（预防兽医学专业论文）鸡胚性腺原始生殖细胞分离培养的研究.pdf

莱阳农学院硕士学位论文摘要 鸡胚性腺原始生殖细胞分离培养的研究 摘要 本试验以罗曼鸡和寿光黑鸡胚胎性腺为实验材料，分别制作18 2 8 期鸡胚的石蜡组 织切片和18 28 期鸡胚性腺细胞涂片，并进行p a s 、h o e c h s t3 3 2 5 8 染色，观察和比较g p g c s 在正常组织与消化分离后的形态结构特征。同时对18 2 8 期胚胎g p g c s 进行消化分离、纯 化及培养。在此基础上，用纯化的g p g c s 在不同的培养体系中培养。本研究的目的旨在 明确鸡胚原始生殖细胞( g p g c s ) 在迁入生殖原基之后的形态学与分布特征，掌握有效 的分离g p g c s 的方法，探索g p g c s 体外培养的影响因素及有效地培养条件，为发展鸡g p g c s 的体外操作技术奠定基础。试验结果如下： i p g c s 形态学研究 组织切片观察表明， g p g c s 呈圆形或卵圆形，有伪足，直径为1 0 m 1 5 “m ，胞核呈 圆形或椭圆形，偏向细胞边缘，大小为5 m 一7 5 u m 。核内缘有少量异染色质，常染色质 均匀分布。细胞悬液涂片观察表明，游离的g p g cs 呈圆形或卵圆形，有伪足，周围有明 显的光环；直径为1 2 5 “m 2 0 ”m ，p a s 反应呈阳性。h o e c h s t 3 3 25 8 染色后可见其胞核呈肾 形或椭圆形，偏向细胞的边缘，大小为5 p m 一7 5 ”m x l 2 5 肛m 。核内缘有少量异染色质，常 染色质均匀分布。另外，可见27 期鸡胚性腺中部分p g c s 仍处于分裂状态，其胞体为 1 2 5 u m 3 2 5 肛m ，h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色后，可见核位于中央且均等分布于赤道面两侧，大 小为7 5 u m x l 2 5 m 。 i i p g c s 分布特点 组织切片观察表明，g p g c s 刚迁入性腺时，均等分布于两侧。2 2 23 期g p g c s 开始由 右侧经背肠系膜向左侧迁移。27 期时，靠近左侧性腺的背肠系膜边缘仍有部分p g c s ，呈 单个或成群分布。此时，左侧性腺g p g c s 数目明显多于右侧。且妒g c s 大部分位于性腺的 皮层。说明2 7 期为g p g c s 从右侧性腺向左侧迁移的最后时期。 生殖原基中p g c s 增长变化趋势 分离1 8 2 8 期罗曼鸡和寿光鸡胚胎性腺p g c s ，并计数作统计分析。发现：g p g c s 在性 腺中主要有两个快速增长期：1 8 一1 9 期和23 27 期。2 8 期时，每只罗曼鸡胚胎g p g c s 个数 显著高于寿光鸡。这可能是导致罗曼鸡产蛋率高于寿光鸡的原因之一。 p g c s 的分离纯化 28 期时，每只罗曼鸡胚胎获得g p g cs 为17 4 5 0 7 306 5 ，占l - 9 8 。每枚寿光鸡胚胎 蒌塑堡兰堕堕主堂堡笙茎： 塑垩 可获得g p g c s l 4 0 1 8 0 28 9 ，占1 6 1 。将酶解法分离后获得的性腺混合细胞培养2 4 h ， 重新悬浮后将部分贴壁的基质细胞除去，每枚罗曼鸡可获p g c s 5 1 2 5 l0 4 2 个，寿光鹂 胚胎个数为：4 3 2 5 1 0 6 5 。f i c o l l 分离后，每只罗曼鸡和寿光鸡胚分别可获得43 5 5 1 20 5 和3 5 6 7 l03 5 个p g c s ，分别占2 0 7 和1 8 7 。 v p g c s 的培养研究 2 8 期胚胎性腺消化分散后，将p g c s 分别培养于由添加b f g f 和未添加b f g f 的基础培养 基和无饲养层和以鸡胚成绎维细胞为饲养层组成的四个培养体系中，结果发现，添加 b f g f ，可显著提高g p g c s 的存活率，以c e f 为饲养层并添加b f g f 培养基可显著提高存活率 和促进生长。 关键词：鸡；性腺原始生殖细胞；分离；培养 2 莱阳农学院硕士学位论文英文摘要 i s o l a t i o na n d c u l t u r eo f g o n a d a lp r i m o r d i a lg e r mc e l l s o fc h i c k e ne m b 眵o s a b s t r a c t p r i m or d l a 【g e r mc e l l s ( p g c s ) w e r ei s o l a t e df r o mg o n a d so fr o m a nc h i c k e n 孤ds h o u g u a n gb l a c k c h i c k e ne m b r y o sa tt h es t a g eo f18 2 8b yt h em e a n so fe d t a t r y p s i na n df i c o l ld e n s 时c e n t r i f u g a t i o n t h e p g c sw e r eo b s e r