（物理化学专业论文）有机小分子探针的研究.pdf

摘要 摘要 本文提出2 ( 8 一羟基喹啉一5 磺酸一7 一偶氮) - l ，8 一二羟基一3 ，6 萘二磺酸、马兜铃酸 a 和甘草酸单铵盐作为蛋白质探针，葛根素作为核酸探针。研究结果表明： 1 运用平衡透析法和分光光度法研究了2 ( 8 一羟基喹啉5 一磺酸一7 偶氮) 一1 ，8 一 二羟基一3 ，6 一萘二磺酸( 简称8 q 5 s a c ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 在酸性溶液中的 结合反应，认为8 q s s a c 与b s a 之间的结合力是以静电引力为主的非共价作用 ， 力，并探讨了其结合模型。( 在2 9 8 k 下，测得这一反应的最大结合数为3 3 4 0 ， 结合常数为6 1 1 0 5l m o l 。还研究了溶液基本条件如酸度和离子强度等对 8 q 5 s a c 与牛血清白蛋白分子复合物形成的影响，在p h = 3 3 4 条件下，标准工作 、 曲线的线性范围为0 2 0 4 6 9 0m g l 。p 2 应用光谱法和电化学方法研究了水溶液中马兜铃酸a 与牛血清白蛋白分 子间的结合反应，铡定了反应的形成常数k a 及热力学函数g ，h 和s ，并 确定了分子问作用力性质；还讨论了温度和微量金属离子对药物与牛血清白蛋白 形成常数的影响：采用同步荧光技术考察了马兜铃酸a 对牛血清白蛋白构象的 影响；依据f o r s t e r 非辐射能量转移机制，确定了给体一受体间的结合距离和能 、 量转移效率。 3 研究了甘草酸单铵盐( m a g ) 对牛血清白蛋白( b s a ) 的荧光猝灭机理。 ，、 ( 证实了二者问的相互作用是由于生成了超分子复合物的静态猝灭过程，求出了反 应的形成常数k a 及热力学函数ag ，h 和s ，根据热力学函数确定了超分子 问作用力类型为静电引力；还讨论了温度和微量金属离子对形成常数的影响；依 据f o r s t e r 非辐射能量转移机制，确定了给体一受体间的结合距离和能量转移效 率；采用同步荧光技术考察了甘草酸单铵盐对牛血清白蛋白构象的影响 4 基于葛根素中加入d n a 或r n a 后，葛根素的荧光被猝灭，建立了葛根 r 素测定d n a 或r n a 的新方法。离根素的最大激发波长和发射波长分别为2 6 6 m - n l 和4 6 0n m 。在最佳的实验条件下，鱼精子脱氧核糖核酸( f sd n a ) 的线性范围 为2 9 。7 6 0 i _ t g m l ，小牛胸腺脱氧核糖核酸( c t d n a ) 为3 f 6 8 0 i _ t g m l ，酵母 核糖核酸( y r n a ) 为1 1 3 6 0 g m u ，变性脱氧核糖核酸( d ad n a ) 为2 旷3 6 0 g m l 。f sd n a 的最低检测限为2 9 肛g m l ，c td n a 为3 6 g m l ，y r n a 为 1 1 肛g m l ，d ad n a 为2 9 “g m l 。五次平行测定浓度为2 0 ug m l 的f sd n a 摘要 的相对标准偏差为1 5 o 葛根素与d n a 的作用机理也进行了探讨 关键词：蛋白质，核酸，探针，2 - ( 8 一羟基喹啉一5 一磺酸7 一偶氮) 一1 ，8 一二羟基一3 ，6 一萘 二磺酸，马兜铃酸a ，甘草酸单铵盐，葛根素，恼合反应荧光猝灭 摘要 a b s t r a c t 2 一( 8 一h y d r o x y lq u i n o l i n e 一5 一s u l f o a c i d 一7 一a z o ) 一1 ，8 - d i h y d r o x y - 3 ，6 一n a p h t h a l e n e d i s u l f o a c i d ，a r i s t o l o c h i ca ，m o n o a m m o n i u mg l y c y r r h i z i n a t ew e r ep r o p o s e d a s p r o b e s o f p r o t e i n p u e r a r i nw a sp r o p o s e d a sa p r o b e o fn u c l e i ca c i d s r e s u l t ss h o w e dt h a t ： 1 t h e b i n d i n g o f2 - ( 8 - h y d r o x y lq u i n o l i n e 一5 - s u l f o a c i d 一7 一a z o ) 一1 , 8 - d i h y d r o x y 一3 ，6 - n a p h t h a l e n ed i s u l f o a c i d ( 8 q 5 s a c ) t ob o v i n e s e f i a l n a l b u m i n ( b s a ) i na c i d s o l u t i o nw a ss t u d i e db yu s i n gs p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o