅胶柱，薄层色谱( t l c ) ，高效液相色谱( ，l c ) 等分离方法，从该发酵液中分离到三个化合物，分别命名为a ，a 2 和b ，并对 它们进行了质谱( m s ) ，核磁共振谱( n m r ) 分析，初步鉴定出了化合物a 的 结构，为f 醇类物质，但活性不太明显。化合物b 具有和化合物a 一样的母核， 同时在相关的文献上没有检索到类似的化合物，且抗肿瘤活性较为明显。由于化 合物a 2 在次级代谢产物中含量少，没能累积出足够的量进行谱图解析。 关键词：植物内生菌，生理活性物质，化合物分离纯化 t 海师范人学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t e n d o p h y t ei san o v e ls o u r c ef o rb i o a c t i v ep r o d u c t ss c r e e n i n g 5 2 6 0s a m p l e s p r o d u c e db y6 6 0e n d o p h y t e sr e s e r v e db y s h a n g h a ih e a l t hc r e a t i o nc e n t e rf o r b i o p h a r m a c e u t i c sr & dw e r et e s t e do ns e v e r a lm o d e l s ，j u s ta sc a n c e rm o d e la 5 4 9 ， l o v oa n da n t i b i o t i c s y n e r g i s t m o d e l a n dt h er e s u l to f s e c o n dr o u n d i n d e p t h s c r e e n i n gf o ra l lb i o a c t i v es a m p l e sd e m o n s t r a t et h a tn i n es a m p l e ss t i l lh a v e i n h i b i t o r ya b i l i t ya g a i n s tb o t hc a n c e rc e l l s ，i n c l u d i n gs i xe s t e r - p h a s es a m p l e s ： h c c b l 5 4 6 。h c c b l 7 7 8 ，h c c b l 9 2 7 ，h c c b l 7 9 1 ，h c c b l 9 0 7 ，h c c b l 5 4 0 a n d t h r e ea q u e o u s - p h a s es a m p l e s ：h c c b l 6 0 1 ，h c c b l 6 2 2 ，h c c b l 6 6 4 t h e r ei so n e a q u e o u s p h a s es a m p l eh c c b l 0 7 2w h i c hh a st h ea b i l i t ya st h ea n t i b i o t i cs y n e r g i s t h c c b l 6 2 2w a ss e l e c t e df i o mt h en i n eb i o a c t i v es t r a i n sf o ri t ss t r o n gi n h i b i t i o n o nc a n c e rm o d e l s t h i ss t r a i nw a si d e m i f i e da st r i c h o s p o r i u mf r i a n dm o r e r e s e a r c h e so nt h ep h y s i o c h e m i s t r yo fi t sf e r m e n t a t i o nh a v ed o n e i no r d e rt og e tt h e b i o a c t i v ec o m p o u n di nt h es e c o n dm e t a b o l i t e ，t h r e ec o m p o u n d sa ，a 2a n dbw e r e i s o l a t e x lb yt h em e a n so fs o l v e n te x t r a c t i o n ，s i l i c a g e lc h r o m a t o g r a p h y , t l c ，a n d h p l ce ta 1 c o m p o u n daa n dbw e r ed e t e c t e db ym a s ss p e c t r u m ( m s ) ，c n m r ， h - n m r c o m p o u n da w a sa n a l y z e dt ob eo n eo ft h es t e r o l s ，a n dc o m p