（生物医学工程专业论文）单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究.pdf

r e s e a r c ho ns p f r e ta n ds i n g l ef l u o r e s c e n c em o l e c u l e p h o t o b l e a c h i n g b y l i ux i n l i a n g b s ( t a i a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n b i o m e d i c a le n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rg a ih o n g w e i j u n e ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 二t1 妈毛 、j 日期：b1 1 年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密毗 ( 请在以上相应方框内打“) 作者签名：三1 扔亮 翩微参f - i p i t - 导师签名：夸， 1 7 坷所f 1 日期：弘1 | 年6 月弓e t 日期：i 年月3 e l 硕士学位论文 摘要 单分子检测( s m d ，s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ) 正在生物学、物理学、医学、 化学以及纳米材料等前沿领域得到广泛的应用和迅猛的发展。s m d 能够检测复杂 体系中的个体，尤其是可以研究反应中的中间产物，实时观测反应过程。其中单 分子荧光成像技术成为了研究单分子相互作用、单分子动力学过程和生物大分子 构象转变的重要工具。利用单分子荧光光谱可以区分复杂的生物体系中被不同的 荧光基团标记的生物大分子。本论文对单分子对荧光共振能量转移( s p f r e t ， s i n g l ep a i rf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) 的研究就是利用单分子荧光光 谱实现了单通道内检测分子之间的荧光共振能量转移。 荧光染料通常被标记在生物大分子上，以对其进行定位和示踪。但是荧光漂 白现象却是荧光染料广泛应用的一个巨大的障碍，所以如何抑制光漂白成为研究 的重点，但是却鲜有研究单个荧光染料分子漂白前光强度的变化。 本论文基于普通宽场落射式荧光显微镜观测了双标记的病毒的外壳和d n a ； 构建了一个单通道内观测s p f r e t 的平台；探究了多种荧光染料分子的漂白行为。 具体内容如下： 1 、单通道内观测s p f r e t 。在电子耦合倍增管( e m c c d ) 芯片的前方添加 一块透射光栅，利用透射光栅的分光作用，根据不同的荧光物质被光栅分光后零 级点到一级条纹之间的距离不同的原理，用一块双通滤光片作为滤光块的发射滤 光片只允许供受体发射光通过，供体被激发以后受体也发出荧光被最终呈现一个 零级点和两条一级条纹。分别以s t r e p t a v i d i a n a l e x a 5 9 4 、a t t 0 4 8 8 一b i o t i n 和c y 3 、 c y 5 为研究对象，实现了单通道内检测单对荧光共振能量转移。 2 、单个荧光染料漂白行为的研究。对罗丹明b 、a l e x af l u o r 、y o y o 一1 染料 在荧光漂白前荧光强度的变化进行分析，得出这几种荧光染料分子在荧光漂白前 的强度变化是一个随时间变化的线性函数，并且这个函数的斜率服从洛伦兹分布。 考察了不同极性溶剂和不同p h 值溶剂对其荧光强度变化的影响。并且发现长波 长光对荧光染料分子同样具有光漂白作用。 3 、病毒外壳和d n a 链的双标记。先将一种荧光染料标记在腺病毒的外壳上， 病毒裂解后，用嵌入式荧光染料( y o y o 1 ) 标记病毒释放的d n a 。实现普通宽 场显微镜下观测单个病毒及其裂解产生的核酸，为将来在微流控通道中和细胞内 动态观测病毒释放d n a 的过程打下了基础。 