（材料学专业论文）静电自组装膜技术构筑葡萄糖生物传感器.pdf

摘要 摘要 静电自组装膜技术操作简单，稳定性好，不受基体材料限制，能 够实现在纳米水平上控制薄膜的结构、厚度和外层薄膜电荷极性，得 到广泛应用。在生物传感器研究中，静电自组装膜技术作为酶固定方 法，也体现出其独有的优点：可以选择固定材料，如选择具有特定功 能的材料等：通过改变组装层数来控制所固定的酶的量，从而提高葡 萄糖生物传感器的灵敏度：改变薄膜结构，赋予薄膜选择透过性，提 高传感器的专一性。 本论文主要针对目前葡萄糖生物传感器生物相容性、稳定性和抗 干扰性差，响应时间较长，检测范围较窄等情况，通过选择固定材料， 运用超分子静电自组装技术，制备了具有良好生物相容性、导电性和 选择性的葡萄糖生物传感器。 采用具有良好生物相容性的壳聚糖作为基底材料，通过静电自组 装膜技术成功制各了( c s g o x ) 。修饰的葡萄糖生物传感器。循环伏安 曲线( c v ) 和时间电流曲线( i t ) 表明6 0 x 不仅成功地固定在电极上， 而且活性保持良好，可在一定程度上通过增加组装层数提高酶电极中 g o x 的量，降低最低检出浓度，提高葡萄糖生物传感器的灵敏度。 在此基础上，采用壳聚糖接枝聚合的方法引入导电聚合物一聚 苯胺，并应用静电自组装膜技术成功制备了( c s p a n g o x ) 。修饰的葡萄 糖生物传感器。该传感器不仅具有壳聚糖的良好生物相容性，而目对 电子的传输能力也显著增强。i t 曲线表明( c s p a n g o x ) 。修饰的葡萄糖 生物传感器与( c s g o x ) 。修饰的相比，响应电流和灵敏度有显著提高。 根据体积排除机理，聚电解质多层累积膜在抗坏血酸和尿酸存在 下对h 2 0 2 有选择透过性。本实验中，应用静电自组装膜技术，通过聚 电解质聚丙烯酰胺( p a a ) 和聚磺化乙烯( p v s ) 之州的静电吸附割备 了聚电解质多层累积膜，并以t m o s 作为前驱体，应用s 0 卜g e l 技术成 功制备了( p a a p v s ) 3 s o 卜g e 卜g o x 修饰的葡萄糖生物传感器。i t 曲线 表明该葡萄糖生物传感器对葡萄糖、抗坏血酸和尿酸表现出良好的选 择性响应，而且有效地改善了凝胶与基极电极剥离问题。 关键词：静电自组装，溶胶一凝胶，壳聚糖，葡萄糖生物传感器 聚苯胺 摘要 a b s t r a c t s u p r a m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i c s e l f - a s s e m b l yt e c h n i q u e f o r c o n s t r u c t i n g p o l y e l e c t r o l y t em u l t i p l a y e r ( p e m ) n a n o c o m p o s i t e f i l m sh a sg a i n e dw i d ea p p l i c a t i o n s d u et oi t st e c h n i c a ls i m p l i c i t y , g o o ds t a b i l i t y , l o wr e q u i r e m e n to nm a t r i xm a t e r i a l sa n d t h ee o n t r o l l a b i l i t yo ft h ec o m p o s i t i o n ，t h i c k n e s sa n ds u r f a c ep o l a r i t yo ft h ep e mo na n a n o s c a l el e v e l i nb i o s e n s o rr e s e a r c h ，s u p r a m o l e c u l a re l e c t r o s t a t i cs e l f - a s s e m b l y t e c h n i q u eh a ss t i l l i t su n i q u ea d v a n t a g e sa sa ne n z y m ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d f o r i n s t a n c e i ti sv i a b l et os e l e c ts p e c i f i cm a t e r i a l ss u c ha sb i o c o m p a t i b l ea n df u n c t i o n a l m a t e r i a l s ；b yv a r y i n gt h en u m b e ro ft h el a y e r s ，w ec a nc o n t r o l t h ei m m o b i l i z e d e n z y m ea m o u n tt h u si m p r o v et h es e n s i t i v i t yo ft h eg l u c o s eb i o s e