（发育生物学专业论文）ft、fd与soc1对ap1基因表达调控的研究.pdf

摘要 摘要 目前已发现的调控植物开花过程的分子遗传学途径主要有四个：光周期途 径、春化途径、自主开花途径和赤霉素途径。相关报道表明各个信号转导途径间 存在着复杂的网络联系，共同影响植物的发育和开花时间。 本研究以四种拟南芥转基因植株：3 5 s ： a p l 3 x h a ；3 5 s ：a p l 3 x h a f i - l o ；3 5 s ： a p i 3 x h a f d 3 ；3 5 s ：a p l - 3 x h as o e l 及三种突变体a p l ；f d 3 ；s o c l 为实验材 料，采用g a t e w a y 克隆系统，荧光定量p c r ( r e a l t i m ep c r ) 及免疫杂交 ( w s t e m b l o t t i n g ) 技术，研究了f t , f d , s o c l 对a p l 在转录和翻译水平上的调 控以及对表型的影响，为进一步研究拟南芥开花的信号转导的网络系统提供新的 证据。获得的主要结果如下： l 、构建质粒p k 2 g w 7 - p a p l - a p l 3 x h a 并转化a p l 突变体，能够将a p l 突 变体的表型恢复成哥伦比亚野生型的表型。 2 、对3 5 s ： a p l 3 x h a 和3 5 s ： a p l 3 x h af t - 1 0 的表型、m r n a 和蛋白水平 比较，得知在序j d 突变体中超表达a p i 的表型消失，开花时间推迟，而且在a p l m r n a 和a p i 蛋白的量均减少。 3 、利用p r o t e a s o m e 抑制剂m g l 3 2 ，m g l1 5 对转基因植株3 5 s ：a p i 3 x h a 肛j d 进行处理，发现a p l 蛋白的量在回升，在处理后3 小时达到最高。说明刀 基因抑制a p i 蛋白通过蛋白酶体的降解。 4 、对3 5 s ： a p l 3 x h a 与3 5 s ： a p l 3 x h a f a 3 或3 5 s ： a p l - 3 x h as o c l 的表型、 m r n a 和蛋白水平比较，得知在触或s o c l 突变体中超表达a p l 的表型消失， 开花时间推迟，而且其a p lm r n a 和a p i 蛋白的量均减少。 我们的结果表明开花时间基因忍f d 和舳c j 分别在转录后水平和翻译 水平调控花原基特异性基因a p i 的表达。 关键词：拟南芥：a p i 基因 a b s t r a c t a b s t r a c t t h e r ea r ef o u rp a t h w a y st h a tc o n t r o l l i n gt h e f l o w e r i n gt i m ei np l a n t s ， i n c l u d i n gp h o t o p e r i o dp a t h w a y , v e n a l i z a t i o np a t h w a y , a u t o n o m o u sp a t h w a ya n d g i b b e r e l l i np a t h w a y s of a r ，s o m er e p o r t sh a v es h o w nt h a tt h ec o m p l e xa n do r d e r l y i n t e r a c t i o nb e t w e e nd i f f e r e n ts i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y sd u r i n gp l a n tf l o w e r i n g i nt h e s t u d y ， f o u r a r a b i d o p s i st r a n s g e n i cp l a n t si n c l u d i n g 3 5 s ：a p l 3 x h a ；3 5 s ：a p l - 3 x h af t - l o ；3 5 s ：a p l - 3 x h af d 3 ；3 5 s ：a p l 3 x h as o c l a n d a p l f d 3 ；s o c lm u t a n t sa r eu s e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s w i t l lt h em a j o rt e c h n o l o g i e s o f g a t e w a yc l o n i n gs y s t e m ，f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r ( r e a l t i m e p c r ) a n d i m m u n o h i s t o e h e m