关键词：单分子；单分子荧光共振能量转移；光漂白；单个病毒 n j 单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究 a b s t r a c t s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ( s m d ) h a sb e e na p p l i e dt os t u d yt h ec h a n g eo ft h e m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n ，d y n a m i c s ，i n t e r a c t i o n sb e t w e e nm o l e c u l e sa n dt h ec o n t r o lo f s i n g l em o l e c u l e s s m dc a no b t a i n i n d i v i d u a li n f o r m a t i o nu n d e rn o n - e q u i l i b r i u m c o n d i t i o n sa n dt h ef l u c t u a t i o no ft h es y s t e mu n d e re q u i l i b r i u mc o n d i t i o n s i ta l s oc a n b eu s et ot r a c kt h ep r o c e s so fm i c r o c o s m i cd y n a m i c sw h i c hi se n s h r o u d e d b e s i d e s ， t h em o l e c u l e s d on o th a v et ob e s y n c h r o n i z e dd u r i n gs m d ，a n ds o m er a r e i n t e r m e d i a t e so rt r a n s i t i o n a ls t a t e sc a nb ec a t c h e de a s i l y u s i n gs i n g l e - m o l e c u l e f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yc a nd i s t i n g u i s hb e t w e e nc o m p l e xb i o l o g i c a ls y s t e m st h a t l a b e l e dw i t hd i f f e r e n tf l u o r o p h o r e so f b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s i nt h i st h e s i s ，w eu s et e c h n i q u e so fs i n g l e m o l e c u l ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yt o d e t e c ts i n g l e p a i rf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rb ya d d i n gat r a n s m i tb e f o r e t h ee m c c d s oo n ez e r oo r d e rp o i n ta n do n ef i r s to r d e rs t r e a kc a nb eo b t a i n e d w e u s ead o u b l e p a s sf i l t e rt om a k es u r ee m i s s i o no fb o t hd o m o ra n da c c e p t o rc a n p a s s e dt h r o u h ，f i n a l l yw ea c h i v e dt od e t e c ts i n g l ep a i rf r e t p h o t o b l e a c h i n gi su s e dt ob eab i go b s t a c l eo ft h ew i d e l yu s eo ff l u o r e s c e n td y e a n d h o wt os u p p r e s sp h o t o b l e a c h i n gi sb e c o m i n gt h ef o c u so fr e s e a r c h ，b u tt h e r ea r e f e ws t u d y sf o c u so n t h ec h a n g eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yb