o u n dbh a v e t h es a m em o t h e rn u c l i d el i k ea ，b u tm o r ec o m p l i c a t e d ，i tw a sn o tf o u n df r o ms o m e r e f e r e n c e sr e l a t e d k e y w o r d s ：e n d o p h y t e ，b i o a c t i v ep r o d u c t s ，c o m p o u n d sp u r i f i c a t i o n 2 i ：海师范大学硕+ 学位论文文献综述 第一篇文献综述 经济的不断发展突现了人类社会更多的健康问题，开发更有效的药物来保障 人类和谐发展已刻不容缓。据统计，约有2 5 5 0 的现有药物来源于植物，因此 植物成为我们寻找对付许多新兴疾病及难治之症的药物而不断进行挖掘的宝库。 然而，随着政府及人民对生态环境的重视，以及药用植物资源的开采周期长，生 长受地理环境和生态条件的限制，使我们不得不寻找一种既可以保护生态环境又 能持续不断生产药物的新途径。 在1 8 9 3 年发现植物内生菌以来，人们就开始研究植物内生菌与植物本身的 药用价值的关系，这种研究的结果令人们欣喜不已，使人们看到了从植物内生菌 的代谢产物中寻找有效的药物分子来代替对植物资源的开采的希望。最近一个全 面的研究显示，5 1 的从植物内生真菌分离的生物活性物质是阱前没有发现的化 合物。而从土壤微生物发现的新物质仅为3 8 口1 。植物内生菌几乎存在于所有目 前已研究过的植物中，而且绝大多数植物内生菌还没有被研究过。因此对这一尚 未深入挖掘的宝库进行更广泛深入的挖掘，使来源于植物内生菌的具生理活性的 物质为人类健康和社会的繁荣发展做出应有的贡献。 1 植物内生菌的概念及研究发展历程 植物内生菌( e n d o p h y t e ) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活 于健康植物的各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌或细菌。虽然早在十九世纪 中叶人们就已经发现在健康植物组织的内部也有微生物存在，d eb a r r y ( 1 8 6 6 ) 首 先提出植物内生菌一词，并在其后的几十年中，先后在几种牧草植物中发现了内 生菌，但由于它们生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，其存在和作用 长期以来一直为人们所忽视。因此，b a r r y 的定义主要是指生活在植物组织内的 微生物，用以区分那些生活在植物表面的表生菌，因而这个定义将植物的致病菌、 菌根菌也包括在这个概念范畴内了。直到1 9 7 7 年b a c o n 等人发现高羊茅内生真 菌与牛的中毒症状相关后，才引起广泛关注，在其后的十几年时间，侧重于草本 植物内生菌研究，特别是对感染内生菌的牧草对草食动物的影响以及对食叶虫的 影响方面研究，这时的内生菌研究才得以广泛地开展起来嘲。c l a y ( 1 9 8 8 ) 将内生 菌定义为在植物内完成其生活史的部分或全部，但又不引起任何病症的微生物， 包括细菌和真菌，突出内生菌与植物的互惠共生关系。特指禾本科牧草中那些属 于麦角菌科( c l a v i v i p i t a c e a e ) 的不引起症状、系统发生、种子携带的内生真菌 以与严格附生的病原真菌种类相区别【3 】。2 0 世纪9 0 年代以后，在植物内生菌方 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 面的研究范围扩大了，不仅仅局限于牧草植物内生菌的研究，也从其他不同植物 中分离内生菌研究其生物多样性，生物学作用，侵染途径以及与宿主之间的关 系等，特别1 9 9 3 年s t r o b e l 首次报道了从短叶紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 的树皮中分离 出一株内生真菌( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) 能产生紫杉醇( t a x 0 1 ) t 4 1 ，对植物内生菌又有 了更深的了解。因此，在2 0 0 0 年由s t o n ej k 等提出了较常用的更为宽泛的内生 菌概念：是指那些生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器 官内部的真菌或细菌，被感染的植物( 至少暂时) 不表现出外在病症，可通过组 织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生 物d n a 的方法来证明其内生嘲。这说明植物内生菌是生活于植物内部的正常菌 群，不仅包括互惠共利的共生微生物，也包括潜伏在宿主体内的病原菌。它泛指 一切生活在植物体内的腐生、寄生和共生真菌及细菌等微生物。植物内生菌是一 个生态学概念，而非分类学单位。