（微生物学专业论文）稻草分步和同步糖化发酵法生产乙醇的研究.pdf

摘要 摘要 纤维素类物质是自然界中数量很大的可再生物质，是生产乙醇的巨大资源， 对解决未来能源问题，有着巨大的潜力。我国秸秆资源十分丰富，因此研究秸 杆类物质生产乙醇具有重要意义。该研究选用本实验室分离筛选的一株糖化稻 草能力强的链霉菌( s t r e p t o m y c e s p ) 菌株，对该菌株进行了稻草发酵糖化条件 优化试验；并对酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、酿酒酵母a s 2 4 5 8 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea s 2 4 5 8 ) 、安琪酵母三株产乙醇酵母进行了利用糖 化稻草产乙醇的筛选试验；利用链霉菌和安琪酵母对稻草的分步糖化发酵法和 同步糖化发酵法产乙醇分别进行了试验研究，并利用s a s 软件优化得到它们各 自的最佳发酵条件，同时对稻草分步发酵法与同步发酵法产乙醇进行了对比分 析；最后对稻草固态同步糖化发酵法进行了试验研究，并得到了最佳产乙酵条 件，与此同时对稻草的液态同步发酵法产乙醇与稻草固态同步发酵法产乙醇进 行了对比分析。研究结果如下： 1 、通过单因素和s a s 二水平设计及响应面分析，得到了链霉菌降解稻草产 生还原糖的最佳条件：p b 设计法筛选出影响其产糖量的显著因素为：稻草粉添 加量、p h 和c a c l 2 添加量。b b 设计法对这三个显著因素响应分析得最佳发酵条 件为：稻草粉7 4 ，麸皮3 ，豆饼粉3 ，玉米粉2 ，k h 2 p 0 40 5 ，c a c l 2o 7 3 ， p h 6 2 ，接种量2m l ，3 7 ，发酵时间7 天。实验结果有良好的稳定性，优化后 产糖量为3 1 3 2 m g m l ，约为优化前的1 5 倍。 2 、酿酒酵母、酿酒酵母a s 2 4 5 8 、安琪酵母利用稻草水解糖产乙酵实验中， 安琪酵母产乙醇能力最高为5 2 1 7 ( v v ) ，残糖量较低，为1 0 1 9 m g m l ，因此 选为后续研究所用产乙醇菌株。在研究补加氮源种类对安琪酵母利用糖化稻草 产乙醇的影响试验中，结果显示，当以硫酸铵为氮源时，产乙醇水平最高，为 5 8 9 ，残余还原糖较低，为8 9 m g m l 。因此选择了硫酸铵为链霉菌糖化后补 充添加的氮源。 3 、对稻草分步糖化发酵法产乙醇条件进行的一系列单因素实验及b b 设计 法优化得到最佳发酵条件为：稻草粉7 4 ，麸皮3 ，豆饼粉3 ，玉米粉2 ， k h 2 p 0 40 5 ，c a c l 20 7 3 ，p h 6 2 ，接入链霉菌种子液，接种量为2 m l ，3 7 ， 1 2 0 r m i n 摇床培养7 天，添加0 8 硫酸铵，调p h 至5 3 后灭菌，接入4 m l 酵 摘要 母菌种子液，3 2 3 静置培养1 9 天。优化后乙醇产量为6 4 1 ，是优化前的1 1 9 倍。 4 、p b 设计法筛选影响稻草同时糖化发酵法产乙醇条件的显著因素为：酵母 接种量、接入酵母时间和酵母发酵时间。b b 设计法对这三个显著因素响应分析 得最佳发酵条件为：稻草粉7 4 ，麸皮3 ，豆饼粉3 ，玉米粉2 ，k h 2 p 0 4o 5 ， c a c l 2o 7 3 ，p h 5 5 ，接入链霉菌种子液，接种量为2 m l ，3 7 ，1 2 0 r m i n 摇床 培养3 2 天，添加1 o 硫酸铵，接入1 8 m l 酵母菌种子液，3 4 静置培养4 2 天。优化后乙醇产量为7 5 2 ，是优化前的1 1 7 倍。 5 、将分步糖化发酵法和同步糖化发酵法发酵乙醇条件的优化结果对比，发 现同步糖化发酵法具有一定的优点：优化后的分步糖化发酵法的乙醇产量为 6 4 1 ，而同步糖化发酵法的乙醇产量为7 5 2 ，是分步糖化发酵法的1 1 7 倍； 分步糖化发酵法的周期为8 9 天，而同步糖化发酵法的周期为7 4 天，比分步糖 化发酵法相比发酵时间缩短了1 5 天；分步糖化发酵法安琪酵母种子液的接种量 需要4 m l ，而同步糖化发酵法安琪酵母种子液的接种量只要1 8 m l ，菌种的用 量为分步发酵法的1 2 还少。由此可见，同步糖化发酵法不仅提高了乙醇的产量， 还大大缩短了生产周期，降低了生产成本。 6 、经过对稻草固态同步糖化发酵法产乙醇条件的单因素系列优化实验，得 到稻草最佳产乙醇条件为：稻草固体培养基的料水比为l ：3 ，初始p h 为5 o ，链 霉菌接种量为3 m l ，置3 7 培养，链霉菌发酵培养后的第3 天，添加0 8 硫酸 铵为补充氮源，同时接入安琪酵母种子液5 m l ，并立即将发酵温度转变为3 4 ， 总培养时间为5 天，稻草的乙醇产量可达到0 1 3 e , g 。 