i c a lh y b r i d i z a t i o n ( w e s t e r n b l o t t i n g ) ，w eh a v es t u d i e dt h e r e g u l a t i o n m e c h a n i s mo fa p le x p r e s s i o nb yf t , f da n ds o c l g e n e a t p o s t t r a n s c r i p t i o n a l a n dp o s t t r a n s l a t i o n a ll e v e l s t h er e s u l t s h e l p u st ob e t t e r u n d e r s t a n dt h ef l o w e r i n gt i m er e g u l a t i o ni na r a b i d o p s i s t h em a i nr e s u l t sa r e 嬲 f o l l o w s ： 1 p a p i ：a p l 3 x h ac o n s t r u c t i o nw a st r a n s f o r m a t e di n t oa p lm u t a n ta n dc a n r e s u m ea p lm u t a n tp h e n o t y p et oa r a b i d o p s i sc o l u m b i aw i l d - t y p ep l a n t 2 3 5 s ：- a p l 3 x h aw a sc o m p a r e d 、i t l l3 5 s ： a p l 3 x h a 户1 0p l a n t sa b o u tt h e p h e n o t y p e 、a p lm r n aa n da p lp r o t e i n 3 5 s ： a p l 3 x h a 孬一1 0p l a n tl o s tt h e p h e n o t y p e sa p l o v e r e x p r e s s i o n a n dw a sa l s ol a t ef l o w e r i n g ，i t sa p im r n al e v e la n d a p 1p r o t e i nl e v e la l s od e c r e a s e d l 3 w h e n3 5 s ：a p l - 3 x h a 声1 0s e e d l i n gw a st r e a t e d 诵t l lp r o t e a s o m e i n h i b i t o r sm g l 3 2 ，m g l1 5 ，i t sa p lp r o t e i nc o n t e n tg r a d u a l l yi n c r e a s e dt h r e eh o u r s l a t e ra f t e rt r e a t m e n t i ts u g g e s t e df tg e n ei n h i b i t st h ed e g r a d a t i o no fa p lm e d i a t e d b yp r o t e a s o m e 4 i nf a 3o rs o c lm u t a n tb a c k g r o u n d ，3 5 s ：a p l 3 x h ac a l ln o ti n d u c e e a r l y i n gf l o w e r i n ga n y m o r e a n dt h e i ra p lr n r n a l e v e la n da p1p r o t e i nl e v e lw e r e a l s od e c r e a s e d 2 a b s t r a c t i nc o n c l u s i o n , o u rr e s u l t ss u g g e s tf l o w e r i n gt i m eg e n ef t ，f da n ds o c l r e g u l a t e a p l e x p r e s s i o n a t p o s t t r a n s c r i p t i o n a l a n d p o s t t r a n s l a t i o n a l l e v e l s ， r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ；a p lg e n e 3 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为(黄诗) 课题( 组) 的研究成果，获得( 黄嚼 ) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 生物以官f d 7 包 ) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：叶金炎 1 年r 月多1 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( x ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：叶金炙 刁年内7 日 第一章前言 第一章前言 1高等植物花器官的形成 开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的一个重要生理过程，严格受 内源发育信号和环境因子的调控，这种调控的复杂性形成一种网络信号途径【1 1 。 