v e di m m e d i a t e l yo ra 舱rs t a i n e d b yp a sa n dh o e c h s t 3 3 2 5 8 m e a n w h j 】e g o n a d ss l i c eo f c h i c k e ne m b r y oa ts t a g eo f1 8 - 2 8w e r em a d e ，c o m b i n e dw i t hi h em o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o no f t h ep g c si n t h es e r ia 1 t h e n ，p g c sw e r ec u l t u r e du n d e rd i 丘b r e n tc u l t u r es y s t e m t h ea i mo f t h es t u d yi st o 矗n dab e t t c r m e t h o dt oi s o i a t i o na n dc u l t u r ep g c s ，a n dt op m v i d et h ed a t af o rt h es t u d yo na v i a ng e n e l i c sm a n i p u i a t i o n i n v i 扣o i t h em o p h o l o g yo f p g c st 、r o mt h eg o n a d s t h eg o n a d a lp r m o r d i a lg e mc e i i sw e r es h o w e da sr o u n do re 1 1 p t i c a li nt h eh i s t 0 1 0 9 i c a ls l i c e s ，w i t ha r o u n do re l l i p l i c a ls h a p e dn u c l e a rn e a rt h ec e l im e m b r a n e p a r t so f t h e mp r e s e n tp s e u d o p o d t h ed i a m e t e r o ft h ep g c sw a sl o m 一1 5 “m ，t h en u c l e a rw a s5 - 7 5 p mal i t l l eh e t e r o c h r o m a t i np r e s e n t su n d e f 廿1 e i n t e o rb r i mo fn u c l e a r ，w h e r e a s ，t h ee u c h r o m a t i nd i s t b u t e se q u a b l y t h es h a p eo ft h ei s o l a t e dg o n a d a l p m o r d i a lg e 丌nc e l l sw e r es h o 、e da sr o u n do re l i i p t i c a i ，w i t har o u n do re l i i p t i c a ls h a p e dn u c l e a rn e a rt h e m e m b r a n e p a f so fc h e mp r e s e n tp s e u d o p o d 。t h ed i 锄e t e fo ft h ep g c sw a s1 2 ，5 p m - 2 0 p m ，t h ep g c s 印p e a r sp o s i t v er e a c t i o na f t e rp a ss t a i n i n g 厂h e nt h ep g cs t a i n e db yh 0 e c h s t 3 3 2 5 8 ，t h en u c i e a rw a s 5 - 7 5 m 1 2 5 m al i 廿l eh e t e r o c h r o m a t i np r e s e n t su n d e ri n t e r i o rb mo f n u c l e a r ，w h e r e a s ，t h ee u c h r o m a t i n d i s t r b u t e se q u a b l y i i t h ed i s t r i b u t i o no f p g c si ng o n a d s o b s e r v a t i o n ss h o w e dm a tt h eg p g c sw e r ee q u a i i yd j s t “b u t e dj u s ta 矗e rs e 圳i n gi n t ot h eg o n a d s a n d p r o l i f e r a t 】o nw a si n i t i a t e dq u i c k l y 丁h en u m b e ro fp g c sw e r eq u i c k 】yj n c r e a s e dd ur - n gs t a g e1 8 1 9 a n d s t a g e2 3 2 7 f r o mt h ef o u r t hd a yw a r d ，p a 巾o f t h e mb e g i nt om i g r a t ef r o mt h e g h lg o n a d st ot h el e f tv i a l h ed o r s a lm e s e n t e r y r e s u i t ss h o w e dt h a ts t a g e2 7w a sd e a d l i n eo fr e m i 酽a i i 。