（蔬菜学专业论文）mhgai2基因在番茄中的异位表达分析.pdf

l 英文缩略表 l i i l l i i iili l llu l l i t tii i i 、t17 8 6 5 0 1 英文缩写英文名称中文名称 a m p b p c 删3 5 s t a e c d n a p v p d d h 2 0 d e p c c t a b d n a d n t p e b e c o l i e d t a g f p q r t - p c r i p t g t r n a k a n a m p i c i l l i n b a s ep a i r p r o m o t e ro f c a l i f l o w e rm o s o i cv i r u s t r i s h c i e d t ab u f f e r c o m p l e m e n t a r yd n a p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e c e t y l t r i m e r o m i d e t h y l a m m o l l o n i u m b d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e r w h 妇c o l i 氨苄青霉素 碱基对 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 t r i s 乙酸e d t a 缓 冲液 互补d n a 聚乙烯吡咯烷酮 重蒸水 焦碳酸二乙酯 十六烷基三乙基溴 化铵 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷 酸 溴化乙锭 大肠杆菌 d i s o d i u me t h y l e n d i a m i n e t e t r a c e t a t e乙二胺四乙酸 g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 q u a n t i t i v er e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n i s o p r o p y l t h i o p d g a l a c t o s i d e t r a n s f e rr n a 实时定量反转录聚 合酶链式反应 异丙基一p - d 一硫代半 乳糖苷 转运砒怆 卡那霉素 l b l u r i a b e r t a n im e d i u ml b 培养基 目录 中文摘要l 英文摘要2 1 引言3 1 1 赤霉素的发现和分布3 1 2 赤霉素的生物合成与代谢途径。4 1 3g a 的信号应答机制5 1 3 1g a 信号途径的主要组分6 1 3 2g a 受体7 1 3 3d e l l a 蛋白7 1 4d e l l a 蛋白与植物的生长发育1 1 1 4 1d e l l a 蛋白与植物的形态1 1 1 4 2d e l l a 蛋白与环境之间的互作1 2 1 5 本研究的目的和意义1 3 2 材料与方法1 4 2 1 试验材料1 4 2 1 1 植物材料1 4 2 1 2 菌株和质粒。1 4 2 1 3 酶及生化试剂1 4 2 1 4 培养基1 4 2 1 5p c r 引物15 2 2 试验方法l5 2 2 1c n 媪法提取r n a 15 2 2 2r n a 含量和纯度检测1 6 2 2 3c d n a 第一链的合成1 6 2 2 4 反转录产物质量检测1 7 2 2 5c t a b 法提取d n a 17 2 2 6p c r 扩增条件和程序1 8 2 2 7p c r 扩增产物的回收2 0 2 2 8p c r 产物的克隆2 l 2 2 9e d n a 序列测定2 3 2 2 10 质粒d n a 的酶切鉴定2 3 2 2 1 l 根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 感受态细胞的制备与转化2 4 2 2 1 2 点突变正义表达载体p b l l 2 1 a m h g a l 2 的构建。2 4 2 2 1 3m h g 触2 g f p 亚细胞定位载体构建2 5 2 2 1 4m h g a l 2 基因原核表达载体的构建2 5 2 2 1 5m h g a l 2 原核表达重组菌株的诱导表达及电泳分析2 6 2 2 16 农杆菌介导的番茄转化2 8 2 2 17 番茄继代培养2 9 2 2 1 8 转基因番茄的鉴定2 9 2 2 1 9 光合色素含量的测定2 9 2 2 2 0 番茄植株外源喷施g a 处理3 0 2 2 2 1 番茄生长数据统计3 0 2 2 2 2 番茄干旱处理3 0 3 结果与分析3 0 3 1 苹果m h g a l 2 基因的扩增3 0 3 1 1r n a 的提取和质量检测3 0 3 1 2 反转录产物质量检测3 0 3 1 3m h g a l 2 基因的扩增31 3 2a m h g a l 2 定点突变序列分析及表达载体p b l l 2 1 & m h g a l 2 的构建3 1 3 3m h g 烈2 蛋白的亚细胞定位3 2 3 4 胁g 4 口基因的原核表达。