近年来通过对拟南芥突变体的研究、基因的分离及功能分析，使人们对开花的分 子机制有了新的认识【2 1 。这些理论对高等植物开花时程控制的分子机理具有普遍 的指导意义和应用意义【3 1 。花的发育可分为3 个阶段【4 】： 第一个阶段是成化决定，进行着营养生长的植物感受外界环境信号及自身产 生开花信号，向生殖生长转变 第二个阶段是形成花原基，茎端分生组织转变为花分生组织，由诱导状态向 分生组织的转变 第三个阶段是花器官的形成及其发育，花分生组织中的细胞进一步分化成不 同的花器官。 1 1 成花诱导的多因子途径： 1 1 1 光周期途径( p h o t o p e r i o d i ep a t h w a y ) 植物对昼夜相对长度的反应称光周期现象( p h o t o p e r i d i s m ) ，日照长度( 即光 周期) 是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 是一种兼 性( f a c u l t a t i v e ) 的长日照植物，在长日条件下会提早开花，但在短日条件下推迟开 花。 叶片是植物感受光周期的部位，植物通过光受体( p h o t o r e c e p t o r s ) 来感受可见 光。光敏色素( p h y t o c h r o m e s ) 感受红光( r ) 和远红光( f r ) ，隐花色素( c r y p t o c h r o m e s ) 感受蓝光和紫外光a 【5 1 。光敏色素和隐花色素存在于高等植物的所有部分，是植 物体本身合成的一种调节生长发育的色蛋白。拟南芥的光敏色素蛋白质的多基因 家族中至少存在5 个基因：p h y a ，p h y b , p h y c , p h y d , p h y e 5 1 。隐花色素是植物 中对蓝光诱导的反应，是不同于光敏色素的另一个吸光色素系统。在藻类、真菌、 4 第一章前言 苔藓、蕨类和种子植物中都找到了有隐花色素的存在，有c r y i 和c r y 2 两个基因 【4 j o 光周期途径开始于光受体p h y a 和c r y 2 感受光信号，随后光受体将此信号 与体内的昼夜节律钟( c i r c a d i a nc l o c k ) 联系起来，产生昼夜节律( c i r c a d i a n r h r d _ 1 m ) t 4 1 。促进开花的基因 如c o n s t a n s 纠】被激活，调控下游的花分生组织 决定基因表达，实现开花【2 1 。光质影响开花时间，红光抑制开花，而远红光和蓝 光促进开花 6 1 。p h y a 可以区别远红光和黑暗；它不仅可以感受日长变化，还可 以在诱导性光周期时促进开花，而p h y b ，p h y d 和p h y e 抑制开花【7 1 。蓝光通过 c r y 2 和c o n s t a n s g ! ) 促进开花。c r y 2 是c o 对光周期反应的正调因子，而c r y 2 和光敏色素在调节c o 基因表达方面相互拮抗【3 】。c r 砣通过抑制p 闭旧介导的红光 开花而促进开花 9 1 。光受体除了有相互拮抗作用外，在调节开花起始中还有冗余 作用，例如p h y b ，p h y d 和p h y e 以冗余的方式抑制开花，而c r y 2 在蓝光依赖的 开花促进中和c r y l 冗余作用，p h y a 和c r y 2 蛋白在光下能突然而迅速地降低，可 能为生物钟的光暗转换提供信息【5 l 。c r y l 促进开花，p h y b 抑制c d 的表达，而 删，僳和积y 2 相互作用，而且光对c d 转录后激活导致凡d 眦足胁r g 三0 c 吣 t 仞) 转录的激活并最终引起开花【i o j 。 1 1 2 春化途径( v e r n a l i z a t i o np a t h w a y ) 低温对开花的促进作用称为春化作用f 1 1 】。感受春化作用的部位在茎生长点， 但所有活跃分裂的细胞都能感受春化【l 到。在春化反应中f l o w e r i n gl o c u s c ( f l c ) 起中心作用。f l c 是开花抑制子，而春化降低了咒c 的转录和蛋白水平， 且这种降低可以通过细胞的有丝分裂而稳定传递，但在下一代f l c 的活性又恢复 【1 2 】。f l c 编码一个含m a d s 结构域的转录因子，抑制拟南芥开花，且抑制程度与 其剂量成正比。 