植物内生菌的涵义已延伸至植物微生态学、植 物病理学和生物防治等领域。当然，相对其它学科来说，植物内生菌的研究尚缺 乏一定的系统性，但近年来，随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入， 植物内生菌所发挥的重要的生态和生理作用及其作为潜在生防资源和外源基因 载体，在农业和医药领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点。 2 植物内生菌的分离和培养 用无菌手术刀从植物不同部分上取少部分样本，置于干燥的无菌塑料袋中。 在进行分离前要将样本储存于4 c 的环境中。分离时，要对样品表面进行彻底消 毒，典型的消毒剂有7 0 9 0 的乙醇、漂白剂、1 的过氧乙酸和3 3 0 的h 2 0 2 。 通常多种消毒剂结合使用。例如，在7 5 乙醇中浸泡1 m i n ，6 5 的次氯酸钠1 0 m i n 和7 5 乙醇3 0 s ，涂平板前用无菌蒸馏水清洗。表面消毒后，在无菌操作台中， 用无菌刀片，将植物样品外部组织剔除，用无菌刀片或牙签挑一小块植物内部组 织小心的置于琼脂培养基上，再将其轻轻植入培养基。平板堆放培养，不能倒置。 分离低温菌需要5 1 5 的低温培养，分离中温菌则需要2 0 3 5 ，嗜热菌则要高 于4 5 5 0 。可以用不同的温度培养以筛选不同的菌种。经过几天的培养，真菌 将会从植入处向外铺展生长，可以分离生长在前沿的真菌，当然也会分离出细菌 和放线菌。之后就可以对分离出来的内生菌进行富集和纯化，最后可对分离出来 的内生菌进行生物学和生化方面的检测以确定它们的种属。 3 植物内生菌的基础研究 3 1 环境因子对植物内生菌的影响 植物内生菌生长于植物组织内，环境因子对植物的影响会间接地影响到植物 内生菌的多样性和生长代谢。 4 上海师范人学硕十学位论文 文献综述 3 1 1 对多样性的影响 自然环境因素如季节温度变化、光照、雨水、空气湿度等都会影响到植物内 生菌的多样性。m o c a l is ( 2 0 0 3 ) 等1 6 】人调查研究两株榆树不同季节内生菌的动态变 化，以月份作为研究的一个因子，通过植物器官和植物的纤维蛋白酶的变化参数， 揭示了其内生菌的波动变化是受温度( 冷热) 影响的。环境污染物质同样会影响植 物内生菌的生物多样性；d a n t ir ( 2 0 0 2 ) 7 1 在研究植物f a g u ss y l v a t i al 的枝梢暴露 于s d b s ( 为一种人工合成的阴离子去垢剂，可降解植物叶面的蜡质层，影响植 物同化能力和叶片水份蒸腾作用) 浮质中其内生真菌的多样性和数量的变化时， 发现枝梢中内生真菌的多样性和数量随其暴露时间的延长而减少。现今环境中的 工业污染物的增加不仅对动物植物造成极大的伤害，同时也对植物内生菌资源造 成极大的破坏，一种植物的灭绝就意味着大量的内生菌的消失。 3 1 2 对内生菌生长代谢的影响 环境因子影响植物内生菌的多样性的同时影响着内生菌的生长代谢。内生真 菌的定殖率与冰雪覆盖期、寄主植物弱营养供给成正相关。在极端环境条件下内 生真菌的定殖率是比较低的，如沙漠中的o p u n ms t r i c t a 只有2 3 种内生真菌，比 其它地区的植物要少得多( f i s h e r 等，1 9 9 4 ) 。m a e c h e r o n ij rw ( 1 9 9 8 ) 等协) 研究了 植物内生菌刺盘孢霉在营养缺陷时其磷酸酶的合成与分泌状况，研究表明，p h 5 0 酸性磷酸酶和m 9 2 + d e p e n d e mp h 7 5 磷酸二酯酶在任何生长状况下都恒量表达， 在磷饥饿时，p h 6 0 酸性磷酸酶表达分泌胞外，而碱性磷酸酶的表达为另一独特 模式，在磷丰富或氮饥饿时，表达p i l l 0 0 胞内碱性磷酸酶，但在又缺氧或硫源 时，其表达就会被阻。t 司e r a n a ( 2 0 0 3 ) 9 】等调查了一些非生命因素如干燥、热、 盐等对内生菌g l u c o n a c e t o b a c t e rd i a z o t r o p h i c u s 的生长和生物学活性影响，结果 表明，这株菌可以忍耐热处理和耐盐，但其固氮酶活性和碳代谢酶类活性会受到 高n a c l 浓度的影响。环境除对内生菌酶的产生极其活性的影响之外，还影响着 内生菌的次生代谢，如降低对感染内生真菌的高酥油草和多年生黑麦革的收割次 数和增加其牧草的高度会使内生真菌生物碱代谢增加【1 0 1 。 3 2 植物内生菌的分布 3 2 1 宿主植物种类分布多样 地球上有大约3 0 万种植物。内生菌普遍存在于目前已经研究过的各种陆生及 水生植物中。目前全世界至少已在8 0 个属2 9 0 多种禾本科植物中发现内生真菌， 其中研究较多的有牧草、棉花( g o s s y p i u mh i r s u t u m ) 、小麦( t r i t i c u ma e s t i v u m ) 、 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 高粱( s o r g h u mb i c o l o r ) 、水稻( o r y z as a t i v a ) 、玉米( z e am a y s ) 、马铃薯( s o l a n u m t u b e r o s u m ) 、甘蔗( s a c c h a r u mo f f i c i n a r u m ) 、甜菜( b e t av u l g a r i s ) 等。