（化学工艺专业论文）β环糊精衍生物的合成及其在毛细管电泳手性拆分中的应用.pdf

l ij 东大学硕士学位论文 摘要 手性对映体的存在是自然界中的一种普遍现象，在药物化学领域表现尤为突 出。手性药物对映体的分离具有非常重要的意义，已经成为现代分析化学领域广 泛研究的课题之一。毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 技术因其分离效 率高、需样量少、操作模式多样化、环境污染少、应用范围广等优点受到众多科 学工作者的关注。 使用手性选择剂分离药物对映体仍然是c e 手性拆分的重要方法，发展和研 究新型手性选择剂是手性分离领域的重点。目前，环糊精( c y c l o d e x t r i n s ，c d ) 及其衍生物是c e 中应用最为广泛的手性选择剂。然而，天然环糊精受其分子键 合能力和水溶性等物理化学性能的限制，在手性分离上具有一定的局限性，经改 性的环糊精衍生物则具有以下特点： 1 环糊精分子外缘的羟基衍生化后，其水溶性增加，空腔尺寸与物化性质 也有所改变； 2 能与客体分子产生不同的作用，配位能力提高； 3 若衍生化取代基带电荷，则产生的静电作用也可使手性识别能力有所增 强，即带电环糊精可分离电中性和带电的手性药物。 因此，环糊精衍生物应用于手性药物的拆分研究是一项具有挑战意义的课 题。 本论文主要由三部分组成，其具体内容如下： 首先，系统阐述了毛细管电泳在手性拆分方面的研究进展，并对手性拆分理 论、应用及其操作模式等做了简单介绍。 其次，参照有关文献合成了两种新型的环糊精衍生物。利用丙交酯的开环聚 合反应，将低聚乳酸基团修饰于d 环糊精上，得到了水溶性良好、可生物降解的 6 - 0 一低聚乳酸基一p 一环糊精( 6 - o l i g o ( d ，l - l a c t i ca c i d ) 一p c y c l o d e x t r i n ，6 - o l a - 1 3 一c d ) ； 采用“合成一脱保护一锅法”将完整的甜菜碱内盐结构连到p 一环糊精上，得到 了6 - 0 一( 2 羟基一3 - 甜菜碱基丙基) - 1 3 - 环糊精( 6 o 一( 2 一h y d r o x y l - 3 - b e t a i n y l p r o p y l ) 1 3 一 c y c l o d e x t r i n ，6 - h b p - 1 3 一c d ) 。 最后，以1 3 - c d 、h p d c d 及合成的两种新型环糊精衍生物为手性选择剂对 i i i 东大学硕十学位论文 酮替芬、扑尔敏、特布他林、普萘洛尔等药物对映体进行了手性拆分。研究了环 糊精浓度对分离的影响，同时考察了运行电压和背景电解质p h 值对手性拆分的 影响。 关键词：毛细管电泳；环糊精衍生物；手性拆分；手性药物 l l i ij 东大学硕十学位论文 a b s t r a c t c h i r a l i t yi so n eo fp r e v a l e n tc h a r a c t e r si nu n i v e r s e ，i n v o l v i n gb i o l o g i cs u r v i v a la n d e v o l v e m e n t w i t hf u r t h e rr e s e a r c hd o n ef o rp h a r m a c o l o g i c a lp r o p e r t i e s ，d i f f e r e n c e s h a v e b e e nr e c o g n i z e di np h y s i o l o g i c a le f f e c ta n dm e t a b o l i s mo fap a i ro fe n a n t i o m e r s o fc h i r a ld r u g s b e c a u s eo ft h ee x c e e d i n g l ys i m i l a rp h a r m a c o l o g i c a lp r o p e r t i e s ， e n a n t i o m e r sh a v ee x t r a o r d i n a r yd i f f i c u l t i e si ns e p a r a t i o n d u et ot h ev i r t u e so fh i g h s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , r a p i da n a l y s i s ，g o o ds e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t y , l o wc o n s u m p t i o n o fs a m p l e sa n da u t o m a t i z a t i o n ，h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) h a sb