e f o r ei t sp h o t o b l e a c h i n g t h eb l e a c h i n go fs i n g l ed y em o l e c u l ei sc o n s i d e r e da ss i n g l es t e pp h o t o b l e a c h i n g ，a n d t h ei n t e n s i t yo ft h ef l u o r e s c e n c eo ft h ed y eb e f o r ep h o t o b l e a c h i n gi ss t e a d y i nt h i s w o r k ，t h ep h o t o b l e a c h i n go fs i n g l ef l u o r e s c e n c ed y e sa r es t u d i e d w ef i n dt h a tt h e i n t e n s i t yb e f o r ep h o t o b l e a c h i n gi sn o ta l w a y ss t e a d y ，e n h a n c i n ga n dq u e n c h i n ga r e a l s of o u n di no u rr e s e a r c h ，a n dm o s to ft h e ma r et e n d i n gt oq u e n c h i n g d i s s o l v e di n t h ed i f f e r e n tp hb u f f e r sa n dd i f f e r e n tp o l a rs o l v e n t s ，t h ed i s t r i b u t i o no ft h es l o p eo f t h es i n g l es t e pp h o t o b l e a c h i n ga c c o r d st ol o r e n z ed i s t r i b u t i o n t h ec o a ta n dt h ed n ao fv i r u sa r ed u a l - l a b l e d w eu s ea l e x a 5 9 4a n dq d 5 2 5t o l a b l ew i t ht h ec o a to fv i r u s a f t e rt h ev i r u sr e l e a s ed n a ，q u i c k l ya d d e dy o y o lt o l a b l ew i t hi t a n dt h e no b e r s e r v e du n d e rt h em i c r o s c o p e k e yw o r d s ：s i n g l em o l e c u l e ；s p f r e t ；p h o t o b l e a c h i n g ；s i n g l ev i r u s h i j 硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i i i 插图索引v i 附表索引v i i 第1 章绪论1 1 1 单分子荧光成像检测法2 1 1 1 宽场成像2 1 1 2 扫描成像4 1 2 单个荧光分子的特性与单个量子点的判定4 1 2 1 单分子荧光产生的原理4 1 2 2 单分子的荧光特性以及判定依据5 1 2 3 单分子荧光检测的技术关键小6 1 2 4 单分子荧光检测的技术手段6 1 3 荧光探针7 1 3 1 有机荧光染料8 1 3 2 量子点一8 1 4 荧光共振能量转移9 1 4 1 供受体对的选择1 0 1 4 2s p f r e t 的应用1 2 1 5 单分子漂白行为的研究一1 2 1 6 病毒示踪的研究1 2 1 7 本论文的研究构想与主要内容1 3 第2 章单分子荧光共振能量转移1 5 2 1 引言1 5 2 2 实验部分1 6 2 2 1 实验仪器和试剂1 6 2 2 2 实验方法1 8 2 3 结果和讨论2 0 2 3 1s a a l e x a 5 9 4 和b i o t i n a t t 0 4 8 8 之间的f r e t 2 0 2 3 2 单对荧光共振能量转移( s p f r e t ) 2 2 代 甲分了水、f ，f ：的荧光共振能量转移及漂( j 行为的研究 第3 章单分子荧光漂白行为的研究2 6 3 1 引。