春化作用分二个阶段，首先响应春化低温起始抑制凡cm r n a 的表达，然 后保持这种f l c 低水平表达状态v i n 3 ( v e r n a l i z a t i o n i n s e n s i t i v e3 ) 和v r n l ( v e r n a l i z a t i o nj ) 、v r n 2 ( v e r n a l i z a t i o n2 ) 分别在这两个阶段起主要作用v i n 3 编 码一个p h df i n g e r ( 与蛋白质之间的相互作用有关) 蛋白，许多染色质重建复合体 的组分中含有p h df i n g e r t 3 , 1 4 1 。v r n 2 是果蝇p 0 l y c o m k g r o u p ( p c g ) 发育调节因 第一章前言 子跏( z ) 1 2 的同源基因， 在 s u ( 2 ) 1 2 能通过修饰染色质结构调节基因表 达f 1 5 】。v r n l 定位于核内，具有二个植物特异的与d n a 结合有关的b 3 结构域 与v r n 2 一起保持春化后f l c 的低水平表达。 1 1 3 自主途径( a u t o n o m o u sp a t h w a y ) 自主途径的突变体无论在长日照条件还是在短日照条件下都延迟开花，尤其 在短日照条件下，这种晚花表型更明显有一些突变体如：f c a ，f m ，l d ，加和 彦。自主途径的基因能抑制凡c 的表达，因此它们的突变体中f l cm r n a 的 水平都比野生型和长日照途径、g a 途径的晚花突变体中高【1 6 】。l d 编码一个核 蛋白，含有核定位信号和富含谷氨酸结构域，可能有转录激活功能，在茎端和根端 表达量最高。它对开花时间的调节至少部分是通过调控三刀的表达实现的【1 7 1 。 f p a ，f c a 和f l k 都编码r n a 结合蛋白与f c a 和f p a 具有多个r n a 识别位点( r n a r e c o g n i t i o n m o t i f s ，r r m s ) 的r n a 结合蛋白不同，f l k 是具有三 个k hm o t i f s 的r n a 结合蛋白f l k 和f c a 都定位于核内，并通过凡c 调控 整合基因刀和s u p p r e s s o ro f0 v e r e x p r e s s i o no f c oj ( s o c o 的表达 【1 8 】。通过r n a 结合蛋白月翻与多腺苷酸化因子的相互作用可能是f c a 实现自 我调控的生化机制【l 训。f p a 、f c a ，f l k 这些r n a 结合蛋白的发现说明转录 后调控可能是自主途径成员控制开花时间的一种重要的调节机制。 1 1 4 赤霉素( g i b b e r e l l i n ，g a ) 途径 赤霉素被受体接受之后，通过自身的信号转导途径来促进种子的萌发，茎干 的伸长，花的形成等。参与g a 信号传导的有3 个关键基因：g i b be r e l l i c a c i dl n s e n s l t e ( g a i ) r e p r e s s o ro fg a l 2 3 ，( r g a ) r g a 2 l i k el 厂r g a l l ) 。，它们的功能部分冗余，当g a 缺乏时都负调控g a 信号途径，而活 性g a 则能消除它们的抑制作用g a ，、r g a 和r g l l 这三个蛋白质属于植物特 异的调控蛋白中的g r a s ( g a i 、r g a 、s c a r e c r o w ) 家族。在n 一末端有一特异 保守的d e l l a 区域 2 0 l 。d e l l a 结构域的序列为g a i 、r g a 、r g l l 的功能所必 需，缺失导致一系列g a 缺陷表型。b o s s 和t h o m a s 【2 1 】对葡萄栽培品种p i n o t m e u n i e r 研究证明d e l l a 蛋白与繁殖发育有关。卵】，是g a i 上游的一个负调控因 6 第一章前言 子，编码一个类似于哺乳动物丝氨酸苏氨酸n 一乙酰氨基葡萄糖 ( o o - b i n d i n g - n - a c e t y l g l a c o s a m i n e ) 转移酶的蛋白质s p y 突变体升高的g a 水平 及早花表型可能是增强t g a 传导信号所致2 0 1 。进而促进花序分生组织基因的表 达，由此完成t g a 对开花时间的调控。 