da n de q u i l i b r i u md i a l y s i s m e t h o d ，i ti sc o n s i d e r e dt h a tt h en o n c o n v a l e n tb i n d i n gf o r c e s ( m a i n l yt h ee l e c t r o s t a t i c f o r c e ) a r et h eb i n d i n gf o r c eb e t w e e n8 q 5 s a c a n db s a t h er e a c t i o nm o d ew a sa l s o d i s c u s s e d ，t h em a x i m u mb i n d i n gn u m b e rw a sd e t e r m i n e dt ob c3 3 4 0 ；t h eb i n d i n g c o n s t a n tw a s6 1 l 旷l t o o la t2 9 8 k t h ea b s o r p t i o nc h a r a c t e ro f8 q 5 s a c b s aa t v a r i o u sc o n d i t i o n s ( s u c ha s a c i d i t y , i o n i cs t r e n g t ha n de t a 1 ) w a sa l s o s t u d i e d a t p h 3 3 4 ，t h e l i n e a rr a n g eo f s t a n d a r dw a v ew a s 0 2 0 4 6 ，9 0 呲 2 t h eb i n d i n gc h a r a c t e r i s t i c so fa r i s t o l o c h i ca c i daw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) h a v eb e e ns t u d i e db ys p e c t r o s c o p ym e t h o da n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o di n a q u e o u ss o l u t i o n t h ef o r m a t i o n c o n s t a n tk aa n dt h et h e r m o d y n a m i cf u n c t i o n s ( s u c h a s agah a n d s ) f o rt h er e a c t i o nh a v ea l lb e e nm e a s u r e d ；t h ee f f e c to fv a r i o u s m e t a li o n sa n dt e m p e r a t u r e so nt h ef o r m a t i o nc o n s t a n to fa d s t o l o c h i ca c i da w i t h b s aw a sa l s os t u d i e d ；t h ee f f e c to fa r i s t o l o c h i ca c i dao nt h ec o n f o r m a t i o no fb s a h a sa l s ob e e na n a l y z e du s i n gs y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ；t h eb i n d i n g d i s t a n c eb e t w e e na r i s t o l o c h i ca c i daa n db s aa n dt h et r a n s f e re f f i c i e n c yh a v eb e e n o b t a i n e db a s e do nt h em e c h a n i s mo ff o r s t e re n e r g yt r a n s f e r 3 t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gm e c h a n i s mo fb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) b y m o n o a m r n o n i u mg l y c y r r h i z i n a t e ( m a g ) h a sb e e ns t u d i e d i ti s p r o v e dt h a t s t a t i c q u e n c h i n g e x i t sb e t w e e nm a g - - b s as u p e r - m o l e c u l a rc o m