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摘要 促进黑曲霉发酵提高木聚糖降解酶系活性的研究 摘要 我国生物质资源丰富，通过生物转化法将生物质转化为能源，既 清洁又环保。生物质能源化主要包括生物质分解和生物质转化两个关 键步骤。在生物质分解阶段，如何提高木聚糖酶的活性是关键，选育 高产木聚糖酶系的菌株对生物质开发利用有重要意义。 本实验从饲用木聚糖酶样品中分离到6 株分解木聚糖的菌株，最 后确定2 株木聚糖酶活力较高的菌株。对该菌株的孢子和菌丝进行显 微形态观察，经鉴定该菌株为青霉( p c o r y l o p h i l u m ) 和枯草芽孢杆菌 ( b s u b t i l i s ) ，并分别命名为青霉q m 2 和k c 2 。将筛选菌种与本实验 室保藏的菌种进行发酵培养，测定其木聚糖酶系活性，结果表明黑曲 霉( 彳n i g e r ) 2 4 5 9 所产的木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶活性均 优于其他菌株。 通过对该菌株的固态发酵产酶条件优化，确定黑曲霉2 4 5 9 的最佳 产酶条件为：培养基含水量为3 5 6m l g ，玉米芯添加量为7 2 3 ，发 酵时间为5 d ，蛋白胨0 4 ，p h7 0 ，温度3 0 。在最佳产酶条件下， 其木聚糖酶活最高可达2 8 8 5i u 。 利用混菌发酵菌种间的产酶协同作用能够提高菌株产酶活性，实 验结果显示将黑曲霉与青霉混菌发酵5d 后，其产酶活性明显直于其他 北京化工大学硕上学位论文 混合发酵组合以及各菌株的纯种发酵。 实验研究了芳香族化合物阿魏酸、水杨酸以及香草醛对黑曲霉在 固态发酵过程中产木聚糖酶系活性的影响。研究表明：在发酵过程中， 向玉米芯固体培养基中添加0 2 的水杨酸和o 5 的阿魏酸时效果最 好，木聚糖酶系的活性能够提高1 3 2 7 倍。 关键词：木聚糖酶，黑曲霉，混合发酵，芳香族化合物 玎 r a r c h i n gi m o r o v a t i o n“y l a n o l y t i ca c t i v i t researcii 0 nt m no tx y l a n o l y t l ce n z y m ea c l t y b ya s p e r g i l l u sn i g e r f e r m e n t i o n a b s t a c t c h i n ai sr i c hi nb i o m a s sr e s o u r c e s i ti sc l e a na n df r i e n d l yt h r o u g h b i o t r a n s f o r m a t i o no fb i o m a s si n t o e n e r g y b i o m a s se n e r g yi n c l u d e b i o m a s sd e c o m p o s i t i o na n db i o m a s sc o n v e r s i o nw h i c ha let w ok e ys t e p s i nb i o m a s sd e c o m p o s i t i o ns t a g e , h o wt oi n c r e a s et h ea c t i v i t yo fx y l a n a s e i st h ek e y p o i n t ，s e l e c t i n gh i g h y i e l ds t r a i n so fx y l a n a s ee n z y m e w i l lm a k e s e n s eo fd e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no fb i o m a s s t h et e s ts a m p l e sa r ei s o l a t e df r o ms i xs t r a i n so fx y l a n d e c o m p o s i t i o n f r o mt h ef e e dx y l a n a s e f i n a l l y , t h et w os t a i n sh a v eh i g h e ra c t i v i t yo f x y l a n a s ea f t e re x a m i n a t i o n a f t e rm o r p h o l o g i co b s e r v a t i o no fs p o r e sa n d h y p h a e sb ym i c r o s c o p e ，t h es t r a i n s a r ei d e n t i f i e da sp e n i c i l l i u ma n d b a c i l l u ss u b t i l i s ，t h e nt h e ya r en a m e da sq m 2a n dk c 2s e p a r a t e l y x y l a n a s ea c t i v i t yo ft h es t r a i n sw i l