nb e t w e e nt w os i d e so f g o n a d 5 t h ei n c r e a s i n gt e n d e n c yo f t h eg p g c sa ft h ed i f f b r e n ts t a g e t h en u m b e ro fp g c so fr o m a nc h i c k e nw a sa l w a y sh 遮h e rt h a nt h a to f t l l es a r n es t a g cs h o u g u a n gb i a c k c h i c k e n w ec o n f e rt h a tt h i sm a yb e0 n eo fc a u s el e a d i n gi 。t h el a i d i n gr a t i oo ft h er o m a nc h i c k e ni s h i 曲e rt h a nt h a to f t h es h o u g u a n gc h j c k e n i s o l a t i o na n dp u f i c a t i o no f p g c sf r o mc h i c k e ne m b r y o s o b t a j n e d1 7 4 5 0 7 土9 54 8a n d l 4 0 1 ，8 0 士3 6 8 5p g c si ne a c he m b r y of r o mt w ok i n d so f c h j c k e ne m b r y o s a l t h es t a g eo f2 8 r e s p e c t j v e l y t h ep r o p o 九1 0 no fp g c sw a s1 9 8 a n d1 6 l r e s p e c t i v e i y a f t e r2 4 h 3 鲞堕奎堂堕堡主：羔垡笙苎 蔓塞塑垩 c u l t i v a t i o n ，o b t a i n e d51 2 5 士2 4 5 ，4 3 25 士4 27p g c sr e s p e c t i v e i y v c u l t u r eo f p g c s 加v f 打口 g p g c sc u l t u r e dt o g e t h e rw i t hg e r m i n i a ir i d g es t r o m ac e i l s ( g r s c ) o rc u i t u r e do nc h i c k e ne m b r y o f b t o b l a s tc e l i ( c e f ) w i t ho rw i t h o u ta d d i t i 。no fb f g f ( 1 0 n m 1 ) i nm 1 9 9 ( 1 0 f b s ) ，r e s u l t ss h o w e d 出a t m ea d d i t i o no fb f g fc a ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dv j a b i n t yo fp g c s ，t h ec e ff e e d e rc o m b i n e dw i t ht h e a d d i t i o no f b f g fc a ns i g n m c a n t i yi n c r e a s e dv i a b ij i t yo f p g c sa i l dp r o m o t e 寄o w t h k e yw o r d s ：c h j c k e n ：g o 瑚d a ip r j m o r d j a jg e n c ej j s ；i s o j a t i o n ；c u l t u r e 4 莱阳农学院硕士学位论文英文缩略词对照表及注释 b f g f b m p b s a c e sc e l l s c h b s s c n t f c s c v h d m e m e d t a e gc e j j s e sc e l l s f b s f n g p g c s g r s c s h i g f i h i l 一1 l l i f m 一1 9 9 m a p k p