n s o r s ；i t i sa l s o f e a s i b l et oi m p r o v et h es p e c i f i c i t ya n ds e l e c t i v i t yi nm o l e c u l ep e r m e a t i o nb yc h a n g i n g t h es t r u c t u r eo ft h ep e m i ti so b s e r v e dt h a tc u r r e n tg l u c o s eb i o s e n s o r s h a v e p o o rb i o c o m p a t i b i l i t y , s t a b i l i t ya n ds e l e c t i v i t y o u rr e s e a r c hi n t e n d st oi m p r o v e t h i su n s a t i s f a c t o r ys i t u a t i o n b y s e l e c t i n gs p e c i f i c m a t e r i a l sa n d e m p l o y i n gs u p r a m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i c s e l f - a s s e m b l yt e c h n i q u e w e f a b r i c a t en e w g l u c o s e b i o s e n s o r sw i t l l g o o d b i o c o m p a t i b i l i t y , c o n d u c t i v i t ya n d m o l e c u l es e l e c t i v i t y ( c s g o x ) nm o d i f i e dg l u c o s eb i o s e n s o r sw e r ed e v e l o p e du s i n gs u p r a m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i cs e l f - a s s e m b l yt e c h n i q u ea n db i o c o m p a t i b l em a t e r i a lc h i t o s a n ( c s ) a s m a t r i xm a t e r i a l i ti ss h o w ni nt h ec y c l i cv o l t a m m o g r a m s ( c v ) a n da m p e r o m e t r i c ( i t ) c u r v e st h a tg o x h a sb e e ns u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e di nt h ee n z y m ee l e c t r o d e m a i n t a i n i n gi t sb i o l o g i c a la c t i v i t y m o r e o v e r , b yi n c r e a s i n gt h en u m b e ro fl a y e r s ，t h e a m o u n to fg o xi nt h ee n z y m ee l e c t r o d ec a l lb ei n c r e a s e dt os o m ee x t e n t a sa r e s u l t ， t h el o w e r e dm i n i m u m r e s p o n s i v ec o n c e n t r a t i o ne n s u r e sb e t t e rs e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t y i ts h o u l db en o t e dt h a tt h en u m b e ro f l a y e r sc a n n o ti n c r e a s ei n f i n i t e l yb e c a u s eo f t h el i m i t a t i o no ne x p e r i m e n t c o n d i t i o n s t h e r e f o r e ，b yg r a f tp o l y m e r i z a t i o n o n c h i t o s a n ，w ea l s oe x a m i n e dt h ei n t r o d u c t i o no fc o n d u c t i v ep o l y a n i l i n ei n t ot h ep e m ( c s p a n g o x ) nm o d i f i e dg l u c o s e b i