lb em e a s u r e da n dc o m p a r e dw i t ht h e m i c r o o r g a n i s m sp r e s e r v e db yo u rl a b r e s u l t ss h o w t h a t x y l a n a s e ， x y l o s i d a s e a n da r a b i n o f u r a n o s i d a s ep r o d u c e db ya n i g e r2 4 5 9h a v e h i g h e ra c t i v i t yt h a na n yo t h e rs t r a i n s t h r o u g ho p t i m i z i n g o fs o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ，t h e o p t i m u m c o n d i t i o no fa n i g e r2 4 5 9f o re n z y m ep r o d u c t i o ni st h a tw a t e rc o n t e n ti s 3 5 6 m l ，c o r nc o ba d d i t i o nl e v e la c c o u n tf o r7 2 3 ，f e r m e n t a t i o nt i m ei s i 北京化工大学硕士学位论文 5 d p e p t o n eo 4 ，p h 7 0 ，t e m p e r a t u r e3 0 。c x y l a n a s ea c t i v i t yc a nb eu p t o2 8 8 5 i ui nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n u s i n go fm i x e df e r m e n t a t i o ns y n e r g yb e t w e e nt h ee n z y m ea c t i v i t y c a l li m p r o v ee n z y m a t i ca c t i v i t yo ft h es t r a i n s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o wt h a ta r e rm i x e df e r m e n t a t i o no fa s p e r g i l l u sa n dp e n i c i l l i u mf o r5 d a y s ，e n z y m a t i ca c t i v i t y i s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n a n y o t h e r c o m b i n a t i o n so fs t r a i n sa n dp u r es t r a i nf e r m e n t a t i o n t h i sa r t i c l eh a ss t u d i e dt h ee f f e c to fa r o m a t i cc o m p o u n d s ，c o n c l u d i n g f e r u l a i ca c i d ，s a l i c y l i ca c i da n dv a n i l l i no nx y l a n a s ee n z y m ea c t i v i t yf r o m s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o no fa s p e r g i l l u sn i g e r t h er e s u l t ss h o w t h a t ：i nt h ec o u r s eo ff e r m e n t a t i o n ，t h ec o r n c o b s o l i dm e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t ho 2 s a l i c y l i ca c i da n do 5 f e r u l i ca c i d i sb e t t e r x y l a n a s ee n z y m ea c t i v i t yc a nb ei n c r e a s e db y1 3t o2 7t i m e s k e yw o r d s ：x y l a n a s e ，a s p e r g i l l u sn i g e r , m i x e df e r m e n t a t i o n , a r o m a t i cc o m p o u n d s i i 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 五立血垄 日期： 凼f 翌。