自2 0 世纪7 0 年代后期，内生真菌在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉、云杉、红杉、 紫杉、松柏等以及阔叶的栎树、桦树、桉树等植物树皮、枝叶内相继被发现并得 到了广泛的研究。 3 2 2 内生菌自身种类分布多样 目前，在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌隶属于5 4 个属( 已 超过1 2 9 种) ，其中大部分为土壤微生物种类，包括假单孢菌属( p s e u d o m o n a s ) ， 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) ，肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 以及土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 从现有的研究来看，植物内生细菌有革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性菌约5 0 个属 ”。大多数植物内生真菌属于子囊菌类o s c o m y c e t e s ) ，包括核菌纲 ( p y r e n o m y e t e s ) 、盘菌纲( d i s c o m y e t e s ) 和腔菌纲( l o c u l o a s c o m y e t e s ) 的许多种类以 及它们的一些衍生菌。 3 2 3 内生菌在植物组织中分布多样 内生菌的菌丝生长于植物组织的细胞问，分稚于叶鞘、种子、花、茎、叶片 和根，其中叶鞘和种子的菌丝含量最多。内生菌系统地分布于植物体根、茎、叶、 花、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞问隙。近年来，已从黄瓜( c u c u m i s s a t i v u s ) 、甜菜根、甘蓝( b r a s s ic a o l e r a c e a ) 、花生0 r c h i sh y p o g a e a ) 果仁、百慕 大草( b e r m u d ag l a s s ) 的茎、马铃薯的块茎、种子和胚珠、棉花的胚根、棉铃和水 稻叶子及其它植物储藏器官内分离到大量内生细菌“。内生真菌菌丝在宿主植物 的叶鞘和种子中含量最多，而叶片和根中含量极少o 。 3 2 4 内生菌的宿主专化性和组织专化性 内生真菌要经过识别寄主、孢子萌发，然后才定殖于合适的植物组织内，内 生真菌具有不同程度的专化性。有些内生真菌的寄主专化性不高，只有表现在植 物科的水平上。在同一地点同科不同种的植物上的内生真菌有可能是相似的。不 同器官的内生真菌群落可能显著不同，表现出了器官专化性。s i e b e r ( 1 9 8 8 ) 发 现l o p h o d e r m i u mp i c e a e 和t i a r o s p o r e l l ap a r c a 在云杉( p i c e a a b i e s ) 的针叶上较 多而在嫩枝上则几乎没有。c a r r o l l 等( 1 9 7 7 ) 首先报道的组织专化性从针叶叶柄 上分离的许多内生真菌极少在针叶的其它部位发现。s t o n e ( 1 9 8 6 ) 发现两种真 菌r h a b d o c l i n ep a r k e r i 和p h y l l o s t i c t as p 共同存在于p s e u d o 船u g am e n z i e s i i 针叶上 6 上海师范大学硕士学位论文史献综述 但它们分别存在于不同部位，r h a b d o c l i n ep a r k e r i 在针叶上表皮和皮下组织中， 而p h y l l o s t i c t as p 存在于针叶的叶肉的细胞内。r o d r i g u e s ( 1 9 9 4 ) 发现内生真菌 在e u t e r p eo ? p r a c e a 叶子的叶脉和叶肉组织显著不同，推测一些内生真菌可能只利 用特定的营养物质，内生真菌器官和组织专化性吸收不同的营养物质。这可能是 一种防止内生真菌的小生境重叠在相同环境相互竞争的一种机理，也有一种可能 就是某些真菌对它生存环境的一种适应。 3 3 植物内生菌与宿主的关系 尽管内生菌在植物体中的生物量似乎微不足道，但现有研究认为内生菌可通 过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体旌加影响。