a s p b s p c e f p i 一3 k p m e f s c f s d f s s e a 一1 t g f b 英文缩略词对照表及注释 b a s i cf l b r o b l a s tg r o w mf a c t o r b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n b o v i n es e n 】ma i b u m i n c h i c k e ne m b r y o n j cs t e mc e l l s h a n k sb a l a n c e ds o l ts o l u t i o n c i l i a n yn e u t o t r o p h i cf a c t o r c h i c k e ns e r u m c h i c k e nv a s ah o m o l o g u e d u l b e c c o sm o d i f i e de a 9 1 em e d i u m e 也y l e n e d i a m i n e t e 拓a a c e t i ca c i d e m b r y o n i cg e 肌c e l l s e m b r y o n i cs 把mc e l l s f e t a lb o v i n es e m m f i b r o n e c t i n g o n a d a lp r i m o r d i a lg e r mc e l l s g e m l i n a lr i d g es t r o m ac e l l s h u m a ni n s u l i n l i k eg r 0 、v t hf k t o r i h u m a l li n t e r l e u h n ll l e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r t i s s u ec u l t u r em e d i u m l9 9 m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i i l a s e p e r i o d i ca c i ds c h i f fr e a c t i o n p h o s p h a t e - b u 恐rs a i i n e p r i m a r yc h i c k e ne m b r y o n i cf i b r o b l a s t p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 一k i n a s e p r i m a r ym i c ee m b r y o n i cn b r o b l a s t s t e mc e l lf a c t o r s t r o m ac e l ld e r i v e df a c t o r s t a g es p e c i f i ce m b r y o n i ca n t j g e n 一1 t r a n s f o r m i n gg m w mf a c t o r p 碱性成纤维细胞生长因子 骨形成蛋白 牛血清白蛋白 鸡胚干细胞 h a n k s 平衡盐溶液 睫状神经生长因子 鸡血清 鸡v a s a 基因同源物 d u l b e c c o s 改良培养基 乙二胺四乙酸 胚胎生殖细胞 胚胎干细胞 胎牛血清 纤粘连蛋白 性腺原始生殖细胞 性腺基质细胞 人源类胰岛素生长因子一1 人源白介素一1 1 白血病抑制因子 组织培养基 丝裂原激活蛋白激酶 过碘酸希夫反应 磷酸盐缓冲液 原代鸡胚成纤维细胞 磷脂酰肌醇3 激酶 原代鼠胚成纤维细胞 干细胞因子 基质细胞来源因子 阶段特异性胚胎抗原一1 转化生长因子一b 5 莱阳农学院硕士学位论文h u舌 日u舌 二十世纪生命科学研究取得了一系列突破性的进展，如电子显微镜的应用，d n a 双螺旋结构的阐明，中心法则的提出，限制性内切酶的发现及随后建立的d n a 重组技术， 使人们能够从细胞和分子水平上揭示生命的本质，而且随着对生命本质认识的逐步深 入，有目的地改造生命的细胞工程及基因工程技术的飞速发展。使生命科学领域取得了 举世瞩目的成就，如1 9 5 1 年精子获能现象的发现，随之建立的卵母细胞的体外成熟和体 外受精技术以及试管动物的问世，胚胎干细胞的建系和分化调控，转基因技术与动物生 殖工程技术的结合，为动物克隆、转基因等有目的地改造生命奠定了基础。 家禽具有个体小、世代间隔短、种群维护容易、生产能力高、禽蛋中蛋白含量高且 易分离等特点。转基因技术对禽类而言，无论在生产性状的改良、抗病育种、保存遗传 资源，还是在基础理论研究上都具有独特的优势和光明的前景。但是，由于禽类具有独 特的生殖解剖结构和生殖生理特点，致使许多转基因技术不适用于禽类转基因。 近年来研究表明，禽类生殖系嵌合体技术中的供体细胞p g c s 可以代替受精卵 和早期胚胎而首先在体外进行遗传操作m 6 ，1 2 1 ，1 2 4 ，1 2 孔。