r o a d a p p l i c a t i o ni nt h ea n a l y s i sf i e l do fe n a n t i o m e r so f c h i r a ld r u g s s u c c e s s f u lc h i r a ls e p a r a t i o nl i e si n c h o o s i n ga c c u r a t ec h i r a l s e l e c t o r ，c u r r e n t r e s e a r c hi ss t i l lf o c u so nf i n d i n ga n ds y n t h e s i z i n gn e wc h i r a ls e l e c t o r s c y c l o d e x t r i n s ( c d s ) i n c l u d i n gn a t i v ea n dd e r i v a t i z e dc d sa r ea m o n gt h ew i d e l yu s e dc h i r a l a d d i t i v e si nc e h o w e v e r , t h e r ea r es o m el i m i t st ot h en a t i v ec d si nt h e i rs o l u b i l i t y a n dp h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e sf o r c h i r a l s e p a r a t i o n c dd e r i v a t i v e s e x h i b i t d i f f e r e n tp r o p e r t i e sc o m p a r e dt ot h en a t i v eo n e si nt h ef o l l o w i n g ： 1 i m p r o v e ds o l u b i l i t y ； 2 p o s s i b i l i t yf o rd i f f e r e n tb o n d sw i t ha n a l y t e st h a tc a ni m p r o v et h ei n c l u s i o n - c o m p l e x a t i o n ； 3 t h ec h a r g e dc d sc a ns e p a r a t eu n c h a r g e da n dc h a r g e dc h i r a ld r u g s s ot h ec h i r a l s e p a r a t i o nu s i n gc d sd e r i v a t i v e si so n eo ft h ec h a l l e n g i n gs u b j e c t s t h ed i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ft h r e ep a r t s 。 i nc h a p t e ro n e ，t h ed e v e l o p m e n to fc h r i a ls e p a r a t i o nb yc ew a sr e v i e w e d ，i n c l u d i n g t h e o r e t i c a ls t u d i e s ，a p p l i c a t i o n sa n dd i f f e r e n to p e r a t i n gm o d e l s i nc h a p t e rt w o ，t w om o d i f i e di 3 - c dw e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e d b a s e do n t h er i n g o p e n i n gp o l y m e r i z a t i o no f3 ，6 - d i m e t h y l - 1 ，4 - d i o x a n e - 2 ，5 - d i o n e ( 1 a c t i d e ) ， 6 - o l i g o ( d ，l l a c t i ca c i d ) 一p - c y c l o d e x t r i n ( 6 一o l a p c d ) w a sg o t t e nb ym o d i f i c a t i o n o fo l i g ol a c t i ca c i dg r o u po n1 3 - c y c l o d e x t r i n 6 - o 一( 2 一h y d r o x y l - 3 - b e t a i n y l p r o p y l ) 一p - c y c l o d e x t r i n ( 6 - h b p - p c d ) w a sp r e p a r e