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交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用中文摘要 中文摘要 随着基因工程的迅速发展，分子诊断技术在过去几十年里得到了长足的发展。 在分子诊断技术和药物研究过程中，基因序列的分析和基因规则的研究起着非常 重要的作用，基于基因序列分析的分子诊断，已为传染性疾病抗原及其基本变化 的研究提供了较高的灵敏度和优良的定性方法。由于简单化，脱氧核糖核酸( d n a ) 杂交生物传感器在直接检测中更为普遍应用。d n a 生物传感器对基因序列的明确 分析近年来得到了快速发展，随着d n a 合成技术以及微电子技术的发展，d n a 生 物传感器的发展更趋于完善。电化学d n a 生物传感器是近年来发展起来的一种新 型的生物传感器。它能将目的d n a 的存在转换为电信号，因为本身具有灵敏度高、 成本低、易操作、简单化、并能与其它仪器兼容的特点，因而发展非常迅速。 本文应用自组装法制备了中性红三巯基丙酸修饰金电极、茜素红修饰玻碳电 极等，对电极制备、影响因素、电化学性质及应用等进行了研究。利用循环伏安、 紫外光谱、交流阻抗等电化学实验技术研究了修饰电极与小牛胸腺d n a 的相互作用。 通过循环伏安、紫外光谱法得出中性红与小牛胸腺d n a 有很强的作用，基于 它们之间的强的作用力，发现修饰电极对d n a 有很强的响应，这种强的作用不仅 能对d n a 的浓度在一定范围内进行测定，还能对他们作用的动力学进行研究。 采用纳米多孔羟基磷灰石薄膜能有效地将双链d n a 吸附于其表面，这种固定 d n a 的方法比较简单，易于操作。交流阻抗方法不仅可以反映d n a 与小分子间发 生了作用，同时还可以对耿妣进行定量分析，是一种快速、简便、廉价的检测d n a 与小分子相互作用的方法。 关键词：交流阻抗，中性红，茜素红，d n a ，循环伏安法，d n a 传感器； 作者：顾海芳 指导老师：屠一锋 交流阻抗法研究d 1 雌与小分子的相互作用 英文摘要 e i ss t u d i e dd n aa n dt h ei n t e r a c t i o no fs m a l lm 0 1 e c u l e s a b s t r a c t w i mm er a p i dd e v e l o p m e n to fg e n e t i ce n g i n e e r i n g ，m o l e c u l a rd i a g n o s t i c t e c l l l l o l o 西e si i lt l l ep a s tf e wd e c a d e sh a v es e e ns i g n i f i c a l l td e v e l o p m e n t h lm 0 1 e c u l a r d i a 印o s t i c s 锄dd m gr e s e a r c hp r o c e s s ，t l l eg e n e sa 1 1 dg e n es e q u e n c e 觚a l y s i so nt h e m l e so fp l a y i i l gav e 巧i m p o r t a n tr o l e ，b 硒e do nt h eg e n es e q u e n c e 觚a l y s i so fm e m o l e c u l a rd i a 孕1 0 s i so fi n f e c t i o u sd i s e a s e sh 鸽b e e n 胁d 锄e n t a lc l 【l g e s 觚t i g e n 觚d t i l e s t i l d yo fm eh i 曲e rs e n s i t i v 时a i l dg o o dq u a l i t a t i v em e t l l o d s a ss i i n p l i s t i c ， d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a )i 1 1t 1 1 ed i r e c th y b r i d i z a t i o nb i o s e n s o rd 酏e c t i o no fn 艳 m o r cc o n 蚰0 na p p l i c a t i o n s d _ n ab i o s e i l s o r sc l e a ro ft l l eg e n es e q u e n c ea n a l y s i sh a v e d e v e l o p e dr a p i d l yi l lr e c e n ty e a 娼，嬲：d n as ) ，1 1 t h e s i st e c l l l l o l o g i e s ，嬲w e u 勰谢t 1 1t l l e d e v e l o p m e n to fm i c r o e l e c 仃o i l i c st e c h n o l o g y ，也ed e v e l o p