且利用p c c s 作为外源基因载体进 行转基因有许多优点：如由于禽类具有特殊的p g c s 迁移路径，p g c s 容易得；可以实现外 源基因的定点整合，从而避免了随机整合、整合不表达或异常表达的弊端；性腺中的生 殖细胞一旦携带外源目的基因，就可能世代遗传；一旦技术成熟，适于大批量生产。因 此，利用鸡胚p g c s 作为外源基因载体通过制各种系嵌合体以获得转基鸡是禽类转基因 最有潜力的手段之一0 3j 。其次，p g c s 可被长期低温冷冻保存，解冻后移入受体胚胎， 仍可得到生殖系嵌合体眦1 0 3 川”。因此，利用冷冻的p g c s 制各种间嵌合体的技术对于在 突发灾难或自然繁殖条件下处于濒危的禽类的保种及扩繁方面有更为特殊的意义。 我国是世界上禽类遗传资源最丰富的国家之一，禽类遗传资源保护，禽类输卵管生 物反应器制作，高产、优质及抗病家禽新品种培育，无疑均具有深远的意义。而获取大 量的原始生殖细胞是这三方面的应用研究得以开展的前提条件。鸡胚性腺中p g c s 数目 较多且易于采集，而且再经过分离培养可得到更多的p g c s 以满足对实验材料的需求。 所以，本试验利用稀有地方品种寿光鸡和普通品种罗曼鸡为试验材料，探索性 腺原始生殖细胞的分离纯化和体外培养的合适条件，为生产生殖系高转移率嵌合体鸡及 进一步生产转基因鸡等方面的研究奠定基础。 莱阳农学院硕士学位论文 禽类胚胎学基础 1 禽类胚胎学基础 1 1 禽类卵子的结构组成 禽类的卵子为典型的端黄卵，含有大量的卵黄，呈球形。直径3 4 c m ，卵黄顶部有 一直径3 。4 n m 的白色圆盘状区域称为胚盘( b l a s t o d i s c ) 。卵子的细胞质很少，除一层薄 薄的细胞质包裹于卵黄外，其余主要集中于胚盘部位，细胞核、细胞器以及脂滴和糖原 颗粒等都位于胚盘的细胞质内 8 】。卵黄由黄卵黄和白卵黄构成，由白卵黄形成卵黄心， 从卵黄心到动物极，末端略膨大，延伸部分称为卵黄心颈。膨大部分称潘氏核，此核位 于胚盘之下。卵黄蛋白主要有卵黄生成素和载脂蛋白，他们主要在肝脏中合成，并积聚 于卵黄，于排卵前几天合成。 1 2 禽卵的受精 禽卵的受精部位为输卵管的漏斗部，与哺乳动物不同，禽类的精子在雌性生殖道内 无获能现象，受精时也无严格的多精受精阻止机制。因此，一般每个卵子中有3 1 0 个精 子入卵形成若干个雄原核。可是，其中只有一个雄原核与雌原核融合形成合子完成受精。 融合后的原核位于胚盘正中，其他未融合的雄原核位于胚盘的边缘，不久消失。因此， 禽类属于多精入卵单精受精( p 0 1 y s p e n i l y ) 。 1 3 禽类胚胎早期发育 目前，禽类的胚胎发育分期主要采用两种分类方法：一种方法是由e y a l g i l a d i 和 k o c h a v ( 1 9 7 6 ) 根据受精卵在母体内发育的情况而制定的，共分1 4 期，均以罗马字母i x 表示。另种分期方法是由h 锄b e r g u r 和h a r n i l t o n ( 1 9 5 1 ) 制定的，其将产出的受 精卵在3 8 小件下孵育2 l 天出雏为止，共分为卜4 6 期，均以阿拉伯数字卜4 6 表示。 子宫期( s t a g ef x ) 由于禽类的卵为端黄卵，雄原核与雌原核融合后的合子位于 胚盘正中，所以卵裂仅在胚盘处进行，故称为盘状卯裂。卵裂前，胚盘是一个白色圆形 区域，直径约3 m m ，中央区稍透明，四周稍暗。精子入卵后3 5 h 进行第一次卵裂，以后 几次的卵裂方向基本相互垂直，到第六次卯裂时开始不规则。最早的卵裂为不完全卵裂， 仅在中央区进行，以后才逐渐扩展到胚周区。随着卵裂的进行，中央区的细胞层数不断 增加，胚周区的细胞层数减少，胚盘的分裂球不断增加，其下的分裂腔也逐渐明显。一 般情况下，卵刚产出时胚盘处于第x 期，相当于其他动物的囊胚期。此时胚盘大约有 6 0 0 0 0 个细胞，其中半数以上的细胞将来发育成胚外组织j 。由于禽类分裂腔的形成方 莱阳农学院颈七学位论文禽类胚胎学基础 式与其他动物不同，为区别于其他动物的囊胚腔，又因其位于胚盘下，故称为胚盘下腔 ( s u b e r o n i cc a v i t y ) ：此时，胚盘外观上形成了两个透明度不同的呈同心圆状的区域： 在胚盘中央的细胞被胚盘下腔将其与卵黄隔开，从而显得明亮，称为明区( p e l l u c i d a a r e a ) ：明区周围较宽的带仍与卵黄相连，透明度差，故称为暗区( o p a q u ea r e a ) 。 子宫期胚胎大约发育2 4 小时到达第x 期，伴随胚胎的发育依次经过输卵管的漏斗 部、膨大部、峡窄部及子宫部，为浓卯白和稀卵白所包围，在两端各形成一条卵带，它 使悬浮卵白中的卵黄能保持一定的位置，使胚盘始终位于卵黄上方，内、外壳膜包于卵 白外，随后蛋壳形成。卵在子宫部一直保持锐端向下的位置，到临产时旋转1 8 0 。，以钝 端先行产出。产卵使胚盘的发育环境发生了显著变化。产出后的受精卵出子宫的液态环 境变成了截然不同的气态环境，其发育所需的温度也由4 1 4 2 降到3 7 3 8 。 新产受精卵的发育阶段并不完全处于第x 期，通常青年母鸡所产卵子滞后于成年母 鸡。