3 3 3 5a m h g a l 2 转基因番茄的鉴定。3 4 3 64 彻g 么尼过量表达番茄植株的g a 响应3 5 3 7a m h g a l 2 转基因番茄的表型分析3 6 3 8a m h g a l 2 转基因番茄干旱逆境分析3 9 4 讨论4 0 5 结论。4 3 参考文献4 4 附录5 2 致谢5 5 攻读学位期间发表和形成的学术论文5 6 l i i ， 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 赤霉素( g i b b e r e l l i ca c i d ，g a ) 调控植物生长发育的各个方面，包括种 子萌发、下胚轴伸长、叶片生长和开花等。d e l l a 蛋白的n 端具有高度 保守的d e l l a 结构域，该结构域在g a 信号诱导的d e l l a 蛋白降解过 程中起关键作用。若d e l l a 结构域或上下游的重要氨基酸序列发生改 变，d e l l a 蛋白就不能响应g a 信号发生降解，表现为对g a 信号不敏 感，从而抑制植物生长发育。 从平邑甜茶中扩增了d e l l a 蛋白编码基因m h g a l 2 ，通过搭桥 p c r 对其d e l l a 结构域编码序列进行定点突变，获得m h g a l 2 的g a 不敏感型等位基因a m h g a l 2 。用a m h g a l 2 基因遗传转化番茄，获得 a m h g a l 2 基因异位表达的转基因番茄，转基因番茄t h 和t l 株系作为 a m h g a l 2 在番茄中的高表达和低表达株系，由于t h 和t l 的纯合体后 代表现对g a 极不敏感以及致矮现象严重，因此试验中我们选择的都是 半矮化的杂合体研究a m h g a 2 对生长发育的抑制作用。同时，转p b l l 2 1 空载体的番茄为对照，命名为p b i 。 表型观察发现，转基因番茄植株矮化，下胚轴、主枝和侧枝节间长 度等变短，且表现为g a 不敏感。另外，与对照相比，转基因番茄株系 的花序更紧凑，花、果实和种子等也都比对照小。干旱逆境处理后，转 基因番茄幼苗的抗旱能力明显强于对照。 关键词：番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l i n t u mm i l l ) ；g a ：d e l l a 蛋白； m h g a l 2 异位表达 m h g a l 2 基因在番茄中的异位表达分析 a b s t r a c t t h ep h y t o h o r m o n eg i b b e r e u i ca c i d ( g a ) r e g u l a t e sp l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t i nv a r i o u s a s p e c t s s u c ha ss e e d g e r m i n a t i o n ，h y p o c o t y l e l o n g a t i o n ，l e a fe x p a n s i o na n df l o w e r i n gt i m e ，i np l a n t s ，g ar e s p o n s e sa l e r e p r e s s e db yd e l l ap r o t e i n s ，w h i c hc o n t a i na nn t e r m i n a ld e l l ad o m a i n e s s e n t i a lf o rg a - d e p e n d e n tp r o t e a s o m a ld e g r a d a t i o no fd e l l ar e p r c s s o r s m u t a t i o n so fo rw i t h i nt h ed e l l ad o m a i nh a v e b e e ns h o w e dt h a tt h e m u t a t i o nc o n f e rg ai n s e n s i t i v i t ya n dc o n s t r a i nt h eg r o