1 1 5 各种途径之间的相互联系 p e t a l s s t a m e n s c a r p e l s 图1 ：拟南芥花时基因调控遗传途径图示 注：- 抑制促进 f i g lo u t l i n eo f t h ef o u rm a i nf l o w e r i n g - t i m eg e n e t i cp a t h w a y si na r a b i d o p s i s n o t e ：“竹i n d i c a t e si n t e r a c t i o n sb e t w e e ng e n e so rp r o m o t i v ee f f e c t so ng e n e e x p r e s s i o na n df l o w e r i n g ；- q ”i n d i c a t er e p r e s s i v ee f f e c t so ng e n ee x p r e s s i o no r f l o w e r i n g 在拟南芥中存在4 个调控开花时间的遗传途径并不是孤立的，这些途径通 过整合内在发育和外在环境两方面的因素参与调控开花时剐2 2 1 。感受和传递日 照长短信号的遗传位点属于光周期途径，而感受和应答环境温度变化的遗传位 点则被定位在春化途径上【1 0 2 2 1 。另外2 条途径上的基因能够不依赖于环境信号 而调控开花其中自主途径通过应答未知的植物内部因子来促进开花，而赤霉 素( g a s ) 能够不依赖于光周期促进开花，并且在短日照下g a s 对于植物的开花 第一章前言 是绝对必需的【2 3 l 。此外，越来越多的证据也表明这几条开花调节途径通过几个整 因子，如咒s o c l 和刀互相联系 1 0 2 2 2 3 。 其中s o c l 和刀是c o 促进开花所需要的，且功能上有部分冗余。而s o c i 和刀受春化途径和自动途径所调节，所以c o 的靶基因是不同开花时间途径的 共同元件。s o c i 编码一m a d s 类转录因子1 2 4 1 。过量表达s o c l 会造成长日和短 日条件下开花提前。s o c l 和刀受f r i 和f l c 负调节，又受自主途径中的f c a 、 f v e 和l d 正调节；舳c j 还受植物年龄的正调节而并不依赖于c o 和尺翻：而 春化作用通过抑制f l c 表达而激活s o c l 。因此s o c i 整合了来自光周期、春化 和自主途径的开花信息【2 5 l 。通过f l c ，c o , s o c l ，刀等控制开花的主效基因 相互作用使这4 条途径相互联系，成为一个整体。成花转变过程中各种成花诱导 信号传递到花分生组织特异性基因a p e t a l aj 似尸砂，l e a f y ( l f y ) 后，使花形 态建成。 1 2 拟南芥开花时间基因 在一年生植物拟南芥中，c d ，刀和s o c l 是光周期途径中控制开花的必须基 因川。 刀属于一个高度保守的2 0 k d a 的完整的蛋白家族，在主要的区域都含有 r k i p s 2 6 1 。f t 在子叶和叶片的韧皮部表达【2 7 ，2 酊。 c o 编码具有两个b b o x 类型锌指( z i n cf i n g e r ) 结构的g a t a 转录因子，其 c 端有c c t 域其中c c t 域是g f p ：c o 核定位所必需的，而b b o x 与蛋白 质之间的互相作用有关c o 位于生物钟的输出途径，因而也是生物钟和开花时 间途径之间监测日照长度的重要元件 2 9 1 。 c o 每日的调控是通过c om r n a 的积累来实现的，长日条件下在一天光照 的最后达到峰值，而在短日条件下在黑暗中达到峰值【3 0 l 。而且c o 蛋白在黑暗中 是不稳定的，但是在长日下能够积累【3 l l 。在暗夜条件下c o 蛋白会被一种目前 还不清楚的机制降解，这些因素共同作用的结果使得c o 蛋白在黄昏到初夜这 段时间内积累达到较高水平。高水平积累的c o 蛋白激活了f t 基因的表达， 从而促进拟南芥在长日条件下开花。在短日条件下，c o 基因转录的m r n a 只 有在夜间时才达到很高水平，但由于夜间c o 蛋白不稳定，使得c o 蛋白不能 8 第一章前言 积累到较高水平，不能在短日条件下诱导开花【3 0 ，3 1 1 。 f t m r n a 图2 短日和长日条件下c o m r n a ，c o 蛋白和刀m r n a 的积累 f i g2 t h ec om r n a ，c op r o t e i na n df tm r n aa c c u m u l a t ei ns da n dl d c o 蛋白激活它的靶基因，在转录和翻译水平上进行调控。c o 在拟南芥中 控制开花时间通过调控刀和s o c l ，刀和舳c j 编码的蛋白类似r a f 激酶抑制 剂蛋白和一个m a d sb o x 转录因子，刀和s o c l 被c o 调控。通过构建 3 5 s ：c o ：g r 超表达c o 的植物，在放线酮存在下，通过遗传分析刀和s o c l 失 活在c o 过表达的植株中是作为强抑制物的，从而说明刀和s o c l 是c o 下游 的中间物，通过形j d 或者是s o c l 突变体，c o 过表达植株的早花现象被抑制了， 虽然微弱，说明对3 5 s ：c 0 植株早花中刀和s o c i 是必须的，在厅j d 和s o c l 双 突变体中，这种推迟开花时间加深了，相比较单个的突变体而言，f t l os o c l 3 5 s ：c o 植株的表型和c o 功能丢失很类似，说明刀和s o c j 都失活会阻止c d 的信号输出，而且没有分离到单个的突变体可以完全阻止3 5 s ：c 0 植株早花，说 明c o 调控两条平行的途径刀和s o c i ，促进开花【3 2 】。 