青年母鸡有时产下含有第期胚盘的卵，但通常胚盘可发育到第x 期。孵化过程中， 第x 期胚盘的形态开始发生变化。胚盘随着卵裂进行而逐渐扩大，面向胚盘下腔的上胚 层细胞与胚盘分离，下陷落到胚盘下腔的卵黄表面，形成多点内陷小岛( p 0 1 y i n v a g i n a t i o n i s l a n d ) 即初级下胚层。此后，胚盘后缘紧邻于厚的镰刀形原条的前面的细胞逐渐向前 延伸与多点内陷小岛汇合形成次级下胚层1 4 “。第x i 期时胚盘的中央区分为两层上 胚层和下胚层。在原条期，初级下胚层中起源于边缘区的细胞诱导了上胚层形成原条 【1 30 1 。随后原肠作用开始，形成三个胚层，各种器官相继形成。胚体组织由上胚层分化 形成，初级下胚层的细胞分化为胚外组织。下胚层的细胞继续向前和两侧移动，构成生 殖新月( g e 衄i n a lc r e s e n t ，g c ) 的下层，最后进入卵黄囊。 莱阳农学院硕士学位论文 禽类原始生殖细胞研究进展 2 禽类原始生殖细胞研究进展 2 1p g c s 的形态 p g c s 呈圆形或卵圆形，直径1 5 2 5l l m ，以较大的体积可与体细胞明显地区分开。 细胞核偏于细胞的一端，直径8 1 0 u m 【4 6 】。细胞核内有少量异染色质，常染色质则均匀 分布。有1 2 个核仁，电镜观察表明核仁为电子致密块状结构。胞质中含有糖原颗粒， 早期均匀分布，后期呈半球状分布于一端，经过p a s 反应可被染成紫红色。因此，在 结合p g c s 的形态特点的情况下，p a s 染色法可作为鉴定p g c s 的主要方法旧1 2 3 1 。最近 发现，p g c s 除了可用p a s 、抗s s e a 1 和e m a 一1 鉴别外，还可用抗s s e a 一3 、s s e a - 4 、 整合素6 和b 1 抗体以及马铃薯凝集紊( s o j a n u mt u b e m s u m ，s t a ) 和双花豆凝集素( d o j i c h o s b i n o m sa g g l u t n ，d b a ) 等新的标记物鉴别。运用这些新开发的标记物进行双重染色可被 作为快速鉴定鸡胚p g c s 的方法l 6 ”。 原生殖细胞的形态并不是一成不变的，在不同时期，其形态、大小及其内容物略有 不同。当处于生殖新月区时，呈圆形性或卵圆形，直径1 2 2 0 u m ，细胞内有大量的卵黄 颗粒，核糖体、线粒体。进入血液循环后，呈球形，直径l o 1 6 m ，细胞表面有少量微 绒毛，卵黄颗粒减少，脂滴糖原增多。进入生殖原基后，p g c s 拉长，并有伪足，直径 为1 0 一2 5 “m ，糖原颗粒数锐减，高尔基复合体和内质网发达。卵黄和糖原颗粒减少说明 原始生殖细胞在迁移过程是消耗能量的。 2 2p g c s 起源及迁移 2 2 1p g c s 起源 动物个体的细胞可分为两类，即生殖细胞与各种体细胞。生殖细胞担负着物种繁衍 的重要使命。它起源有两种方式：一种方式是在胚胎发育的后期，由相邻器官、组织、 细胞的诱导或外界环境的影响，生殖细胞由体细胞分化出来，这种方式普遍见于海绵、 腔肠、扁虫、苔藓和有尾两栖类动物；另一种方式是受精卵中含有源于母体的生殖质 ( g e 皿i n a lp l a s m ) 类物质，受精卵的不对称分裂导致含有生殖质的细胞将来发育成生殖 细胞，如许多昆虫，棘皮动物和大部分脊椎动物。生殖质由来自母体的线粒体编码的大 r r n a 、纤维蛋白因子、m i a 等构成，调控未来生殖细胞的基因表达、控制细胞的分 化方向和正确的迁移路径队6 2 1 。 目前在禽类卵子中尚未找到类生殖质物质，也不清楚禽类p g c s 属于哪一种起源方 式。电镜下观察发现，经孵化3 6 小时( 第1 0 期) 的鸡胚生殖新月区的p g c s ，其细胞核 莱阳农学院硕士学位论文禽类原始生殖细胞研究进展 内、核膜间及胞质内发现有一种圆形的电子致密小体，这些颗粒由点状电子致密点构成， 包埋于特别致密而盘曲的海绵状的纤维中，结构与其他动物的生殖质颗粒极其相似。它 是由核内产生，进入核周池，借核膜破裂方式进入细胞质mj 。由于鸡p g c s 在第x 期就 已形成，而类生殖质是在第1 0 期胚胎中发现的，所以还是无法确定鸡胚p g c s 的形成方 式。近年来在果蝇的生殖细胞中分离到v a s a 基因，其在果蝇生殖系的形成中起关键作用。 t s u n e k a w a ( 2 0 0 0 ) 等邮6 j 在鸡体内分离到v a s a 的同源基因c v h ，发现c v h 蛋白在鸡的性 系细胞中特异性表达。用c v h 蛋白制各的抗体在胚胎期p g c s 和性成熟后的精子、卵母 细胞的胞质中分别检测到c v h 蛋白。在早期卵裂时c v h 蛋白存在于卵裂沟的基部，在x 期时有3 0 个细胞、下胚层有4 5 6 0 个细胞、原条期生殖新月有2 0 0 2 5 0 个细胞能够表达c v h 蛋白。 为了弄清楚p g c s 的起源方式，在研究的早期人们利用x 期前后胚胎的体外培养结 合化学染色和免疫组织化学方法，对p g c s 在胚胎中的发生的时空顺序进行了跟踪研究。 e y a l g i i a d i ( 1 9 7 6 ) 等证明p g c s 来自上胚层。