db ya “s y n t h e s i s - d e p r o t e c t i o no n ep o t ” i i i 1 li 东大学硕士学位论文 m e t h o dw i t ht h ei n t e n t i o no fp r o d u c i n gu s e f u lf u n c t i o n a lm o d e l sa n de n h a n c e d p e r f o r m a n c ec h a r a c t e r i s t i c s i nc h a p t e rt h r e e ，i b - c d ，h p - d c da n dn o v e lf l - c dd e r i v a t i v e sw e r es e l e c t e da st h e c h i r a ls e l e c t o rf o rt h e s e p a r a t i o n o f k e t o t i f e n ，c h l o r p h e n a m i n e ，t e r b u t a l i n e ， p r o p r a n o l o l ，e t c e f f e c to ft h ec o n c e n t r a t i o no ft h ec h r i a l s e l e t o r sw a sr e v i e w e d ，a s w h i l ea st h ea p p l i e d v o l t a g ea n dd i f f e r e n tp ho fb a c kg r o u n de l e c t r o l y t e s k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e ；c h i r a ls e p a r a t i o n ； c h i r a ld r u g i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：摧四隍耻 日 期：j q l l 厶孕一 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：毖旌固导师签名：蹦日 期： 山东大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章毛细管电泳手性分离的研究及进展 手性问题牵涉到生命的起源及各种动植物的生存和演化，有手性的分子在人 类的生命活动中起着极为重要的作用。立体化学中，互为镜像且不能叠合的分子 定义为手性分子( c h i r a lm o l e c u l e ) ，又称对映异构体( e n a n t i o m e r ) ，它有使平 面偏振光发生偏转的光学活性一旋光性。如果具有药理活性的药物的分子结构中 存在手性因素，且只含有效对映体或以有效对映体为主，则可称该药物为手性药 物。生物机体和药物的特异性化学反应与药物的分子结构密切相关。含有手性中 心的药物，其异构体通常具有极为相近的理化性质，但药理作用却存在着差异： 往往一种立体异构体有药效而它的镜像分子却药效很小，甚至完全没有药效或具 有毒副作用。比如镇静剂沙力度胺( t h a l i d o m i d e ) ，其有效成分是r 一异构体，具 有良好的镇静作用，而它的s 异构体却有致畸作用i l l 。 据不完全统计，现有的1 3 2 7 种合成药物中含有手性中心的有5 2 8 种，接近 4 0 ，以外消旋体形式销售的手性药物几乎高达8 8 。美国食品和药物管理局于 1 9 9 2 年规定，今后凡发展具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分的结果，必 须测定每个药物的立体异构体的组成，对每个异构体的药理学活性都要有比较， 特别是新药的报批都应有这些材料【2 1 。因此，将对映异构体拆分成具有光学活性 的化合物具有巨大的社会效益和经济效益，从而成为手性化合物研究的热点和前 沿。 目前手性拆分的方法主要有以下几种【3 】：化学拆分、生物拆分、动力学拆分 和不对称合成以及色谱分离法。这几种方法各有优缺点：普遍被采用的化学拆分 法过程冗长，产率和旋光纯度都达不到要求，且适用的化合物类型不多；生物拆 分法适用于环保要求，但可利用的酶品种有限、不易保存且价钱昂贵；动力学拆 分应用的较为广泛，但对映体纯度较低；手性固定相高效液相色谱是色谱拆分中 应用最多的一种，但柱子价格昂贵、性能往往比普通液相柱低、应用范围较窄， 通常需要几类不同的手性液相柱来满足某一特定的分析要求【4 】。 与这些传统方法相比，2 0 世纪8 0 年代发展起来的毛细管电泳( c a p i l l a r y 1 l l 东大学硕十学位论文 e l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 【5 1 分析技术，由于其分离模式多、分离效率高、速度快、费 用低等优点已在药物、生物大分子、临床医学等领域中得到了广泛的应用。 