刀基因是拟南芥诱导开花途径中的重要基因，在光周期中c o 促使刀基因 在叶脉表达，而不是在顶端分生组织中表达，刀m r n a 从韧皮部移动到顶端分 生组织，在茎尖里翻译成f t 蛋白诱导花的形成阱】。而另一种观点发现在叶片中 产生的f t 蛋白能够在嫁接中转移到接穗植株内并导致其开花，但是并未检测到 9 第一章前言 接穗中刀m r n a 的转移。因此认为刀m r n a 在叶片的韧皮组织中翻译成f t 蛋白，f t 蛋白从叶片向茎尖移动，诱导拟南芥开花【”1 。f tm r n a 和f t 蛋白 符合了在1 9 3 0 年提出的“成花素的许多的特点【3 3 1 。在目前对刀的研究中， 一般认为其在叶片中表达，经韧皮部转运到顶端与f d 一起激发下游基因诱导开 花，其中对刀转运方式的研究还不清楚，是否是以刀m 对姨的形式转运到顶 端分生组织，或与f t 蛋白结合的方式转运到顶芽分生组织参与开花诱导，还需 进一步研究。 激活或缺失刀影响s o c l 的表达，但是恢复或失去s o c l 不影响刀的表 达，在3 5 s ：f t 植株中s o c l 的表达被明显的增加了，在3 5 s ：f t 植株中s o c l 的表达和在3 5 s ：s o c l 中的表达类似，在f t l o 中s o c l 的表达降低，说明刀的 表达影响s o c l 的表达，相反，在3 5 s ：s o c l 植株中，刀的表达并没有增加， 水平和野生型中的类似，在s o c l 中，刀的表达水平也和野生型中类似，说明f t 的表达并不受s o c l 的影响，刀和s o c l 不是互相独立的，刀有可能调控s o c l 3 6 1 o f l o w e r i n gl o c u sd ( f d ) 是一个锌指转录因子，利用融合蛋白 f d ：e g f p ：f d 和f d ：e y f p ：f d 发现f d 蛋白在茎尖细胞的细胞核中出现，而且在 3 5 s ，? e y f p ：f d 刚出芽的幼苗中，其他的组织的细胞核中也有发现f 3 7 1 。说明f d 蛋白是分布在细胞核里的，没有明显的昼夜波动而且不受光周期和c o 的影响， 在长日和短日条件下，f dm r n a 水平在萌发后随时间增加【3 7 1 。 f t 和f d 蛋白同时存在与细胞核内，刀在细胞核中调控f d 的活性，f d 蛋白c 末端有一个内在的c a 2 + 依赖的蛋白激酶( c d p k s ) 的磷酸化位点，去掉 或突变这个位点都不能和刀发生作用，说明刀通过这个位点和f d 相互作用【3 8 1 。 通过在酵母细胞内和体外研究显示f d 和刀通过蛋白之间的相互作用在茎尖中 促进花的转变和诱导花的发育。f d 和刀共同调控a p l 和l f y 的表达，并且在 1 7 k b a p i 的启动子上还发现有几个潜在的锌指蛋白结合位点，f t 和f d 蛋白 相互作用并且通过f d 结合在a p l 启动子上调控a p i 的表达网。 1 3 拟南芥花分生组织特异基因 高等植物的开花转换过程一般包括营养分生组织转换为花序分生组织、花序 l o 第一章前言 分生组织转换为花分生组织2 个过程。重要的基因有三刀，a p l 、c a u l i f l o w e r 倒u 、t e r m i n a lf l o w e rjc i f l l ) 0 9 , 4 0 j 。这些基因正调节或负调节花的发育。 工f 】，编码一个转录调控因子，决定花的特征和控制花发育的启动程序【4 1 1 。 促进花序分生组织向花分生组织转变主要是激、 活a p l t 4 2 1 。但是在接着有一个彳p j 独立的中心在控制花的发育，彳川和用何以互相调控。， a p l 和c a l 编码相似的m a d s d o m i a n 转录因子，它们对花序分生组织转换 为花分生组织有重要作用【4 3 1 。而且在花序分生组织中一旦花原基发生4 尸和c a l 就相应的表达【删。 t f l l 基因通过抑制盯，a p l 、a p 2 基因在花序分生组织中的活性而维持花 序分生组织的无限生长模式【4 5 , 4 4 s ，4 7 1 。而f 】，、a p i 、a p 2 基因则抑制7 兕，基因在 花分生组织中的活性来维持花分生组织的有限生长程序，这种抑制作用可能通过 转录抑制或转录物的稳定性实现 4 8 1 。 在营养生长向生殖生长转换时，花分生组织类别基因( 三f la p l ，c a l ) 开 始表达，由它们决定侧分生组织是发育为花还是茎枝，当花发育程序起始后，a 、 b 、c 功能基因便开始在特定的区域表达，控制花器官的正常发育。 1 4 决定花器官基因 高等植物花的形成是一个由遗传和环境因子控制的复杂过程，在这个过程 中，m a d s 的基因家族起着很重要的作用。 