p l e x t h ef o r m a t i o n c o n s t a n tk aa n dt h et h e r m o d y n a m i cf u n c t i o n s ( s u c ha s gaha n d as ) f o rt h e r e a c t i o nh a v ea l lb e e no b t a i n e d a c c o r d i n gt ot h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ，t h e m a i ns o r to f b i n d i n g f o r c ew a se l e c t r o s t a t i cf o r c e t h ee f f e c to fv a r i o u sm e t a li o n sa n d t e m p e r a t m e so nt h ef o r m a t i o nc o n s t a n to fm a g w i t hb s aw a sa l s os t u d i e d ：t h e m 摘要 b i n d i n gd i s t a n c eb e t w e e nm a g a n db s aa n dt h et r a n s f e r e f f i c i e n c y h a v eb e e n o b t a i n e db a s e do nt h em e c h a n i s mo ff o r s t e re n e r g yt r a n s f e r ；t h ee f f e c to fm a g o r l t h ec o n f o r m a t i o no fb s ah a sa l s ob e e na n a l y z e du s i n gs y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y 4 an o v e lf l u o r e m e t r i cm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o rr a p i dd e t e r m i n a t i o no f d n ao rr n aw i t hp u e r a r i na saf l u o r e s c e l l c ep r o b e b a s e do l lt h et u o r e s c e n c e q u e n c h i n g o f p u e r a r i ni nt h ep r e s e n c eo f d n ao rr n a t h em a x i m u me x c i t a t i o na n d e m i s s i o n w a v e l e n g t h s a r ea t2 6 6n ma n d4 6 0n m , r e s p e c t i v e l y u n d e ro p t i m a l c o n d i t i o n s ，t h ec a l i b r a t i o n 掣印h sa r el i n e a ro v e rt h er a n g eo f2 9 7 6 0hg ，m _ lf o r f i s hs 岬d n a ( p s d n a ) ，3 6 6 8 0ug m l f o rc a l f t h y m u sd n a ( c td n a ) ，1 1 3 6 oue d m lf o ry e a s tr n a ( y r n a ) a n d2 9 3 6 01 tg m lf o rd e n a t u r e dd n a ( d a d n a ) t h ec o r r e s p o n d i n gd e t e c tl i m i t sa r e2 9 g m lf o rf sd n a ，3 6 1 t e c m l f o r c td n a 1 1ue d m lf o ry r n aa n d2 9ue c m lf o rd ad n a t h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o no ff i v e r e p l i c a t e m e a s u r e m e n t si s1 5 f o r2 0u 舢f sd n a t h e m e c h a n i s mf o rt h e b i n d i n go fp u e r a r i nt od n a i sa l s os t u d i e d k e y w o r d s2 - ( 8 - h y d r o x y lq u i n o l i n e - 5 一s u l f o a c i d - 7 一a z o ) 一1 ，8 一d i h y d r o x y - 