o s e n s o ri s t h e r e b y d e v i c e d b ye l e c t r o s t a t i c s e l f - a s s e n t h l y i t i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h i sn e wb i o s e n s o rn o t o n l y h a s g o o d b i o c o m p a t i b i l i t yb u ta l s oe n h a n c e de l e c t r o nt r a n s f e rc a p a b i l i t y i tc u r v e so f t h i sn e w s e n s o r s u g g e s th i g h e rr e s p o n s ec u r r e n t ，s t e e p e rs l o p e a n d b i g g e r c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tc o m p a r e dt ot h e ( c s g o x ) nm o d i f i e db i o s e n s o r t h er e s u l t e ds l o p ea n d 摘要 c o r r e l a t i o nc o e m c i e n ta r eo 0 6 6 8l aam m a n d0 9 9 5 ( n 2 1 3 ) r e s p e c t i v e l a c c o r d i n gt ot h es i z ee x c l u s i o ne f f e c t ，t h ep e m s h a v es e l e c t i v i t yo v e rh 2 0 2i n t h ep r e s e n c eo fa s c o r b i ca c i da n du r i ca c i d i no u rs t u d y , p e m sw e r ep r e p a r e db y e l e c t r o s t a t i c s e l f - a s s e m b l y b e t w e e np o l y e l e c t r o l y t e sp a aa n dp v s f u r t h e r m o r e s o l g e lt e c h n i q u e w a sa p p l i e di n p r e p a r i n g ( p a a p v s ) 3 s o l g e l g o x m o d i f i e d g l u c o s eb i o s e n s o rb yu s i n gt m o s a st h ep r e c u r s o r i ti s c l e a r l ys h o w ni n t h ei t c u r v e st h a tt h i sn e wb i o s e n s o rh a sg o o ds p e c i f i cr e s p o n s eo ng l u c o s e ，a s c o r b i ca c i d a n du r i ca c i d a d d i t i o n a l l y , t h ep r o b l e mo fg e la n dm a t r i xe l e c t r o d e ss e p a r a t i o na s w e l la st h ep r o b l e m o f g e lc r a c k i n g h a sb e e ns o l v e d k e y w o r d s ：e l e c t r o s t a t i cs e l f - a s s e m b l y , s o l g e l ，c h i t o s a n ，g l u c o s e b i o s e n s o r s ， p o l y a n i l i n e 独创性声明 y 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨注盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名力毋劫 签字日期： 珈p ；年7 月，彳，f _ _ i f 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫壅盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权叁鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：力岛移 导师签名 签字日期：加d 5 年f 厶月停日签字日期：d 谚年2 月2 。日 绪论 1 1 引言 第一章绪论 糖尿病是全世界共同面临的一个公共健康问题，是导致死亡和残 疾的主要原因之一。