m a d s b o x 基因包括m a d s 盒结构、i 区域、k 区域及c 终端区域。 m a d s 盒结构( 6 0a a ) 存在于所有m a d s b o x 基因n 端的一高度保守区 域。该区域有9 个氨基酸在已经发现的所有该类基因中完全保守，具有d n a 结 合序列( c a r gb o x e s ) 1 4 9 , 5 0 1 。 i 区域( a a6 0 - 8 6 ) 在各个花同源异型基因之间序列保守性很小，在决定特异 d n a 结合二聚体方面具有重要作用【5 0 1 。 k 区域( 8 7 1 5 0 a a ) 是一中度保守的序列，能够作为二聚体基元，有三个a - 螺旋结构的k 1 ，k 2 ，k 3 组成，k l 和k 2 占据整个k 区域，飚跨越k 区域c 末端 的边界【5 1 1 。形成卷曲螺旋结构，调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用是转录因 子的结构特征序列【5 2 】。 第一章前言 c 末端区域是可变化的。它可以参与调整m a d s 之间的相互作用1 5 3 】。是不 同特异性功能所必需的【5 4 】。并参与转录激活【5 5 】。和增强或稳定k 区域为媒介的 相互作用 5 6 , 5 7 】。 植物的m a d s - b o x 基因家族的成员在花发育过程中调控一些关键的步骤。 如在拟南芥中，控制花分生组织特性的3 个基因中的2 个0 尸j 和c a l ) 为 m a d s b o x 基因，其它发育时期的一些关键基因也有很多属于m a d s b o x 基因， 如a p l ，a p 3p i s t i l l a t a 例和a g 。一些m a d s b o x 基因在花分生组织特性和 花器官特性基因之间起调节作用，如a g l 2 , a g l 4 和a g l 9 。 通过对拟南芥和金鱼草的花同源异型突变体研究，m e y e r o w r i t z 和b o w m a n l 提出了花器官发育的a b c 模型【5 8 】。随后，大量花器官特征基因及蛋白特性的研 究完善了a b c 模型，形成了目前广为接收的a b c d e 模型【5 9 】【删。 i b d 踮s 删倒 ac l a s sa p l a p 2 cc l a s s a g 洲删g l ec l a s ss e pl ? s e p 2 7 s e p 3 7 s e p 4 i 萼片花瓣 雄蕊l 心皮胚珠 图3 拟南芥花器官发育的a b c d e 模型及相关基因( 引自s a n g t a e ，2 0 0 5 ) f i g3 t h ea b c d em o d e lo f f l o w e ro r g a nd e v e l o p m e n ta n dr e l a t i o ng e n eo f a r a b i d o p s i s ( q u o t ef r o ms a n g t a e ，2 0 0 5 ) 在传统的a b c 模型中，从花分生组织到花器官的形成主要由三类基因 ( a 、b ，c ) 控制【5 8 】。a 类基因参与萼片与花瓣的形成，a 类基因完全失活导致第 一轮萼片片转变为心皮，第二轮花瓣转变为雄蕊：b 类基因参与花瓣与雄蕊的形 成，b 类基因丧失功能的突变体中，萼片代替第二轮花瓣，第三轮雄蕊转变为心 1 2 第一章前言 皮：c 类基因在雄蕊和雌蕊的发育中起作用，c 类基因失活导致第三轮雄蕊转变 为花瓣，第四轮心皮转变为萼片片。a 类基因单独控制萼片的形成，a 类基因和 b 类基因共同决定花瓣的分化，b 类基因和c 类基因共同决定雄蕊的形成，c 类 基因单独控制心皮的发育。d 功能基因是a g l i i ( s t k ) ，另外的两个基因 s h p l ，s h p 2 控制着胚珠的发育。三个d 类基因分别或同时突变，都能使胚珠和 种子发育受阻，部分胚珠转化成为叶状或心皮状组织。e 类基因包括s e p a l l a t a j ( s e e l ) ，s e p 2 ，s e p 3 ，s e p 4 决定着萼片的特性。s e p l ，s e p 2 和s e p 3 三重突变 体的花瓣、雄蕊和心皮均转为萼片【6 i 】。s e p 四重突变体所有的4 个轮都转变成为 叶状结构，只残存部分类似心皮的组织，与缺少a b c 功能的三重突变体表型类 【6 2 ，6 3 1 。 1 5a p l 基因 在拟南芥中，a p l 为花序分生组织向花分生组织转变过程中所必需的基因， 编码包括- - m a d s 区域的转录因子，同时自身的表达也受到开花时间决定基因 f c a 和另一个花分生组织决定基因三刀的激活以及花分生组织决定基因刀吧j 的 抑制i 4 2 , 4 5 , 4 6 , 4 7 1 。 a p l 首先在花分生组织转化早期发生的花原基中表达，其次是在花器官萼片 和花瓣发育中表达。a p l m r n a 在花的分生组织中第一个阶段积累，但是在后来 的发育中只限制在外围的两轮如萼片和花瓣中发育【6 4 1 。 