拿 一 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的 规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京 化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件 和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部 或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在廿解密后适用本 授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权 书。 作者签名： 4 丑迸 日期： p ，。2 导师签名：三奠牡 日期：u 吐n j l # 一 第一章文献综述 1 1 半纤维素及木聚糖 1 1 1 半纤维素 第一章文献综述 植物细胞壁中的纤维素和木质素是由聚糖混合物紧密地相互贯穿在一起的， 这些聚糖混合物属于碳水化合物类，横向分布在细胞壁各层，被称为半纤维素。 半纤维素是植物纤维原料中的另一主要组分，它们与纤维素不同，不像d 纤维素 那样仅有葡萄糖基相互以肛l ，4 - 糖苷键连接而成直链，而是由不同的单糖基以不 同的连接方式连接成各种结构的聚糖。它们分别含有一种至几种糖基，如d 木糖 基、d 甘露糖基、d 葡萄糖基或d 半乳糖基等构成的基础链，而其它糖基作为支 链连接于此基础链上。半纤维素在针叶木中含有1 0 2 5 ；阔叶木中含有 1 8 一- 2 3 ；禾草类为2 0 - - 2 5 e 1 1 。半纤维素的分子链要比纤维素短小得多，聚合 度多在2 0 0 以下，因此它们的聚集状态很难呈线状，而是粉末状，这样就具有比 纤维素高得多的吸湿性和溶胀性。 1 1 2 木聚糖 木聚糖( x y l a n ) 是植物半纤维素的主要成份，是除纤维素之外自然界中最为丰 富的多糖，也是自然界中最为丰富的可再生资源之一。自然界中存在的木聚糖形 式多样，结构差异非常大，且多为异型多糖( 见图1 1 ) 。木聚糖是一种杂合多聚分 子，其主链由p d 木糖残基经p 1 ，4 糖苷键连接，侧链上连有多种不同类型 的取代基【2 1 ，比如主链木糖残基的c 一2 、c 3 位可以单独或同时发生乙酰化 【3 ，4 1 ，还可以通过a 1 ，3 糖苷键与a l 邛可拉伯糖残基相连【5 1 ，或者通过a 1 ，2 糖苷键与4 o 甲基葡萄糖醛酸残基相连【6 1 。有些木聚糖还可通过l 邛可拉伯糖 残基的c 5 与阿魏酸( f e r u l i ca c i d ) 或香豆酸( p c o u m a r i ca c i d ) 连接，或将木糖 或聚合的阿拉伯糖作为其侧链【3 1 。 北京化工大学硕士学位论文 图l - l 木聚糖的一+ 般结构及其降解酶系的作用位点【2 1 f i g 1 - 1t h eg e n e r a ls t r u c t u r eo f x y l a nd e g r a d i n ge n z y m e sa n dt h e i rs i t e so f a c f i o n 1 2 木聚糖降解酶系 1 2 1 木聚糖降解酶系简介 一般意义上讲，木聚糖酶是指可以将木聚糖催化水解成低聚木糖或木糖 的复合酶系。由于不同来源的木聚糖在主链聚合度、支链残基的种类、数量、 长度及其在主链上结合位点等方面的不同，要彻底降解木聚糖需要多种酶的 共同参与【7 1 。木聚糖酶主要包括以下几种类型 8 , 9 , 1 0 , 1 1 】： 1 ) 内切p - 1 ，4 一d 一木聚糖酶( e n d o p 一1 ，4 一d x y l a n a s e ) e c3 2 1 8 】，简称木聚 糖酶，作用于木聚糖主链的p 1 ，4 糖苷键，主要可生成木二糖和木三糖等寡 糖，很少生成木糖【12 1 。 2 ) p d - 木糖苷酶( p d x y l o s i d a s e s ) e c3 2 1 3 7 ，作用于寡聚木糖的还原 端，并逐个释放出木糖。 3 ) a l 。阿拉伯糖苷酶( o 【l 。a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ) ，并分为两种类型，一种 是只对线型阿拉伯聚糖侧链有活性内切1 ，5 - a l 一阿拉伯聚糖酶 e c3 2 1 9 9 】； 2 第一章文献综述 另一种是外切型的t l , l 阿拉伯糖苷酶 e c3 2 1 5 5 ，它同时对分枝阿拉伯聚 糖具有活性1 3 1 。 4 ) a d 一葡萄糖醛酸酶( 仅- d - g l u c u r o n i d a s e s ) e c3 2 1 1 3 9 】，主要作用于 4 o 甲基葡萄糖醛酸与木糖之间的a 1 ，2 糖苷键。 5 ) 乙酰木聚糖酯酶( a c e t y l x y l a ne s t e r a s e s ) e c3 1 1 6 】，作用于木糖残基 的c 一2 和c 3 位上的乙酰基【3 1 。 6 ) 酚酸酯酶( p h e n o la i de s t e r a s e s ) ，主要包括阿魏酸酯酶( f u r u l i ca c i d e s t e r a s e s ) e c3 1 1 7 3 和香豆酸酯酶( p c o u m a r i ca c i de s t e r a s e s ) e c3 2 1 - 】， 前者主要作用于阿魏酸与阿拉伯糖残基间的酯键，后者则主要是针对香豆酸 和阿拉伯糖残基之间的酯键产生作用【1 4 】。 