1 2 毛细管电泳技术 1 2 1 毛细管电泳的发展简介 毛细管电泳是2 0 世纪8 0 年代后期迅速发展起来的一项液相分离分析新技 术，是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。它使分析科学从微升 水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。随着商品化仪 器的出现及c e 仪器和各种检测器的联用，c e 技术快速渗透到与分析化学相关的 各个领域，其发展历史见表1 2 1 。 表1 2 i毛细管电泳发展史 t a b l e1 2 1 h i s t o r yo ft h ed e v e l o p m e n to fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 年份毛细管电泳发展状况文献 2 h j e r t e n 首次提出毛细管电泳技术，利用内壁涂有甲基纤维素、内径为 1 9 6 7 3 0 0 p m 的玻璃毛细管成功地对金属离子进行了分离检测，并把这种模 式称为毛细管区带电泳。 m i k k e r s 等使用细内径为2 0 0 p m 的聚四氟乙烯毛细管实现了毛细管区 1 9 7 9 带电泳分离1 6 中有机酸，获得了小于1 0 岬的柱效。 j o r g e n s o n 和l u k a c s 发展了电色谱技术，指出在以电渗流作推动力的 1 9 8 1 情况下，固定相的填充不规则性对样品区带展宽并不重要。 j o r g e n s o n 和l u k a c s 首次使用内径为7 5 i t m 的石英毛细管和3 0 k v 的高 1 9 8 1 电压，获得了高于4 0 万理论塔板数的分离柱效，他们的研究使c z e 取得了突破性进展，同时奠定了毛细管电泳的理论基础。 t e r a b e 等发展了基于组分疏水性差异而实现中性化合物分离的毛细 1 9 8 4 管胶束电动色谱。 h j e r t e n 将两性电解质引入毛细管电泳中，发展了基于等电点不同而分 1 9 8 5 离的毛细管等电聚焦电泳，使其成为分离蛋白质的重要方法之一。 1 j 1 j 1 j 1 j r 嘲 网 网 网 m i 一 山东大学硕士学位论文 我国是丌展毛细管电泳研究较早的国家之一，国内的研究首先由竺安教授于 1 9 8 0 年开始。他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建立了两个研究组， 并从1 9 8 6 年开始陆续在有关会议和杂志上发表研究结果，其中关于红细胞毛细 管区带电泳【1 5 】，扁形毛细管区带电泳【1 6 】、低背景毛细管凝胶电泳和毛细管梯度 凝胶电泳 1 7 , 1 s 等具有理论和实际意义。尤其是近年来，我国在基础研究、仪器研 制以及实际应用等方面都有了长足进展。 1 2 2 毛细管电泳分离的基本原理 毛细管电泳的基本原理1 19 】是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道， 依据样品中各组分之间的电泳淌度( 即溶质在单位时间间隔内和单位电场下移动 的距离) 或分配行为的差异而实现的液相分离技术，其基本结构见图1 2 2 。 图1 2 2 毛细管电泳示意图 f i g u r e1 2 2 t h ed e v i c eo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 毛细管和电极槽首先充有相同组分和浓度的背景电解质溶液。样品从毛细管 iji 东大学硕十学1 _ 7 = 论文 进样端导入，在毛细管两端加上电压后，荷电溶质便朝与其电荷极性相反的电极 方向移动。若样品组分淌度不同则迁移速度不同，一定时间后各组分按其淌度大 小依次通过检测器被检测出，得到按时间分布的电泳图，根据谱峰的迁移时间和 峰面积或峰高即可进行定性和定量分析。 电泳用的毛细管通常内径为2 5 1 0 0 p m ，外径一般为弹性聚酞亚胺外涂层的 熔融石英管。毛细管电阻高，能应用于高电场( 1 0 0 - - - 1 0 0 0v c m ) ，缩短了分析 时间；大的表面积体积比能有效扩散所产生的热量，避免对流，提高了分离效 率。当石英毛细管中充入p h 值 2 5 的背景电解质溶液时，管壁的硅羟基一s i o h 开始部分解离使其内表面带负电荷。在静电引力的作用，电解质溶液中的阳离子 被吸引到管壁附近，并在一定距离内形成阳离子相对过剩的扩散双电层( s t e m 层和扩散层) 。在外加电场作用下，电双层中的水合阳离子引起流体整体地向阴 极流动，形成电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w , e o f ) 。组分的流出时间取决于电渗 速度和电泳速度的矢量和，一般电渗方向从阳极到阴极且电渗速度大于电泳速 度，因此组分中的阳离子、中性分子、阴离子都能同时检出。毛细管中e o f 另 一重要特征是塞状流，流速在整个横截面上几乎相等，平流型与高效液相色谱中 泵驱动产生的抛物流形不同，它不直接引起组分区带扩散，这是毛细管电泳获得 高分离度的重要原因之一。 