w t ho fp l a n t s m h g a l 2g e n ei s o l a t e df r o mt e ac r a b a p p l e ( m a l u sh u p e h e n s i s ) e n c o d e da p r e d i c a t e dd e l l ap r o t e i n a m h g a l 2w a si t sg a i n s e n s i t i v ea l l e l ea r t i f i c i a l l y o b t a i n e d 、航t hab r i d g e - p c ra p p r o a c h e c t o p i ce x p r e s s i o na n a l y s i si nt o m a t o v e r i f i e dt h a tt h a ti 乜g a i n s e n s i t i v ea l l e l ea m h g 么口c a u s e dd w a r f i s m t r a n s g e n i c t o m a t ol i n e st ha n dt le c t o p i c a l l y e x p r e s s e da m h g a 2 t r a n s c r i p t s a th i g ha n dl o w l e v e l s ，r e s p e c t i v e l y ，b e c a u s e t ha n dt l h o m o z y g o u sp l a n t se x h i b i t e de x t r e m e l yg a - i n s e n s i t i v ed w a r f i s ma n ds t e r i l i t y ， s e m i - d w a r fh e t e r o z y g o u sp r o g e n i e sw e r eu s e dt oe x a m i n ei fa m h g a l 2a l t e r s g r o w t hh a b i t s m e a n w h i l e ，t h et r a n s g e n i ct o m a t op b ic o n t a i n i n gp b i 121 e m p t yv e c t o rw a s u s e da sc o n t r 0 1 t r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e do n l yas l i g h tg r o w t hr e s p o n s et og a s g e n e t i c a n a l y s i s i n d i c a t e st h a ta m h g a l 2i sam u t a n tr e p r e s s o rt h a ti sr e l a t i v e l y r e s i s t a n tt ot h ee f f e c t so fg a ，w h i c he x h i b i t e ds h o r t e ri n t e m o d e si np r i m a r y a n d b r a n c hs h o o t sa n ds m a l l e rp l a n ts t a t u r e st h a np b i i n t e r e s t i n g l y ， t r a n s g e n i cp l a n t sa l s og e n e r a t e dc o m p a c t e di n f l o r e s c e n c e sw i t hs m a l lf l o w e r s ， r e s u l t i n gi ns m a l lf i u i t sa n ds e e d sr e l a t i v e t op b i i na d d i t i o n , t r a n s g e n i c s e e d l i n g sw e r em o r e r e s i s t a n tt od r o u g h ts t r e s st h a np b i k e yw o r d s ：t o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l i n t u mm i l l ) ；g a ；d e l l ap r o t e i n ； m h g a l 2 ；e c t o p i ce x p r e s s i o n 、 2 位论文 1 1 赤霉素的发现和分布 赤霉素是由日本植物病理学家在研究水稻恶苗病( r i c eb a k a n a e ) 时发 现的，患恶苗病菌的水稻表现植株徒长并黄化，原因就是赤霉菌分泌的 物质所致。