自然界中存在的木聚糖结构比较复杂，要完全降解需要以上所述多种酶 的共同参与，但通常文献中所说的木聚糖酶是指内切b 1 ，4 d 一木聚糖酶，主 要负责木聚糖主链骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最关键的酶，也是当前 木聚糖酶研究的重点【9 1 。 1 2 2 木聚糖酶( 内切p 一1 ，4 一d 一木聚糖酶) 的结构与催化特性 1 2 2 1 木聚糖酶的分子结构 在分子水平上，木聚糖酶由功能结构域、非功能结构域和连接区组成，功能 结构域又可进一步分为催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 、纤维素结合结构域 ( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 以及木聚糖结合结构域( x y l a n - b i n g d i n gd o m a i n ， x a o ) 等。不同微生物产生的木聚糖酶在分子结构上有很大的差别，有的木聚糖酶 只含有单一区域，即催化结构域，而有的则同时具备催化结构域和多种非催化结 构域【1 5 , 1 6 】 。 ( 1 ) 木聚糖酶的催化结构域( c d ) 承担着酶对底物的水解功能，并可作为该酶 分类的基础。在数量上，木聚糖酶的氨基酸组成变化很大，但其催化区在大小上 都趋向一致，且催化区特定位置上的谷氨酸和天冬氨酸对催化特性却至关重要。 木聚糖酶一般只有一个c d ，但也有含两个c d 的，比如生黄瘤胃球菌 僻“聊伽d c c 凇加v 咖c f e 邶) 产生的木聚糖酶 1 6 】。 ( 2 ) 纤维素结合结构域( c b d ) 也存在于许多木聚糖酶分子中，其功能和氨基酸 北京化工大学硕士学位论文 组成与纤维素酶分子中的c b d 有一定的相似性。存在c b d 的木聚糖酶既能水解 木聚糖，也能水解纤维素，因而被称为双功能酶。虽然c b d 不是酶发挥催化功 能所必需的，但它却能调节酶对可溶性和不溶性纤维素底物的特殊活力，促进酶 对纤维素的水解作用。例如荧光假单胞菌( p s e v d o m o n a s 伽d 彻播c e 搬) 中木聚糖酶 d ，它的全长和缺失c b d 的形式对水解纸浆木聚糖是等效的，而含有c b d 的酶 能更有效的降低k m 值【1 7 1 。 在木聚糖酶分子中常含有一种独立的无催化功能的区域，即纤维素结合结构 域，该区域可以和结晶纤维素结合，其主要特征包括： 1 ) 在靠近末端和末端分别有一个； 2 ) 除g l y 、a s p 之外还含有4 个很稳定的t r p ； 3 ) 带电氨基酸的含量低【1 羽。 将纤维素结合结构域或木聚糖酶催化结构域、中间区域、连接序列一并除去， 仅影响酶与纤维素的结合能力，但酶的底物特异性、酶活性、k m 以及其对可溶 性木聚糖的水解能力不变。 ( 3 ) 连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ，l s ) 多结构域的木聚糖酶需要连接区将各个结构域连接起来。连接区通常是富含 脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸的序列，具有很好的柔韧性和伸展性，它的组成和功能 类似于某些核糖体蛋白或免疫球蛋白的连接区，良好的柔韧性可以使酶与底物更 好的结【1 5 】。连接区的长度一般为6 5 9 个氨基酸残基【1 6 1 。但是，来源于 r u m i n o c o c c u sf l a v e f a c i e n s 的木聚糖酶含有一个3 7 4 个氨基酸长度的连接区，它 仅有7 种氨基酸残基构成，其中天门冬酰胺占了4 5 。谷氨酸占了2 6 t 1 9 1 。木 聚糖分子中还含有重复序列，它可能是连接区的一部分或担负有其它功能。例如 在n e o c a l l i m a s t i xp a t r i c i a r u m 的木聚糖酶x y l a 中，含有一个由4 5 5 个残基组成 的连接区，有5 7 个重复八肽x s k t l p g g ( x 可以是s 、a 、k 或n ) ，但其功 能尚不清楚【2 0 1 。 1 2 2 2 木聚糖酶的催化特性 木聚糖酶的催化特性包括底物组成的特异性、键的特异性和对取代基底物的 特异性。根据木聚糖酶对底物组成的特异性不同可分为特异性酶和交叉特异性酶。 前者只分解木聚糖的p 1 ，4 糖苷键，后者除分解木聚糖的p 1 ，4 _ 糖苷键外，还能够 分解纤维素的p 1 ，4 糖苷键，这种底物特异性与木聚糖的活性位点不同有关。特 4 第一章文献综述 异性不严格的酶可与纤维素底物相作用，而特异性严格的酶则无此能力。底物特 异性反应了酶与底物结合区而不是催化区的不同【2 l 】。 根据木聚糖酶与底物作用时是否可释放出阿拉伯糖，将其分为脱支链酶和非 脱支链酶，这就要取决于木聚糖酶除了裂解主链连接键外，是否可除去阿拉伯糖 侧链取代基，前者多见于一些黑曲霉和链霉菌产生的木聚糖酶【2 2 ，2 3 】。还有一些木 聚糖酶，只作用于含有某取代基邻近的主链的键，比如某些黑曲霉产生的木聚糖 酶【2 4 】，它们对线型木寡糖或除去阿拉伯糖取代基的木聚糖没有作用或几乎无作 用。