1 2 3 毛细管电泳的分离模式 通过对毛细管及其填充物进行修饰、更换或改进，可以创造出各种不同的分 离模式，表1 2 3 列出了一些毛细管电泳分离模式。可以按操作方式重新分为手 动、半自动及全自动型毛细管电泳，或按分离通道形状分为圆形、扁形、方形毛 细管电泳等等。 毛细管电泳的多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会，这对复杂样 品的分离分析是非常重要的。对于带电荷的化合物，往往采用毛细管区带电泳 ( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) i 2 0 1 ，而对于不带电荷的中性化合物，一般 采用胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a rm l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e c c ) i 2 1 】。c z e 和m e c c 是手性药物拆分的两种常用操作模式，其中以c z e 的应用最为广泛【2 2 1 。 4 山东大学硕十学位论文 表1 2 3 毛细管电泳的分离模式 t a b l e1 2 3 s e p a r a t i o nm o d e so fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 1 2 4 毛细管电泳的进样技术 毛细管进样量极微，最小可达纳升级，这固然可以满足分析微量试样的要求， 但也给进样技术提出了更高的要求【2 3 1 。不仅要求进样准确性高、重现性好，而 l ii 东大学硕士学位论文 且所迸的样品组成要与原样品组分有一致性，避免样品失真。目前，进样技术主 要有电动力进样、流体动力进样、扩散进样、进样阀进样、电分流进样等。其中， 电动力进样和流体动力进样是最常用的两种方法。 电动力进样受较多因素的影响，如进样时间、进样电压、样品溶液组成、组 分的性质以及环境温度等。虽然它的重现性还不尽如人意，但由于操作简便，可 以利用堆积效应富集样品，而且可用于高粘度样品及毛细管凝胶电泳的进样，所 以仍是毛细管电泳常用的进样方式。与电动力进样相比，流体动力进样基本不受 溶液组成和组分性质的影响，由易受控制的压差和迸样时间决定，因而重现性较 好，是目前毛细管电泳中最常见的进样方法。 1 2 5 毛细管电泳的检测技术 毛细管电泳技术的广泛应用与深入发展所面临的主要挑战是高灵敏度和多 模式检测器的发展。为了适应毛细管电泳微体积柱上检测的要求，人们在检测方 法和检测器方面进行了大量研究【2 4 】。目前己经商品化的检测器中，光学检测器 ( 紫外、二极管阵列、荧光) 的发展较为成熟，电化学检测器及放射性同位素检 测器已开始应用。利用毛细管电泳时应根据所分析物质的特点选用相应的检测方 法，以扬长避短。常用毛细管电泳检测器的一般性能及简要特点见表1 2 5 。 6 表1 2 5 常用毛细管电泳检测器及其性能 t a b l e1 2 5p e r f o r m a n c eo fc o m m o n l yu s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t o r s 化学检侧 i i 东大学硕士学位论文 安培检测器 电导检测器 折射率检测器 同位素检测器 1 0 母1 0 刁 l o s 1 矿 1 0 7 l o 巧 l o 一1 0 。7 灵敏度高，有选择性 通用性好 通用性好 选择性强，需同位素标记 间接紫外 间接荧光直接检测的1 0 。2 1 0 。1 间接安培 1 2 6 毛细管电泳技术的前景展望 毛细管电泳是分析化学中不断发展的一种技术，今后将向快速、准确、小型 化、自动化及多管系统等方面发展，并可通过以下几个方面加以改进： 1 柱系统的改进。通过新型介质的采用进一步减少进样量，提高分离效果； 与各种梯度( 包括温度梯度、电压梯度、电导梯度、p h 梯度及电解质梯度) 法 联用，可以得到更快、更好的分离纯化效果。 2 前处理及进样技术的改进。使用各种预浓缩法弥补浓度检测限的不足， 如堆积法、场放大、等速电泳法、等电聚焦法、电压极性切换法和固相预柱浓缩 法等。 3 毛细管电泳方法本身和仪器的改进。以建立新的分离模式、组合式毛细 管电泳联用技术及发展毛细管电泳检测器为重点。如集成毛细管电泳芯片 ( i n t e g r a t e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p s ，i c e c ) 2 5 - 3 8 】、阵列毛细管电泳 ( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) 以及c e m s1 2 9 1 、c e - n m r 3 0 1 、c e m s m s 联用技术等。