为了满足糖尿病预防和治疗的要求，需对血液中 葡萄糖含量进行监测。用于葡萄糖检测的电化学生物传感器能方便、 准确地检测葡萄糖含量，特别是将葡萄糖氧化酶( g o x ) 固定在修饰 电极上制备电流型葡萄糖生物传感器已经引起人们的极大关注l l 。3 。 1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s l 4 1 提帛电化学葡萄糖生物传感器的原理， 他们用一薄层o o x 覆盖在氧电极表面，通过氧电极检测溶液中溶解氧 的消耗量间接测定葡萄糖的含量。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s l 5 j 根据此 原理成功地制成了第一支电化学葡萄糖生物传感器。从此以后，基于 酶电极的电化学葡萄糖生物传感器的研究得到了迅猛发展。 目前，葡萄糖生物传感器应用领域很广“，除了用于糖尿病人血糖 的检测，还可用于食品分析【6 1 和生物检测【7 】等重要领域。 1 2 葡萄糖生物传感器的发展 目前研究的葡萄糖生物传感器通常是基于g o x 催化氧化b d 葡萄 糖产生葡萄糖酸内酯和h 2 0 2 【8 引，并通过电化学方法检测h 2 0 2 分解而 产生的电流确定葡萄糖含量，以实现其对血糖的检测功能。它是 g u i l b a u l l 和l u b r a n o i l 在1 9 7 3 年阐述葡萄糖生物传感器检测血样中的 葡萄糖浓度的工作原理时提出的。这个过程包括g o x 引起的葡萄糖氧 化，f a d 还原成f a d h 2 ，然后辅酶被分子氧氧化( 牟物催化剂的再生) 并产：牛h 2 0 2 ： p d g l u c o s e + g o x ( f a d ) 斗g l u c o s e 一6 1 a c t o n e 十g o x ( f a d h2 )公式( 1 - 1 ) g o x ( f a d h2 ) + 02 卜g o x ( f a d ) + h2 02公式( 1 2 ) 绪论 反应原理如图1 1 图1 1 葡萄糖生物传感器反席撩理 f i g 1 - 1 r e a c t i o np r i n c i p l eo fg l u c o s eb i o s e n s o r 近四十年来，葡萄糖生物传感器的发展有了长足的进步。根据反 应原理及应用，先后经历了第一代葡萄糖生物传感器、第二代葡萄糖 生物传感器、体外检测和体内检测四个阶段的发展。 1 2 1 第一代葡萄糖生物传感器 第一代葡萄糖生物传感器主要依靠作为共存基质的氧气以及h 2 0 2 的产量检测葡萄糖含量，制作简便，尤其是用于制备微型葡萄糖生物 传感器。第一代葡萄糖生物传感器以氧电极为基础，采用阴极电压， 只有很少的活性物质可r 扰葡萄糖的测定【6 7 1 ，而且在电极表面的气体 渗透膜能有效的排除在电极表面的电化学干扰物，因此第一代葡萄糖 生物传感器结构比较简单。最常见的结构是把葡萄糖氧化酶固定在两 层薄膜之间，其中外层膜是起扩散控制的生物相容性聚碳酸酯膜，内 层膜是起抗干扰作用的醋酸纤维素膜。第一代葡萄糖生物传感器反应 原理如下i “t ： o2 + 2 h + + 2 e 叶h j 0 2公式( 1 3 ) h 2 02 + 2 h + + 2 e 。_ 2 h2 02公式( 1 4 ) 依靠氧气氧化酶电极作为电子受体的第一代葡萄糖生物传感器冈 为受到氧气压力的波动和氧气化学计量限制，测量时会产生较大的误 差，这种局限性被称为“氧短缺”，通常氧气浓度比生理上的葡萄糖浓 度低一个数量级。另外，第一代葡萄糖生物传感器通过测量初始电流 的减小检测葡萄糖含量，在葡萄糖含量很低时，测量精度不够，用于 人体血糖含量检测时受到很大限制。 针对“氧短缺”的改进方法有以下几种：使用传质控制膜( 如聚 碳酸酯和聚氨酯) 调整葡萄糖和氧气的流动，增加氧气对葡萄糖的渗 绪论 透比i l2 j ：通过设计氧饱和碳酶电极吸附更多的氧气克服葡萄糖生物传 感器中的“氧短缺”【1 3 ；用对氧气有极高溶解性的喷涂液体一一氟碳 化合物作为酶电极氧气的内部来源制备酶电极【l “，即使在没有氧气存 在的葡萄糖溶液里，内部流动的氧气仍可支持酶促反应的进行；也可 通过无需氧气参与反应的脱氢酶替代葡萄糖氧化酶。 1 2 2 第二代葡萄糖生物传感器 第二代葡萄糖生物传感器主要依赖电子在酶的氧化一还原中心和 电极表面之间的传递实现对葡萄糖的检测。第二代葡萄糖生物传感器 反应如下： 1 3 - d g l u c o s e + 0 2 + h 2 0j 翌l + g l u c o n i ca c i d + h2 0 2 公式( 1 5 ) 在核黄素氧化一还原中心有一层厚的蛋白质层，这层厚的蛋白质 层导致电子给体与电子受体之间产生空间分离，即相对于依赖电子传 递速率的传递距离来既，成为阻碍电子转移的内部障碍，所以g o x 并 不能直接把电子转移到常规的电极上。 电子传递速率【l 5 ： k t = 1 0 1 3 e - 0 9 1 p 一3 ) e - ( a g + 2 ) j 4 r t a 公式( i - 6 ) 其中g 和d 分别是对应于电子传输的吉布斯自由能和实际距离。