s u t a s u r y a ( 19 83 ) 等利用抗体标记证明了 p g c s 存在于明区的下层m ，并通过分别培养第x i 一4 期鸡胚的上、下胚层发现，在原 条形成时p g c s 逐渐由上胚层移向下胚层。g i n s b u r g 和e y a l g i l a d i ( 19 87 ，1 9 8 9 ) 等”j 将x i 期鸡胚明区的中央盘、暗区和边缘带进行分割培养，发现多数p g c s 来自胚盘明 区的中央盘，分散分布，大约有1 5 0 一2 0 0 个，并证明早在x 期就已决定它的发生。k a m g e n c ( 19 9 6 ) 等【8 0 j 将v 期胚盘分割后在卵黄膜上培养，发现p g c s 出现伴随有明区发生， 表明p g c s 的出现与明区的形成密切相关。k a g 锄i ( 1 9 9 7 ) 等i 7 5 】利用微玻璃针取出中央 盘区7 0 0 个细胞后发现至1 5 期胚胎每微升血液的p g c s 数目由5 1 个减少到1 3 个。进一步证 实了p g c s 主要来自胚盘明区的中央盘。利用v 一胚盘细胞移植制备嵌合体，嵌合程度 也证明了这一点，即明区的形成是体细胞和生殖细胞分化的决定事件。 2 2 2p g c s 的迁j f 多 2 2 2 1p g c s 的迁移路径 所有的羊膜动物的p g c s 都起源于性腺之外，虽然其产生的部位和迁移的路径不尽 相同，但最终一定要聚集并通过背肠系膜迁移到生殖原基，在其中进行分裂分化成生殖 细胞和配子。鸟类的p g c s 起源于x 期胚胎上胚层【5 0 8 0 1 。从x l 期开始p g c s 由上胚 层向下胚层迁移，并由下胚层转移到原条时期( 4 期) 的生殖新月部位【50 ，”“。从x i i i 期到4 期，p g c s 在上下胚层中的比例由9 0 和1 0 转变为2 0 和8 0 【5 0 j 。接着p g c s 从生 殖新月区的内胚层脱离，位于内、外胚层之间。当l o 期胚胎的胚外中胚层侵入生殖新月 区形成血岛时，p g c s 进入血岛。1 2 一1 3 期时胚胎血管形成并建立血液循环，p g c s 进入血 莱阳农学院硕士学位论文禽类原始生殖细胞研究进展 液，随血液循环到达生殖原基附近。1 5 期时，大部分p g c s 从脐肠系膜动脉以主动迁移 的方式穿过内皮间隙到达脏中胚层，并通过背肠系膜的间叶细胞进入生殖嵴内定居并开 始活跃地增殖，组成未分化的性腺5 4 ，5 ”。 禽类p g c s 在各个时期的数目因种类、品种而异。鹌鹑在第x 期的胚盘中仅有几个 p g c s ，2 3 期时增加到9 0 个，8 9 期在生殖新月区有几百个，在1 4 期胚胎每微升血液中约 含1 0 4 个p g c s 。在1 3 1 4 期莱航鸡胚胎每微升血液含5 0 个p g c s ，而同期麻鸭胚胎血液 中仅有3 0 个p g c s ，野鸡有3 1 4 个。尽管存在差异，但大部分禽类在1 3 1 4 期胚胎血液 中p g c s 数目达到最高值。生殖原基中的p g c s l 5 期开始增多，到1 7 2 1 期( 孵化3 天左右) 可达1 0 0 0 个左右【2 7 j 。2 7 期( 孵化5 天) 时，可达2 0 0 0 个左右3 引，此时的比例约为5 。根 据n a l 【a m u r a ( 1 9 88 ) 等【”7 j 的研究，在正常发育情况下约有2 0 p g c s 不能到达性腺，而 到达其它组织，其中9 0 进入头部神经管周围的间质中。这可能是因为头部微血管网发 育早且发达，导致原始生殖细胞进入其内。但是其命运和生理意义尚未解明。 禽类胚胎发育到第2 2 期，脏壁中胚层增厚，并沿体腔壁向中肾部迁移，最后终止于 中肾附近构成生殖原基。p g c s 于1 5 期开始陆续进入生殖原基。迁入初期，p g c s 均衡分 布于两侧生殖原基中，但孵化4 天后p g c s 出现不均衡分布，不论雌雄个体，p g c s 主动由 右侧迁移到左侧性腺中，最终6 5 p g c s 定居于左侧性腺口”。这时的性腺由生殖上皮和 p g c s 构成。早期的两性性腺形态和组织结构上很相似，并且具有发育成任何一种性腺 的潜能。随着p g c s 的迁入，性腺开始分化。将分化为卵巢的性腺中的p g c s 分布于皮质 区，分化为睾丸的性腺中的p g c s 分布于髓质中。p g c s 在性腺定居后，进入有丝分裂期， 在雌性中很快就开始减数分裂，左侧卵巢中的p g c s 分化为卵原细胞开始卵子发生，右 侧卵巢开始退化，雄性减数分裂开始较晚，在孵化l l 天后开始分化为精原细胞，并且直 至性成熟才完成。 2 2 2 2p g c s 迁移机制 p g c s 的迁移机制包括迁移的时空顺序、运动动力、迁移的方向的确定、与组织细 胞间的相互作用等多个方面。与哺乳动物比较，禽类的迁移距离很长，涉及的因素很多， 主要有主动迁移、被动迁移、生殖原基的趋化、细胞外基质和细胞因子等四个方面的作 用。 1 ) 主动迁移作用 p g c s 在组织间的迁移过程具有主动变形运动能力，k u w a n “1 9 8 3 ) 和w y l i e 等 ( 1 9 7 9 ) 发现体外培养的人和爪蟾的p g c s 有主动迁移现象。