言2 6 3 2 实验部分2 6 3 2 1 试剂与仪器2 6 3 2 2 实验方法2 7 3 3 结果与讨论2 7 3 3 1 单个染料分子荧光强度随时间的变化2 7 3 3 2 罗丹明b 在不同极性溶剂中斜率分布一2 9 3 3 3 罗丹明b 在不同p h 溶液中的斜率分布2 9 3 4 长波长的光对单个染料分子的光漂白3 0 3 5 小结3l 第4 章病毒外壳和d n a 的双标记3 2 4 1 引言一3 2 4 2 实验部分3 3 4 2 1 实验仪器和试剂3 3 4 2 2 实验方法3 3 4 2 3 标记度的计算3 4 4 2 4 病毒的裂解3 4 4 2 5 病毒d n a 的标记3 4 4 2 6 制片观察3 4 4 3 结果与讨论一3 4 4 3 1 染料标记病毒外壳的成像3 4 4 3 2y o y o 1 标记病毒d n a 的成像3 5 4 3 3 量子点标记病毒成像3 5 4 4 小结3 6 结论3 8 参考文献4 0 附录a 攻读学位期间所发表的论文及专利4 7 致谢4 8 v 硕士学位论文 插图索引 图1 1 全内反射及衰逝波的产生示意副1 3 1 3 图1 2 共聚焦显微镜示意图4 图1 3 荧光产生原理示意图5 图2 1 成像原理1 7 图2 2s a a l e x a 5 9 4 吸光度与漂白曲线1 9 图2 3a t t 0 4 8 8 和a l e x a 5 9 4 荧光光谱2 0 图2 4 同一区域不同滤光块下内成像并叠加2 1 图2 5 加光栅以后分别成像与单通道到内观测f r e t 2 2 图2 6 三种比例c y 3 和c y 5 荧光光谱图：2 3 图2 7 单分子判定依据2 3 图2 8s p f r e t 成像2 5 图3 1 漂白曲线和斜率分布2 8 图3 2 荧光染料分子在不同溶剂中的斜率分布3 0 图3 3a l e x a 5 9 4 在长波长光下的漂白3 1 图4 1 不同浓度的病毒成像3 5 图4 2d n a 光解作用j 3 5 图4 3 量子点标记病毒3 6 v i 一一一 。墼坠型墼丝坚墼墼塑塑型丝堕一 附表索引 表o l 三种荧光染料分子斜率分布参数2 5 表3 2 为斜率上述不同溶剂中分布的相关参数”2 9 v 硕士学位论文 第1 章绪论 长久以来人们就梦想着能在原子、分子尺度上观测和操纵物质世界。特别是 当人类基因组测序完成以后，生命科学从根本上提出了从单分子水平上研究生命 活动现象的需求。上世纪8 0 年代伴随着各种光学扫描显微镜、荧光探针、光镊技 术等新兴分析仪器和研究方法的出现和发展，单分子学科应运而生。实现单分子 检测( s m d ，s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ) 成为了人类测量的终极尺度，为分析化 学、生物学开辟了一个新的领域。单分子检测指在单分子水平上对分子行为( 相 互识别、相互作用、构象变化等) 的实时，动态检测以及操纵和调控。这种高灵 敏度、实时检测的优势使其迅速成为生物学、物理学、化学、医学以及纳米材料 等前沿学科的一种重要的研究手段。 目前，单分子检测的研究方法按原理不同主要有三大类：基于电学或力学的 扫描探针显微技术，包括扫描隧道显微镜( s c a n n i gt u n n e lm i c r o s c o p y ，s t m ) 、 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 、静电力显微镜( e l e c t r o s t a t i cf o r c e m i c r o s c o p y ，e f m ) ：基于光学的显微技术和光谱技术，包括共聚焦荧光显微镜 ( c o n f o c a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) 、近场扫描光学显微镜( n e a r f i e l ds c a n n i n g o p t i c a lm i c r o s c o p e ，n s o m ) 、宽场荧光显微镜( f a r f i e l df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) 、 表面增强拉曼光谱( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) 、光镊技术( o p t i c a l t w e e z e r ) 等；基于化学反应的检测技术，包括包括电化学检测( s m e d ) 、化 学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 检测等。