缩 小电子转移的距离( 即固定化g o x 和电极表面之间的距离) 成为取得最 佳效果的关键。因而出现了许多方法建立或调整氧化还原中心与电极 表面的电接触距离。 1 2 2 1 人工介体的作用 比较有效的改进方法是使用人工介体使电子在f a d 中心和电极表 面之间依照下列反应式进行电子传递。 g l u c o s e 一8 1a e t o n e + g o x 斗g l u c o n i ca c i d + g o x ( r e d ) 公式( 1 - 7 ) g o x ( r e d ) + 2 m ( o x ) g o x ( o x ) + 2 m ( r e d ) + 2 h + 公式( 1 8 ) 2 m ( r e d ) _ 2 m ( o x ) + 2 e 公式( i 9 ) 其中m ( o x ) 和m ( r e d ) 分别是介体的氧化态与还原态。根据上述介 体循环过程产生依赖葡萄糖浓度的电流。二茂铁衍生物、铁氰化物、 导电聚合物、吩噻嗪、吩嗪化合物或对苯二酮化合物等可扩散的电子 介体已经广泛应用于电化学葡萄糖生物传感器【12 , 】。使用电子介体后， 测量过程基本与氧气分压无关，并且可在不引发共存的电活性组分发 生干扰反应的较低电压下进行。为了得到更好效果，要求所使用的电 子介体能很快的与还原态的酶反应，以减少与氧气的竞争；具备优良 绪论 的电化学性能，如较低的氧化还原电位；无毒性；氧化态与还原态化 学稳定性好。 目前所使用的介体大多有毒，难溶于水溶液，且在制备葡萄糖生 物传感器时容易发生介体泄漏。凶此多数葡萄糖生物传感器中，没有 介体或使用改性的介体。 1 2 2 2 电子转移继电器的固定 采用电子继电器对酶电极进行电化学修饰是促进氧化一还原中心 和电极表面之问电子转移的新的途径。h e l l e r 1 开发了一条出色的非扩 散路线建立葡萄糖氧化酶和电子之间的连接。他通过接线把酶连接到 长而柔的聚氮苯大分子表面，并且聚氮苯大分子中紧密排列着锇化合 物继电器，形成氧化一还原聚合物酶三维网络，能输出很高的电流， 并且使电极表面的电子介体得到稳固。w i l l n e r 和他的合作者7 1 将 g o x 的f a d 中心移去，用电子继电器修饰，并使用于电子传递的二茂 铁单元优先酶的重组，制各了性能优越的葡萄糖生物传感器。其它， 如通过在固体电极表面形成单分子层或多层累积膜以及g o x 网络来增 强酶电极响应性( 用功能化烷烃硫醇修饰会电极表面形成层层累积的 g o x 介体网络或静电自组装膜技术制备多层累积酶膜) ；在酶的外表面 固定电子继电器以达到缩短电子传递距离，提高传感器灵敏度，都可 以改善氧化一还原中心和电极表面之间电子转移。 1 2 3 体外葡萄糖测试 电化学生物传感器能很好的满足家庭( 个人) 葡萄糖测定的需要。大 多数个人血糖仪用的是抛弃型( 一次性) 酶电极试条。每个试条都印刷有 工作电极和参比电极，其中工作电极有所需试剂( 包括酶、介体、稳定 剂和连接剂) ，这些试剂通常用喷墨印刷技术分散到电极表面。这种一 次性装置可避免被污染和漂移的问题。控制仪通常依靠电位差起作用， 通过电池控制。这种装置能更快速，简便的提供可靠的临床信息。第 一批产品是1 9 8 7 年m e d i s e n s e 投产的使用二茂铁衍生物作为介体的笔 式装置，也有使用二茂铁和铁氰化物介体的多种商业试条【l8 1 。大多数 情况下，糖尿病病人将i f 【l 滴在试条上，15 3 0 s 就内可测到血糖浓度。 最近产生的新的试条，只需亚微米级血液体积，并可使用胳膊中的无 痛血样。个人血糖仪除了体积小、响应快、所需血样微量以外，还具 有扩展的记忆容量和司算机下载能力，发展极为迅速。 绪论 1 2 4 体内葡萄糖监测 对体内葡萄糖传感器临床精确性的主要要求包括：组织的生物相 容性生物污损、微型化、酶和传感器的长期稳定性、氧短缺、基线漂 移、快速稳定、体内标定、安全性和方便性等。因此葡萄耱生物传感 器必须具备易于植入体内的尺寸和形状，并且要尽量避免植入后引起 的副作用。在满足生物相容性的前提下，还必须考虑体内环境对传感 器性能的影响以及传感器对体内环境的影响。生物相容性的问题已经 成为开发可靠的可植入葡萄糖生物传感器的主要障碍。大部分葡萄糖 生物传感器缺乏在整体血液中长久、可靠工作所必要的生物相容性。 因而，选择具有良好生物相容性的固定材料成为目前研究的重点i l “。 1 3 自组装膜技术在电化学酶传感器中的应用 制备葡萄糖生物传感器的核心是生物活性单元g o x 的固定化。既 要保持g o x 的活性，又要避免在固定化过程中带来应用上的缺陷。g o x 的固定化技术决定着葡萄糖生物传感器的稳定性、选择性和灵敏度等 主要性能。自组装膜( s e l f a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 技术为g o x 的固定提供了行之有效的方法。首先s a m s 有类似生物膜的结构，具有 良好的生物相容性，能保持酶的原始构象和催化活性：其次s a m s 的有 序结构能调节酶的活性位点与电极表面的相对位置，使g o x 处于有利 于电子传递的环境；此外s a m s 能阻止溶剂分子或离子接近电极表面， 从而提高检测底物的灵敏度。