3 , 6 一n a p h t h a l e n e d i s u l f o a c i d ，p r o t e i n ，n u c l e i c a c i d s ，a r i s t o l o c h i c a c i da ，m o n o a m m o n i u m g l y c y r r h i z i n a t e ，p u e r a r i n ，b i n d i n gr e a c t i o n ，f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g i v 、绪论 一、绪论 1 研究意义 蛋白质、核酸和多糖是三类主要的生物大分子，其中蛋白质和核酸是生物 体的重要组成部分。蛋白质在重量上占细胞干重的一半以上。肌肉、皮肤、血 液和毛发等的重要成分是蛋白质，蛋白质参与几乎所有的生命活动过程。核酸 是遗传的物质基础，它在生物的生成、发育和繁殖等活动中具有十分重要的作 用。核酸的结构直接影响其功能，并与致癌、抗癌有关。总之，蛋白质和核酸 具有极其重要的生物学意义。 正是由于蛋白质和核酸本身的重要性，所以对其进行深入的研究很有必要， 但是又由于它们的分子巨大，结构复杂，使得蛋白质和核酸的理论研究及其应 用受到限制。近年来蛋白质和核酸探针的研究为解决这方面的问题提供了很大 的可能性。以药物为例，研究药物如抗生素、抗癌药物作为生化探针，有益于 阐明药物在体内的运输及其与疾病的作用机理。如蒽醌类抗癌新药米托葸醌插 入癌细胞d n a 碱基对中，阻止癌细胞d n a 的复制。阿霉素与b s a 之间作用 力主要为疏水作用力，而与h s a 之间的作用力主要为范德华力，认为血液中的 金属离子与药物竞争，减少了白蛋白与药物的结合力，缩短了药物在血浆中的 储留时间，增加了药物的最大作用强度。总之，对于蛋白质、核酸探针的研究， 可以用来研究蛋白质、核酸的高级结构及阐明其生物学意义；可以建立完善的、 快速准确的蛋白质、核酸的定量方法；可以指导新药的合成及体外筛选工作， 尤其是抗肿瘤药物的研究。 2 蛋白质、核酸探针的类型及研究进展 本文对近几十年来利用各种方法研究蛋白质、核酸探针的情况进行了综述。 下面将分别阐述蛋白质、核酸探针的研究情况。 2 1 蛋白质探针的类型及研究进展 人们对蛋白质的研究，主要集中在蛋白质定量分析和作用机理两个方面。 蛋白质定量测定既是生物化学和其它生物学科中经常涉及的分析内容，又是临 床检验中诊断疾病及评价疗效的重要指标，同时也是许多生物药物分离提纯中 质量检验及食品检验中常见的分析项目。目前，已发现用来定量蛋白质的探针 绪论 很多，见表1 1 1 。5 9 1 。下面将对蛋白质探针作用机理方面的研究情况进行介绍。 2 1 1 有机分子型蛋白质探针 有机分子型蛋白质探针根据其用途的不同可以分为药物和分析试剂两种类 型。 ( 1 ) 药物型蛋白质探针b r o w n ，j r t 6 0 l 指出牛血清白蛋白( b s a ) 和人血 清白蛋白( h s a ) 的空间结构由三个结构域组成，每个结构域由两个亚结构域 以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有的疏水性氨基酸都分布在圆筒的 内部，构成疏水腔。h exm 曾报道在h s a 分子上存在疏水裂隙，故蛋白质与 药物之间可通过疏水作用结合 6 i 】。 最近人们对抗癌药物与白蛋白的相互作用研究较热。卢继新1 6 2 1 研究了蒽环 抗菌素一抗癌药物阿霉素与b s a 、h s a 的相互作用，指出阿霉素与b s a 之间 的作用力主要为疏水作用力，而与h s a 之间的作用力主要为范德华力，认为血 液中的金属离子与药物竞争，减少了白蛋白与药物的结合力，缩短了药物在血 浆中的储留时间，增加了药物的最大作用强度。易平贵垆3 l 结合光谱法与微量热 法研究了水溶液中丝裂霉素c 与b s a 的结合反应，确定了两分子问的主要作用 力为疏水作用力。 人们还研究了抗菌素一喹诺酮类药物与白蛋白的相互作用。马贵斌指出 氟哌酸分子内有氨基和羧基，可能与赖氨酸的氨基共价结合。他亦研究喹诺酮 类药物氟哌酸，萘啶酸对h s a 的荧光猝灭现象，认为药物与氨基酸残基的相互 作用使酪氨酸与色氨酸间发生了能量转移，两者的结合主要靠疏水作用力鲫。 朱铿通过计算热力学参数认为毗哌酸，氟哌酸主要依靠疏水作用力与免疫球蛋 白( i g g ) 发生作用，而与h s a 主要依靠静电引力发生作用【峋。商志才【6 刀通过 同步荧光光谱，认为环丙沙星使色氨酸所处环境的疏水性增加，使b s a 的构象 发生变化，两者之间的结合力主要是疏水作用力。 此外，还有一些从中草药中提取的药物可作为蛋白质探针。张保林 6 8 1 研究 了十四种葸、醌及黄酮类化合物与b s a 、h s a 的相互作用，指出葸、醌及黄酮 类化合物与b s a 、h s a 的结合能力随其极性减少、脂溶性增加而增大，主要是 通过疏水作用而与b s a 结合的。 由于血清白蛋白是许多内源性和外源性化合物的存储和转运蛋白，研究药 2 一、绪论 物作为蛋白质探针，可获取许多蛋白质分子的有关信息，亦是一项重要的药动 力学性质。 ( 2 ) 分析试剂型蛋白质探针分析试剂与蛋白质反应的研究主要是从蛋白 质的检测深化而来的。b r a d f o r d 在研究用考马斯亮蓝g - 2 5 0 ( c b b g 一2 5 0 ) 测 定蛋白质时发现不同蛋白质对c b b g - - 2 5 0 的响应程度不同，这种现象就促使 人们想进一步弄清楚染料与蛋白质的反应机理，对实验现象做出合理的解释。 f a z e k a sd es tg r o t h 例在研究普施安亮蓝r s 和考马斯亮蓝r - 2 5 0 ( c b b r - 2 5 0 ) 时提出染料离子是与蛋白质上的一n h 3 + 依靠静电引力相结合的。s e d m a r i ( 1 7 0 j 也 持上述观点。与此相对应，许多作者认为有机小分子是与蛋白质上的碱性氨基 酸残基相结合的7 1 , 7 2 ，这些碱性氨基酸残基包括赖氨酸、组氨酸、精氨酸和n 端氨基。m o s h e t a l 7 2 】在研究c b b r 与蛋白质反应时发现，c b b r 在不同蛋白质 上的结合数与蛋白质所带正电荷成正比，染料结合数目和电荷数之比为 1 5 3 0 ：1 。c b b r 上存在着- - s 0 3 ，它就是依靠一s 0 3 与蛋白质碱性氨基酸残基 相互作用。l i n d 7 3 1 也有过类似的研究。 目前普遍认为在蛋白质的碱性氨基酸残基中，精氨酸和赖氨酸残基起着重 要作用。c h i a l 7 4 1 和c o n g d o n p s l 求 了不同蛋白质与c b b g 2 5 0 的结合数他们 发现每种蛋白质所结合的c b b g 的个数几乎等于蛋白质所包含的精氨酸与赖氨 酸残基的总和，因此他们认为c b b g 就是结合在精氨酸与赖氨酸残基上的。在 正常的测定条件下( 染料过量) ，染料分子与每一个赖氨酸、精氨酸的残基结合， 且每一个残基结合一个染料分子。若染料不过量，赖氨酸、精氨酸则表现几个 强结合部位。 k m g h - h a n s e n 口6 l 通过实验详细地研究了静电力在有机小分子酚红与血清白 蛋白的结合反应中所起的作用。他发现，在蛋白质总体上带正电时，二价的酚 红( 带两个负电荷) 易与血清白蛋白结合；在蛋白质总体上带负电时，一价的 酚红( 带一个负电荷) 比二价的酚红更易于与血清白蛋白结合。无论对于一价 还是二价酚红，随着p h 值增加，结合常数都将降低。作者认为这是由于静电 力相斥的缘故。在蛋白质的等电点以下增加p h 值，酚红与人血清白蛋白( h s a ) 结合数量将增加，这是由于随着p h 值增高，酚红由负一价向负二价转变，二 价酚红所占比例增加，与h s a 的结合数量也就增加。在血清白蛋白溶液中加入 、绪论 k c i ，对二价酚红的影响超过一价i ”j ，因为加入k c i 将增加血清白蛋白上负电 荷的数目，血清白蛋白结合阴离子的能力比结合阳离子的能力强，即使在其等 电点以上也是如此。这些现象都说明静电力在有机小分子与蛋白质的结合中起 着重要的作用。俞英等7 7 1 也持上述观点。可见，利用静电力与蛋白质上的碱性 基团相结合是蛋白质与有机小分子相互作用的一种方式。 除静电力外，利用疏水作用力和蛋白质的疏水部位相结合也被广泛地认为 是有机小分子和蛋白质相互作用的一种方式。k a k i n ”】曾指出c b b g 2 5 0 可以依 靠疏水作用力与蛋白质的疏水部位相互作用。a s h o k a i t s 研究了正辛烷和正十二 烷衍生物和牛血清白蛋白的强结合作用，他认为疏水的碳氢链提供主要的结合 能量，碳氢链越长，结合能量越大，这都表明非静电力在结合中起了很大的作 用。e d e k m a n 例也持上述观点。 在疏水氨基酸残基中，色氨酸残基最引人注意。有作者认为疏水阴离子就 是结合在色氨酸残基附近的。m o s h e 眦口2 1 和f a z e k a sd es tg r o t h 删提出 c b b r 一2 5 0 与蛋白质的作用是先依靠静电引力相互吸引，疏水键再起加固作用。 c o m p t o n 即】也持同样的观点。 从表1 1 列出的有机分子型蛋白质探针可以看出，有机分子型探针具有如 下特点：有大的电子共轭体系的生色团；有强的疏水陆；有较多的带有负电荷 的亲水性基团，水溶性较好。如磺酸基、羟基和酚羟基。 2 1 2 金属离子型蛋白质探针 金属离子中以稀土离子作为探针的研究较多。李晓晶 8 l 】在模拟生理条件下 研究了稀土离子( 如t b ( m ) 、p r ( 1 n ) ) 与b s a 的相互作用，表明t o ( m ) 与b s a 形成1 ：2 配合物：用平衡透析法确定p r ( m ) 与b s a 存在两类结合。稀土金属离 子除与b s a 相互作用之外，还与其它蛋白质作用。生物物理研究表吲吲，脱铁 转换蛋白与金属离子的结合或释放表现出一定的构象变化。x 射线晶体分析证 明：编号7 的二硫键的存在，使c 端结合部位与金属离子结合时隙缝不象n 端 那样有较大的敞开；脱铁转换蛋白的c 端比n 端具有更强的刚性吲。杨频i 酬 介绍了t b ( i i ：i ) 、e u ( m ) 与蛋白类生物大分子的相互作用。