上述检测单分子方法的具有共同的特征： 一、高空间分辨率；二、能捕提单分子的性质和行为；三、能放大检测信号，并 做相应的分析处理以获取准确的信息。 单分子研究具有许多优势：一、传统的系综观测只能给出一个整体的平均值， 而这就会掩盖许多特殊的信息例如具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子， 单分子检测就可做到对体系中单个分子的行为进行研究；二、单分子检测能揭示 分子在异质微环境中的行为；三、实时观测分子的定位、运动轨迹、分子相互作 用、反应动力学过程等。 单分子荧光检测是单分子检测中最常见的方法。1 9 7 6 年，h i r s c h f e l d i l l 首次实 现了多染料标记的单分子荧光检测；1 9 9 0 年，s h e r a 等人【2 】第一次实现了室温下 流体中的单荧光团分子的荧光检测；1 9 9 4 年，m o e r n e r 3 】首先在水容器风干表面 对单荧光团进行观测；1 9 9 5 年，f u n a t s u 4 1 第一次在水溶液中试验了对单个荧光基 团标记的蛋白质分子进行示踪，从而真正实现了单个荧光分子的检测。单分子通 过标记后的荧光集团各种特性的变化反映相关分子的反应动力学、分子间相互作 单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究 用、构想动力学以及在化学、物理环境下改变的信息，成为研究生命活动机制的 有力手段，加之单分子荧光光谱检测可以识别复杂的、多组分体系中的分子，更 加丰富了单分子检测的应用领域。如今单分子荧光成像技术已经在诸多领域广泛 应用，如分子示踪研究1 5 , 6 ，生物分子在固液界面的脱附吸附行为研究【7 ，3 1 ，检测 生物分子相互作用以及在微通道中流体力学探究【9 , 1 0 】等。可以预料单分子荧光检 测必定是一个充满前景的研究领域。本论文主要使用落射式宽场荧光显微镜，以 汞灯作为光源，高灵敏c c d 作为检测器来实现单分子检测。 1 1 单分子荧光成像检测法 根据检测原理的不同，单分子检测的荧光成像方法主要包括宽场成像和扫描 成像两种。宽场成像中最常用的就是全内反射荧光显微镜( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o n f l u o r e c c e n e e m i c r o s c o p y ，t i r f m ) 和落射式荧光显微镜( e p i f l u o r e s e e n c e m i c r o s c o p y ) ；扫描成像中常见的有共聚焦显微镜( c o n f o c a lm i c r o s c o p y ) 和近场 扫描光学显微镜( n e a r f i e l ds c a n n i n go p t i c a lm i c r o s c o p y ) 。 1 1 1 宽场成像 宽场成像与点检测扫描成像相区别，是指成像区域尺寸远大于光衍射极限大 小，这种成像方式能够在较长的时间内、较大面积内追踪多个单分子，常用于单 分子示踪的研究。根据激发方式的不同分为落射式宽场荧光成像和全内反射式宽 场荧光成像。 1 1 1 1 落射式荧光显微成像 落射式荧光显微镜在普通显微镜的基础上结合恰当的滤光块组和高数值孔径 的物镜，在以高灵敏c c d 为检测器，如i c c d ( i n t e n s i f i e dc h a r g ec o u p l e dd e v i c e ) 和e m c c d ( e l e c t o nm u l t i p l y i n gc h a r g ec o u p l e dd e v i c e ) 来实现单分子检测。这 种显微镜操作简易，结构简单，在单分子检测中也非常广泛。s e i s e n b e r g e 1 1 】等人 利用利用此种成像方法研究了病毒侵入h e l a 细胞的过程，l a k a d a m y a l i t l 2 】等观测 流感病毒进入细胞的过程，从而揭示了流感病毒进入细胞的内吞途径。虽然落射 式荧光显微镜不需要扫描，可以对样品进行较大面积成像，但是当观测的样品较 厚或者溶液中有运动辐度较大的分子时，落射式荧光显微镜除了能清楚地检测的 焦平面上的样品外，焦平面以外的样品也能被观察到，这样就会使得许多杂散光 进入采集范围，降低了信噪比，影响成像质量。因此此种显微成像技术一般只用 于多染料标记的生物大分子或者高量子产率荧光探针的单分子检测。 