m l 斌0 fd n a b i o s e n s o rt e n d s t 0b em o r cp e 疵c t e l e c 昀c h e m i c dd 】姒b i o s e n s o ri sd e v e l o p e di nf e c e n ty e a r san e w 蜘e o f b i o s e l l s o r n 、7 l ，i ua i mo ft 1 1 ee x i s t e n c eo fd n ac o n v e r t e dt 0e l e c t r i c a ls i g l l a l s ， b e c a u s eo fi t s1 1 i g l ls e n s i t i v i t y ，1 0 wc o s t ， e 弱yt 0o p e r a t e ，s i m p l e 锄dc o i n p a t i b l ew i m t h ec h a r a c t e r i s t i c so fo m e ri n s 饥l i n 朗t s ，灿sd e v e l o p i n gv e 巧r 印i d l y i nt h i sp 印e r ，i n r e c e n ty e 盯se l e c t r o c h e i i l i c “d n ab i o s e n s o rr e s e a r c hr e v i e w e dp r o g r e s sm a d e h lt 1 1 i sp a p e r ，p 邺db yt h es e l f 髂s e m b l yo fn e u t r a lr e d 3m e r c a p t o p r o p i o m c a c i dm o d i f i e dg o l de l e c t r o d e s ，a l i z a r i nr e d 9 1 a s s yc a r b o ne l e c t i d d e ，a n ds oo ne l e c n o d e p r e p 删o n ，i n n u e n c i n gf a c t o r s ，锄dt h ea p p l i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a lp r o p e n i e s 、r e s t u d i e d u s i n gc y c l i cv 0 1 t a 舶m e t g ，u v ，a i l de l e c t r o c h e l l l i c a li m p e d 锄c et e c h l l i q u e ss u c h 嬲 e l e c t r o c h 删c a le x p e r i m e n t s0 nm o d i 丘e de l e c 昀d ew i t hc a l ft h y m u s 聊呵ai n t 蹦l c t i o n s b yc y c l i cv o l 蛐唧， u vm 砒o dt 0g e tn e 们a lr e d 谢n lc a l fm ) 恤u sd n ah a s as t r o n gr o l eb e 抑e e nt ：h e mb a s e do n 廿l es t r o n gf o r c e f o u i l dm a tm ed n am o d i f i e d e l e c t r o d e1 1 a sa 鳓r o n gr e s p o n s et 0t l l i ss 订o n gr o l en o to i l l yo n 廿l ec o n c e n t r a t i o no fd n a i i lac e r t a i l lr 肌g ed e t e 加：l i n a t i o n ，b ma l s ot 1 1 e i rr o l ei nt h ed y n a l l l i c sr e s e a r c h 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用英文摘要 u s i n gn a l l o - p o r o u s1 1 y d r o x y a p a t i t e 丘1 mc a l le f i f e c t i v e l y d o u b l e - s t r a n d e dd n a a d s o 印t i o nt 0t h es u r f a c e ，m ef i x e dd n am e t h o di sr e l a t i v e l ys i m p l e ，觚de a s yt o 0 p e r a t e a ci i n p e d a i 】l c em e m o dc a nn o to i l l yr e f l e c tt l l ed n aa n ds m a l lm o l e c u l e si nar o l e c a l l2 l l s ob