关键词：稻草；纤维素；乙醇；分步糖化发酵法；同步糖化发酵法；响应面分 析 i i a b s t r a e t a b s t r a c t c e l l u l o s ei sr e n e w a b l em a t e r i a l sw h i c hq u a n t i t yi sl a r g ei nn a t u r ea n di th a sg r e a t p o t e n t i a lt op r o d u c ee t h a n o la n ds o l v et h ee n e r g yp r o b l e mi nt h ef u t u r e c h i n a i sr i c h i ns t r a wr e s o u r c e s ，s ot h es t u d yo fp r o d u c i n ge t h a n o lb ys t r a wm a t e r i a li so fg r e a t s i g n i f i c a n c e i n t h i sr e s e a r c h ，w ec a r r i e do u tt h ee x p e r i m e n tt oo p t i m i z e t h e s a c c h a r i f i c a t i o nc o n d i t i o no fs t r a wb ys t r e p t o m y c e s pw h i c hw a ss c r e e n e db yo u rl a b a n dh a sh i g ha b i l i t yt os a c c h a r i f ys t r a w w ea s l os c r e e nt h es a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 、s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea s 2 4 5 8a n da n g e ly e a s tf o r t h ey e a s tw h i c h h a s h i g h e s ta b i l i t yt op r o d u c ee t h a n o lb yu t i l i z i n gt h er e d u c i n gs u g a rd e g r a d eb ys t r a w w ec a r r i e do u tt h ee t h a n o lp r o d u c i n ge x p e r i m e n tb ys t r e p t o m y c e s pa n da n g e ly e a s t u s i n gt h ef r a c t i o n a ls t e ps a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o da n ds i m u l t a n e o u s s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o d w eo p t i m i z ef e r m e n t i o nc o n d i t i o n sb y u s i n gs a ss o f t w a r ea n dc o m p a r ew i t he a c ho t h e r a tl a s t ，w eo p t i m i z e t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fe t h a n o lp r o d u c t i o nb ys o l i ds i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o n a n df e r m e n t a t i o nm e t h o d ，a n dc o m p a r ew i t ht h el i q u i ds i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o n a n df e r m e n t a t i o nm e t h o d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 、w i t ht h ee x p e r i m e n t so fs o m es i n g l ef a c t o r sa n da n a l y s i sb yt h es a ss o f t w a r e ， w eo p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si nw h i c hs t r e p t o m y c e s pp r o d u c e sr e d u c i n g s u g a r ：b yt h em e t h o d so fp b ，w ef o u n dt h em o s ts i g n i f i c a n tf a c t o