1 1 1 2 全内反射荧光显微镜 全内反射荧光显微镜( t i r f m ) 是利用在界面处以指数形式衰减的衰逝波激 硕士学位论文 发界面附近2 0 0 h m 以下的荧光分子。所以只有在非常靠近全反射面的样品区域会 激发荧光，这样就使得激发体积大大减小，提高了信噪比。 如图1 1 ，当入射光从折射率为n 1 的光密介质( 如玻璃) 进入到折射率为n 2 的光疏介质( 如溶液) 时，一部分发生反射回光密介质，另一部分则折射进入光 疏介质。入射角e i 和折射角0 2 之间的关系服从s n e l l 定律： n l s i n o l = n 2 s i n 0 2 ( 1 1 ) 此时存在着一个临界角o c = a r c s i n ( n l n 2 ) 。当入射角大于临界角0 。时，光 线会在光密介质界面上完全反射而在折射进入光疏介质。而同时由于能量的波动 效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到光疏介质( 溶液) 中，即所谓的衰逝 波( e v a n e s c e n tw a v e ，也称隐逝波) ，平行于界面进行传播。 r e f r a c t e d 一一之 - 名磐一隈二 图1 1 全内反射及衰逝波的产生示意图【1 3 1 衰逝波场的强度i z 在光疏介质( 溶液) 中随界面的距离z 以指数关系衰减， 如公式( 1 2 ) ， = i o e x p ( - z h ) ( 1 2 ) 其中i o 为在界面处入射光的强度，z 为距离界面的距离，h 为透射深度，则h 可表达式为 h = z o ( 4 1 t 厨i 虿i ) ( 1 3 ) 因为t i r f m 衰逝波的激发深度( h ) 约为2 0 0 h m 以内，所以很明显其背景噪 音相比宽场落射式荧光显微镜来说要低的多，而且其具有高度的表面特异性，从 而使人们更获得一种全新的表面分析技术。在配备高灵敏c c d 使其具有了：高 分辨率、高信噪比、对生物样本损伤小，更适合研究两相界面的单分子行为等优 势。而且t i r f m 还可以与多种技术结合，例如光镊技术、单分子操纵等，因此 t i r f m 的应用范围非常广泛。1 9 9 5 年，f u n a t s u 1 4 】等人利用此种方法对肌球蛋白 酶在水溶液中的活性进行研究，从而开启了t i r f m 在生物大分子上研究的大门。 随后人们相继研究了细胞膜表面的反应【1 5 , 1 6 】，细胞内的运输途径【1 7 1 ，蛋白和病毒 单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究 通过细胞膜的过程【1 8 , 1 9 ，溶液中蛋白质分子之间的相互作用2 0 1 ，以及生物大分子 的示踪1 2 l 】等等 1 1 2 扫描成像 扫描成像在单分子检测中最为常用的是激光共聚焦显微镜。激光共聚焦技术 通常是将激光束通过照明针孔形成一个点光源，进而通过物镜聚焦到荧光分子， 当荧光分子在聚焦的焦点上时，反射光又会通过物镜和二向色镜一部分穿过位于 检测器前的探测针孔到达检测器，另一部分光测重新汇聚到照明针孔。这就是共 聚焦技术，即反射光经过物镜、二向色镜能够同时产生两个焦点：检测焦点和照 明焦点，如图1 2 。激光共聚焦显微镜通常与光电倍增管( p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ， p m d ) 和雪崩二极管( a v a l a n c h ep h o t o d i o d e ，a p d ) 联用进行点检测。此种检测 方法的检测体积非常小约为l f l ，而且检测灵敏度极高。而且可以对物体实现三 维扫描，所以更加容易观察活细胞和组织【2 2 , 2 3 , 2 4 。上文提到1 9 7 6 年错误l 未定义 书签。h i r s c h f c l d 对多染料标记的单分子荧光进行检测就是使用的激光共聚焦显 微镜与光电倍增管检测器。之后利用此项技术n i e 成功地对单个r h o d a n m i n e 分 子【2 5 】和f i t c 分子t 2 6 1 进行了示踪。最近z h a n g 等人利用金属纳米颗粒作为探针检 测了c c r 5 受体的表达水平及其在细胞表面的分布。【2 7 1 在焦 一 面上不在焦面上 图1 2 共聚焦显微镜示意图 1 2 单个荧光分子的特性与单个量子点的判定 1 2 1 单分子荧光产生的原理 单分子荧光检测是单分子检测最常用的方法，通过生物大分子上标记各个荧 硕士学位论文 光基团或染料。