利用t b ( m ) 、e u f m ) 荧光敏化现象进行计量化学方面的研究，测定t b ( n i ) 、e u ( t l d 与生物大分子结 合的解离常数，确定竞争离子与生物大分子结合的解离常数。杨斌盛【8 玉8 6 1 ，梁 4 、绪论 宏等8 7 1 也有过类似的研究。 除稀土金属离子外，人们还研究了其它金属离子作为蛋白质探针。周永洽、 梁宏【8 8 - 9 3 1 进行了一系列的研究工作，他们指出：n i ( t 0 1 i s a 和n i ( n ) b s a 的l ：1 体系内均有2 个强偶合的金属中心，其电荷转移谱带( l m c t ) 是一种新型减 色效应，且这一效应符合生色基跃迁偶极矩间的偶极一偶极相互作用机理； c u ( n ) b s a 和n i t 四一b s a 配合物结构随b s a 浓度增大，以五配位的四方锥构型 转变成四配位的四方平面构型。还研究了f e ( m ) 、c u ( u ) 与h s a 的相互作用， 指出f e ( m ) 对h s a 的荧光猝灭是由于f e ( 1 n ) 与h s a 色氨酸吲哚氮结合，形成 不发光的复合物所致，人血清白蛋白与c u ( i d 有两类结合部位。 2 1 3 金属配合物型蛋白质探针 魏永巨州i 研究了f e ( d 一铬天青s 配合物与蛋白质的相互作用，发现f e ( m ) 一 铬天青s 的吸收光谱中的最大吸收波长为5 7 0n m ，而蛋白质与f e ( m ) 铬天青s 三元配合物的最大吸收波长为6 6 0n f f l ，认为这是因为b s a 侧链上的质子化氨 基与f e ( m ) 一铬天青s 配合物的磺酸基、羧基发生了静电作用而缔合，使配合物 电子体系”一+ 跃迁的能级间隔显著变小，引起较大幅度的红移。f u j a t ay 研究了h s a 与邻磺酸基苯基荧光酮一u ( v d 配合物的相互作用，依靠热力学参 数指出两者的相互作用是疏水作用1 9 5 l 。f u j a t ay 发现3 , 4 ，5 ，6 一四氯羧基一苯基荧 光酮一m n ( n ) 配合物与蛋白质相互作用时，蛋白质与金属配合物的结合能力与蛋 白质的等电点有关【州。 金属配合物型蛋白质探针主要是基于染料分子与金属离子配位。染料分子 如邻苯二酚紫、邻苯三酚紫、邻苯三酚红、铬天青s 等以邻近的基团提供配位 基团与金属离子配位。染料分子结构中大都有带有负电荷基团，可依靠静电作 用与蛋白质结合或者利用疏水基团以疏水作用与蛋白质结合，从而产生光学 性质方面的变化，藉此测定蛋白质的浓度以及探讨蛋白质的高级结构。 2 2 核酸探针的类型及研究进展 核酸探针的研究，主要集中在核酸定量分析和作用机理两个方面。表 l 一2 9 7 1 卅介绍了核酸探针在定量分析方面的运用。下面对不同类型核酸探针作 用机理方面的研究情况进行介绍。 2 2 1 有机分子型核酸探针 一、绪论 有机分子型核酸探针根据其用途的不同可分为药物和分析试剂两种类型。 ( 1 ) 药物型核酸探针研究药物分子如抗生素、抗癌药物与d n a 的相互作 用，无论是对阐述抗癌，抗病毒药物的作用机理，药物的体外筛选，还是对致 癌物的致癌机理的研究都是非常有意义的。 葸环抗生素是一类研究得比较多的抗癌抗生素。阿霉素( a d m ) 、道诺霉素 ( d n m ) 是这一家族中比较重要的两种抗生素。此外还有诺加霉素( n g ) 、阿克拉 霉素a 等，其共同的结构特征是含有一个由3 个共平面的六元环构成的四氢并 四苯醌发色团。关于a d m 的生物活性机理研究，迄今有两种观点：一种认为 a d m 直接与d n a 相互作用( 即经典的嵌入结合) 而导致对d n a 复制及转录 过程的抑制【1 2 5 】；另一种观点认为a d m 可诱导氧自由基的形成，从而导致对核 酸的切割1 蚓。w e i n e r 等 t 2 7 用电子顺磁共振方法( e l e c t r o np a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e ，e p r ) 分别研究了a d m 与双链d n a ( d s d n a ) 、单链d n a ( s s d n a ) 及转运r n a ( t r n a ) 的结合作用，认为a d m 必须先与核酸结合，然后才可产 生能切割核酸的o h 这与s c h u s m r 等人的观点相似【堙8 j 。即认为具有蒽醌结构 的衍生物均可以被设计成人工核酸酶，与含双功能基团的天然核酸内切酶相比， 葸醌衍生物具有结构简单、合成方便等优点，因此具有很大的研究与应用价值。 f r e d e r i c k 等【1 2 5 1 研究发现，d n m 与a d m 相比仅在c 1 4 位上存在着微小差别， 但是由于这微小差别导致了溶液中的溶剂分子、离子或其它一些大配体如聚胺、 蛋白质等对d n m a d m d n a 加合物产生不同的作用，此研究结果有助于指导 改进现有药物的化学结构，从而改善其生物活性。 烯二炔是一类在临床与理论研究中都有很大价值的抗癌抗生素这类抗生 素结构上的独特之处在于其分子中含有一个张力较大的烯二炔环，一个能与靶 d n a 接近的引导系统，另有激发系统以激活并起动级联反应。