已发现内生菌对宿 主植物至少有以下几个方面的有益作用：固氮作用( 主要是内生细菌) 、促植物生 长( 如分泌吲哚乙酸i a a 等植物生长激素物质) 、抗逆境( 如干旱等) 、抗动物( 昆虫、 线虫、食草哺乳动物等) 摄食、抗病原真菌和细菌等。 3 3 1 促进植物生长 内生菌可增进宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收。在甘蔗的根、茎、叶内 存在大量的新型内生固氮菌一重氮营养醋杆菌0 c e t o b a c t e rd i a z o t r o p h i c u s ) “， 这种内生菌具有强的抗酸能力，能在高糖环境中生长和保持高效的固氮活性并与 甘蔗建立联合固氮作用，表现严格的寄主专一性。此外，在水稻、玉米和l e p t o c h l o a f u s c a 等植物中也相继分离到具有固氮作用的内生菌“。许多内生菌可产生i a a 、 吲哚乙腈以及细胞激动素等植物生长激素“，禾本科植物中常见的内生菌 a c r e m o n i u ms p 与寄主植物形成了互惠共生体，并不破坏植物的组织或细胞，宿 主与真菌之间的代谢或营养循环相互关联，还促使感染内生真菌的植物增强光合 作用，延长植物的生长期( p e i r i n i1 9 9 1 ) 。因此感染内生菌的植物一般具有比未 感染植株生长快速的特点。 3 3 2 增强宿主植物抗逆性 c h e n 等“7 1 用来自棉花的内生细菌回接棉花，可以减轻人工接种感染的棉花枯 萎症状。c l a y 等“8 3 发现侵染内生真菌的草遭受到真菌病害影响的程度远远低于没 有感染内生菌的。傅正擎等“9 1 用内生菌及其代谢产物与棉花黄萎病菌共培养的方 式，证明内生菌可通过促生长作用来提高棉株的抗逆性。许多研究表明，内生菌 感染的植物对植物害虫和土壤线虫也有一定的抗性，如草坪草内生真菌对其根茎 及地上部分包括叶鞘上的害虫具有定的抗性。 上海师范大学硕士学位论文文献综述 3 4 植物内生菌之间的关系 在同一生境的不同微生物菌群问也存在相互作用，一种内生菌的代谢产物可 能抑制其中一些其它内生菌的酶类，或成为另一些内生菌所含酶类的反应底物而 促进另外这些内生菌的生长，使内生菌之间在宿主植物中达到一种动态平衡。 4 植物内生菌的开发和应用 4 1 植物内生菌在医药领域的开发和应用 在过去2 0 年，约有一半的药物来源于天然产物或天然的先导化合物，约5 的药物为天然化合物的真接应用。研究者发现，特殊生态环境下的微生物与特殊 的次生代谢产物有紧密的关系。这使得在植物内生菌在药物研发领域中成为热 点。 4 1 1 抗生素的开发 内生菌产生的抗生素类物质，不仅对病原体起作用，还对其它的细菌、真菌、 病毒和一些原生生物起抑制作用。大量内生真菌次生代谢产物体外抗菌试验表明 约有3 0 的内生真菌能够产生具有抗菌活性的物质”，表卜l 是近几年从植物内生 菌中发现的具有抗菌作用的活性成分。s t r o b e l 研究小组从卫矛科著名药用植物雷 公藤( t r i p t e r y g e u mw i l f o r d i i ) 中分离到的内生真菌c r y p t o s p o r i o p s i sc f q u e r c i n a 能 产生一种新型环肽抗生素c r y p t o c a n d i n ( 结构如图卜1 ) ，对癣菌及白色念珠菌等 人类病原真菌具有强烈抑杀作用，其m i c 与临床应用的抗真菌药a m p h o t e r i c i n b 相 当，具良好开发前景“。 邹文欣等从黄花蒿翻r t e m i s i a 口玎竹獬) 和蒙古蒿6 4 r t e m & i am o n g o l i c a ) 分离到 1 0 余种内生真菌，其中一株内生真菌刺盘孢霉( c o l l e t o r i c h u ms p ) 能产生炭疽菌 酸( c o l l e t o t r i c h u ma c i d ) ( 结构如图卜2 ) 等3 种新的抗菌活性物质，对枯草芽孢杆 菌、金黄色葡萄球菌和八叠球菌有很好的抑制作用。从一些兰科植物分离到的内 生真菌可产生杀菌活性的物质，分别对奥里斯葡萄球菌、长球菌、大肠杆菌、隐 球酵母和假丝酵母具有广谱或专一抗性。“和h a r p e r 等从亚热带植物中分离到的 一株盘单毛孢内生菌能够产生一种新的抗真菌物质a m b u i ca c i d ( 结构如图l 一3 ) ： 从一种橡树的内生真菌中分离到两种抗菌活性物质j e s t e r o n e ( 结构如图卜4 ) 和 h y d r o x y j e s t e r o n e ：从薄荷中分离到的拟茎点霉属( p h o m o p s i sl o n g i c o l l a ) 内生真菌 能产生一种具有临床应用前景的新抗生素d i c e r a n d r o l ( 结构如图卜5 ) 。c y t o n i c a c i d a 和b ( 结构如图卜6 ) 是分离自内生真菌c y t o n a e m a s p 的三缩酚酸类异构体， 实验证明，c y t o n i c a c i d a 和b 是一种新的人巨细胞病毒( h c m v ) 蛋白酶抑制剂”“。 