1 9 3 8 年从水稻赤霉菌中分离出有活性的物质正式命名为赤霉 素( g i b b e r e l l i n ，简称g a ) 。随后，又发现了几种新的g a ，并在未受赤霉 菌感染的高等植物中也发现了许多与g a 具有同样生理功能的物质。 p h i r m e y 等( 1 9 5 7 ) 的研究报道，在不同属、种的植物种子或果实提取液中 都发现了“类似赤霉素”的物质存在，并且这些物质能够使矮化突变的玉 米品种恢复生长，其效应相同于赤霉素。1 9 5 8 年，m a c m i l l a n 等在多花 菜豆未成熟种子中分离得到g a 结晶，表明赤霉素类化合物也是高等植 物的天然产物。目前，已经从植物、真菌和细菌中发现赤霉素类物质 1 3 6 种，其中大多数种类存在于高等植物中，而一部分存在于真菌或细 菌中，另一部分是真菌和植物共有的。其中的g a 3 叫赤霉酸，是生物活 性最高的一种。 赤霉素是在化学结构上近似的一类化合物，属于萜类，并在植物体 内占有重要地位，是叶黄素、胡萝卜素、橡胶的基本结构单位。赤霉素 类基本结构是2 0 碳的赤霉烷。它是一种双萜，由4 个异戊二烯单位组 成，含有4 个碳环( a 、b 、c 、d ) 。由于在赤霉烷上双键、羟基的数目和 位置不同，以及内酯环的有无，而形成了不同的赤霉素。又根据赤霉素 分子中碳原子数目的不同，分为c 1 9 和c 2 0 两类赤霉素，c 1 9 g a s 由 c 2 0 g 越转变而来，但前者所包含的种类多于后者，且生理活性也高于后 者。 赤霉素在生长旺盛的部位含量较高，如茎端、根尖和果实种子。高 等植物的赤霉素含量一般是1 - 1 0 0 0n g g 。鲜重。植物所含赤霉素的种 类、数量和状态也因植物发育时期而异。 在植物体内赤霉素有两种存在形式：游离态和结合态。其中结合态一 赤霉素是赤霉素和其它物质( 如葡萄糖) 结合形成的赤霉素葡萄糖酯和赤 霉素葡萄糖苷，无生理活性，是赤霉素的储藏和运输形式。在植物不同 发育时期，结合态和游离态赤霉素可以相互转化，如种子成熟时，游离 m h g a l 2 基因在番茄中的异位表达分析 态赤霉素不断地转化为结合态赤霉素并储藏起来；而在种子萌发时，结 合态赤霉素通过酶促水解的方式释放出具有生物活性的游离态赤霉素， 从而发挥其生理作用。 1 2 赤霉素的生物合成与代谢途径 在高等植物体内，g a 生物合成的前体是栊牛儿糖牛儿基焦磷酸 ( g g p p ) ，生物合成过程分三步进行：( 1 ) 原生质体内，内根贝壳杉 ( e n t k a u r e n e ) 的合成；( 2 ) 内根贝壳杉烯( e n t k a u r e n e ) 转化成 g a l 2 ，发生在内质网上，并由内质网膜上的p 4 5 0 单加氧酶催化完成； ( 3 ) c 2 0 和c 1 9 g a s 的生成，发生在细胞质内( 图1 1 ) 。 ( 1 ) 内根贝壳杉烯( e n t - k a u r e n e ) 的合成 栊牛儿栊牛儿基焦磷酸( g g p p ) 是二帖类物质( 如赤霉素) 和四萜 类物质( 如类胡萝卜素) 的共同前体，它既可以通过依赖甲羟戊酸 ( m v a ) 的途径合成，也可以通过其它途径合成( l a n g e ，1 9 9 8 ； h e d d e na n dp h i l l i p s ，2 0 0 0 ) 。然后，g g p p 在古巴焦磷酸合成酶( c p s ) 和内根合成酶( k s ) 催化下环化为赤霉素的前身内根贝壳杉烯( e n t - k a u r e n e ) 。 ( 2 ) g a l 2 一醛( g a l 2 a l d e h y d e ) 的合成 内根贝壳杉烯c 1 9 的甲基在内根贝壳杉烯氧化酶( k o ) 催化下能 不断被氧化，分别形成内根贝壳杉烯醇、内根贝壳杉烯醛和内根贝壳 杉烯酸，再在内根贝壳杉烯酸氧化酶( k a o ) 作用下生成g a 的最初产 物g a l 2 醛，g a l 2 醛在1 3 水解酶作用下转变成g a 5 3 。 ( 3 ) 不同种类g a s 的生成 g a l 2 醛在g a 2 0 氧化酶、g a 3 氧化酶和g a 2 氧化酶作用下转变为 包括各种g a 中间物和具有生物活性的g a l 与g a 4 的其他种类的g a 。 在高等植物、真菌和细菌中，已经发现了1 2 6 种g a s ，但只有很少一部 分具有生物活性，如g a l 、g a 3 、g a 4 和g a 7 ( h e d d e na n dp h i l l i p s ， 2 0 0 0 ) ，其它的都是中间物或代谢物。