研究表明这类抗 生素通过与d n a 序列特异性结合并进而引起s s 一或d s d n a 的损伤而表现出生物 活性。新制癌素( n c sc h r o m ) 是一种较早发现的此类抗生素，在自然界中与 其宿主蛋白质以l ：1 的配合物形态存在。研究表明唧，n c sc h r o m 通过糖残 基( 2 一n - m e t h y f u c o s a m i n e ，卦m f ) 识别a _ t 碱基对并引导n p h ( n a p h t h o a t e ) 嵌入5 7 - c t 5 7 一a g 序列的碱基对间，同时烯二炔环( t e t r a h y d r o i n d e c e n c e ，t i l l ) 定 位于小沟中从而实现对d s d n a 的特异性结合及切割。近年来新发现或合成的此 6 、绪论 类抗生素还有d y n e m y c i n a ，c a l i c h e a m i c i n ，e s p e r a m i c i n a 及c 1 0 2 7 等 1 3 0 , 1 3 1 】。 近年来对于多肽及蛋白质类抗生素的研究较热。博莱霉素( b l e o m y c i n b l m ) 是一种天然存在的糖肽，是此类抗生素的代表，临床上常被用来治疗头、颈及 鳞状细胞癌。其结构通常可分为3 个功能区：n 一端、糖残基和c 端。n 端，主 要与金属离子和氧结合并切断d n a ；糖残基被认为是分子对细胞表面进行识别 的功能区；由二噻唑与不同阳离子取代基所构成的c 端则构成d n a 的识别区。 b l m 的抗癌活性被认为是在f e ( i d 或c u ( m 等具有氧化还原活性的金属离子 与氧同时存在的条件下，断裂d n a 所致。虽然b l m 分子对s s d n a 的切割机 理己比较清楚，但它对d s d n a 的序列特异陛切割直到最近才有较多报道。 v a n d e r w a l l 等 1 3 2 提出一种新的模型，即认为b l m 分子无需从d n a 链上解离， 即可同时催化互补的双链被切割。当然b l m 能对d n a 进行序列特异性剪切首 先取决于c 一端对d n a 的识别。有关b l m d n a 识别的模式也有不同的解释 t 3 3 , 1 3 4 1 。m a n d e r v i l l e 等1 3 司进行过类似的研究。近年来，从海洋生物中还发现了 一系列高活性的抗癌肽，其结构多为小分子环肽。它们不仅抗癌活性高，且稳 定性好。有关此类抗癌肽作用机制的研究尚需进一步探索。 此外，人们还研究了乙撑亚胺型抗生素。乙撑亚胺型d n a 探针是一种重 要的烷化剂。丝裂霉素c ( m i t o m y c i nc ，m c ) 作为一种临床上常用的重要抗肿瘤 剂，是这类化合物的代表。研究表明，m c 所具有的抗肿瘤能力及强细胞毒性 均与它和d n a 双链共价交联的能力有关。作为一种生物还原性烷化剂。m c 在 与d n a 结合之前，必须先经还原活化过程，活化后的m c 先与d n a 结合使之 单烷基化，然后产生双烷基化产物【1 3 6 1 。进一步研究表吲1 3 7 1 ，m c 在单烷基化 d n a 时具有高度的序列选择性。 ( 2 ) 分析试剂型核酸探针研究分析试剂与d n a 的相互作用机理，可以帮 助人们弄清d n a 污染物及毒物在d n a 分子上的结合，在病理分析，临床检测 以及基因变异等方面有重要意义。b o r i s s e r i t c hl o u de c ”8 1 研究了t m p y p 与d n a 的相互作用，认为其与d n a 的a t 碱基对结合时，可增强其荧光强度。m a s u d a g e n 9 3 9 研究了亚胺试剂与d n a 的相互作用，发现d n a 的加入使亚胺试剂的荧 光强度发生改变。 分析试剂型核酸探针的研究中，以酸碱荧光指示剂较多。d a r z y n k i e w i c zz 7 一、绪论 f 1 4 0 1 ，g u ox i a n g q u n l l 4 1 1 研究了吖啶橙与核酸的相互作用，认为可以用荧光法测 定细胞中的核酸，其荧光强度的增大是因为阴离子表面活性剂溶液中d n a 使 吖啶橙的单聚体与双聚体之间的平衡发生变化，单聚体嵌入d n a 中，引起二 聚体的离解，导致荧光增强。唐宏武1 4 2 1 ，赵一兵【1 4 3 1 也进行过类似的研究。 其次，还有一些花青染料作为核酸探针。k u m a rcv 【1 4 卅研究了花青染料与 d n a 的相互作用，花青染料阳离子型d s m i 与小牛胸腺d n a 作用后，其吸收 光谱发生红移及减色效应，认为沟槽结合机理允许染料的激发态发生旋转，而 这对这一类染料的激发态动力学上说是重要的，故沟槽结合较为合理。y a r m o l u k , s m 1 4 5 1 合成系列单次甲基花青染料，研究了其与具有天然活性的核酸的相互作 用，发现花青3 、花青6 与核酸作用后，荧光强度增大到3 5 0 1 5 5 0 倍，而花 青4 与核酸作用，有极大的s t o k e s 位移( 1 5 4n m ) ，指出合成含亚甲基氧苯 并噻唑残基的花青染料有可能成为新型核酸探针。 