荧光基团或染料的各种特性的变化反映了有关分子间相互作用、 酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性 改变的信息，对宿主影响小，而且稀溶液中荧光发射检测较为灵敏，背景值较低， 信噪比高。荧光产生的原理如图1 3 所示。当荧光分子光子以后从基态( s o ) 跃 迁到较高的第一激发单重态( s 1 ) 或者第二激发单重态( s 2 ) ，然后迅速弛豫到 s l 的最低振动能级即图中所示z 的内转换。在此期间是没有能量损失的。然后再 由s l 的最低振动能级通过辐射弛豫跃迁到s o 中的各个不同的振动能级，此过程 中发出荧光。 3 s 2 至 0 s l 耋 内转换 吸收： 振动弛豫 至 荧光磷光 图1 3 荧光产生原理示惹图 1 2 2 单分子的荧光特性以及判定依据 1 量子跳跃特性：如图1 3 所示荧光分子也会从s 1 无辐射跃迁到t l ，即系 间窜越。在此过程中分子的荧光很弱，甚至不发荧光，称之为暗态。分子从t l 态回到s o 态又被重新进入激发、发射的循环。所以单分子的荧光呈现发射暗态 交替的量子跳跃过程。另外单分子受周围环境的影响也会发生此种量子跳跃的特 ( p h o t o b l e a c h i n g ) 是 逐步减弱甚至消失的 发生一步完成，即荧 测到的光斑是否是单 射偶极矩，因此在此 向，可以完全确定单 量1 0 单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究 4 光谱特性：不同荧光分子具有各自相应的光谱信息。可以通过单分子光谱 来区分不同的物质分子。本实验室h a n 等人【3 0 】通过在e m c c d 前面放置一块透射 光栅，考察了a l e x a 4 8 8 、a l e x a 5 9 4 、q d 5 2 5 的光谱信息，能够通过零即点和一级 条纹之间的光谱分辨率转化为发射光波长。将一级条纹进行拟合后得到了和系综 光谱吻合的单分子荧光光谱。 1 2 3 单分子荧光检测的技术关键 单分子检测中有两个关键技术首先是要提高检测器的灵敏度和信背比。，因 为单个分子的荧光很弱，这就要求荧光检测器的灵敏度具有较高的量子效率和很 低的暗计数。目前比较常用的超敏检测器是增强型电感耦合装置( i c c d ) 和单光 子计数模式的雪崩光二极管( a p d ) ，最终光子检测效率能够达到o 1 3 1 , 3 2 1 。 第二个关键的技术就是要排除背景干扰信号，提高信背比。要尽可能的降低由瑞 利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰，加强对溶液中的单分子的识 别。例如用带通滤光片去掉不需要的杂光( 如瑞利散射光，溶液中的杂质荧光) ； 减小检测体积，减少杂光的来源；有效的清洗玻片，除去玻片上荧光物质；另外 可以增加曝光时间，使累计的光子数增加，以达到比较好的检测效果。 1 2 4 单分子荧光检测的技术手段 常有的单分子荧光检测的手段有利用荧光寿命、荧光相关光谱和荧光共振能 量转移技术。分子的荧光寿命是指当分子被激发吸收光子后从基态跃迁到激发态， 再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态。当激发停止后，分子的荧光强度降到激 发时最大强度的1 e 时所需的时间称为荧光寿命。不同的荧光分子其荧光寿命也 不同，所以可以通过测量分子的荧光寿命来区分不同的荧光分子；另外相同的荧光 分子在不同的环境中，由于受到周围环境的影响，其荧光寿命也不相同，因此可 以借助此种方法来测定分子周围的微环境。b o w e n 3 3 等人研究了红色荧光蛋白分 子在干样( 无溶液) 和湿样( 溶液中) 在玻片上的荧光寿命的不同，并且通过与 系综水平的荧光寿命作比较证明单个红色荧光蛋白会迅速的光转化为一个四聚体 的中间形式。s a u e r 等人1 3 4 j 就利用了不同的荧光分子荧光寿命的不同来区分溶液 中的c y 5 d c t p 、m r l 2 1 d u t p 和b o d i p y d u t p 。荧光相关光谱( f l u o r e s c e n c e c o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ，f c s ) 是一种通过测定微体积内( 通常s 1 0 d 5 ) 的发光 粒子因化学反应、自身的布朗运动而产生的荧光强度随时问的涨落进行分析检测 的荧光光谱技术，通过这些信息我们可以获得单个荧光分子浓度、化学动力学等 的信息【3 5 1 。荧光相关光谱单分子检测技术是利用了分子荧光的高灵敏度和高特异 性，另外如强度、偏振、波长和荧光寿命都可以作为其分析特征，其被广泛的应 用于生物分子的相互作用和活细胞的研究。