具有生物活性的g a 合成主要有3 条途径：早期3 b 羟基化途径( g a l 4 一g a 3 7 _ g a 3 6 叶g 一q 吣4 ) 、早 期1 3 1 3 羟基化途径( g a s 3 一q 气4 4 一g a l 9 叶g a 2 0 _ g a l g a 8 ) 和早期非 3 p 和1 3 1 3 羟基化途径( g a l 2 _ g a l 5 一g a 2 4 一g a 9 _ g 一g a 3 4 ) 。g a 4 山东农业大学硕士学位论文 通过抑制g a 3 0 x 和g a 2 0 0 x 以及激活g a 2 0 x 来控制自己的合成和代谢 ( j i a n g 等，2 0 0 7 ；s c h w e c h h e i m e r ，2 0 0 8 ) 。 、 与c p s 、k s 、k o 和k a o 不同，细胞质定位的g a 2 0 0 x 、g a 3 0 x 和 g a 2 0 x 都是由一个小的基因家族编码的，而且每个基因的表达模式具有 组织特异性( h e d d e na n dp h i l l i p s ，2 0 0 0 ) 。在有些情况下，过量表达这 些基因，可以改变转基因植株的内源g a 浓度( h e d d e na n dp h i l l i p s ， 2 0 0 0 ：y a m a g u c h ia n dk a m i y a ，2 0 0 0 ) 。 p d i j 鸥矗d 妒= i 戳幢 r 一帅椭g 伸帅 一 钒f 帅 一呻戳。釉神 g 叠l r _ o 峥- - - g bc o h 呻g a tl r _ o 岣呻g r e o h g 2 0 椎g 轴a 船喇 图l l 高等植物体内赤霉素的合成及其代谢途径( o l s z e w s k ie ta i ，2 0 0 2 ) 各种酶的名字已在箭头下用黑体标出。g a 2 0 x 也能够将g a 9 和g a 2 0 转变成g a 5 l 和g a 凹， g a i 和g 是具有活性的赤霉素，g a 3 4 和g a b 是它们的代谢物，不具有生物活性。 f i g u r e1 - 1m a j o rg ab i o s y n t h e t i ca n dc a t a b o l i cp a t h w a y si nh i g h e rp l a n t s t h ee n z y m ef l a m e sa r cs h o w ni nb o l d f a c eb e l o wo rt ot h er i g h to fe a c ha r r o w g a n dg a 2 0a l s o c a l lb ec o n v e n e dt og a s la n dg a z 9b yg a 2 0 x g a a n dg a ta r ct h eb i o a e t i v eg a s , a n dg a 3 , a n dg a e a r ct h e i ri n a c t i v ec a t a b o l i t e s 1 3g a 的信号应答机制 具有生物活性的g a 通过一个复杂的信号转导网络，实现对植株形 态建成和生长发育的调控。g a 受体感知g a 信号后，激活信号传递途径 中各基因的表达，植物做出g a 响应。当编码这些信号因子的基因及其 识别的顺式作用位点发生突变时，下游基因表达和相关蛋白间的相互作 用也会发生变化，从而导致植物对g a 响应的改变。近年来，随着模式 5 胁g 口基因在番茄中 植物拟南芥和水稻基因组测序的完成及其突变体的大规模筛选，对赤霉 素信号转导途径有了更深入的了解。目前为止，已经克隆出多个g a 信 号传递途径中的相关作用因子( o n e i l 等，2 0 0 2 ；s u n 和g u b l e r ，2 0 0 4 ) ， 对g a 介导的d e l l a 蛋白降解的分子机制研究也有很大突破。该途径有 两个关键环节：g a 受体介导的信号感应和d e l l a 蛋白介导的生长发育 抑制的解除。 1 3 1g a 信号途径的主要组分 利用遗传学的方法，已发现和鉴定了一些与g a 信号转导相关的蛋 白，根据它们在g a 信号转导中的调节作用可以分为正向作用因子 ( p o s i t i v e l ya c t i n gc o m p o n e n t s ) 和反向作用因子( n e g a t i v e l ya c t i n g c o m p o n e n t s ) 。 ( 一) 正向作用因子 在水稻和拟南芥中分别克隆到的g i d 2 ( g a i n s e n s i t i v ed r a w l 2 ) s l y l ( s & e p y l ) 基因编码高度同源的f b o x 蛋白，推测可能是泛素e 3 连接酶s c f ( s k p 、d c 5 3 c u l l i n 、f - b o x ) 复合体的1 个亚基。