还有一些其它的分析试剂可作为核酸探针。b h a a a c h a r y a ，s a r t a n u l l 删利用蒽 基荧光探针研究表面活陛剂与d n a 的相互作用，指出阳离子型表面活性剂和 盐可以诱导d n a 构象转变，使得结合在d n a 上的荧光探针被释放出来，而且 表面活性剂的加入可导致d n a 热熔温度的升高。 c h e n g z h i h u a n g l l 4 7 1 认为t a p p 与核酸的反应与核酸的浓度有关当核酸与 t a p p 的摩尔比小于4 ：1 时，核酸使t a p p 减色，并且使t a p p 的荧光发生猝灭， 但共振光散射增强；当核酸与t a p p 的摩尔比大干4 ：1 时，核酸与t a p p 形成一 个新的荧光配合物。 从表1 2 中列出的有机分子型核酸探针可以看出，大部分探针结构上有如 下特点：带有正电荷，有大的电子共轭体系，有强的芳香性或疏水性，不具带 有负电荷的亲水性基团，如磺酸基、羧基和羟基等。 2 2 2 金属配合物型核酸探针 近年来，金属配合物与d n a 相互作用的研究正逐渐引起人们的重视。如 金属卧啉配合物，铂配合物，其它过渡金属配合物( 如r u 、r h 、c o 配合物等) 与d n a 的相互作用。 国内杨频教授领导的课题组，选择了c o ( m ) 、n i ( i d 作为中心离子，合成了 c o ( p h e n ) z d p p z 3 + 、 c 0 0 ) p y ) 2 d p p z 3 + 、 n i ( p h e n ) z d p p z 2 + 和 c o ( p h e n ) 2 d p p z 2 + 配合 一、绪论 物，进行了结构表征并首次研究了这些配合物与小牛胸腺d n a 的作用【1 4 昏1 53 1 ， 取得了一些有意义的结果：( 1 ) 配合物与d n a 作用后吸收光谱减色，吸收峰 有轻微红移，红移程度随d n a 浓度的增大而增大。4 种配合物与d n a 键合常 数k 1 0 5l m o l 。( 2 ) 在t d s h c i 缓冲液中，单独的配合物本身无荧光，与 d n a 反应后，荧光明显增强。这是由于配合物与d n a 作用后，d p p z 插入d n a 碱基对中，吩嗪n 受到保护而脱去缔合水，使荧光增强。( 3 ) 由于配合物和 d n a 碱基对之间产生堆积效应，d n a 稳定性增加、熔点升高、粘度增大。而 粘度增大是插入结合的重要指标之一。( 4 ) 在t d s h c i 缓冲液中，当在 c o ( p h e n ) 2 d p p z 3 + 中加入d n a 后，配合物的特征氧化还原峰电流均明显下降， 且峰位有位移。峰位的移动表明，配合物与d n a 分子中带有负电荷的磷酸基 可能存在静电结合。( 5 ) 利用圆二色谱( c d ) 考察外消旋配合物与d n a 透析4 8 h 后溶液旋光度的变化，本来是外消旋配合物，经透析有了旋光性，表明发生了 立体结合。这些配合物在光照下可使d n a 断裂，从而为设计与d n a 结合力强、 以光切断d n a 的新型抗癌药提供根据。此外，俞英等【1 蚓也有过类似的研究。 虽然国外有关【r u ( p h 吼) 3 】2 + 作为d n a 结构探针的研究报道很多，但配合物 与d n a 的作用机理仍不十分清楚，并且还存在着争议。b a r t o n 使用平衡透析 及光物理方法，研究了异构体与不同组成、不同结构的核酸的反应。通过测定 异构体的荧光发射寿命发现，两异构体与d n a 的反应都有插入和表面键合两 种模式存在，键合发生在d n a 大沟中，并获得了外消旋体与d n a 作用的结合 常数为6 2 x 1 0 3 l m o l 1 5 5 。s a t y a n a r a y a n a 等通过平衡透析和测定粘度的方法研究 了该配合物与小牛胸腺d n a 的作用，发现每一种异构体与d n a 键合能力都较 弱。粘度实验表明，每一种异构体均不会导致d n a 粘度增大，因此典型的插 入方式不可能存在。分子模拟和能量最低计算表明：p h e n 环的一部分插入d n a 小沟中，并导致d n a 结构的轻微扭曲【1 5 6 , 1 5 7 。n o r d e n 曾认为异构体与d n a 键 合仅有一种模式，而且是非插入( n o n i n t e r c a l a t i v e ) 模式，该结论被二维n m r 证 实 1 5 8 i 。 2 2 3 金属离子型核酸探针 对金属离子型核酸探针的研究，将促使人们进一步了解金属离子对核酸的 生物功能的影响。目前，研究集中在金属离子与核酸的结合反应上。 9 一、绪论 金属离子型核酸探针的研究中以稀土金属离子较多。s h i o n o y a ，m r l 5 9 1 研究 了t b ( m 3 与d n a 的相互作用，发现t b ( m 3 可使体系荧光增强几倍，而 r b ( u i ) 的大环配合物与d n a 中的鸟嘌呤碱基相互作用，体系荧光剧增，认为鸟嘌呤 碱基发生能量转移。 其次，一些非稀土金属离子也可作为核酸探针。花尔并等1 6 0 l 研究了a 型 均聚双链核糖p o l