eaq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fd n a ，i sar a l p i d ，s i i n p l ea 1 1 di n e x p e n s i v et e s td n a a 玎ds m a l lm o l e c l l l ei n t e r a c t i o nm e t h o d s k q w o r d s ： e i s ，n e u 竹a lr e d ，舢让赫n d ，d n a ，c y c l i cv o l t a m m e 仃y ，d n a s e n s o r ： i i i w r i t t e nb y ：g uh a i 胁g s u p e n ，i s e db y ：t u f e n g 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明j 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：题蛰壅 日期： 型：堕：! 主 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：碰塑垄日期：型：竖：! 主 导师签名： 哗 日期：丝噬：! ! 交流阻抗法研究d l n a 与小分子的相互作用第一章引言 第一章引言 1 1 生物传感器研究概述 传感器在信息处理系统中占有十分重要的地位，它是信息处理系统的三个构 成单元( 传感器、通信系统、计算机) 之一，相当于人的感官。其品种繁多，应 用领域广耐1 1 。按检测对象可以分成两大类：物理传感器和化学传感器。第一支化 学传感器是2 0 世纪初由g e n n e r 首先研制的p h 玻璃电极。化学传感器的另一个分支 是用陶瓷、半导体、固体电解质等材料制成的气体传感器和湿度传感器。1 9 6 2 年 c l a r k 和l y o n s 首次提出生物传感器这一概念。经过几十年的研究，生物体成分( 酶、 抗原、抗体、激素) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 都被作为敏感元件。 所以生物传感器既不是指专用于生物领域的传感器( 虽然生物医学也是它的应用 领域之一) ，也不是指被测量必是生物量的传感器( 尽管用它也能测定生物量) ， 而是基于它的敏感材料来自生物体，属化学传感器领域的一个新分支【2 】。 在生物传感器中除敏感元件( 分子识别元件) 之外还有信号转换器件，常用 的信号转换器有电化学电极、离子敏场效应晶体管、热敏电阻及微光管等。从传 感器整体的观点出发，生物传感器可划分为三代。1 9 6 7 年u p d i k e 研制出世界上第 一支葡萄糖传感器，称为第一代生物传感器，后逐步发展出组织、微生物、免疫、 酶免疫和细胞器等传感器，称为第二代生物传感器。第三代生物传感器是将生物 技术和集成电路技术结合起来，研制成场效应生物传感器。现在更有将生物传感 器和流动注射分析与电脑技术相结合等长足的进展，并在生物工程、医疗与临床、 环境监测等领域展示出十分广阔的应用前景和价值翊。 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为：微生物传感器、 免疫传感器、组织传感器、细胞传感器、酶传感器、d n a 传感器等。根据生物传 感器的信号转换器可分为：电化学生物传感器、半导体生物传感器、热学生物传 感器、光学生物传感器、声学生物传感器等。根据生物传感器中生物敏感物质相 互作用的类型可分为：催化型生物传感器、亲和型生物传感器、代谢型生物传感 器【8 】。 1 1 1d n a 生物传感器研究进展 2 1 世纪是生命科学的世纪，对d n a ( 脱氧核糖核酸) 的研究是生命科学研究 l 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用第一章引言 中的一个极其重要的方面，采用生物传感器测定d n a 的研究已形成热点。d n a 生 物传感器是一种能将目的d n a 的存在转变为可检测的电、光、声等信号的传感装 置，它与传统的基因技术方法相比，具有快速、灵敏、操作简便、无污染、并具有分 子识别、分离纯化基因等功能，已成为当今生物传感器领域中的前沿性课题【乳1 3 1 。 此类传感器用来检测d n a 的损伤，以及一些药物与d n a 的作用机理，进行特 定药物的设计合成，在临床诊断，体外药物筛选等方面都有应用。而且d n a 电化 学传感器分子识别能力强，无放射性标记。避免了操作过程中对人的危害，它还能 与流动注射技术相结合，可以进行实时、在线检测，也可以进行活体检测。 1 1 2d n a 生物传感器的设计原理及分类 麓t 薯 难敏出信糍 壤壤 率静体 光纤 靶电：搬穗 墩憨辐奢器件 疆电奄鏊甏 燕般电溉 耨面 生籀务予讽卿l 剐l 4 ：j _ i 卜j _ 舞标坡国赠褥、f 岛 说套夼聪 组殴、q 铡蠹：； - 啦他譬信孽 蔸信二壤 - 热傅蹙 t 撕质变俄 橼援 图l 生物传感器示意图 2 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用第一章引言 d n a 生物传感器主要由两部分组成，即分子识别器( d n a ) 和换能器。