r st h a ta f f e c tt h e p r o d u c t i o no fr e d u c i n gs u g a ra l e a d d i t i o no fs t r a wp o w d e r , p ha n da d d i t i o no f c a l c i u mc h l o r i d e a n dw i t ht h ed e s i g no fb b ，w eg o tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sa sf o l l o w i n g ：s t r o wp o w d e r 7 4 ，b r a n 3 o ，b e a np o w d e r 3 o ，c o r n f l o u r 2 0 ，k h 2 p 0 40 5 ，c a c l 20 7 3 ，p h 6 2 ，i n o c u l u m s i z e2 m l ，3 7 ， f e r m e n t a t i o np e r i o d7 d a y s r e s r u l to ft h i se x p e r i m e n ta r es t e a d yw i t ht h i so p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，t h ey i e l do fr e d u c i n gs u g a ra f t e ro p t i m i z e di s31 3 2 m g m l w h i c hi sa b o u t1 5t i m e so f t h ey i e l di no r i g i n a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 2 、i nt h es t u d yo ft h ea b i l i t yo fp r o d u c i n ge t h n o lb yu t i l i z i n gt h er e d u c i n gs u g a r d e g r a d eb ys t r a wo fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 、s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea s 2 4 5 8 a n da n g e ly e a s t ，w ef i n dt h a tt h ea n g e ly e a s th a st h eh i g h e s ta b i l i t yo fp r o d u c i n g i i i a b s t r a c t e t h n o l 。t h ee t h a n o li s 5 217 ( v ) a n dt h ea m o u n to fr e s i d u a ls u g a ri s 10 19 m g m l i nt h es t u d yo fi n f l u e n c eb ya d d i t i o n a lk i n d so fn i t r o g e ns o u r c e st ot h e e t h a n o ly i e l dt h a ta n g e ly e a s tp r o d u c e ，w ef i n dt h a tt h ee t h a n o ly i e l di sh i g h e s ta n d r e s i d u a ls u g a ri sl o w e s tb yu s i n ga m m o n i u ms u l f a t ea st h en i t r o g e ns o u r c e s ，s o a m m o n i u ms u l f a t ei ss e l e c t e da st h ea d d i t i o n a ln i t r o g e ns o u r c e si nf u r t h e rs t u d y 3 、a f t e ras e r i e so fs i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t sa n dr e s p o n s es u r f a c ee x p e r i m e n tt o o p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fe t h a n o lp r o d u c t i o nu s i n g s t r a wb yf r a c t i o n a l s t e ps a c c h a f i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o d ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s a r e a sf o l l o w s ：s t r o wp o w d e r 7 4 ，b r a n 3 o ，b e a np o w d e r 3 0 ，c o r nf l o u r 2 o ， k h 2 p 0 40 5 ，c a c l 20 7 3 ，p h6 2 ，i n o c u l a t et h es e e dl i q u i do fs t r e p t o m y c e s p ， i n o c u l u ms i z e2 m l ，3 7 ，f e r m e n t a t i o np e r i o d7 d a y s a d do 8 a m m o n i u ms u l f a t e t h e na a j u s tt h ep ht o5 3a n ds t e r i l i z e i n o c u l a t et h es e e dl i q u i do fy e a s t ，i n o c u l u m s i z e4 m l f e r m e n t e1 9d a y su n d e r3 2 3 c t h ey i e l do fe t h a n o li s6 4 1 w h i c hi s 1 19t i m e so ft h ey i e l di no r i g i n a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 4 、b vt h em e t h o d so fp b ，w ef o u n dt h em o s ts i g n i f i c a n tf a c t o r st h a ta f f e c tt h e p r o d u c t i o no fe t h a n 0 1b ys i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o da r e a d d i n go fy e a s ti n o c u l u m ，t h et i m ei n o c u l a t ey e a s ts e e dl i q u i da n dt h ef e r m e n tt i m e t h ey e a s tn e e d a n dw i t ht h ed e s i g no fb b ，w eg o tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sa sf o l l o w i n g ：s t r o wp o w d e r 7 4 ，b r a n 3 0 ，b e a np o w d e r 3 0 ，c o m f l o u r 2 o ，k h 2 p 0 40 5 ，c a c l 2o 7 3 ，p h5 5 ，i n o c u l a t e t h es e e dl i q u i do f s t r e p t o m y c e s p ，i n o c u l u ms i z e2 m l ，37 c ，f e r m e n t a t i o np e r i o d3 2 d a y s a d d1 0 a m m o n i u r ns u l f a t ea n di n o c u l a t et h es e e dl i q u i do fy e a s t ，i n o c u l u ms i z e1 8 m l ， f e r m e n t e4 2d a y su n d e r3 4 n l ey i e l do fe t h a n o li s7 5 2 w h i c hi s1 17t i m e so f t h ey i e l di no r i g i n a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 5 、c o m p a r et h eo p t i m i z e d r e s u l t so fp r o d u c i n ge t h a n o lb yf r a c t i o n a ls t e p s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o da n ds i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n d f e r m e n t a t i o nm e t h o d ，w ec a nf i n dt h a ts i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n m e t h o dh a ss o m ea d v a