上海师范人学碗 学位论文 文献综述 表1 一i 近几年来从植物内生凿中发现的部分抗菌活性成分 图l 一1c r y p t o c a n d i n 的结构图 图1 3a m b u i ca c i d 的结构图 o 图l _ 4j c s t e r o n e 的结构图 h 3 c j l ，os o h 邺魄嘲跪 6 - i s o p e n y l i n d o l e - 3 c r b o x y l i ca c i d 2 邓，5 a - d i h y d r o x y - 6 d - a c c t o x y e r g o s 忸_ t 2 2 - d j e n e = 3 3 p , s a - d i h y d m x y _ 1 5 肛p h e n y l a e e t y - l o x y - e r g o s t a - 7 ，2 2 _ c l i c n c 图1 2 刺盘孢霉产的三种抗菌物质结构图 k 0 妊0 进0 “。挺溶 图1 6c y t o n i ca c i da ( i ) 和c y t o n i ca c i db ( 2 ) 的结构图 9 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 如o h 。i0 。妣。 。钟朴。电。 嚣h 。 8 、氏：y o 吖“，厂 c1 o “3 o h3 c 图1 8c r377 的结构图 m e h o h 0 图 图l _ 1 1g u a n a c a s t c p e n ea 的结构图 圈1 12p h o m o l 的结构图 图113e n f u m a f u n g i n 的结构图 4 1 2 抗肿瘤活性物质的开发 m e 1 9 9 3 年美国学者s t i e r l e 等1 首次从短叶紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 的树皮中分离 出一株内生的真菌新种t a x o m y c e sa n d r e a n a e ，在培养液中能产生紫杉醇( t a x 0 1 ) ( 结构见图卜1 4 ) 和其他紫杉烷类化合物。至今已在短叶紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 、 喜马拉雅红豆杉( t w a l l i c h i a n a ) 、欧洲红豆杉( z b a c c a t a ) 、南方红豆杉( t m a i r e i ) 、 云南红豆杉( t a x u sy u n n a n e n s i s ) 、落羽杉( t a x o d i u md i s t i c h u m ) 、榧树( t o r r e y a g r a n d i f o l i a ) 和w o l l e m i a n o b i l i s 中分离到了许多种能产生紫杉醇的内生真菌与放线 菌。其中内生真菌微孢拟盘多毛孢( p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a ) 的紫杉醇产量已初 步显示其商业潜力。 鬼臼毒素( p o d o p h y l l o t o x i n ) ( 结构见图卜1 5 ) 是存在于鬼臼类植物中的一类 天然的木脂素( 1 i g n a n s ) 对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效而 1 0 r 海师范大学硕l 学位论文 文献综述 被美国f d a 批准上市。李海燕等从桃儿七( s i n o p o d o p h y l l u me m o d i ) 茎中分到一株 能产生鬼臼毒素的内生真菌”“。曾松荣等又分别从南方山荷叶( d i p h y l l e i a s i n e n s i s ) ”和川八角莲( d y s o s m av e i t c h i i ) 中分离到了产生鬼臼毒素的内生真菌 1 2 6 0 长春新碱( v i n c r i s t i n e ) ( 结构见图1 1 6 ) 是有效的抗癌药物之一，一般用于 治疗白血病和恶性淋巴瘤等症。张玲琪等从长春花( c a t h a r a n t h u sr o s e u s ) 茎皮中 分到一种内生真菌( 9 7 c g 3 ) ，证明该菌能产生长春新碱。郭波等从云南巍山长 春花茎皮中分离到能产生长春碱的内生真菌菌株，属交联孢属0 l t e r n a r i as p ) 。 球毛壳甲素a ( c h a e t o g l o b o s i na ) ( 结构见图1 - 1 7 ) 是一种细胞分裂抑制剂， 通过影响细胞内的收缩蛋白而抑制细胞质的分裂。张玲琪等。”从生长于西双版纳 的美登木( m a y t e n us h o o k e r i ) 的老叶中分离、筛选出一株内生真菌球毛壳菌 ( c h a e t o m i u m g l o b o s u m ) 。从该内生菌的发酵产物中分离得到了球毛壳甲素a 。