与其它技术联用，可以充分利用毛细管电泳的高分离效率和核磁共 振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ，n m r ) 或质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y , m s ) 的高 灵敏度与定性鉴别能力，达到快速完成众多复杂成分的分离和结构测定的目的。 化学计量学是分析化学的另一新兴领域，在毛细管电泳的分离分析中己有应 用【3 0 1 。李关宾等【3 2 1 就这一领域的进展加以综述，认为化学计量学是毛细管电泳 理论研究方面极其有效的工具，有助于开拓新的应用领域。 毛细管电泳分析简单、迅速，只要在电泳液中添加适当的手性分子识别剂， 就能获得满意的分离分析结果。随着毛细管电泳手性分离机理的不断研究，毛细 7 山东大学硕士学佗论文 管电泳手性分离技术的不断完善，以及各类手性选择剂的不断开发利用，毛细管 电泳在手性药物的分离分析方面将具有更加广泛的应用前景。 1 3 毛细管电泳手性分离的基本策略 根据实验和有关文献，毛细管电泳手性分离有两种基本策略，即“间接分析 和“直接分析”。 间接分析是让对映体通过共价键和手性试剂作用形成一对非手性异构体，既 不导致外消旋，也不会出现动力学上的歧视，从而可以使用普通的毛细管电泳法 进行分析。间接分析的优点是衍生化形成非对映异构体的理化性质差异大，适合 于色谱分析，提高分离度，且衍生化产物具有发光或荧光基团，便于检测和提高 检测灵敏度。这一方法是否成功决定于找到一个好的衍生化试剂，而且手性分子 上要有可以反应的官能团。但是衍生化降低了分析方法快速、准确、精密和简便 方面的指标，所需的高纯度手性试剂价格昂贵，产物的手性也可能不能恢复。 直接分析是在分析过程中引入手性环境，样品通过手性相互作用来改变迁移 速度，最终获得分离。手性环境可以通过三种方法构建，即手性添加剂、手性填 充毛细管和手性涂层毛细管。其中手性填充毛细管和手性涂层毛细管需要特别的 制作方法，推广有一定的难度，而且重现性较差。手性添加剂法只需向电泳缓冲 液中加入合适的手性选择剂，使对映体分子与手性选择剂形成过渡性非手性异构 体分子的络合物。如果形成的两个非对映异构体具有不同的结合常数，则两个分 析物的迁移速率不同，从而实现分离。本方法不触及样品本身，已被普遍采用并 迅速发展。直接分析的关键是使对映体有足够大差异的手性环境，以及高的分离 效率，选择剂的手性纯度只影响分离度。实验证明，当手性选择剂中含有1 0 的杂质时，对映体仍可获得很好的分离。常用的手性选择剂及其应用举例见表 13 。 8 山东大学硕十学位论文 表1 3 常用的手性选择剂及其应用举例 t a b l e1 3 c o m m o n l yu s e dc h i r a ls e l e c t o r sa n da p p l i c a t i o ne x a m p l e s 迄今为止，在手性药物的拆分中，基于主客体配合物形成手性识别的环糊精 一毛细管区带电泳法应用最为成功，利用环糊精作为手性添加剂分离对映体简便 易行，成功率最高【3 3 。5 1 。 1 4 环糊精及其衍生物在毛细管电泳中的应用 1 4 1 环糊精的结构及特点 环糊精( c y c l o d e x t r i n ，c d ) 是由d 吡喃葡萄糖分子以0 【一1 ，4 糖苷键相互连接 而成的一系列环状低聚糖的总称。按参与成环的葡萄糖苷单元数目的不同，可以 9 山东大学硕士学位论文 形成六元环、七元环、八元环，以及更大的九元环、十元环等分子个体口q 。其 中，发现虽早、研究最为成熟的分别是六元、七元、八元环的d 、0 、t 环糊精， 它们的c p k 模型见图1 4 1 - l ，结构参数和物理性质见表14 l 。 穆0 匿耍要西 幽l41 1 天然环糊精的c p k 模型 f i g u r e l 4 i - 1 c p k m o d e l s o f n a t u r a lc y c l o d e x t r i n s 表14 】凡然环糊精的结构参数利物理性质 t a b l e 】1m a i np a r a m e t e r so f n a l a r a lc y c l o d e x t r i n s 环糊精类型以d1 3 - c d v c d 葡萄糖单元数 相对分子晕 水中溶解度( g 0 0 m l ，室温 【a 】d 2 5 c 空腔直径( ) 空腔高度( ) 外围直径( ) 空腔近似容积( 3 ) 】m o l 环糊精的近似彝积( m l l g 环糊精的近似容积( m 1 ) 水中结晶形状 结晶水( w 懈) 单斜的平行四边形 02 0 棱柱 8 1 3 - 1 77 。 脚 m 蕈 蚍 脚 拼 l 昌 i 7 i 7 j 3 4 h r 。言：!兰一一一m删m l li 东大学硕十学位论文 4 0 时的散射系数 3 4 4 33 2 2 43 0 0 0 + 米曲霉1 1 淀粉酶对其水解情况可忽略慢快 水解最大速度v 懈( r a i n 。1 ) 5 81 6 62 3 0 0 2 5 时的p k a ( 电位法) 1 2 3 3 2 1 2 2 0 21 2 0 引 在水溶液中的偏摩尔体积( m l m o l d )6 1 1 4 7 0 3 88 0 1 2 参与成环的各葡萄糖苷单元，在空间构型上采取稳定的椅式构象，经q 1 ，4 糖苷键连接后，环糊精分子的整体呈“v ”型的圆筒状结构。