a n d o 和f u j i m o t o ( 1 9 8 3 ) 引利 用透射电镜观察到了p g c s 黏附于血管内表面，然后产生一个膨大的伪足通过血管内皮 的缝隙进入脏壁中胚层向生殖原基迁移。k u w a j l a ( 1 9 8 7 ) 用扫描电镜观察了多个时期 莱阳农学院硕：b 学位论文禽类原始生殖细胞研究进展 p g c s 的迁移行为，发现p g c s 首先在生殖原基侧伸出一伪足，然后伪足增长和膨大，大 部分细胞质流向膨大的伪足，留下纤细的细胞质尾巴再汇合入主要的胞质中。将1 3 1 6 期鸡胚p g c s 培养于发育至4 0 期的鸡肠系膜中胚层组织为饲养层的细胞上，发现p g c s 沿 饲养层细胞的长轴方向进行类阿米巴方式移动，平均速度为2 6 3 微米小时，运动中的 p g c s 形状不规则，表面有微绒毛和伸长的伪足，表明p g c s 具有自主运动能力。 2 ) 被动迁移作用 p g c s 在胚胎发育过程中随形态发生变化而被动迁移，居于上胚层的p g c s 在一x m 期向逐渐形成的下胚层转移，随下胚层迁移到生殖新月部位，血液循环系统建立后进入 血流，随血液循环到达生殖原基。k u 锄a 和r o g u l s k a ( 1 9 9 9 ) 【8 9 】将与p g c s 体积大小相近的 花粉粒子注入1 3 1 9 期鸡胚血液中，2 4 小时后检查发现花粉粒子离开血液，大部分进入 头部和将要形成性腺的区域，而且在体腔角、背肠系膜根部也发现部分粒子，但在性腺 中未发现。进一步研究发现，花粉粒子的分布与血管网的发达程度有关。在1 6 期胚胎， 花粉粒子的2 3 分布于性腺附近，6 0 在头部；而在同期胚胎，p g c s 的7 4 6 在性腺附 近，2 4 8 在头部。 3 ) 生殖原基的趋化作用 生殖原基对迁移中的p g c s 具有趋化作用，s i m o n 等第一次提出生殖原基通过产生 一种化学物质引诱p g c s 向生殖原基定向迁移，体外和体内的实验也都证明这种作用的 存在。d u b o s i s 等( 1 9 7 6 ) 将发育中的性腺移植到受体生殖原基附近的体腔中，发现供 体的p g c s 在靠近移植部位的受体性腺侧聚集。k u w a n a 等( 1 9 8 4 ，1 9 8 6 ) 【8 7 ，8 8 j 将p g c s 在体 外与胚胎性腺、神经管、尿囊、肝脏的原基作等距离培养，发现p g c s 产生伪足向生殖 原基作定向移动，表明生殖原基确有一种吸引p g c s 的能力。而且1 3 2 2 期胚胎生殖原 基均具有这种吸引作用，其中1 3 期胚胎吸引作用最强。若将p g c s 培养于缺乏生殖原 基的胶原蛋白培养基中，p g c s 限定在一定范围内随机无特定方向迁移。k u w a n a 和 r o g u i s k a 【8 9 1 ( 1 9 9 9 ) 将1 2 一1 6 期鹌鹑生殖原基移植到去除卵黄囊动脉以后区域的8 一1 7 对体 节鸡胚的视泡与听窝之间，培养4 8 h 后发现鹌鹁生殖原基对失去生殖原基鸡胚p g c s 同 样具有吸引作用，且1 6 期的吸引作用最强，l o 3 的鸡胚p g c s 进入移植后的鹌鹑生殖 原基，且迁移期之后的生殖原基似乎失去了对受体鸡的p g c s 的吸引能力。r o g u l s k a 等 ( 1 9 7 1 ) 【坦7 1 将含有鼠p g c s 的背肠系膜组织移到鸡胚体腔的后部，发现鼠p g c s 向鸡的生 殖原基移动。这说明诱导p g c s 的迁移的物质无种的特异性。fu j i m o t o ( 1 9 8 4 ) 将2 2 5 天的胚胎p g c s 和同期的生殖原基一起培养，发现p g c s 向生殖原基迁移，并最终到达 生殖原基。李赞东【”7 1 f 2 0 0 1 1 通过微注射法移植鸡胚盘细胞制备了麻鸭一鸡嵌合体其中一 只雄性嵌合体经后代检测证明为生殖系嵌合体，表明麻鸭生殖原基对鸡胚p g c s 也有诱 莱阳农学院硕士学位论文禽类原始生殖细胞研究进展 引作用。李赞东【1 5 6 】( 2 0 0 3 ) 将用p k h 2 6 荧光色素标记鸡胚血液中的p g c s 并微注射到 鹌鹁胚盘中，发现荧光标记的鸡p g c s 在微注射4 8h 后移动到鹤鹑胚胎生殖原基附近聚 集。以上证据都说明了生殖原基确实对p g c s 具有吸引作用。目前，这种吸引作用的机 理尚不清楚，d u b i o s 等1 5 引认为可能是一种化学类固醇类物质。近年来，在小鼠p g c s 迁 移的研究中发现，鼠生殖原基可产生一些趋化因子如t g f b l ，能够对p g c s 产生趋化作 用口”。当在含生殖原基的培养基中加入t g f b l 抗体时，即使抗体浓度很低也能阻止整 个生殖原基的吸引作用。另外，t g 耶1 刺激迁移路径上的体细胞分泌细胞外基质分子有 利于p g c s 迁移，业已证实t g 耶l 能促进f n 的分泌，也刺激其他细胞外基质的分泌和 受体合成【4 】。禽类是否存在这种机制尚待研究。 4 ) 细胞外基质和细胞因子的作用 细胞