识别 器主要用来感知样品中是否含有( 或含有识别器( d n a ) 和换能器。识别器主要 用来感知样品中是否含有( 或含有多少) 待测物质，转换器则将识别器感知的信 号转化为可以观察记录的信号( 如电流大小、频率变化、荧光和光吸收的强度等) 。 在待测物、识别器以及转换器之间由一些生物、化学、生化作用或物理作用过程 彼此联系。其设计原理是在电极上固定一条含有十几到上千条核苷酸的单链d n a ( 即s s d n a ) ，通过d n a 分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的d n a 进行识别， 结合成双链d n a ( 即d s d n a ) 。杂交后应在敏感元件上直接完成，换能器将杂交 过程所产生的变化转变成电信号，根据杂交前后电信号的变化量，推断出被检测 d n a 的量。d n a 生物传感器不仅能测定悄的浓度，还能识别部分碱基的排列顺 序，可确定微生物的种属，这是一般生物传感器所不具备的特性，按换能器转换 信号的不同可以将d n a 生物传感器分为d n a 电化学传感器、d n a 光学传感器、 d n a 压电传感器等类。 d n a 电化学传感器d n a 电化学传感器是由一个支持d n a 片段( 即d n a 探 针) 的电极( 包括金电极、玻碳电极、裂解石墨电极和碳糊电极等) 和检测用的 电活性杂交指示剂构成。d n a 探针一般都是由2 0 4 0 个碱基韵核苷酸组成，包括 天然的核苷酸片段和人工合成的寡聚核苷酸片段。将s s d n a 修饰到电极表面，构 成d n a 修饰电极，由于电极上的探针d n a ( 即s s d n a ) 与溶液中的互补链( 即靶 序列) 杂交的高度序列选择性，使得d n a 修饰的电极具有极强的分子识别能力。 d n a 探针分子与靶序列杂交，在电极表面形成d s d n a ，从而导致杂交前后的电 极表面结构的改变，这种杂交前后的差异可用杂交指示剂来识别，从而达到检测 的目的。d n a 电化学传感器具有快速、灵敏和便宜等优点，是目前d n a 传感器中 最成熟的一种，文献报道最多。主要有d n a 修饰电极制作的传感器和离子敏场效 应管d n a 传感器。 d n a 光学传感器d n a 光学传感器 1 5 】采用发光法、椭圆光度法及假布儒斯 物角反射法等作为光学检测手段。d n a 光学传感器中较为常见的是荧光型和表面 等离子体共振型传感器。根据所选光学材料和检测材料的不同，光学d n a 生物传 感器又可分为许多种类【1 6 1 。d n a 光纤传感器的传光部分是石英光纤，它的作用机 理是利用石英表面特性通过一连接物d n a 探针连在光纤端面上，然后与目的基因 进行杂交，杂交后的d n a 经杂交指示剂产生的光效应的变化而被检测。d n a 光纤 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用 第一章引言 传感器可检测杂交反应后产生的特征性光信号，选择性强，易于排除杂交过程中 非特异性吸附的干扰，测定准确。不采用放射性同位素标记探针，安全性好。不 足之处在于选择的发光反应信号较弱，需要加入嵌和剂来提高灵敏度。在d n a 光 纤传感器的基础上，可以制作光渐消逝波e 瞳叮a 生物传感器和瞬波光纤d n a 传感器。 g r a h 锄等利用光渐消逝波【，n a 生物传感器检测寡核苷酸，将1 6 2 0 个碱基的寡核 苷酸结合在波导管的表面，可以检测d n a 片段的互补序列并可以达到1 0 。9 m o l 级水 平。p c r 扩增的2 0 4 个碱基的寡核苷酸也可以固化在波导管表面。表面等离子体共 振( s p r ) d n a 传感器是基于监测传感片表面液体的折射率变化反映出靶基因的 浓度大小设计的，主要集中于基因突变的检测、p c r 产物的测定、病毒和其它微生 物的检测等方面的研究。大约每m m2 传感器表面可以检测到2 6 3p g 核酸，传感器也 可以重复使用。光学传感器除了以上几种外，还有生物( 化学) 发光蚣传感器、 荧光d n a 传感器、拉曼光谱式d n a 传感器和光寻址电位式d n a 传感器。b a r d 等【1 6 】 采用化学发光检测了d n a 在烷基二磷酸铝 a 1 2 ( c 4 b p ) 】膜电极表面的固定化程度和 杂交程度。他们将未标记的s s d n a 先固定到【a 1 2 ( c 4 b p ) 膜电极表面，然后将电极 浸入含有已用r u ( b p y ) 2 + 3 标记的互补d n a 的溶液中，由于杂交作用而使电极表面形 成标记了r l 加p y ) 2 + 3 的d s 叮a ，通过测定在含有三正丙胺溶液中r u ( b p y ) 2 ”的氧化 产生的电致化学发光而检测d n a 的杂交程度。许丹科【1 刀等通过将巯基化修饰的寡 核苷酸探针固定在金电极表面，研制了对特定核酸片段序列具有识别功能的发光 生物传感器件。浓度检测范围可以从o 1m g ml 到1 0 l 酌n i 。，最低检测限为2 3 缸o l ， 建立的夹心式杂交方法可用于乙肝病毒c 区基因扩增片段的检测。 