分子中所有的羟基 都分布在空腔的外侧，其中伯羟基排列在空腔开口较小的一端，仲羟基均排列在 空腔开口较大的一端。糖苷毗喃环上所连的c 一3 、c 5 位氢原子指向环的内侧， 它们与q 1 ，4 糖苷键中的氧原子一起构成了环糊精分子的空腔。这种特殊的官能 团排列方式，使得环糊精分子具有外侧亲水，而内层相对疏水的性劂3 7 j 。 单个毗喃型葡萄糖苷的c 2 仲羟基可与相邻糖苷单元上的c 3 仲羟基之间形 成氢键，依次连接下去则形成一个大的带状氢键体系。对于仅环糊精，糖苷在空 间上形成六元环后，其中一个毗喃环有一定的扭曲，这就使其分子内的氢键只能 形成4 对，而不是理论上的6 对。丫一环糊精含有的糖苷数较多，分子的变形性更 大，但它本身并不是一个完全的共平面结构，因而分子内的氢键数目更少。1 3 环糊精内的糖苷数介于上述两者之间，不存在糖苷毗喃环扭曲的情况，c 一2 羟基 和临近的c 3 羟基之间形成的氢键恰好为理论上的7 对，呈一个前后封闭的氢键 带。这一完整氢键体系的存在，使得d 环糊精分子不易发生变形，是三种天然环 糊精中最具刚性的结构【3 8 。3 - 环糊精( c 4 2 h 7 0 0 3 5 ) 的分子结构如下图所示： 图1 4 1 - 2p - 环糊精的化学结构和立体结构 f i g u r e1 4 1 - 2 c h e m i c a la n ds p a t i a ls t r u c t u r e so fp - c y c l o d e x t r i n l l l 东大学硕士学位论文 正是由于这种独特的中空筒状结构，具有合适尺寸及形状的疏水性分子( 客 体分子) 可进入到环糊精的空腔中，与之形成非共价键键合【3 9 】的主客体包结物 4 0 1 。环糊精分子所含葡萄糖苷的个数决定了其个体空腔的大小及形状，这在一 定程度上决定了它们所能包结的客体分子种类：仅c d 适用于低分子量或带有烷 基支链的分子；i b - c d 适用于芳香族或杂环化合物；) , - c d 适用于分子量更大的化 合物，如大环化合物或是甾体分子。一般认为【4 1 】，包结物形成时涉及的作用力 主要有以下5 种： ( 1 ) 环糊精空腔与客体分子上疏水部位之间的范德华力； ( 2 ) 环糊精羟基与客体分子极性基团之间氢键的作用； ( 3 ) 包结物形成过程中，环糊精释空腔内处于高能状态的水分子的释放； ( 4 ) 包结物形成过程中，环糊精释放的大环张力； ( 5 ) 一些环糊精衍生物带有电荷，与离子化客体产生的库仑力。 包结过程是一个快速可逆的平衡过程h 2 j ，相应的稳定程度取决子主、客体 之间相互匹配适应的程度以及客体分子与环糊精空腔表面的原子之间特定的局 部相互作用，这种选择性使环糊精具有了对包结客体的分子识别功能。此外，环 糊精分子含有多个手性中心，具有良好的手性识别能力，可针对手性客体分子进 行选择性地包结，作为手性选择剂用于对映异构体的拆分。 1 4 2 环糊精手性拆机理研究 w r e n 和r o w e | 4 3 - 4 5 1 对以环糊精为手性选择剂的毛细管电泳分离对映体的方 式建立一个简单的模型，认为其手性拆分机理可用下面的平衡过程表示： 彳+ c 马a cb + c 马b c 其中，a 、b 为对映体，它们在溶液中具有相同的迁移率，；c 是手性选择剂， a c 和b c 是对映体与手性选择剂形成的包结物，它们具有几乎相同的迁移率9 2 ； c 为填充的或键合的固定相时，比= o ；局、局为对映体与手性选择剂形成结 合物时的平衡常数。上述平衡虽然是以环糊精类手性选择剂的拆分为基础提出 的，但因其基本假定具有一般性，同样也适用于其它基于包结、吸附、配位、分 配机理的拆分。故a c 和b c 也可看成是吸附结合物、含对映体的胶束或微乳液 等。毛细管电泳手性分离中，环糊精浓度 c 】对手性分离程度的影响可以 1 2 山东大学硕士学位论文 表示为： 弘= j l l 4 一p 日= i ：i ( x p i , - ：了j i 2j)(ik苔,丁-；kji2)丽c 因此，当对映体与手性添加剂形成的结合物的淌度与对映体在自由溶液中的电泳 淌度有差别，且两对映体与手性添加剂相互作用形成结合物的结合常数也不同 时，淌度差不为零，两对映体能够得到分离。此方程适用于手性选择剂与 对映体形成l ：l 的络合物。许多实验参数如手性选择剂的类型、浓度、缓冲液的 p h 值、离子强度、电渗流( e o f ) 和溶剂种类等都会影响分离的选择性和分离 度，而手性选择剂的性质对手性分离起关键作用，它直接影响着( k 1 一飓) 值。 当d d 砑= 0 ，艮p c j = ( k i k 2 ) 加时，对映体达到最佳分离。此时， p = ( n 一1 ) ( “一j l l 2 ) ( ，z + 1 ) 其中，n = k i k 2 。上述关系式表明： ( 1 ) 对映体因其与环糊精包结常数硒、局的差异而获得分离，差异越大，分 离程度也越大； ( 2 ) 环糊精浓度【q 存在优化点； ( 3 ) 对映体迁移率之差与组分在形成与未形成包结物时迁移率之差 ( a l _ 抛) 戚j 下比。 