研究还发 现，在g i d 2 和s 砂j 突变体中积累的d e l l a 蛋白对外源g a 不敏感。通 过对拟南芥研究发现，功能获得型( g a i no ff u n c t i o n ) s l y l d 突变体是通过 增加f b o x 蛋白与d e l l a 蛋白的亲和性来降低d e l l a 蛋白水平，而且 s l y 是直接与d e l l a 蛋白r g a 和g a i 作用( w i l l i g e 等，2 0 0 7 ) 。研 究表明，g i d 2 s l y l 在g a 诱导d e l l a 蛋白降解的过程中起到关键的 正向调节作用，因而是正向作用因子。 从马铃薯中克隆到的基因p h o r l ( p h o t o p e r i o d - r e s p o n s i v e ) ，其转录 水平在短日照条件下增强，而反义p h o r l 可抑制马铃薯中p h o r i 的表 达，降低对g a 的反应，p h o r l 过量表达则表现为下胚轴伸长，提高对 g a 的响应，说明p h o r l 在g a 信号中起正调节作用。 ( 二) 负向作用因子 目前发现的负向调节因子可分为两类：一类不与d n a 结合，如拟南 芥s p y 蛋白和d e l l a 蛋白家族；另一类是与启动子序列结合，如拟南 芥锌指蛋白s h i 。 6 山东农业大学硕士学位论文 对拟南芥的研究发现，s p y ( s p i n d l n 基因突变可不同程度的抑制与 g a 相关的g a i 突变体的表型，这表明s p y 是g a 信号途径中的重要负调 控因子( s w a i n 等，2 0 0 2 ) 。研究还推测，r g a g a i 蛋白可能是s p y 的靶 蛋白；而s p y 通过激活r g a 和g a 而抑制g a 信号的转导。 拟南芥s h i ( s h o r ti n t e r n o d e s ) 基因在幼嫩器官中高度表达，可防止幼 嫩器官对g a 做出响应进行伸长生长；s h i 在大麦糊粉细胞中的表达也能 够抑制g a 诱导的a 淀粉酶基因的表达，说明s h i 是反向调节g a 反应 的。s h i 蛋白含环状的锌指区基序( z i n cf i n g e rm o t i f ) ，一般认为，锌指区 能调节蛋白质水解或转录调控过程中的蛋白质的相互作用，但s h i 在 g a 信号转导中的功能还需要进一步研究明确。 d e l l a 蛋白是赤霉素信号途径的抑制蛋白，属于植物特有的g r a s 蛋白家族，在不同的物种间是高度保守的，如拟南芥、大麦、芸苔、葡 萄、玉米、水稻和小麦等。拟南芥基因组包含5 条d e l l a 基因，而水 稻和番茄各有l 条( s l r l 和s i d e l l a ) 。但至今未明确鉴定出d e l l a 蛋 白的d n a 结合部位，说明它们可能作为1 种辅助催化剂或者辅助抑制 物，通过与结合到d n a 上的其它转录因子作用，共同抑制g a 信号转 导。 1 3 2g a 受体 g a 作为一种羧化阴离子，可在植物细胞的胞间和胞内溶解，并且能 通过被动运输穿过细胞质膜。由此推测，植物体含有与质膜结合的可溶 性受体。g a 受体是u e g u c h i t a n a k a 等在鉴定水稻矮化突变体g i d l 时发 现的，该突变体表现对g a 不敏感，过量表达g i d l ( g i b b e r e l l i c a c i di n s e n s i t i v ed w a r f l ) 则导致对g a 超敏感，进一步研究证明， g s t g i d l 与具生物活性的g a 有很强的亲和性。酵母双杂交实验表明， g i d l 能与水稻的d e l l a 蛋白s l r l 作用，在水稻中g i d l 作为一种可 溶性受体介导g a 信号传导，与活性的g a 结合感知g a 信号后，将信 号传递到d e l l a 蛋白，从而诱发下游的一系列反应( u e g u c h i t a n a k a 等，2 0 0 5 ) ，而且g i d l 与g a 的结合对g a 反应是必需的。 1 3 3d e l l a 蛋白 7 图1 - 2 赤霉素信号途径模型( f l e e ta n ds u n ，2 0 0 5 ) 卵形框表示转录因子，灰线表示推测的相互作用，箭头和t 形线分别表示激活或抑制作用 b 基因编码p i 和a p 3 蛋白；c 基因编码a g a m o u s ：d e l l a 包括r g a ，g a i ，r g l s ，s l n i 和 其它同源蛋白。