有的木聚糖酶可切开与4 _ 甲基葡萄糖醛酸取代基邻近的主链键【2 5 1 ，可以看出 该取代基的存在是此类木聚糖酶发挥作用所必需的。 1 2 3 木聚糖酶的理化性质 目前，人们对于木聚糖酶的研究大部分集中在细菌和真菌上，它们所产生的 木聚糖酶一般只有一个亚基。对于不同来源的木聚糖酶，其相对分子质量范围 8 1 4 5l 【u ， p i 范围3 1 0 ，大多数酶的最适作用p h 4 - - - 7 ，最适作用温度为4 0 - - 6 0 。 根据酶的理化特性可分为两大类：相对分子质量小于3 0 k u 的酶、相对分子质量大 于3 0 k u 的酶。分别称为碱性木聚糖酶和酸性木聚糖酶。通常情况下，细菌能产生 两种木聚糖酶，即较高相对分子质量的酸性木聚糖酶和较低相对分子质量的碱性 木聚糖酶；而在真菌中，这种现象就很少，一般只产生碱性木聚糖酶【2 6 】。 在自然界中，纤维素通常是与木聚糖等半纤维素结合在一起的，因此有些酶 既能水解纤维素又能水解半纤维素，因此称为双功能酶。有报道称木聚糖能够被2 种类型的酶所水解：一类是具有木聚糖酶活性的纤维素酶【2 7 1 ，另一类是无纤维素 酶活性的真木聚糖酶( 仃u ex y l a a s e s ) t 2 9 l 。此外，木聚糖酶还存在多样性，例如， s t r e p t o m u c e ss p 的一个菌株b 1 2 在燕麦木聚糖上培养时，可以产生5 种木聚糖酣2 9 1 。 p e t e r b 等人从黑曲霉中的培养基中分离出1 5 种木聚糖酶，从绿色木霉的培养基中分 离到1 3 种木聚糖酶【3 0 】。可能由于翻译后经不同程度修饰的结果，从而导致木聚糖 酶存在多样性，如糖基化、蛋白酶水解或者二者的共同作用【3 l 】：另一个原因是分 别由不同的基因来编码这些同工酶的【3 2 3 3 1 。金属离子对木聚糖酶也有很大的影响， 通常是通过引起酶的构象发生变化来发挥作用。一般重金属离子都能抑制酶的活 性，而一部分金属离子如m 孑+ 等却能激活酶的活性( 表1 1 ) 。 5 北京化工大学硕上学位论文 表1 - 1 不同来源的木聚糖酶的最佳作用环境3 3 】 t a b l e1 - 1t h eb e s tr o l et h ee n v i r o n m e n to fx y l a n a s e sf r o md i f f e r e n ts o u r c e s 1 3 木聚糖酶产生菌的筛选及鉴定 1 3 1 产木聚糖酶的菌株 产木聚糖酶菌株在自然界分布广泛，对于降解自然界大量的半纤维素起着重 要作用。在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、放线菌和反当动物瘤胃、 蜗牛甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在【2 6 1 。目前，报道产木聚 糖酶的微生物多为木霉、曲霉、青霉、链霉菌等真菌以及芽抱杆菌，具体如表1 2 。 6 第一章文献综述 表l - 2 木聚糖霉产生菌 t a b l e1 - 2x y l a n e - p r o d u c i n gs t r a i n 菌属菌种 巨大芽孢杆菌 b m e g a t e r i u m 枯草芽孢杆菌b s u b t i l i s 地农芽孢杆菌 b 1 i c h e n i f o r m u s 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 短小芽孢杆菌 b p u m i l u s 环状芽孢杆菌 b c i r c u l a n s 嗜热芽孢杆菌 b s t e a r o t h e r m o p h i i u s 卷须链霉菌 s c i r r a t u s 链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 青紫链霉菌$ 1 i v i d a n s 橄榄绿链霉菌 s o l o v a c e o v i r d i s 黑曲霉 a n i g e r 宇佐美曲霉 a u s a m i i 黄柄曲霉 a f l a v i p e s 烟曲霉 a f u m i g a t u s 曲霉 ( a s p e r g i l l u s ) 白曲霉a k a w a c h i i 土曲霉 a t e r r c u s 米曲霉 a o r y z a e 海枣曲霉a p h o e n i c i s 哈茨木霉t h a r z i a n u m 康氏木霉 z k o n i n g i i 卜素术霉t 1 i g n i r u m 术霉属 ( t h c h o d e r m a ) 拟康氏小霉t p s e u d o k o n i n g i i 里氏术霉t r e c s e i 绿色木霉t v i r i d e 酵母( c r y p t o c o c c u s ) 浅白色隐球酵母c a l b i d u s 瓦曼纳氏青霉p w o r t m a n n i 青霉( p e n i c i l l i u m ) 顶青霉p c o r y l o p h i l u m 7 北京化工大学硕士学位论文 1 3 2 产木聚糖酶菌株的筛选 木聚糖酶生产菌的筛选多数是基于酶的催化特性和底物分解前后性质的改 变。