w r e n m 还提出了环糊精浓度 6 3 对迁移影响的模型，进一步可以得到柱效 与分离度r s 的方程 如：亟 4 a k c ( i + k l 【c 】) ( 1 + k 2 c 】)j l l 嘴+ 心。 其中，为理论塔板数，瞅为两对映体的平均电泳淌度，心d 为电渗流淌度。 根据上述方程，w r e n 以i b - c d 分离普奈洛尔( p r o p r a n o l 0 1 ) 为例，研究了添 加有机溶剂对拆分结果的影响【4 5 1 。他认为：有机溶剂可以增加缓冲溶液的疏水 性，提高样品对缓冲溶液的亲合力，减小环糊精与对映体的平衡常数，从而影响 拆分结果；乙腈因极性弱具有比甲醇更强的作用，但它使迁移时间减少( 甲醇为 增大) ，原因可能与溶液粘度及样品。c d 包结物离解度的变化有关。 p e n n 等【4 6 】通过研究环糊精与噻康唑( t i o c o n a z o l e ) 对映体的包结常数k 及 相关热力学常数，提出了系统优化c z e 手性拆分的途径，证实了甲醇可以增强 t li 东大学硕士学位论文 溶质对缓冲液的亲合力而使k 值降低，环己醇则会与溶质竞争结合环糊精分子 而改变其最佳浓度。林炳承等【4 7 】推导了毛细管电泳手性分离过程的热力学参数 方程，从热力学角度对环糊精的手性拆分机理进行了研究，表明了环糊精的浓度 存在优化点，即与对映体的亲和力越大，所需的最佳浓度越小。为了全面反映各 种因素对分离度r s 的影响，r a w j e e 和v i g h 4 8 】建立了峰分离度模型方程来表明对 映体形态参数和操作参数对分离度的共同影响。 1 4 3 环糊精及其衍生物在手性拆分方面的研究现状 天然环糊精因受分子键合能力和水溶性等物理化学性质的限制，在手性分离 应用上有一定的局限性。因此，对环糊精进行适当的选择性化学修饰，即引入其 它的原子或基团以合成不同性质的环糊精衍生物( c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e s ) 是十 分必要的。 1 9 8 9 年，f a n a l i 等【4 9 1 首先报道了以环糊精毛细管区带电泳法进行手性药物 对映体的拆分。近年来，大量手性识别能力强的衍生化环糊精不断被报道，国外 有很多代表性的权威综述 5 0 - 5 3 1 提供了多种环糊精及其衍生物和被分离对象的电 泳操作条件。到目前为止，以p 一环糊精的衍生化及应用最为广泛，下面着重介绍 各种类型d 一环糊精衍生物在毛细管电泳中的具体应用。 ( 1 ) 中性环糊精 仅、1 3 、y 一环糊精均为中性环糊精，它们与手性药物的相互作用主要包括氢键、 7 c 一兀和偶极偶极作用，因此手性识别能力相对较弱。天然环糊精的手性识别能力 可以通过羟基的化学衍生化来提高，此时新的作用点被引入，其立体选择性改变， 水溶性也会提高 5 4 】。 对于a 、丫环糊精，除羟丙基化的衍生物外，其它用于手性分离的报道很少。 中性环糊精衍生物主要有二甲基1 3 环糊精( d m 1 3 c d ) 、三甲基p 环糊精 ( t m b c d ) 、羟乙基1 3 环糊精( h e p c d ) 、羟丙基1 3 环糊精( h p 1 3 一c d ) 5 s 】 等。g u t t m a n 【5 6 】等以d m 1 3 c d 为手性选择剂，在有效长度为7 c m 的毛细管内， 仅用4 0 s 的时间实现了对映体m e t a p r o t e r e n o l 的基线分离，被称为超速分离。l i n 等t 5 7 1 厶成t 乙酰甲基羟丙基p 一环糊精( 2 一o a c e t o n y l 2oh y d r o p r o p y l p c d ) ，并 将其用于手性药物对映体的拆分，研究发现这种新型中性环糊精的分离效果明显 1 4 山东大学硕十学位论文 高于1 3 - c d 、d m b c d 和h p b c d 。 ( 2 ) 阴离子型环糊精 阴离子型环糊精主要包括磺酸化、磷酸化、磺丁基化和羧酸化的环糊精，这 类环糊精是目前应用效果最好、最有潜力的手性选择剂。负电基团的引入提高了 环糊精的溶解性，使其适合中性、碱性、甚至酸性药物对映体的分离。 羧酸化的环糊精是最早用于手性分离的带电环糊精，s c h m i t 和 e n g e l h a r d t 5 8 , 5 9 1 在研究羧甲基一p 环糊精( c m p c d ) 、羧乙基p 一环糊精 ( c e p - c d ) 、丁二酰基一1 3 一环糊精( s u c c p c d ) 分离手性药物时发现：p h 5 时，羧基完全解离，环糊精带 负电。于是，调节背景电解质溶液的p h 值可以选择对映体的不同迁移顺序和迁 移方向，这对于特定分离很有帮助。磺丁基一p 一环糊精( s b e p c d ) 、磺酸基p 环糊精( s 0 3 p c d ) 属于强电环糊精，在任何p h 值背景电解质溶液条件下都带 负电【6 0 击3 1 ，主要用于分离中性和碱性手性药物。 近年来，科学工作者合成了许多新型的阴离子环糊精，并将其应用于毛细管 电泳手性拆分。如c h i n a