由 于美登木自身合成的抗癌活性成分是美登素( m a y t e n s i n e ) ，这一研究表明，植物 内生真菌不仅能产生与宿主成分相同或相似的活性物质，有的还能产生与宿主成 分结构不同而作用相似的活性物质。同样的例子还见于红豆杉，从中分离到的内 生真菌除能合成紫杉醇外，还能产生其它一些抗癌活性物质，如十一元环松孢菌 素d ( c y t o c h a l a s i nb ) ( 结构见图1 - 1 8 ) 、大环内酯类布雷菲德菌素a ( b r e f e l d i n a ，b f a ) ( 结构见图卜1 9 ) 以及s e q u o i a t o n e a 和b 1 。另外，从欧洲紫杉( t a x u sb a c c a t 曲 内生菌枝顶孢0 c r e m o n i u m 印) 产生的白灰制菌素a ( 1 e u c i n o s t a f i na ) ( 结构见图 卜2 0 ) 、从一种小蘖( b e r b e r i so r e g a n a ) 内生真菌得到的法尼基蛋白转移酶抑制剂 o r e g a n i ca c i d ( 结构见图1 2 1 ) 等多种成分均表现出抗肿瘤活性。 表1 2 为近几年来从内生菌中发现的部分抗肿瘤活性成分 海师范入学硕士学位论文文献综述 圉1 1 4 t a x o 删 围1 _ 1 5p c d 啦f i o 岫的结构疆 蹦* 1 7c l i 鲫 罐1 0 b o 妇a 的结捣霹 嘲l - 2 lo m g a n i ca c i d 的结构图 4 1 - 3 抗糖尿病的活性物质 z h a n g 和s a t i t u r o 等从菲澜刚果热带 瓿物分离得到的内生菌( s e u d o m a s s a r i a 妒) 产生的次生代谢产物中分离出一秘类似胰岛素熙小分予他合妨( l 2 7 8 3 ，2 8 1 ) ， 该物质可使入的胰岛素受体酪氨酸0 亚基磷酸化，并使胰岛素受体的作用底物磷 酸像，激透a k t ，越到类钕胰岛素中赍终鼷豹效暴。进一多磅究表鞠，魏小分子 化合物制成片剂在给糖尿瘸大鼠模毅r i f l e 后，能明显降低m 糖浓度。 h 海师范大学硕士学位论文文献综述 4 1 4 抗疟原虫，结核类的活性物质 疟疾和结核病在当今普遍存在，现也有多种药物可以治疗，在植物内生菌中 也分离到多种抗疟疾和结核类新物质，o s t e r h o g ec ( 2 0 0 0 ) 等。”从绿藻类石莼植物 内生真菌a s c o c h y t as a l i c o r n i a e 中分离出一种新的结构异常的四聚体酸 a s c o s a l i p y r r o l i d i n o n e sa ( 结构见图1 2 4 ) 对疟原虫f a l c i p a r u ms t r a i nk 1 和 n f 5 4 有抗性。从内生真菌g e o t r i c h u ms p 的发酵液中分离出三种新的二氢异香豆 素衍生物( k o n g s a er e e p ，e ta 1 2 0 0 3 ) 和从内生真菌p h o m o p s i ss p b c c l 3 2 3 中分离 出的两种新的二聚体p h o m o x a n t h o n e s a 和b ( 结构见图卜2 5 ) ，都具有抗结核菌 和抗疟疾作用”“。 h 图l _ 2 4 a s c o s a l i p y r r o l i d i n o n e s a 的结构图 图1 - 2 5 p h o m o x a n t h o n e s a ( 1 ) & b ( 2 ) 的结构图 4 1 5 免疫抑制剂 分离白药用植物雷公藤的镰孢菌属内生真菌( f u s a r i u ms u b g l u t i n a n s ) 能产生 一种非细胞毒的二萜吡酮类化合物s u b g l u t i o n o la 和b ”( 结构见图卜2 6 ) 。实 验证明，两者都具有免疫抑制活性。两者在m l r ( m i x e dl y m p h o c y t er e a c t i o n ) 和 t p ( t h y m o c y t ep r o l i f e r a t i o n ) 评价系统的i c 。都为0 i p , m o l l 。与环孢菌素 a ( c y c l o s p o d n a ) 相比较，m l r 系统分析发现两者的活性与其相当，而t p 实验结 果则显示环孢菌素a 的活性比两者高1 0 4 倍。但因为s u b g l u t i o n o la 和b 缺乏细 胞毒性，所以二者仍将具有诱人的应用前景。 c i - 1 3 罔1 2 6s u b g l u t i n 。ia 的结构田 圈1 2 7p e 蛐犯i n ( 1 ) 和i p e 8 切i r i ( 2 ) 的结构图 【：海师范大学硕上学位论文 文献综述 4 1 6 抗氧化剂 h a r p e r 等人从t e r m i n a l i am o r o b e n s i s 的内生真菌( p m i c r o s p o r a ) 中分离到了 两种化合物p e s t a c i n 和i s o p e s t a c i n ( 结构见图卜2 7 ) 。