主要方法有以下几种：( i ) r b b x y l a n 法：接种于含有深蓝色r b b x y l a n 的选择 平板上，产木聚糖酶可分解深蓝色的底物，在菌落周围形成明显的透明圈。( 2 ) 木 聚糖为唯一的碳源生长，诱导其产生木聚糖酶，将木聚糖降解为低聚糖作为生长 所需的能源因而产生透明圈。( 3 ) 刚果红法：基于刚果红能与有1 3 1 ，4 糖苷键连接的 纤维性底物紧密结合形成红色，糖苷键水解后这种红色可被n a c l 溶液脱去的原理。 1 3 3 产木聚糖酶菌株的鉴定 微生物形体微小，结构简单等特点，因此，微生物的分类和鉴定除了传统的 形态学，生理学和生态学特征之外，随着生命科学领域的不断发展，在现代微生 物的分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料都有分类学上的意义，都 可以作为分类鉴定的依据。较为常用的、重要的依据有以下几个方面 3 2 , 3 3 , 3 4 ： ( 1 ) 形态学特征 它因为易于观察和比较，始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，尤 其在真核生物和具有特殊形态结构的细菌中，它的多形态特征依赖于多基因的表 达，具有相对的稳定性。在现今的丝状真菌鉴定中，形态学特征仍然是重要的分 类鉴定手段之一。 ( 2 ) 生理生化特征 对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生 理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因而生理生化特征对于微生物的系统 分类依然是有意义的。 ( 3 ) 氨基酸序列和蛋白质分析 蛋白质是基因的产物，蛋白质的氨基酸顺序直接反映m r n a 顺序而与编码基因 密切相关。因此可通过对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较分析不同生物系统发 育关系，序列相似性越高，其亲缘关系越近。 ( 4 ) 核酸的碱基组成和分子杂交 目前，比较d n a 的碱基组成和进行核酸分子杂交是通过直接比较基因组进行 生物分类最常用的两种方法。 8 第一章文献综述 1 4 木聚糖酶的应用 1 4 1 木聚糖酶在食品工业中的应用 木聚糖的水解产物( 木糖和低聚木糖) 可应用在食品行业，比如作为增稠剂、 脂肪替代物或抗冷冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与其他物质结合使用，它 们可迟缓药物成分的释放。木聚糖的水解产物还可以进一步转化为液体燃料、单 细胞蛋白、溶剂和低热量甜味剂。 在面包食品中，木聚糖酶水解谷物面包粉中的木聚糖，产生木寡糖，使水分 子在戊聚糖相和谷蛋白相中重新分布，从而改善面包的质地、结构、松软度和保 质期。在果汁和啤酒的生产中，木聚糖酶能够降解果汁和啤酒中的一些多糖类物 质，因而有利于果汁和啤酒的澄清。在酿酒工业中，木聚糖酶对谷物细胞壁中木 聚糖的作用有助于加快淀粉酶的作用，因而有助于提高发酵效率，从而增加酒精 的产率【2 7 1 。另外，木聚糖酶还用于生产咖啡过程中咖啡胶的液化，以及提取风味 物质、色素物质、植物油和淀粉。 1 4 2 生产低聚木糖 木聚糖酶在食品行业应用酶法生产低聚木糖。低聚木糖也称木寡糖，是以木 聚糖为底物通过内切木聚糖酶水解木聚糖的b 1 ，4 糖昔键而得到的以木二糖、木 三糖为主要成分的低聚木糖混合物。a izl 等【2 8 】利用固定化木聚糖酶水解稀碱玉 米芯，在玉米芯浓度为4 ，加酶量1 5 0u g ( 玉米芯) ，水解时间8h 后，可获得以 木二糖、木三糖为主的高纯度低聚木糖。k a t a p o d i sp 等【2 4 1 在高温蒸煮玉米芯 后，1 0 0g l 玉米芯添加5 7 0n m o l l 木聚糖酶水解2 4h 后，阿魏酸低聚木糖的得 率最高。宋娜等2 9 1 通过响应面试验优化了高温蒸煮( 1 7 0 c 2 1 0 。c ) t 米芯酶法制备 低聚木糖的工艺，其最佳工艺条件为浸泡硫酸浓度0 0 5 ，蒸煮温度2 0 0 ，蒸 煮时间4m i n ；水解液经3 o 木聚糖酶酶解1 2 h 后，其还原糖转化量可以达到2 2 6 6 m g g 。 1 4 3 木聚糖酶在饲料工业中的应用 植物细胞壁是由包括木聚糖和p 葡聚糖在内的复杂多糖所组成。由于非反刍 9 北京化工大学硕士学位论文 动物缺少相应的消化酶类，半纤维素饲料不能被它们消化吸收。木聚糖酶( 尤其是 双工功能性木聚糖酶) 可以破坏植物中的细胞壁结构，从而改善农作物青贮饲料的 营养成分，有利于动物的消化吸收，故可显著提高各种饲料的利用率。同时，木 聚糖酶还可以降解可溶性多糖，降低其粘性，减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康， 提高畜禽成活率，减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度，减少环境污染 3 0 3 。 1 4 4 木聚糖酶在造纸工业中的应用 1 9 8 6 年，v i i k a r i 首次提出用半纤维素酶处理纸浆，可以减少后道工序漂白过 程中氯的需求量。