d n a 压电传感器压电晶体在制作完成以后有一个固定频率，当有少量物质 吸附在其表面以后，其共振频率会产生一个变化量：f = 2 3 1 0 6f 2 m 从。 据此原理可制作d n a 压电传感器。在传感器的压电晶体上用适当方法固定单链 d n a ( s s d n a ) 或具有特异性序列的寡聚核苷酸片段( 称探针分子) ，根据碱基 序列配对互补原理，压电敏感元件上的探针分子与试液中的目标s s d n a ( 称靶 临) 分子间互补杂交，引起传感器振荡频率及阻抗等参数发生变化，由此可实 现d n a 检测【1 8 也1 1 ，因非互补d n a 单链间不会杂交生成双链d n a 分子，故这种传感 器具有良好的选择性，它易于与其它方法联用，可提供实时控制信号，也能用于 动力学研究。将修饰有s h 基因的d n a 用自组装方法固定于金电极上形成探针， 可监测它与m 1 3 噬菌体d n a 的杂交过程f 1 8 j ，压电d n a 传感器可用于研究染料分子 4 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用 第一章引言 与d n a 之间的嵌入作用，或抗癌药物与d n a 的相互作用。传感器的响应机理与其 表层粘度变化以及双链d n a 形成时溶液电导的改变有关【1 9 珈】。压电d n a 传感器的 探针d n a 不需要标记，简化了杂交过程，且成本比表面等离子体共振d n a 传感器 低。其不足之处是难以排除非特异性吸附的干扰。高志贤等【2 2 】对d n a 压电传感器 的构成、工作原理、敏感膜的制备方法等作了评述，本文不再赘述。总之，与常 规的核酸检测相比，d n a 传感器有以下特点：可进行液相杂交检测；可进行 d n a 实时检测；可对活体内核酸进行动态检测；可进行d n a 的大量智能化检 测；特异性强；无污染。但d n a 生物传感器还存在灵敏度不够、易受杂质干 扰等缺点。相信随着科学技术的发展，一些新型的实验技术将会给d n a 传感器注 入更新的活力。 d _ n a 电化学传感器的制备方法 单链d n a 的固定方法有很多种，已用的基底电极有汞电极，固体电极如金电 极、玻碳电极、石墨电极、碳糊电极等，制备方法主要有以下几种： ( 1 ) 吸附法即将d n a 直接滴涂或在一定电位富集吸附到电极表面。w a n g 【2 3 】 等在p h = 5 0 的乙酸缓冲溶液( o 1 m o 儿) 中，于+ 1 7 v 处理碳糊电极1 i n i n ，然后 于+ 0 5 v 吸附 n a 探针2 m i n ，从而固定d n a 探针。吸附法相对简单，但是结合的 力度和方向性较差，d n a 在溶液中有可能脱附或结构扭曲而不易发生正确的杂交 反应。吸附法相对简单，但是结合的力度和方向性较差，d n a 在溶液中有可能脱 附或结构扭曲而不易发生正确的杂交反应。 ( 2 ) 共价键合法这是d n a 分子固定的一种常用方法。它是将电极表面预 处理后产生各种功能的活性键合基因，再与s s d n a 发生有机反应，通过共价键的 形成把s s 。d n a 固定在电极表面。方禹之【2 4 2 7 】等用多种方法将s s d n a 片段固定在 石墨电极上，如用乙基( 3 二甲基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 或羟基丁二酰 亚胺( n h s ) 活化已被氧化的光谱纯石墨电极，用于固定s s d n a ；或用5 0 9 l3 氨 基丙基三乙氧基硅烷( p r n h 2 ，硅烷i i ) 将石墨电极表面硅烷化以引入氨基，再用 e d c 为偶联活化剂，将s s d n a 固定于电极表面。 ( 3 ) 自组装法根据分子的自组装作用，在电极表面形成高度有序的s s 瑚妊 单分子层。通常是利用巯基化合物修饰s s d n a 后再组装于金电极的表面形成单分 子层。这种方法制备的d n a 探针表面结构高度有序、稳定性好、易于发生杂交反 应，但对巯基修饰过程要求较高f 2 8 】。刘志红删等将1 0 此的1 0 0 m g 甩寡核苷酸探针 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用第一章引言 溶液滴于金膜石英片上，晾干后冲洗，即制得自组装d n a 探针电极。庞代文【3 0 】等 比较了巯基乙醇、半胱胺酸和巯基丙酸三种硫化物自组装单层固定d n a ，结果发 现巯基乙醇效果最好。刘盛辉【3 1 】等将氨基乙硫醇在金电极表面自组装形成单分子 膜，再用水溶性的碳化二亚胺作为偶联活化剂，使s s d n a 的5 端磷酸基与电极表 面活化后的氨基以磷酸氨基酯键的形式共价结合，而在金电极表面形成s s d n a 单 分子层。 ( 4 ) 组合法将化学修饰剂与电极材料如石墨粉混合后制备组合修饰电极， 再利用s s d n a 与修饰剂的相互作用而固定【3 2 】。这种方法制备的电极修饰层相对稳 定，易于杂交反应的发生，但其再生能力较差，使用次数有限。 ( 5 ) 其他方法如电聚合法是利用导电聚合物将s s d 1 怕固定在电极表面的方 法。