p k l 在胚胎发育的后期抑制胚细胞的命运。 f i gi 2m o d e lo f t h eg as i g n a l i n gp a t h w a yo v a l sr e p r e s e n tt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，g r a yl i n e si n d i c a t e h y p o t h e s i z e di n t e r a c t i o n s a r r o w sa n dt - b a r si n d i c a t ed i r e c to ri n d i r e c ta c t i v a t i o na n di n h i b i t i o n ， r e s p e c t i v e l y bg e n e se n c o d ep ia n da p 3 ；t h ecg e n ei nt h i sp a t h w a ye n c o d e sa g a m o u s ；d e l l a i n c l u d e sr g a , g a i ，r g l s , s l r i ，s l n i ，a n do t h e ro r t h o l o g s + p k li n h i b i t se m b r y o n i cc e l lf a t ed u r i n g p o s t - e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t 1 3 3 1d e l l a 家族蛋白的保守结构域 d e l l a 蛋白是一类能够抑制g a 响应的转录调控因子( 如图1 2 ) ，因其n 末端含有保守的氨基酸序列d e l l a 而得名，这段保守 的序列对于d e l l a 和g a 受体g i d i 间的相互作用起着至关重要的作用 ( p e n g 等，1 9 9 7 ；u e g u c k i t a n a k a 等，2 0 0 5 ；g r i f f i t h s 等，2 0 0 6 ； w i l l i g e 等，2 0 0 7 ) 。 拟南芥基因组编码5 个d e l l a 蛋白，即g a i 、r g a 、r g l l 、 r g l 2 和r g l 3 ( p e n g 等，1 9 9 9 ；d i l l 等，2 0 0 1 ；w e n 和c h a n g ，2 0 0 2 ； l e e 等，2 0 0 2 ) 。其中g a i 和r g a 是营养生长和花诱导的抑制因子， r g l 2 是种子萌发的负调控因子，r g a 、r g l l 和r g l 2 一起调控花发 8 山东农业大学硕士学位论文 育。另外大麦s l n i ( f u 等，2 0 0 2 ) 、玉米d 8 ( p e n g 等，1 9 9 9 ) 、水稻 s l r l ( 1 k e d a 等，2 0 0 1 ) 、小麦r h t i ( p e n g 等，1 9 9 9 ) 和葡萄v v g a l l ( b o s s 等，2 0 0 0 ) 等也都属于d e l l a 蛋白家族。小麦“绿色革命”基因r h t l 是拟 南芥g h ，的同源基因。 通过对水稻s l r i 基因的不同核苷酸缺失突变体的分析，i t o h 等 ( 2 0 0 2 ) 分析了d e l l a 蛋白的不同保守结构域的功能，分为d e l l a 与 v h y n p 结构，是g a 信号的感知结构域；而p o l ys t v ( 丝氨酸、苏氨 酸、缬氨酸富集区) 是蛋白磷酸化和糖基化位点，是g a 信号的调节结构 域；l z 介导蛋白间的相互作用，是二聚化结构域；c 端的v h i i d 、 s h 2 ( 磷酸酪氨酸结合结构域) 和s a w 等结构是阻遏结构域。利用转g f p 融合蛋白技术，发现拟南芥的g a i 、r g a 、r g l l 和r g l 2 蛋白定位在 细胞核( w e n 和c h a n g ，2 0 0 2 ；f u 和h a r b e r d ，2 0 0 3 ) ，以上蛋白序列结构 特征分析和蛋白的核定位都表明了d e l l a 蛋白是一类潜在的转录因 子。 1 3 3 2d e l l a 蛋白在g a 信号通道中起阻遏效应的分子机制 g a 通过泛素蛋白酶途径诱导d e l l a 蛋白降解，解除d e l l a 蛋白 对下游因子的抑制，从而使植株表现正常的g a 响应。