木聚糖酶在造纸和纸浆工业中的重要性在于其取代了有毒的化 学物质；同时，通过酶法预处理可以回收该行业中有用的副产物。对纯化后的木 聚糖酶的使用可以缩短纸浆的处理时间；木聚糖酶的预处理可以降低漂白过程中 化学药品使用量，并且改善漂白效果。木质素和糖之间的键被切开，纸浆结构被 打开，从而获得了酶作用后的漂白效果。扫描电镜研究显示：用木聚糖酶预处理 后的纸浆在纸浆纤维的孔隙上有所提高，木聚糖酶在为纸浆溶解而进行的回收纤 维的脱树皮和脱墨过程中，以及在纤维素的纯化中起了重要作用。不过，彻底从 纤维中除去木聚糖是不必要的，因为木聚糖有助于纤维的强度和纸的质量。纸浆 漂白过程中，具有高的最适作用p h ( p h l 0 ) 和温度( 9 0 ) 的木聚糖酶是很重要的。 通过蛋白质工程还可以改善木聚糖酶的水解效率、水解特异性和酶的热稳定性， 能够获得产生更高活性木聚糖酶的菌株和相应的工艺，将使应用木聚糖酶的漂白 还能够降低投资成本，并且在环境和经济两方面也具有优势。 1 4 5 其它方面的应用 在生物转化处理废弃物方面，木聚糖酶可用于将木质纤维性材料转化为单细 胞蛋白、生物燃料以及其它有用物质，具有十分大的发展潜力。综上所述，木聚 糖酶在食品、饲料、造纸等领域都有非常广阔的应用前景。但不同的应用领域， 对木聚糖酶性能的要求也有差别。例如，在食品和饲料工业中应用的木聚糖酶大 多属于酸性或中性木聚糖酶，国内外，尤其一些发达国家在这方面的研究起步较 早，发展也很快，目前已有商品化的木聚糖酶出售。近年来，木聚糖酶在造纸工 业中日益显示出了它的巨大应用潜力，采用木聚糖酶进行生物漂白，不但可以提 l o 第一章文献综述 高纸浆白度，改善纸张性能，还能够减少化学漂白剂用量和有毒化学物质的排放 量，是一项环境友好的绿色技术。制浆和漂白等工序一般都在高温和碱性状态下 进行的，相应地对木聚糖酶的热稳定性和耐碱性有一定要求。 1 5 木聚糖酶系的研究进展 国外对木聚糖酶的研究较早，应用与生产技术已逐渐趋向成熟，细菌、真菌 和放线菌木聚糖酶都得到了广泛而深入的研究，并且在1 9 9 2 年就已经实现了木聚 糖酶的工业化生产。目前，国外对木聚糖酶的研究已达到了分子水平，从世纪七 十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有1 5 0 多种来自真菌和细菌的木 聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。g h o s e 等人【3 1 】采用里氏木霉和温氏曲霉 通过液态混合发酵，生产纤维素酶和半纤维素酶制剂。p a n d a 等【3 2 】通过采用木霉 t 6 和黑曲霉a 3 固态混合发酵，同时生产并提高纤维素酶和木聚糖酶。此外，对 表面活性剂促进微生物产木聚糖酶的研究也都取得了一定的成梨3 3 】。 我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期， 中国科学院微生物所的张树政院士开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作【3 4 1 ，首 次从海枣曲酶( a s p e r g i l l u s p h o e n i c 括) 中纯化得到了四种木聚糖酶：酶i 、酶i i 、酶 和酶，并深入研究了活力较高的组分酶的酶学性质。九五期间，山东大学曲 音波教授等【3 5 】开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究。目前，我国对木聚糖酶的 研究已从最初产酶菌株的筛选、酶的纯化和酶学性质研究发展到了分子生物学研 究、木聚糖酶基因克隆以及基因的表达和重组，并且已经初步应用在工业生产中。 目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选、酶的纯化和酶学 性质研究方面部分课题己涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、 表达和重组。但对混合发酵和表面活性剂等化合物促进微生物产酶的研究基本都 是关于纤维素酶的，而对混合发酵和表面活性剂等化合物促进木聚糖酶系活性的 研究较少。 1 6 课题的提出及意义 目前，工业降解木聚糖常用的方法有酸法、碱法和酶法，其中酸法、碱法应 用较为广泛，但酸碱水解液中含有较多的有毒物质，对后期微生物发酵有抑制作 北京化工大学硕士学位论文 用；此外，采用酸法或碱法降解木聚糖，生产环保压力很大，日益受到国家的限 制，因而从长期生产效果来看，酶法降解木聚糖将是未来木聚糖降解的主要方式。 当前，工业酶法降解木聚糖需要解决的主要问题是提高单位菌体的酶产量和提高 酶对工业生产环境的耐受性【3 ，解决上述问题，就有必要进一步寻找高产木聚糖 酶系的菌株并深入研究提高菌体产酶活性的方法以及酶活提高的机理。 1 7 课题的主要研究目标及内容 半纤维素是存在于自然界中非常丰富的再生资源之一，其主要成分为木聚糖。 在我国，植物纤维资源丰富，但这些资源到目前为止仍没有得到很好的利用，尤 其是农林纤维废弃物，其潜在的应用价值不仅没有得到很好的发掘和利用，甚至 它还往往造成严重的环境污染。因此，研究如何更为有效地转化和利用这一丰富 的可再生资源，己成为我国科技工作者十分关注的研究课题之一。 