因此自组装膜技术倍受电分析化学工作 者的青睐i l 9 - 2 2 。 1 3 1 自组装膜技术固定酶 采用自组装膜技术固定酶主要有两种方法。一是化学吸附自组装 膜技术【2 0 ，2 1 ，如：( 1 ) 在金电极表面形成末端带有一n h 2 或一c 0 0 t 1 的 s a m s ，利用偶联通过共价键固定酶。( 2 ) 在金电极表面形成的s a m s 末 端带有一n h 2 或一s h 可共价结合纳米金，再吸附固定酶。( 3 ) 通过化学 修饰方法在酶分子表面引入巯基等。二是静电自组装技术，如：聚电 解质与生物大分子通过静电相互吸附固定酶1 2 2 , 2 3 1 。当然这两种方法不 足绝对独立的，有时需要同时使用才能制备高效的酶修饰电极。 绪论 1 3 2 自组装膜技术在生物传感器中的应用 1 3 2 1 化学吸附自组装技术在生物传感器中的应用 利用含硫聚合物分子在金、银等金属e 的化学吸附是形成聚合物 自组装单分子膜的十分有效的方法。基于金一硫之间的相互作用在金 属表面上形成的自组装单分子膜体系也是目前研究最为深入的自组装 体系。由于金属与硫之间形成的是化学键，因此这种膜的牢固度与热 稳定性都很好。 19 4 6 年，z i s m a n 等【2 4 】人发现在洁净的金属表面吸附表面活性剂分 子可以得到单分子吸附膜，并能用于气、液相色谱分离和酶的固定。 从此化学吸附自组装膜技术在生物酶传感器领域迅速发展。g o r t o n 等 2 5 】用吸附法在自组装膜修饰电极表面固定过氧化物酶一1 1 ，发现不同的 吲定方法电子传递速度相差较大，说明巯基化合物的末端基团影响酶 在电极表面的覆盖量，决定酶在电极表面的取向，并且影响酶与电极 之间的电子传递。g o o d i n g 等 2 6 1 利用自组装膜技术制各了g o x 和葡萄 糖脱氢酶( g d h ) 双酶生物传感器。在媒介体苯醌存在下，g o x 氧化葡萄 糖为葡糖酸内酯；而在n a d h 存在下g d h 还原葡糖酸内酯为葡萄糖。 通过酶促反应的循环，传感器检测电信号被加强，从而增加了检测葡 萄糖的灵敏度，但线性范围变窄。另外他们利用自组装膜的可调控性 研究了g o x 与g d h 的相对位置对传感器性能的影响。此外，利用自组 装方法在会电极表面模拟生物双层膜，将尿酸氧化酶和媒介体( 卜甲氧 基一5 一甲基吩嗪) 固定于自组装膜中，构成的尿酸传感器响应快、灵敏 度高、干扰小，应用很广怛“。 利用含硫聚合物分子在金、银等金属上的化学吸附形成的聚合物 自组装单分子膜的性质决定酶在电极表面的取向，并影响酶与电极之 问的电子传递效率和酶与底物的作用速率。因此应根据酶的特性，如 酶辅基所处的环境、酶蛋白电荷的分布及氨基酸残基的性质等，选择 带有适当功能基团的巯基化合物。此外电极表面的状念虽然并不影响 自组装膜的性质、固定酶分子的数量及检测底物的灵敏度，但光滑表 面的酶修饰电极具有较宽的检测线性范围拉8 1 。 虽然化学吸附自组装膜技术比较简便，同时具有在分子水平h 进 行组装的能力，自组装膜的物理、化学稳定性也比较好。然而在实际 应用中，特别是在形成有序的多层结构的时候，化学吸附自组装膜技 术依然存在一些问题：( 】) 成膜分子的分子量帽对较小，且分子必须含 绪论 有双功能团( 通常在首尾位置) ；( 2 ) 为了保证多层膜组装的顺利进行， 必须针对不同的作用键在基片上引入含有不同基团的有机物；( 3 1 为保 证多层复合膜的结构有序性及周期性，必须保证上层可反应基团与相 邻层的反应基团1 0 0 的反应，否则就会出现结构缺陷，而这一点又是 化学吸附法难以避免的。 1 3 2 2 静电吸附自组装膜技术在生物传感器中的应用 1 9 9 1 年，在i l e r 等人 2 9 工作的基础之上，d e c h e r 6 ，3 0 】提出了一种 新的纳米复合薄膜制备技术一静电自组装膜技术( e l e c t r o s t a t i c s e l f a s s e m b l v l 。1 9 9 2 年d e c h e r 首次对聚阴离子、聚阳离子电解质以 交替吸附的方式实现了聚阴离子，聚阳离子类多层有机复合膜的自组 装，得到了纳米复合薄膜。 静电自组装成膜技术的基本操作手法与化学吸附自组装技术一 样，但静电自组装不要求形成化学键，并且使用对环境友好的水溶液， 因此可以避免复杂的化学反应，成膜速度加快、生产成本降低、对环 境的污染减小。所以静电自组装薄膜技术是一种可操作性更强的新技 术。 在过去十多年中，静电自组装薄膜技术发展很快，研究对象由最 初的聚电解质扩展到生物大分子【引1 、金属胶体粒子3 2 1 、无机微小粒子 3 3 等。所研究的功能薄膜包括聚电解质一聚电解质、聚电解质一无机 纳米颗粒、聚电解质一生物大分子等复合膜，也成功地实现了聚合物 纳米复合薄膜的功能化 3 4 1 。因此，针对目前生物传感器普遍存在的生 物相容性、抗于扰性较差，响应时间较短，检测范围较窄等缺陷，采 用不同功能的聚合物纳米复合薄膜制备葡萄糖生物传感器，为其发展 提供了广阔的应用前景。 ( 一) 由于静电自组装技术可以将酶或具有活性的细胞组织固定在 自组装膜电极上 3s 1 ，并能对特定物质选择性的产生电催化反应，实现 对葡萄糖的检测。