遗传学研究显示，a p i 在决定花的分生组织特性及第1 轮和第2 轮花器官的 正常发育中起作用【65 。随着花原基的增大，a p l 的表达增加，在这个阶段，a p i 在整个花分生组织中表达，但不在花序分生组织中表达。a p l 在花发育的所有阶 段的梗内均有表达1 6 6 1 。 a p l 的突变体表型为花转换成花序，花萼转变成花苞，并形成不正常的花瓣 6 7 , 6 8 , 6 9 。3 5 s ：ja p l 转化的野生型拟南芥表现次级花序枝转化为单花及出现项花 等促进开花的表型，同时出现莲座叶数目减少 6 7 , 6 8 , 6 9 l 。 a p i 和l f y 在c o 的诱导下表达，使茎端分生组织转变为花分生组织，而且 a p l 在三几，的下游发挥作用，表达晚于盯基因【硎。a p l 的表达受发育阶段和 环境的多重控制，是一个多重调控的作用位点，它的表达需要c o 和另外的长日 第一章前言 照依赖因子。表达的前期和后期均受到光周期的作用7 1 1 。豫l 籼j 进行负调 控。c a l 促进a 川的表达7 2 1 。a p l 和s e p 3 之间的互作可以促进正常的花发育。 s e p 3 的表达促进a p 珀勺表达，而表现早花表型盯3 1 。 2 泛素调节的蛋白质降解 生物体内存在着两类蛋白质降解过：一种是不需要能量的，只需要蛋白质降 解酶参与，可以将蛋白质降解为氨基酸；另一种则需要能量，它是一种高效率、 指向性很强的降解过程。泛素一蛋白酶体途径( u b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a t h w a y ) 是一 个新近受到关注的调节蛋白质降解与功能的重要系统r 7 4 】。其主要作用于细胞内一 些半衰期短的调节蛋白和一些结构异常、错构或受损伤的蛋白。其过程是以共价 键形式联结多个泛素( u b i q u i f i n ) 分子，形成靶蛋白多聚泛素链即泛素化 ( u b i q u i t i n a t i o n ) 后，再输送至l j 2 6 s 蛋白酶体上被消化降解。 2 1 泛素的结构与组成 泛素由7 6 个氨基酸组成，是一种存在于大多数真核细胞中高度保守的小蛋 白，其分子量约8 5 k d a 。泛素基因主要编码两种泛素前体蛋白质：一种是多聚泛 素，另一种是泛素融合蛋白。在不同生物体间组成泛素的氨基酸序列差别很小， 如酵母和人的泛素仅有3 个氨基酸序列的差别。 1 4 帮尊酊言 口 北m 图4 泛素的结构图”i f i g 4t h es t r u c t u r eo fu f i i q u i t i n 【7 4 2 2 泛素一蛋白酶体途径的组成 泛素活化畸e l ( u b i q u i t i n - a c t i v a t i n ge n z y m e ) 足催化泛豪与戚物结合所需 的第个酶。细胞内仪柑单的泛紊活化酶堆h 。利用4 ：j 刊的转球起始点，它可 产申e la 乖】e 1b 阿种泛素活化酶，它”j 的乍物功能町能柏所4 ：刚7 5 1 。 泛紊俏连嗍e 2 ( u b i q u i t i n c o 哪u g a f i n ge n z y m e s ) 是泛素与蛋白底物结合所 需的第二个晦。细胞内有多种泛柔偶连酶基w 。人多数泛紊偶连酶j l 一个1 4 1 6 k d 的核心含tj 活性所必需的、卜胱氨酸妓基。卉环例的泛索偶连酶间有约3 5 的 - 】源性这区城可能参与泛素俏连酶和蚩白底物的结台m 1 。 泛亲一蚩白连接酶e 3 ( u b i q u i t i n p r o t e i nf i g a s e s ) 是泛素与底物生白结含所 需的第三个酶i ”i 。 e 3 是通过识别和结合特异的靶蛋白序州或降解决定予( d e g r o n ：谀定某一蚩 白发生降解或部分降衅的序列i 。水特异性地训节靶蚩自的降解代谢。e 3 家族 t 璺f j 两类，也括 l 多数的r i n g f i n g e r 家族m 。乖i h e c t ( h o m o l o g o u s t o e 6 a p c t e r m i n u s ) 家族。r i n g f i n g e r 家族的e 3 均乜含相似的e 2 结合结构域，作为桥粱 将洁化的泛紊从e 2 自接转移到靶篮白，其本身州小与泛索发生作用”。i i i i h e c t 第一章前言 家族的e 3 除与e 2 结合外，均包含8 e c r 自 化结构域，其中保守的c y s 残基可与e 2 携带的泛素形成硫酯键，e 2 先将泛素传递给e 3 ，再由e 3 递呈给底物。 有些底物还需要泛索延长因子e 4 来达到更有效的聚泛素化唧】。 蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 是催化泛素与底物蛋白偶联体降解韵关键酶，包括2 0s 蛋白酶体和2 6s 蛋白酶体。2 6s 是由2 0s 和1 9s 复合体共j 一结合装配而成，此组装过 程需要耗能。2 0 s 蛋白酶体把蛋白降解为小