g 觚l i e r 【3 3 】等以聚( 3 乙酸吡咯) ( 3 n 羟基邻苯二甲酰亚胺毗咯) 为前体共 聚物，将带有氨基的1 4 个碱基的d n a 或低聚核苷酸共聚到电极表面；彭图治【3 4 】等 在铂电极上将氮 6 ( 3 乙酰氧基噻吩基) 】吡咯2 ，5 二酮( n 址d ) 电聚合来固定 d n a 探针。方禹之等研究了壳聚糖将s s d n a 分别固定在金、铂和石墨电极表面的 方法。 1 1 3 怕生物传感器的应用 随着对d n a 结构和功能研究的不断深入，d n a 电化学传感器已经在基因识别 分析、生物工程研究、药物合成设计、d n a 损伤检测、环境检测、转基因食品监 控等各个方面起到重要作用【3 ”7 1 ；它还具有实时、在线检测，活体分析等优点， 必然有利于其应用范围的扩展。 在基因序列检测中的应用利用聊蛆电化学传感器，可以检测目标基因序列。 m i l l a i l 【3 8 】等利用18 个碱基的寡聚脱氧核苷酸探针选择性检测了囊性纤维变性基因 f 5 0 8 序列。h i s h i m o t o 【3 9 】等利用一个含2 0 个碱基的脱氧核苷酸固定在金电极表面 制备的探针检测了单链p u l 6 2 3 的p a t 片断上的致癌基因v m y c ，检测下限可达 1 0 朋m o 儿。方禹之等用7 5 个碱基的s s d n a 为电化学探针检测了人体精子膜表面 蛋白基因片段。w a n g 【4 1 】等通过1 7 个碱基的肽核酸p n a 探针检测了抑癌基因p 5 5 的 突变位置，及对m 肺结核d i n a 、人体免疫缺陷病毒h i v 有关的短d n a 序列的研究， 取得了很好的结果。彭图治等采用聚合物法固定s s d n a 后对h 1 和集合丝杆菌核 苷酸进行了测定。 在基因损伤检测中的应用化学物质、辐射等外界条件的作用对d n a 的结构 6 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用 第一章引言 造成一定的损伤。基因损伤可以导致最基本的生命过程的紊乱，甚至导致复制过 程中的突变和变异。z h o u 【4 2 小】等利用r u ( b p y ) 3 和c o ( b p y ) 3 + 3 与e i n a 的相互作 用，采用方波伏安法测定损伤d n a ，可检到o 1 的受损碱基。孙星炎【4 5 】等利用道 诺霉素为杂交指示剂，研究了不同的致突变因素如紫外光照射、超声波作用等对 特定碱基序列d n a 的损伤程度。 在药物分析中的应用许多药物( 如抗癌药物、致癌剂等) 和d n a 之间存在 着相互作用，d n a 传感器可用于d n a 结合药物的检测和新型药物分子的设计。 w a r i n g 【4 5 l 等研究了一些抗癌药物与d n a 的作用，结合电化学方法，为药物的体外 筛选提供一种很好的方法。庞代文【4 6 】等研究了道诺霉素在d n a 修饰石墨粉末微电 极上的电化学行为并建立了测定人尿中痕量道诺霉素的方法。o l i v e i r a 2 b r 嘣【4 7 j 等 研究了亚德里亚霉素对d n a 传感器上d s d n a 的损伤。其它的药物如卡铂 ( c a r b o p l a t i n ) 、阿的平、硝基咪唑、吩噻类、维生素b 2 、米托蒽醌、盐酸阿霉素 等药物与d n a 传感器的作用都有报道【4 8 5 0 1 。 在环境监测中的应用利用d n a 电化学传感器可以监测环境中的有机污染物 和病原微生物【5 0 1 。w a n g 【5 0 。5 1 】报道了灵敏测定肼类化合物和有毒芳胺类化合物的 d n a 电化学传感器，对肼类化合物的检出限可达l o 轨水平，对2 氨基萘、1 氨 基葸等芳胺化合物的检出限达到m o 儿；还利用丝网印刷电极制造了测定大肠杆 菌d n a 序列的电化学传感器并应用于环境水样中大肠杆菌的测定【5 2 1 。m 嬲c 砬等 报道了对水样中的毒素嗍如双酚a 和芳香胺【5 4 】如萘胺、二氨基葸醌等物质的测定。 d n a 电化学传感器是电分析化学和分子生物学相互交叉的一项新型研究领域，是 生物电分析化学的一个重要研究方向，在临床检测和遗传工程方面有着重要意义， 同时还可用于抗癌药物筛选、基因致病机理研究等方面，今后的研究将集中于高 灵敏、高选择性的杂交指示剂的选择；在基因诊断和基因损伤上的应用扩展；药 物与d n a 电化学传感器的相互作用机理及检测；传感器的微型化和多元化的研究； 在农业、食品如转基因食品等方面中的应用。 1 2d n a 与生物分子相互作用的研究 d n a 分子是重要的生命物质基础【5 5 】。小分子与d n a 核酸作用后，将会不同程 度地导致d n a 分子的结构与功能的变化。研究d n a 与小分子物质的作用对阐述抗 癌药物的作用机理、药物的体外筛选以及致癌物致癌机理都有非常重要的意义【5 6 1 。 d n a 与识别分子尤其是药物小分子的相互作用研究是近年来活跃在前沿的研 7 交流阻抗法研究聊姨与小分子的相互作用 第一章引言 究领域之一，电化学研究可以得到小牛胸腺d n a ( c t - d n a ) 与中性红( n r ) 相 互作用的宏观信息。小分子与核酸的作用，在不同程度上引起核酸结构和功能的 改变，核酸结构和功能变化的研究对深入认识和掌握核酸的性质具有重要的意义。 