n t a g e s ：t h ee t h a n o ly i e l db yf r a c t i o n a ls t e ps a c c h a r i f i c a t i o na n d f e r m e n t a t i o nm e t h o da f e ro p t i m i z ei s6 41 w h i l et h ee t h a n o ly i e l db ys i m u l t a n e o u s s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o da f e ro p t i m i z ei s7 5 2 w h i c hi s1 1 7t i m e s t h a nt h ef o r m e r t l l ec y c l eo ff r a c t i o n a ls t e ps a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o d i v a b s t r a c t i s8 9 d a y sa n dt h ei n o c u l u ms i z eo fy e a s ti s4 m lw h i l et h ec y c l eo fs i m u l t a n e o u s s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o di s7 4 d a y sa n dt h ei n o c u l u ms i z eo fy e a s ti s 1 8 m l t h es i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o dr e d u c et h e f e r m e n t i o nc y c l e1 5 d a y sa n dm o r et h a nh a l fo fy e a s ti n o c u l u ma m o u n t s ot h e s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o i la n df e r m e n t a t i o nm e t h o dr e d u c et h ep r o d u c t i o nc y c l e s i g n i f i c a n t l ya n dr e d u c e st h ec o s to fp r o d u c t i o n 6 、a f t e ras e r i e so fs i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t st oo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so fe t h a n o lp r o d u c t i o nu s i n gs t r a wb ys o l i ds i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o n a n df e r m e n t a t i o nm e t h o d ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：r a t i o o fm a t e r i a lt ow a t e r l ：3 ，p h5 0 ，i n o c u l u ms i z e3 m l ，i n o c u l a t et h es e e dl i q u i do f y e a s t t h et h i r dd a ya f t e ri n o c u l a t et h es e e dl i q u i do f s t r e p t o m y c e s p a d do 8 a m m o n i u m s u l f a t ea n dc h a n g et h et e m p e r a t u r et o3 4 * ( 2a ss o o na si n o c u l a t et h es e e dl i q u i do f y e a s t t h et o t a lc u l t u r et i m ei s5d a y sa n dt h ey i e l do fe t h a n o li s0 13 9e t h a n o l g k e y w o r d s ：s t r a w ；c e l l u l o s e ；e t h a n o l ；f r a c t i o n a ls t e ps a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n m e t h o d ；s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o d ； r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s v 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谓 的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：彳豪跟喧 签字日期：砂譬年，) 月协日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名( 手写) ：彳荠浓重 签字日期：洳9 年侄月沙日 导师签名( 手写) ： f 伞友 签字日期：妒驴年j y 月日 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 秸秆纤维素生产乙醇的研究意义 随着现代工业的发展和世界人口的激增，能源危机日趋加剧。专家估计， 可开采石油储量仅还可供人类使用大约5 0 年，天然气还可用7 5 年，而煤炭则为 2 0 0 3 0 0 年f i 】。目前，世界各国纷纷展开对新能源，特别是可再生生物能源的研 究与开发。生物能源主要有生物乙醇、生物柴油、沼气、氢气和燃料电池等，其 中以生物乙醇的研究与生产最引人注目。生物法生产的乙醇在一些国家和地区 正广泛使用。巴西每年以甘蔗作为原料，生产1 1 0 0 万吨燃料乙醇。美国则每年 大约生产5 5 0 万吨以上的燃料乙醇。目前我国乙醇年产量为3 0 0 多万吨，仅次子 巴西、美国，位列世界第- - - t 2 1 ，其中用发酵法生产乙醇占绝对优势，8 0 左右的乙 醇用淀粉质原料，1 0 的乙醇用废糖蜜生产，而以纤维素原料生产的乙醇仅仅约 占2 左右。 纤维素是地球上最丰富的有机物之一，它是一种可以再生的资源，每年仅 陆生植物就可以产生纤维素约5 0 0 亿吨；纤维素资源还是最主要的生物质资源， 它占地球生物总量的6 0 8 0 。我国的纤维素原料非常丰富，仅农作物秸秆、 皮壳一项，每年产量就达7 亿多吨，其中玉米秸3 5 、小麦秸2 1 和稻草4 9 是 我国的三大秸秆，林业副产品、城市垃圾和工业废物数量也很可观。我国大部 分地区依靠秸秆和林副产品作燃料，或将秸秆在田间直接焚烧，不仅破坏了开 展纤维素类再生资源转化生产乙醇等产品的生态平衡，污染了环境，而且由于 秸秆燃烧的能量利用率低，造成资源严重浪费1 3 】。 尽管乙醇燃烧时产生的热能比汽油低( 乙醇为2 2 1 m j l 、汽油为3 4 3 m j l ) ， 但它是可再生的能源，具有环保特性，是汽油所不能比拟的；乙醇的辛烷值比 汽油高许多，既是抗爆剂，又是助燃剂，所以用乙醇作燃料不用再添加4 乙基铅 或m t b e ，就可成为高标号燃料油，可减少大气中铅的污染。用乙醇作燃料不会 增加大气中二氧化碳含量，可显著缓解地球温室效应以及改善地球气候环境。 自上个世纪以来，随着世界人口的增加及更多国家的工业化，能源消耗也 日趋增加。面对即将到来的能源危机，世界许多国家的研究机构，已深入开展 纤维素类再生资源转化生产乙醇等产品的研究工作。美国、日本等国都已进行 第1 章绪论 了万吨以上纤维素物料生产乙醇工厂的初步工程设计。经济分析结果显示，纤 维素物料生产乙醇的成本已接近以粮食为原料生产乙醇的成本，但至今尚未有 工业化装置的建成。 我国政府也已将纤维素发酵生产乙醇引入国家发展计划，2 0 0 0 年9 月国务院 正式批准了在国内发展燃料乙醇试点。利用废弃纤维素物质代替粮食生产乙醇 的研究工作方兴未艾，前景广阔。 1 2 秸秆的化学组份 秸秆主要由纤维质原料构成，其中主要是纤维素( 3 7 4 0 ) 、半纤维素 ( 3 0 3 5 ) 和木质素等成分1 4 。 纤维素分子是由葡萄糖苷通过d 1 ，4 糖苷键联接起来的链状聚合体。纤维素 具有( c 6 h 1 2 0 5 ) 。h 2 0 的结构式，其分子量、聚合度根据种类及测定方法的不同有 较大的差别。植物纤维素结构复杂，基本上是由原纤维构成的微纤维束集合而 成。原纤维是由1 5 4 0 根有结晶部和非结晶部构成的纤维分子长链。纤维素的结 晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折叠排列而成的。在结晶部分里， 葡萄糖分子的羟基或在分子内部或与分子外部的氢离子相结合，没有游离的羟 基存在，所以纤维素分子具有牢固的结晶构造，酶分子及水分子难以侵入到内 部中。因此，纤维素的结晶部分比非结晶部分难分解得多【5 】。 半纤维素是有不同的多聚糖构成的混合物。这些多聚糖由不同的单糖聚合 而成，有直链也有支链，上面连接着不同数量的乙酰基和甲基。半纤维素的水 解产物包括两种五碳糖( 木糖和阿拉伯糖) 和三种六碳糖( 葡萄糖，半乳糖和 甘露糖) 。各种糖所占比例随原料而变化，一般木糖占一半以上，以农作物秸秆 和草为水解原料时还有相当量的阿拉伯糖生成( 可占五碳糖的1 0 2 0 ) 。半纤 维素的聚合度较低，所含糖单元数在6 0 2 0 0 ，也无晶体结构，故它较易水解， 在l o o 左右就能在稀酸罩水解，也可在酶催化下完成水解。