本论文采用透明圈筛选法从市售木聚糖酶中筛选降解木聚糖的菌株，对菌株 进行鉴定，并对菌株具体产酶活性进行测定，然后与本实验室保藏的产酶菌株进 行比较，选出一株高产木聚糖酶系的菌种；通过大量的单因素实验确定对菌体产 木聚糖酶系存在显著影响的因素，采用响应面法进行产酶条件优化，确定最佳发 酵条件；利用不同菌株之间的竞争机制，通过混合发酵法进一步提高菌株的产酶 活性；然后再向上述确定的发酵培养基种添加芳香族化合物( 水杨酸、阿魏酸、香 草醛) 诱导菌体分泌更多的木聚糖酶，并且对该诱导机制下酶活提高的机理进行了 深入研究。 1 2 第二章木聚糖酶系产生菌的筛选与鉴定 2 1 材料 2 1 1 筛选样品 第二章木聚糖酶系产生菌的筛选与鉴定 本实验用于筛选对比的样品是购自夏盛公司的饲用木聚糖酶。 2 1 2 主要仪器 表厶l 主要仪器设备 t a b l e2 - 1t h em a j o re q u i p m e n t s 2 1 3 主要药品 木聚糖购自美国s i g m a ，对硝基苯基一p d 一吡喃木糖苷( p n p x , p n p p d x y l o c o p y r a n o s i d e ) ，对硝基苯基伽d 一阿拉伯糖苷( p n p a ， p n p 一叶d a r a b i n o f u r a n o s i d e ) 其余试剂为国产分析纯试剂。 2 1 4 主要试剂的配制 2 1 4 1d n s 溶液的配制 北京化工大学硕士学位论文 称取1 0g3 ，5 一二硝基水杨酸溶于水中，全部溶解后，加入2 0g 氢氧化钠、2 0 0g 酒石酸钾钠，加入蒸馏水，使总体积至5 0 0m l 左右，加热溶解后，加2g 苯酚、o 5g 无水亚硫酸钠，加热搅拌至全部溶解，冷却，用水稀释至1 0 0 0m l ，储于棕色瓶中， 1 周后使用。 2 1 4 2 缓冲液的配制 ( 1 ) lm o l l 磷酸氢二钾( k 2 h p 0 4 ) 溶液的配制 称取k 2 h p 0 4 2 8 2 3 9g ，用蒸馏水定溶至1 0 0 0m l 。 ( 2 ) lm o l l 磷酸二氢钾( k h 2 p 0 4 ) 溶液的配制 称取k h 2 p 0 41 3 6 0 9 9g ，用蒸馏水定溶至1 0 0 0m l 。 ( 3 ) 不同p h ( 6 o - 7 o ) 磷酸钾缓冲液的配制 o 1m o l lp h 6 0 磷酸钾缓冲液：lm o l l 磷酸氢二钾( k 2 h p 0 4 ) 1 3 2m l o 1m o l l 磷酸二氢钾( k h 2 p 0 4 ) 溶液8 6 8m l 。 o 1m o l lp h7 0 磷酸钾缓冲液：lm o l l 磷酸氢二钾( k 2 h p 0 4 ) 溶液6 1 5m l ，0 1 m o l l 磷酸二氢钾( r , y i 2 p 0 4 ) 溶液3 8 5m l 。 ( 4 ) 醋酸缓冲液的配制 乙酸一乙酸钠缓冲液( 0 2m o l l ) 表2 - 2 乙酸一乙酸钠缓冲液( o 2t o o l l ) 与p h 的配比量 t a b l e2 - 2a c e t i ca c i d s o d i u ma c e t a t eb u f f e r ( 0 2m o l l ) a n dp ho ft h er a t i oo fv o l u m e n a a c 3 h 2 0 分子量= 13 6 0 9 ，o 2m o l l 溶液为2 7 2 2 9 l ；冰乙酸1 1 8m l 稀释至l l ( 需标定) 。 ( 5 ) 柠檬酸冲液的配制 1 4 第二章木聚糖酶系产生菌的筛选与鉴定 母液a ( 0 2m o l l 的n a 2 h p 0 4 溶液) ：称取n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 1 4 3 2 5 6g ，用去离子 水定容至2l 。 母液b ( 0 1m o l l 的柠檬酸溶液) ：称取柠檬酸4 2 0 2 8g 用去离子水溶解定容至2 l 。 p i - 1 2 6 、4 6 、6 6 的三种缓冲液的如表2 - 3 ： 表2 3 柠檬酸缓冲液的配制 t a b l e2 - 3p r e p a r a t i o no fc i t r i ca c i db u f f e r p h 值a ( m l ) b ( m l ) 2 6 1 0 9 0 8 9 1 0 4 64 6 7 5 5 3 2 5 6 67 2 7 5 2 7 2 5 按上表混匀后，4 保存。 ( 6 ) m a d e l s t 3 6 1 盐溶液的配制 ( n h 4 ) 2 s o , 1 4 ，k h 2 p 0 42 ，c a c l 2 2 h 2 0o 4 ，c o ( n h 2 ) 20 3 ，无水m g s 0 4 0 0 7 。 m a n d e l s 微量元素液：f e s 0 4 7 h 2 0o 5 ，m n s 0 4 h 2 0o 1 6 ，z n s 0 4 。7 h 2 0o 1 4 ， c o c l 2 。6 h 2 00 3 7 。 2 1 5 培养基 ( 1 ) 富集培养基( ) ：蔗糖3 ，蛋白胨0 5 ，n a c lo 5 ，p h 自然。 ( 2 ) 筛选培养基( ) ：木聚糖1 0 ，n a n 0 30 2 ，k 2 h p 0 4o 1 ，k c l0 0 5 ，m g s