由于小分子化合物和生物大分子d n a 的作用具有特异性，这种特异性结合在基因 表达的调控过程中起着重要的作用，很多药物的活性及毒性都与d n a 的选择性作 用有关【5 5 】，因此对小分子与d n a 的作用的研究在药物的筛选，靶向药物的设计， d n a 探针的选择等方面都具有非常重要的意义。用于研究d n a 与小分子相互作用 的方法有波谱法、色谱法、荧光猝灭法、核磁共振法等【5 6 - 5 9 1 。电化学方法因其灵 敏度高，方法简单，所用样品量少而在该领域中显示出很大的优势。 文献报导研究了吩嗪染料与d n a 的作用【6 嘶，发现吩嗪染料中性红( n r ) 与 聊蛆可发生嵌插作用，嵌插后的n r 荧光量子产率大大增加。且n r 本身毒性很低， 水溶液可长时间放置( 1 0 0 1 0 d m o 儿的n r 溶液放置2 年后没有发生变化) 。吩噻 嗪类药物是一类治疗精神分裂症或其它心理疾病的药物【6 2 j ，如盐酸氯丙嗪 ( c l l l o r o p r o m a z mh y d r o c l l l o r i d e ，c p z ) 和盐酸三氟拉嗪( 啊f l u o p e r a z i n e h y d r o c l l l o r i d e ，t f p ) 被用于治疗精神分裂症，盐酸异丙嗪( p r o m e t l 抛i n e h y d r o c l l l o f i d e ，p m z ) 则是一种抗组胺药物。三者都具有平面吩噻嗪基团，但侧链 取代基不同。以n r 与d n a 研究作用可以类比d n a 间存在着嵌插作用，前者的作用 强度高于后者；p m z 与d n a 间只有弱的静电作用【6 3 】。 1 2 。1 交流阻抗的发展 发展【“彤】交流阻抗方法是电化学测试技术中一类十分重要的研究方法，该方 法具有频率范围广、对体系扰动小的特点，是研究电极过程动力学、电极表面现 象以及测定固体电解质电导率的重要工具，近几十年来发展非常迅速，已成为研 究电极过程动力学和表面现象的重要手段，应用范围已经超出电化学领域，越来 越广泛。 随着电化学理论的不断完善与发展，电化学方法也得到了相应的发展。在电 化学测量中做出了重要贡献的是s t e m 和他的同事。他们在1 9 5 7 年提出了线性极化 的重要概念，虽然线性极化技术有着一定的局限性，但在实验室和现场快速测定 腐蚀速度时还是一种简单可行的方法。腐蚀工作者在随后的十余年中又做了许多 工作，完善和发展了极化电阻技术。电子技术的迅速发展促进了电化学测试仪器 的发展，现代电子技术的应用和用于暂态测量测试仪器的出现，一些快速测量方 8 交流阻抗法研究d 】姐与小分子的相互作用 第一章引言 法和暂态响应分析方法也得到了发展，最典型的例子就是交流阻抗技术的发展。 最初测量电化学电阻采用交流电桥和李沙育方法等，这些方法既费时间又较繁琐， 干扰影响也大。随着电子技术的发展，锁相技术和相关技术的仪器( 如频率响应 分析仪、锁相放大器等) 被用于交流阻抗测试，它们的灵敏度高，测试方便，而 且容易应用扫频信号实现频域阻抗图的自动测量。后来可以利用时频变换技术从 暂态响应曲线得到电极系统的阻抗频谱，从而实现了在线测量，追踪电极表面状 态的变化。最近一种利用震动探针电极测量局部电极阻抗的技术也得到开发。计 算机技术引入电化学领域，可以由计算机对电化学交流阻抗测量进行控制，自动 完成数据采集和数据分析。 1 2 2 交流阻抗的原理 交流阻抗技术的基本原理交流阻抗方法是基于测量对体系施加小幅度微扰 时的电化学响应，在每个测量的频率点的原始数据中，都包含了施加信号电压( 或 电流) 对测得的信号电流( 或电压) 的相位移及阻抗的幅模值，从这些数据可以 计算出电化学响应的实部与虚部阻抗谱中涉及的参数有阻抗幅模( i z i ) 、阻抗实部 ( z ) 、阻抗虚部( z ) 、相位移( o ) 、频率( ) 等变量，同时还可以计算出导纳 ( y ) 和电容( c ) 的实部与虚部，因而阻抗谱可以通过多种方式表示，每一种方 式都有其典型的特征，根据实验的需要和具体体系，可以选择不同的图谱形式进 行数据解析嗍。 阻抗的概念【6 7 】一个纯正弦电压可以表示成e _ e s i n t ，其中为角频率。对一 个纯电阻r 加上正弦电压时，根据欧姆定律，响应电流为i = ( 旅) s i i l t 或以向量 标记i = 别r ，相角为零。对一个纯电容c 施加正弦电压e 时，由于i = c ( d e d t ) ，因 此i = 嗽o s 似或i - ( 胍c ) s i i l ( 砒吲2 ) ，其中x c _ ( c ) d 称为容抗，相角是胞， 电流导前于电压，用复数符号表示向量，规定纵坐标分量为虚部，横坐标为实部。 对纯电容用向量表示激励正弦电压与响应正弦电流的关系，可写为庐- j x c i ，或 e _ i z ，其中z _ - j x c _ 一j ( c ) 称为阻抗。阻抗是一种普遍化的电阻，庐i z 是欧姆 定律的普遍形式。 同样方法可以导出纯电感l 的阻抗为j l 。导纳是阻抗的倒数，用y 表示。对纯 电阻y r - 1 ，纯电容y - j c ，纯电感y = 1 j l 。 对于串联电路，总阻抗为各个阻抗的复数和。对并联电路，总导纳为各个导 纳的复数和。