但因生物质里的半 纤维素和纤维素互相交织在一起，故只有当纤维素被水解时，半纤维素才能完 全水解。 木质素是植物界中仅次于纤维素的最丰富和最重要的有机高聚物。木质素 是一类由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接的复杂无定型物。它和半纤维素一 起作为细胞间质填充在细胞壁的微细纤维之间，加固木化组织的细胞壁；它也 2 第1 章绪论 存在于细胞间层，把相邻的细胞粘结在一起。木质素和半纤维素形成牢固的结 合层，紧紧地包围着纤维素，阻碍酶与纤维素的接触。因此，要提高糖化速度， 必须除去木质素、半性纤维素的结合层，使纤维素的孔隙增大，提高纤维素与 酶接触的有效比表面积，从而提高糖化速度。 1 3 纤维素发酵生产乙醇的概述 1 3 1 纤维素发酵生产乙醇微生物 1 3 1 1 可产纤维素酶糖化纤维素的微生物 自然界可产纤维素酶的微生物主要有细菌、放线菌、真菌。细菌中产酶活 力较强的菌有纤维黏菌属、生孢纤维菌属和纤维杆菌属。但细菌纤维素酶产量 低，而且所产纤维素酶一般都存在于胞内或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液 中，所以很少用作工业生产菌种。放线菌中产酶活力较强的菌种有链霉属放线 菌、玫瑰色放线菌、纤维放线菌等【6 l 。真菌纤维素酶产量高，研究较多的是霉菌， 其中产酶活力较强的菌有木霉、曲霉、根霉和青霉【_ 7 1 ，尤以木霉属( t r i c h o d e r m a s p ) 菌种居多，如里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉等是目前公认的生产菌种。目前 研究最清楚的是里氏木霉【8 】，其具有降解纤维素与半纤维素的完全酶系，产生八 种不同的纤维素酶。另外真菌中黑曲霉不产生毒素【9 】，是公认的安全微生物，纤 维素酶应用在食品生产中该类菌占首位。表1 1 是常见的可产纤维素酶的微生物。 表1 1 产纤维素酶的主要微生物 t a b l e1 1m a i n m i c r o o r g a n i s mp r o d u c i n g c e l l u l a s e 分类菌种 zv i r i d e ( 里氏木霉) ，zk o n i n g i i ( 康氏木霉) ， zp s e u d o k o n i n g i i ，zh a r z i a n u m ， zl i g n o r u n ，zl o n g i b r a c h i a t u m , p c i t r i n u m ( 桔梗青霉) ，p f u n i c u l o s u m ( 绳状青霉) ， 真菌( f u n g i )p i r e n s i s ，p j a n t h i n e l l u m ( 微紫青霉) ， p n o t a t u m 啭异青霉) ，尸v e r r u c u l o s u m ( 疣孢青霉) ， a n i g e r ( 黑曲霉) ，a 刀叫淞( 黄曲霉) ， a f o e t i d u s ，a f u m i g a t u s ( 烟色曲霉) ， a o r y z a e ( 米曲霉) ，a 。s a i t o i ， 第l 章绪论 s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e , s c l e r o t i n u mr o l f s i i , 其他 p y r i c u l a r i ao r y z a e ，p h y s a r u mp o l y c e p h a l u m 1 3 1 2 乙醇发酵微生物 乙醇工业上通常采用酿酒酵母( s a c c h a r o m y s e sc e r e v i s i a e ) 或卡尔酵母 ( s c a r l s b e r g e n e s i s ) 进行乙醇发酵，但针对以纤维素酶糖化产物作为碳源，为了把 五碳糖利用起来，有的研究者【1 0 】正在利用假丝酵母( c 口玎以砌) 发酵d 木糖异构化 代谢物d 木酮糖生产乙醇。有的研究者 1 1 , 1 2 , 1 3 】则提倡用嫌气性热纤梭菌 4 第1 章绪论 ( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 、白色瘤胃球菌( r u m i n o c o c u sa l b u s ) 、生黄瘤胃菌 ( r f a r e f a c i e n s ) 来发酵纤维素生产乙醇。 1 3 2 纤维素材料的预处理 纤维素是由b 1 ，4 糖苷键结合成大的分子，纤维素糖链间通过氢键堆积起来， 形成紧密的结晶构造。天然纤维素类物质的组成成分主要有木质素、纤维素和 半纤维素。影响纤维素酶解糖化的因素主要有两个：一是木质素和半纤维素的 空间障碍效应；二是纤维素本身的结晶度和聚合度。