实验证实，两者既具有抗 菌活性，又有抗氧化活性。p e s t a c i n 是一种消旋体，实验发现其抗氧化活性至少 比t r o l o x ( 维生素e 的衍生物) 大一个数量级。l s o p e s t a c i n 的结构与f l a v a n o i d s 相 似，在缓冲液中，它可以消除超氧自由基和羟基自由基。 4 2 植物内生菌在涉农领域的开发和应用 在植物内生菌中转入抗病抗虫基因，是现在植物病虫害生物防治又一新思 路。植物在其整个生活史中，总会受到病虫害的侵害，特别是一些经济植物，一 旦遭受病虫，就会造成经济损失，如用化学药剂，既影响产品质量，又会给环境 造成污染。 在植物内生菌中转入抗病虫基因较在植物中直接转入抗病虫基因简单容易。 被转入抗病虫基因的内生菌在宿主中表达，抗病虫物质直接分泌在植物体内，更 易被转运。d o w n i n gk j ( 2 0 0 0 ) 等”“就在从节果苗中分离出的内生菌 p s e u d o m o n e a s f l u o r e s c e n s 中转入抗病e h i a 基因，再把这种携带有c h i a 基因的内 生菌接种到豆苗中，可以防治豆苗病原真菌r h i z o c t o m i as o l a n i ，他们又在甘蔗内 生菌中转入抗虫基因c r y l a c 7 基因，回接甘蔗，可以防治甘蔗钻心虫e l d a n a s a c c h a r i n a 。 5 立题依据 天然药物筛选已经成为新药研究的一个热点。据统计，近二十年约有一半的 药物来源于天然产物或天然产物为先导药物，但是天然药物的来源却是有限的， 生产周期长，使得药物的产量无法提高。药物因为价格等因素不能得到广泛的应 用。同时，随着经济生活水平的提高，人类对环境保护越来越重视，对天然植物 资源的开采将会得到严格的控制。幸运的是，人们已经开始注意到生活在药用植 物组织中的植物内生菌。由于其与中草药密切的关系，及其产生的丰富的代谢产 物具有多种生理活性，因此从中发现新的有意义的化合物潜力相当大，其作为新 的治疗药物或前体药物的潜在来源已经引起了研究者的广泛关注。世界上最早研 究植物内生菌的是美国，同时也是研究植物内生菌最多的国家，利用植物内生菌 代谢产物这一丰富的化合物资源已经分离并鉴定出了一些有价值的生理活性物 质，如：紫杉醇，赤霉素，c r y p t o c i n 等，对于植物内生菌的研究，国内的研究者 已经做了较多的工作，国内的研究集中在对内生菌的种类，分布，定植部位以及 内生菌在植物体内的特殊生境下的生物学作用。还有部分学者针对不同生境的植 1 4 一t 海簿蒂丈攀娥 ：学搜论文文献练逮 甥竣菜秽邂多 已卷磅究的挺拣逮括跟踪碳究，并联褥了一些显萋浆成果。 故本课题将利用植物内生菌邋一尚束深入挖掘的宝库，针对人类还束能战胜 鹊癌瘟以及弱盏严重的缨蓠烈药性徽些工作，以期张源予植物内生蕴的具生理活 榷的物质为人类健康发展做出应有的贡献。 上二海师范大学顾 ：学位论文活性菌株的筛选及鉴定 前言 实验部分 第一章活性菌株的筛选及鉴定 微生物的次级代谢产物是生理活性化合物的重要来源，自从英国细菌学家弗 莱明发现青霉素以来，人们已经从微生物的次级代谢产物中发现了多种生理活性 物质，包括抗生素、酶抑制剂、免疫调节剂等多个领域，为人类健康做出了巨大 贡献p ”。而植物内生菌是一个具有丰富多样性的微生物类群，迄今为止，绝大 多数还未被研究过，它们产生的次级代谢产物具有多种生理活性( 如：杀虫抗菌、 抗肿瘤等) 。上海来益生物药物研发中心收集保藏了大量的植物内生菌资源，本 研究利用上海来益生物药物研究开发中心保藏的植物内生菌6 6 0 株，制备出样品 共5 2 8 0 份，并将这些样品在抗肿瘤及抗菌增效剂模型上进行活性筛选，以期发 现具有抗肿瘤活性及有抗菌增效活性的样品并开展进一步研究。 1 材料 1 _ l 菌株 植物内生菌( 由上海来益生物药物研究开发中心保藏) 1 2 主要培养基 1 2 1 固体培养基 土豆汁2 0 ，葡萄糖2 ，琼脂1 5 2 ，p h 自然 1 2 2 种子培养基 葡萄糖l ，玉米粉l ，黄豆粉2 ，k h 2 p 0 40 1 ，p h 自然 1 2 3 发酵培养基 选用上海来益生物药物研发中心的4 种基础培养基 f m l ( ) 蔗糖 1 小麦淀粉 1 5 玉米粉1 5面粉l 黄豆粉1药媒05 f m 2 ( ) 葡萄糖o 2可溶性淀粉0 5 小麦淀粉1 0甲壳素0 5 盐酸氨基葡萄糖 0 1 半乳糖0 1 1 6 上海师范大学硕士学位论文活性菌株的筛选及鉴定 f m 3 ( ) 小麦淀粉 1 5 玉米粉 1 0 面粉 1 0 黄豆粉 0 ，5 复合氨基酸 o _ 3 硫酸铵 0 2 f m 4 ( ) 小麦淀粉 1 5 玉米粉 1 0 面粉 1 0黄豆粉0 5 复合氨基酸0 3 硫酸铵 o 2 每种培养基各需要加入盐溶液o 1 ，微量元素0 0 0 1 ，维生素o 0 0 5 1 2 4 鉴定用培养基 1