s c f 复合体具有 e 3 泛素连接酶活性，其中的1 个亚基f b o x 蛋白决定了底物识别的特异 性；f b o x 蛋白n 端有1 个f b o x 基序( m c g i n n i s 等，2 0 0 3 ) ，能与s c f 的s k p 结合，c 端有1 个保守的蛋白蛋白相互作用结构域，主要介导底 物的泛素化，底物泛素化后就能被2 6 s 蛋白酶体降解。 在g a 信号转导中，对于其泛素蛋白酶体途径的研究是通过研究 配w 来解释的。比如在水稻s l y l 突变体中，r g a 和g a i 的蛋白表达水 平提高，外源喷施g a 不能诱导蛋白降解：利用双重和三重突变体的遗 传分析，以及酵母双杂交实验都说明，乩聊和d e l l a 蛋白有直接的相 互作用，并由d e l l a 蛋白的c 端g r a s 结构域介导( d i l l 等，2 0 0 4 ；f u 等，2 0 0 4 ) ；体外p u l l d o w n 和免疫共沉淀实验进一步证实两种蛋白 的互作。以上研究说明，当有g a 信号或g a 处理时，s c f 扎y 1 蛋白复合 体中的f b o x 蛋白s l y l ，能特异地与d e l l a 蛋白发生亲和反应，通过 2 6 s 蛋白酶体降解途径降解d e l l a 蛋白，从而去除d e l l a 蛋白质的阻 9 m h g a l 2 基因在番茄中的异位表达分析 遏作用，实现g a 的应答反应。 正常g a 反应必需保证d e l l a 蛋白的完整性。如果d e l l a 结构发 生改变，使之不能感知g a 信号，d e l l a 蛋白便成为组成性的阻遏蛋 白，植株表现出类似g a 缺乏的表型，这类突变多为显性或半显性。越 来越多的突变体研究支持了这一模型。 当d e l l a 蛋白的阻遏作用因c 端的变化而丧失时，植株的表型就 像被施加了过量的g a ，生长细长，遗传上为隐性，常称之为功能缺失 突变，例如拟南芥的r g a 、大麦的s l n l c 和水稻的s l r l 4 ( c h a n d l e r 等， 2 0 0 2 ) 。 1 3 3 3g a 信号转导模式 图1 3g a 信号元件间相互作用的模型 当g i d i 受体接收到赤霉素信号后，迅速与d e l l a 蛋白结合，然后s c f ( 掣吼朋将d e l l a 蛋白 泛素化，随后，泛索化的d e l l a 蛋白通过2 6 s 蛋白体途径降解。s p y 可能会对d e l l a 抑制子 进行修饰，这种修饰可能会激活d e l l a 蛋白。 f i g1 - 3m o d e lo f t h ei n t e r a c t i o n so f t h ee s t a b l i s h e dg as i g n a l i n gc o m p o n e n t s g 八w h e nb o u n dt ot h eg i d1g ar e c e p t o r , i n d u c e st h ei n t e r a c t i o no ft h eg ar e c e p t o rw i t ht h e d e l l ap r o t e i n s ( d e l l a ) t h i se v e n ti sf o l l o w e db yd e l l ap r o t e i nu b i q u i t y r l a t i o nv i as c f 3 l y l ，o 咙 a n dd e l l a p r o t e i nd e g r a d a t i o nb yt h e2 6 sp r o t e a s o m e ( u b i ，u b i q u i t i n ) s p y im a ym o d i f yt h ed e l l a r 印佗s s o r sa n dt h es p y im o d i f i c a t i o nm a yb er e q u i r e dt oc o n v e r tt h ed e l l ap r o t e i n si n t oa c t i v eg r o w t h r e p r e s s o r s 研究表明，在水稻、拟南芥和大麦中，g a 信号均导致d e l l a 降 解，其中d e l l a 蛋白通过作用于s c f 复合体的f b o x 蛋白而与泛素结 l o 山东农业大学硕士学位论文 合，随后经泛素2 6 s 蛋白酶体途径降解，解除其对下游g a 响应基因的 抑制。水稻和拟南芥的f - b o x 蛋白g i d 2 s l y l 均参与这个过程。在水稻 g a 信号途径中，g a 与质膜外受体结合，通过g 蛋白或c a 以及g i d l 将信号传到胞内，s l r l 即与s c f g i d 2 复合体作用，从而经泛素2 6 s 蛋 白酶体途径降解，解除其抑制作用，进而g a 信号应答，调节植物的生 长发育。 1 3 3 4g a