p e t r a 等人【3 6 】通过使用荧光标记磷脂 分子观测其在磷脂双分子层膜中的横向扩散。通过测定荧光分子进入和离开激发 硕士学位论文 区域的时间来测算磷脂分子在双分子层膜中的扩散系数。s v e n r i c h 等人【3 7 】研究了 d n a 寡核苷酸与原核转录活化蛋白n t r c 的相互作用，测定了单结合位点时的解 离常数，并研究了乙酸钾浓度对双结合位点的影响。p r a m a n i k 等人1 3 s 】通过用荧光 探针标记谷胱甘肽研究其在胰腺癌细胞膜上的的结合作用，发现在此细胞膜上存 在着两种谷胱甘肽的受体。w e n n m a l m 等人【3 9 】利用链式聚合酶反应技术扩增除了 一端标记四甲基罗丹明而另一端标记生物素的d n a 的片段，通过生物素和玻片 上的链霉亲和素的结合作用固定此d n a 片段，根据荧光强度的变化得到了d n a 分子构象的变化。此外，f c s 单分子检测技术还被应用于溶液中荧光分子的实时 监测【4 们，化学反应引起的分子内单线态和三线态的相互作用【4 1 1 ，以及蛋白质的折 叠和d n a 的转录【4 2 1 、细胞核的检测【4 3 】等多方面的研究。 荧光共振能量转移技术是应用非常广泛的一项分子荧光的检测手段。使用光 谱重叠的两个荧光团，一个作为供体荧光团另一个作为受体荧光团，两个相互作 用的分子相互靠近时，其中作为供体的荧光团被激发，受体荧光团也会发出荧光。 通过测量供受体荧光的光强可以计算出荧光共振能量转移效率。常规显微镜的分 辨率为2 0 0 r i m 以上，即使是近年来兴起的远场纳米显微镜的检测范围也仅为 1 0 n m - - - 2 0 0 n m 。而荧光共振能量转移技术则能够突破衍射极限，可以检测1 1 0 n m 范围的分子构象变化和分子之间的相互作用。 在本章第五节，我们将对利用荧光共振能量转移技术进行单分子检测做详细 的论述。 1 3 荧光探针 要想达到检测单分子的水平，作为生物大分子的标记物荧光探针必须具有以 下的特点：耐光，不容易发生光漂白；量子产率要高；容易被激发；分子要尽可 能的小，以免影响生物大分子的特性。荧光探针的灵敏度是影响检测结果的重要 因素，因而开发出更灵敏的荧光探针，同时避免生物荧光背景的干扰已成为目前 研究的熟点。在选择合适的荧光探针时，通常要求探针的摩尔吸光系数大，荧光 量子产率高，荧光发射波长处于长波且有较大的s t o k e s 位移。斯托克位移是指激 发峰和发射峰的峰值之间的波长差，是一个表示分子发光特性的物理常数，它表 示分子在回到基态以前，在激发态寿命期间能量的消耗。荧光探针的量子产率受 到溶剂极性、电荷强度、淬灭剂浓度、氧含量以其与探针分子的亲和性以及环境 温度等因素的影响。到因此，应根据实验要求选择合适的探针，一般情况下，应 注意以下两个问题：( 1 ) 最大吸收波长或发射波长：选用荧光染料应结合现有仪 器的激光光源可以提供的工作波长，选择可供使用的荧光探针，并选用相应的滤 光片。( 2 ) 光漂白：应尽量选用耐光漂白荧光染料，并且在样品制备过程中应该 尽量避免光，在试验过程中应该避免长时间照射，以免缩短样品使用寿命。通常 单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究 荧光探针分为三类：自发光荧光蛋白、有机荧光染料、量子点( q u a n t u md o t s ， q d s ) 。有些生物体内自身的具有就具有能够发射荧光的生物分子，例如从 a e q u o r e av i c t o r i a 水母提取得到的绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ) 是 生物实验中应用最为广泛荧光探针【4 4 1 ，之后又在此基础上发展了绿色荧光蛋白的 变体增强绿荧光蛋白( e n h a n c e dg f p ，e g f p ) 、黄色荧光蛋白( y e l l o wg f p ， y g f p ) 等等。藻红蛋白也是一种自发光荧光蛋白，经常被用于细胞体内单分子 的检测。g o u l i n 4 5 i 等跟踪观测了单个藻红蛋白分子在猴的肾表皮细胞质和细胞核 中的运动。利用全内反射荧光单分子成像技术检测活细胞中绿色荧光蛋白或者黄 色荧光蛋白标记的蛋白质分子【4 6 4 9 1 。 1 3 1 有机荧光染料 常用的有机荧光染料按照结构的不同可以分为以下几种：1 ) a l e x a 家族的染 料，如a l e x a4 8 8 、a l e x a5 9 4 、a l e x a6 4 7 等；2 ) 罗丹明