这两个因素的综合结果使 纤维素酶分子和纤维素分子之间的亲和性大大降低，从而影响了纤维素酶有效 地将纤维素水解成可利用的糖。因此，要用纤维素类物质作原料发酵生产乙醇， 必须对原料进行预处理。预处理还关系到后续工作和物料转化利用率、产品得 率、成本等。已经和正在研究的主要的预处理方法有：物理法( 微粉碎、电子 射线、x 射线、微波辐射、爆碎法) ；化学法( 臭氧处理、有机溶剂、酸、碱处 理) ；其它微生物学方法。 1 3 3 纤维素的糖化 1 3 3 1 酸法糖化 浓酸糖化：浓酸水解在1 9 世纪即已提出，它的原理是结晶纤维素在较低的 温度下可完全溶解于7 2 的硫酸、4 2 的盐酸和7 7 8 3 的磷酸中，导致纤维 素的均相水解。浓硫酸水解为最常用方法，其主要优点是糖的回收率高，大约 有9 0 的半纤维素和纤维素转化的糖被回收。w i l l i a m a f a r o n e 等【1 4 】人提出的浓 酸水解工艺：生物质原料干燥至含水1 0 左右，并粉碎到约3 - 5 m m 。把该原料 和7 0 7 7 的硫酸混合，以破坏纤维素的晶体结构，最佳酸液和固体质量比为 1 2 5 ：1 ，糖的水解收率达到9 0 左右。浓酸对水解反应器的腐蚀作用是一个重 要问题。近年来在浓酸水解反应器中利用加衬耐酸的高分子材料或陶瓷材料解 决了浓酸对设备的腐蚀问题。浓硫酸法糖化率高，约有8 0 9 0 纤维素能被糖 化，糖液浓度高，但采用了大量硫酸，需要回收重复利用。 稀酸糖化：稀酸水解工艺较简单，是木质纤维素原料生产乙醇的最古老的 方法，也是较为成熟的方法。革新的稀酸水解工艺采用两步法【”】。第一步稀酸 水解在较低的温度下进行，半纤维素非常容易被水解得到五碳糖产物，分离出 液体( 酸液和糖液) 。第二步酸水解是在较高的温度下进行，重新加酸水解残留固 5 第1 章绪论 体( 主要为纤维素结晶结构) ，得到水解产物葡萄糖。主要工艺为【l6 1 ：木质纤维原 料被粉碎到粒径2 5 c m 左右，然后用稀酸浸泡处理，将原料转入一级水解反应器， 温度1 9 0 ，0 7 硫酸水解3 分钟。可把约2 0 纤维素和8 0 半纤维素水解。 水解糖化液经过闪蒸器后，用石灰中和处理，调p h 后得到第一级酸水解的糖化 液。将剩余的固体残渣转入二级水解反应器中，2 2 0 ，1 6 硫酸处理3 分钟。 可将剩余纤维素中约7 0 转化葡萄糖，3 0 转化为羟基糠醛等。经过闪蒸器后， 中和，得到第二级水解糖液。合并两部分糖化液，转入发酵罐，经发酵生产得 到乙醇等产品。在稀酸水解中添加金属离子可以提高糖化收率。金属离子的作 用主要是加快水解速度，减少水解副产物的发生。近年来，f e 离子的助催化作 用的研究令人关注。q u a n g a n g u y e n l l 。7 1 等人详细研究了f e 离子的催化效果。华 东理工大学等单位也对二价f e 离子的催化效果进行了详细研究。总的说来，稀 酸水解工艺糖的产率较低，一般为5 0 左右，而且水解过程中会生成对发酵有 害的副产品。 1 3 3 2 酶法糖化 纤维素酶是一种多组分的复合酶，包括内切型葡聚糖酶( c x 酶、c m c 酶) 、 外切型葡聚糖酶( c 1 酶、微晶纤维素酶) 和纤维二糖酶( d 一葡萄糖苷酶) 等3 种主要组分【博l 。天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠这3 种组分的协 同作用才能完成【1 9 】。纤维素大分子的物理结构是由分子链排列整齐、紧密的结 晶区和结构疏松但取向大致与纤维主轴平行的无定形区交错结合的体系。在纤 维素水解过程中，首先由内切型d 葡聚糖酶优先在纤维素聚合物的内部起作用， 在纤维素的无定形区进行切割，产生新末端，生成较小的葡聚糖；然后再由外 切型b 葡聚糖酶作用于末端基释放出纤维二糖和其他更小分子的低聚糖；最后 由b 葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖分子【2 0 】。纤维二糖的积累对于内切和 外切葡聚糖酶的催化作用有强烈的抑制影响，解除该抑制作用是实现纤维性材 料完全酶解的重要条件。纤维素酶吸附于纤维素表面是纤维素发生水解的必需 条件，纤维二糖并不影响纤维素酶的吸附，但它可结合在外切型p 葡聚糖酶活 性部位附近的色氨酸残基上形成“位阻效应”，阻止纤维素分子链进入活性中心， 造成纤维素酶对纤维素的“无效吸附 【2 。 1 3 4 乙醇发酵的机理研究 酵母的乙醇发酵机理已经很清楚，乙醇工业上通常采用酿酒酵母进行乙醇 6 第1 章绪论 发酵，使用葡萄糖通过e m p 途径脱羧成丙酮酸，丙酮酸脱羧成乙醛，再在醇脱 氢酶的作用下被n a d h 2 还原成乙醇。 纤维素乙醇发酵主要分为两个阶段：第一阶段是纤维素在纤维素酶的作用 下降解为葡萄糖；第二阶段为葡萄糖经发酵生成乙醇，其中第一阶段尤为重要。 g i b b s 和d e m o s s 等【1 2 】用同位素标记法研究运动发酵单胞菌( z y m o n o n t l $ m o b i l i s ) 的乙醇发酵机理，发现不是通过e m p 途径，而是通过第三条糖代谢途 径即e d ( e n