因此静电自组装技术被广泛的应用于生物传感器领 域。r a mm k 等【2 2 】利用静电自组装方法将高分子聚电解质用于固定胆 周醇氧化酶( c o x ) ，制成性能优越的胆固醇生物传感器。m a s a y o s h i y 等 2 3 i 通过聚阴离子p a a 和聚阳离子p a h 静电吸附制备了聚电解质多 层累积膜，并依靠静电吸附将带有正负电荷的烟尘微粒吸附到电极表 而，制备了检测烟尘的传感器。目前研制的自组装膜生物传感器还有 苹果酸传感器，过氧化氢传感器等。 另外，将抗体固定在自组装膜电极表面，研制快速，简单，高选择 绪论 性的免疫传感器也已见报道。同时基于s a m 的阻抗免疫分析及络合物 在s a mf ：的定向研究制备再生式免疫传感器研究也取得进展。 ( 二) 对于葡萄糖生物传感器，存在一个急待解决的问题，即在相 对i 丁a g a g c l 为0 6 v 的电位下，抗坏血酸与尿酸在p t 电极表面发生 氧化反应，对生物传感器的电流检测产生很大干扰，降低葡萄糖检测 的灵敏度。 在二十世纪八十年代，研究者在减少对葡萄糖电极的电活性干扰 方面作了大量的尝试。其中一种有效的方法是在酶电极表面加一层选 择渗透膜，以减少干扰组分的进入。多层累积膜和混合膜，根据膜尺 寸、表面电荷和极性不同会产生不同的传递特性，因此在区分不同的 共存组分时，可使用不同的聚合物和不同的多层累积膜或混合膜。多 层累积膜和混合膜也可排除电极表面的活性大分子，使酶电极具有更 高的稳定性。目前应用广泛的抗干扰膜有n a t i o n 膜、有机硅膜和带有 负电荷的醋酸纤微素膜 3 6 1 。 最近b r u e n i n g 等 3 7 , 3 8 1 研究发现：经纳米复合薄膜修饰的电极表现 出对溶液中有氧化还原活性的离子和分子的选择性响应，这种选择性 取决于形成膜的聚电解质类型和膜的层数。w i l l n e r 等1 3 9 ，4 叫报道了种 取决于薄膜最外层电荷性质的选择性纳米复合薄膜。他们发现组装完 好的膜是一个膨胀的、电中性的、多孔渗水的结构，而且薄膜最外层 电荷性质主要依赖于电极最外层纳米复合薄膜表面的电荷极性。这些 研究结果表明通过选择合适的聚电解质、调整组装的层数、控制最外 层电荷的性质以及改变多层累积薄膜的内部结构等方法可以实现纳米 复合薄膜对特定分子或离子的选择透过性。 m i z u t a n i 及其合作者【4 1 l 发现h 2 0 2 可以选择性地通过由聚电解质 p a a 和p v s 形成的多层累积膜，聚电解质多层累积膜对分子大小的识 别机制是分子选择性渗透的主要原因。经研究证实，应用静电自组装 膜技术制备的聚电解质多层累积膜引起分子选择性渗透的主要原因是 在膜层之间形成致密的层状结构。这种结构通过每层聚合电解质薄膜 支链问相互作用的离子配对形成。通过系统的调整累积薄膜的层数或 者改变聚合物的材料可以在分子水平上控制纳米复合薄膜的渗透性。 1 4 溶胶一凝胶法 生物传感器要呈现良好的工作性能，其圊化技术应满足以下条件 绪论 ( 1 ) 固化后的生物组分仍能保持良好的生物活性； ( 2 ) 生物膜能适应多种测试环境； ( 3 ) 固化层要有良好的稳定性和耐用性： ( 4 ) 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选 择性。 至今，虽已发展了多种生物分子的固定化方法，如物理或化学吸 附法，共价结合法，交联法及包埋法，但均存在着一些问题f 4 “。其中， 吸附法优点是方法简单，操作条件温和，不足之处是生物分子与固定 表面结合力弱，在表面上进行任意取向的不规则分布，因此制得的生 物传感器易发生生物分子的泄露或解脱。共价结合法是通过共价键的 形成将生物分子固定于固体表面，因而不易发生分子的泄漏，并且改 善了分子在固体表面的分布状况。该法存在的问题主要是1 4 4 1 ：生物分 子在聚合物基底中的不稳定性、失活、扩散和聚集问题，且操作复杂、 耗时，成本高。交联法是通过多官能团试剂如戊二醛，使吸附的生物 分子以共价键结合的方式结合至固体表面。该法的缺点主要有：反应 难以控制：形成的酶蛋白层膨松、峰固性差；所需生物样品量多；扩 散阻力大以及酶蛋白在多分子的固化层中活性降低。包埋法则是将生 物分子包埋于聚合物胶、膜或表面活性剂基底中，是较为直接、更接 近生物体的一种固化方式。过去多是固化予聚氯乙烯、聚乙酰胺、聚 碳酸脂或半透性的n a t i o n 膜内。存在的问题是生物分子在聚合物内生 物活性的容易丧失。 近年来研究结果表明1 4 5 1 ：采用溶胶一凝胶技术将生物分子固化于无 机陶瓷或玻璃材料内，活性的保持能有明显改善。此外选用二氧化硅 做基底材料比使用有机聚合物材料具有良好的坚固性、抗磨性和化学 惰性低及高的热稳定性和光化学稳定性。 1 4 1 溶胶一凝胶定义 溶胶不是物质而是一种“状态”。最简单的溶胶与溶液在某些方 面有相似之处”6 1 ： 溶质+ 溶剂= 溶液 分散相+ 分散介质= 溶胶( 分散系) 凝胶是一种柔软的半固体，由大量胶束组成三维网络。胶束之间为 分散介质，是极薄的薄层。所谓“半固体”指表面上是固体，而内部 仍含液体，后者的一部分可通过凝胶的毛细管作用从其细孔逐渐排出。 