更复杂的电路可以根据类似于电阻所运用的规则，通过合并阻抗来 9 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用第一章引言 分析。 交流阻抗的复数表示【6 3 】 阻抗可以表示成复数平面的矢量或写成复数形式z = a + i b 。z 可以由模i z i 和相 角0 来定义，则a i l z i c o s 0 ，b = i z l s i n e ，即z _ l z i c o s 0 + j l z i s i n o ，i z i 表示它的幅值。阻 抗的表达式中含有所施加正弦信号的角频率，因此阻抗矢量将随角频率的变化而 变化。描述阻抗随频率变化的方法是用由阻抗矢量值和相角绘成的n y q u i s t 图，也 可用包含幅频特性曲线和相频特性曲线的b o d e 图表示。 a 寸 8 磊 蔼 a 童 害 一 n y q u i s t 图 乙n l o gf 糟q u e n c y b o d e 图 交流阻抗测试中电解池的基本等效电路 l o (9m乙西p)oacm o 螗l l 山 。竹约的柏o巾国dr嘲母币棚删 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用第一章引言 由于电极过程可以用电阻r 和电容c 组成的电化学等效电路来表示，因此交流 阻抗技术实质上是研究r c 电路在交流电作用下的特点和规律。讨论交流阻抗法应 首先对电解池的等效电路进行分析。交流阻抗测试中电解池的基本等效电路【6 7 1 见 图2 。 b 图2 交流阻抗测试中电解池的基本等效电路 图2 中a 和b 分别表示电解池的研究电极和辅助电极两端，r a 和i 也表示电极本 身的电阻，c a b 表示两电极间的电容，r l 表示溶液电阻，c d 和c ：d 分别表示研究电 极和辅助电极的双电层电容，z f 和z f 分别表示研究电极和辅助电极的交流阻抗。 图1 中的等效电路是阻抗测量中最基本的等效电路形式，在实际测量过程中根据实 际测量条件的不同，此等效电路往往进行简化【6 引。 1 2 3 交流阻抗的应用 目前应用交流阻抗技术较多的如电化学领域中研究电极过程、金属腐蚀机理 和耐蚀性能、缓蚀剂性能评价等；生物领域中研究生物膜的性能等；物理学领域 研究电子元器件、导电材料的性能等；材料科学中研究材料的力学性能以及材料 表面改性后的性能评价等【6 9 】。 交流阻抗方法是一种暂态电化学技术，属于交流信号测量的范畴，具有测量 速度快，对研究对象表面状态干扰小的特点，因此在实际科研工作中，交流阻抗 技术的应用范围非常广泛。 生物科学领域电化学交流阻抗谱应用于生物膜研究与传统方法比较，小幅的 交流电激励信号能使体系更接近和保持其生命的原始状态，具有特殊的意义。崔 艳芳等【7 0 1 将交流阻抗谱应用在蟾蜍膀胱膜通透性研究中发现，上皮细胞膜的通透 性变化可以在交流阻抗谱的复平面图上直观地显示出来，项膜和底侧膜的性状表 现为两个连续的容抗半圆，顶膜和底侧膜阻抗很容易地分开。进而以此为基础探 交流阻抗法研究d n a 与小分子的相互作用 第一章引言 讨了制菌霉素对顶膜的作用机理。 物理学领域许恒生【7 1 】首次将交流阻抗法应用于双电层电容器电解液的研究， 在测得阻抗频谱曲线的基础上，对其进行等效电路解析，再结合电解液性质对双 电层的结构、界面状态等进行分析，从而对电解液的优劣从物理本质上进行分析 与理解。交流阻抗技术用于研究导电聚合物的导电性是很成功的。 材料学领域传统电化学方法只能研究金属表面膜的性能，而对其成膜过程 的研究却受到限制。交流阻抗方法因以测得很宽范围的阻抗谱来研究电极体系， 可以获得比常规方法更多的动力学信息和界面结构信息。近年来交流阻抗谱技术 在混凝土材料方面的研究方兴未艾，研究结果表明，交流阻抗谱与混凝土的孔结 构有密切的关系，而且交流阻抗谱的电学参数可反映出材料组成对孔结构的影响。 尤其是用于交流阻抗谱分析的试样体积可以是胶砂试件或混凝土抗压强度标准试 件，克服了其它检测方法试样体积小的局限性。交流阻抗谱检测过程时间短而且 是非破损检测，可在同一试件上进行孔结构分析和力学破坏试验，因此，利用交 流阻抗谱方法分析孔结构并建立材料孔结构与力学性能的关系更为直接可靠。 电化学领域电流阻抗技术是随着电化学理论和测试技术的发展而出现的， 因此其最重要的应用领域还是电化学领域，主要用于研究电极过程、金属的腐蚀 行为、缓蚀剂等。 交流阻抗技术的发展和应用前景随着电化学研究的深入，要求不断发展适 应金属电极特点的研究和测试方法，测试仪器也必将进一步发展，以期获得金属 电极表面上进行的复杂电极过程的信息。因此，交流阻抗测试仪器将会进一步提 高微弱信号的检测能力和抗环境干扰能力。能够测量金属电极微局部阻抗信息的 技术将会得到发展，这将为电化学领域研究金属的局部腐蚀机理和特征提供新的 研究手段。计算机技术将与电化学交流阻抗技术进一步融合，计算机控制测量仪 器和数据处理能力进一步增强，简化了阻抗测量操作程序，提高了实验效率。交 流阻抗技术的应用领域也将进一步拓宽，不仅是电化学研究的有力工具，而且将 为其他诸如生物、环境、电子、材料、土建等领域的研究工作提供新的机遇例。 1 3 展望 生物传感器是在生命科学和信息科学之间发展起来的一个交叉学科，是由