凝胶义可分为易张型( 如明胶) 和非易胀型( 如硅胶) 两类，如下表1 绪论 一l 所不。 溶胶与凝胶是两种互有联系的状态。溶胶冷却后即可得到凝胶。 凝胶可能具有触变性，在振荡、超声波或其它能产生内应力的特定作 用下，凝胶能转化为溶胶。上述作用一经停止，凝胶又恢复原状。溶 胶与凝胶也可共存，组成一个更为复杂的胶态体系。 表1 i 两种类型凝胶比较 t a bl c o m p a r i s o nb e t w e e n t w ot y p e so fg e l s 溶胶一凝胶技术m 1 指将金属醇盐等原料配制成均相溶液，在饱和条 件下经水解一缩聚等化学反应，生成物聚集成溶胶，再经蒸发，干燥 转变为凝胶的技术。溶胶一凝胶技术( s o l g e l ) 最初是用来生产陶瓷材 料的一种方法。近10 多年来，该技术用于固定生物活性物质制作生物 传感器得到了较大的发展1 4 8 ，49 1 。溶胶凝胶技术的应用价值在于它具有 纯度高，均匀性强，处理温度低，反应条件易于控制等优势。 1 4 2 溶胶一凝胶过程的基本原理 最常用的溶胶凝胶体的制备方法是以醇盐为前驱体的水解聚合， 包括水解、聚合、凝胶化、老化和干燥等几个过程【5 “。 典型的s 0 1 一g e l 反应通常包括两个步骤5 1 1 ：( 1 ) 烷氧基金属有机 化合物( 如s i ( o c 2 h 5 ) 4 ，t i ( o c 2 h 5 ) 4 等) 水解成羟基化合物：( 2 ) 羟基 化合物缩合及缩聚过程。烷氧基硅烷具有疏水性，所以，s o l g e l 技术 多采用共溶剂( 如醇) 作为均化剂来控制水解过程。这两个过程如图 l 一4 所示： 水解过程： ? c 2 心宁c ：h s? c ：h s c 2 h 5 0 一辛一o c 2 h 5 + h 2 0 c 2 h 5 0 一 i o h+ h 2 0 斗h o s i i o h 6 c ，h ； o c 2 h 5o c 2 h 5 绪论 缩聚过程 o c 2 h 5 o c 2 h 5 h o s 卜一o hh o s 卜o h i h o0oo h l 1 l i 一一- h o s i o s j o s i o s i o h lili h oo0o h 1l h o s i o hh o s i o h jl o c 2 h 5o c 2 h 5 图1 2 典型溶股一凝胶过程 f i g 1 2 t y p i c a lp r o c e s so fs o l g e lr e a c t i o n s 缩聚得到的s i o h 进一步脱水缩聚而成s i 0 2 无机网络，生成的水和 醇从体系中挥发造成网络的多孔性。经过卜述水解缩聚后，得到透明 且具有一定粘度的溶胶，此时町注模成型，也呵采用浸渍( d i p c o a t i n g ) 或旋涂法( s p i n c o a t i n g ) 成膜。随水解缩聚反应的进一步进行，溶胶 粘度增大，即形成凝胶。再经过陈化干燥，令剩余的和反应生成的水 和醇挥发，最后形成干凝胶。s 0 1 g e l 聚合反应过程如图1 3 ： 。# t n 十 尊a 图1 - 3s 0 1 g e l 聚合一收反应过程示意图( “r ”是反应活性基团) f i g1 3s c h e m ef o rp o i y m e r i z a t ；o nr e a c t i o no fs o l g e l ( “r ” isar e a c t i o ns i t e ) 1 4 3 溶胶一凝胶法应用于生物传感器领域的优点 生物活性分子掺入s 0 1 g e l 基质，n 】，称为“s 0 1 g e l 包埋法”：在溶 胶转变成凝胶过程中逐步把生物活性分子( 酶、蛋白质等) 包埋于基 质中。它是一7 种物理吸附过程，能使蛋白质表面的微结构得以保存， 鼹 一 举一举一 邺 泌一 吝i 眺 o i s l o 绪论 不影响活性，对基质没有特殊要求，这些都是一般交联法和共价键合 法所没有的优点。 溶胶一凝胶应用于生物传感器具有如下优点 5 2 l ：( 1 ) 基质在可见 光区是透明的，适于光化学生物传感器的制作；( 2 ) 基质具有一定的 罔0 性，提高了生物活性分子的热稳定性；( 3 ) 基质的热稳定好，且呈 化学惰性，对生物活性分子的失活作用很小，能保持酶分子的活性； ( 4 ) 通过溶胶凝胶制备条件的优化，可控制基质的孔径大小及其分 布，使酶分子有足够的自由活动空问而又不至于从基质中流失。 ( 5 ) 溶胶一凝胶材料还具有生物相容性，为微电极植入人体提供了新的可能 性：( 6 ) 溶胶凝胶的制备条件十分温和，生物分子可以在不同的制 备阶段加入，并且可以制成不同大小与形状的修饰电极等。溶胶一凝胶 材料作为酶固定化载体，开辟了制备生物传感器的新领域。 但在s o l g e l 法成膜过程中，膜容易开裂，而且膜与基体电极结合 不牢固，很大的限制了其在传感器方面的应用 4 4 1 。虽然h e n c h 建议使 用控制干燥的化学添加剂如t r i t o n x 和甲酰胺等来防止开裂，但效果 并不明显而且操作困难。因此需要利用其它方法解决s o l g e l 法成膜过 程中，膜容易开裂，且膜与基体电极结合不牢