（细胞生物学专业论文）人类未知功能蛋白质的克隆、表达、纯化和结晶.pdf

摘要 随着人类结构基因组计划的完成，基因产物的功能更加受人关注。通过大规模高通 量的未知结构蛋白质的晶体筛选、结构解析来阐述其生物学功能和意义成为了当前研究 蛋白质功能的一个主要手段。 我们选择了1 0 0 个人类基因作为靶基因，这些蛋白质分子量在2 0 到5 0k d a 之间， 没有已知的晶体结构和作为同多聚体亚单位的结构，含有较少的疏水残基。我们希望通 过对所挑选的靶蛋白的晶体来确定其结构，以此来解释其功能和生物学意义。通过 g a t e 、嘶o m 技术我们成功地克隆了这1 0 0 个基因，其中有7 9 个基因在e 白疗b l 2 1 ( d e 3 ) 中表达，有9 个基因在e c o l ig o s e t t a ( d e 3 ) 表达。通过可溶性鉴定，发现有2 1 个蛋白 质具有可溶性。我们使用n i 亲和层析和凝胶过滤等方法得到了1 2 个具有高纯度的目的 蛋白质，并利用坐滴法将已纯化的蛋白质放在4 8 孔坐滴板上进行蛋白质晶体生长条件 的筛选，然后使用悬滴法进一步优化晶体生长条件。目前获得了c o q 3 蛋白质晶体。这 些工作为进一步研究这些蛋白质的结构和功能奠定了良好的基础。 关键词：结构基因组学；表达；可溶性鉴定；纯化；晶体生长 a b s t r a c t f o l l o w i n gt h ec o m p l e t i o no ft h eh u m a ng e n o m es e q u e n c e ，m u c ha t t e n t i o ni sn o w s h i f t i n gt o w a r d st h ef u n c t i o n so ft h eg e n ep r o d u c t s t h eh i e ) p u tt h r o u g hc r y s t a l l i z a t i o na n d d e t e r m i n a t i o no fu n k n o w nf u n c t i o np r o t e i nw a sam a i na p p r o a c h e st oe x p l a i nt h e i rf u n c t i o n 10 0h u m a ng e n e sw e r es e l e c t e d 邪t e s t t a r g e t s f o rp a r a l l e l c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ， p u r i f i c a t i o na n dc r y s t a l l i z a t i o n p r o t e i n sf r o mt h e s eg e n e sw e r es e l e c t e dt oh a v ea m o l e c u l a r w e i g h to fb e t w e e n2 0a n d5 0kd a , n o tt oh a v eah i g hp e r c e n t a g eo fh y d r o p h o b i cr e s i d u e s ( i e m o r el i k e l yt ob es o l u b l e ) a n dt oh a v en ok n o w nc r y s t a ls t r u c t u r e sa n dw e r en o tk n o w nt ob e s u b u n i t so fh e t e r o c o m p l e x e s t od a t e ，10 0e x p r e s s i o nc l o n e sh a v eb e e nc o n s t r u c t e dw i t ht h e g a t e w 矿c l o n i n gs y s t e m o ft h e s e ，7 9c l o n e sw e r ee x p r e s s e da sr e c o m b i n a n tp r o t e i n si n e s c h e r i c h i ac o l is t r a i nb l 2 1 ( d e 3 ) ，a n d9c l o n e sw e r ee x p r e s s e da sr e c o m b i n a n tp r o t e i n si n e s c h e r i c h i ac o l is t r a i nr o s e t t a ( d e 3 ) ，o fw h i c h21w e r es o l u b l ea n d12h a v eb e e np u r i e dt o h o m o g e n e i t y c r y s t a l l i z a t i o nc o n d i t i o n sw e r es c r e e n e df o rt h ep u r i f i e dp r o t e i n si n4 8 一w e l l p l a t e sb yt h es i t t i n g - d r o p a f t e r f u r t h e rr e f m e m e n tw i t ht h es a m ed e v i c eo rb yt h e h a n g i n g - d r o pm e t h o d ，t h ec r y s t a lo fc o q 3w e r eg r o w n t h er e s u l t sp r o v i d ei n s i g h t si i l t 0t h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h o s ep r o t e i n k e y w o r d s ：g e n o m i cp r o t e i n s ；e x p r e s s i o n ；s o l u b i l i t yi d e n t i f i c a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ； c r y s t a l l i z a t i o n i i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所 取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：燃日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东= i l i ) i l i 范大学可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学 位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文 数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行 和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：象巡 指导教师签名： 日 期：泌! 殇：q 岁 e l 期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 3 塔 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 引言 本论文的研究背景和立题依据 随着人类全基因组计划的完成，生物学进入了后基因组时代，对蛋白质功能的了解 成为了生物学研究的一个迫切地需求【l 引。由于蛋白质空间结构能够为功能的解释提供 大量的信息，结构的探索也成为了生物学研究的一个热点，因此结构基因组学应运而生。 结构基因组学旨在发现、分析、普及整个自然界物种中所有蛋白质、r n a 、d n a 、糖等 生物大分子以及各种大分子复合物的结构。主要研究手段是利用x 射线晶体学、多维核 磁共振以及电子显微镜对未知结构的生物大分子或者复合物的结构进行解析，获得较高 分辨率的空间折叠构象。目前研究主要集中于蛋白质分子及蛋白质r n a 、蛋白质d n a 、 蛋白质小分子的结构上睁7 1 。由于多维核磁共振具有要求样品纯度高、浓度大、稳定性 好，分子量小等缺点，电子显微镜要求样品分子量较大，且分辨率较低的缺点，蛋白质 x 射线晶体学仍然是当前解析蛋白质结构的主要手剧1 0 1 。从1 9 9 9 年起，陆续有美国、 欧洲、日本、中国发起了结构基因组计划，目的是获得大量的未知三维结构的蛋白质或 蛋白质复合物的空间构象，以此来设计药物，提高生物化学、生物技术的催化效率，检 测和治疗肿瘤疾病，目前已经解析了大量的蛋白质结构并取得了阶段性的成果【1 1 1 。 本论文的研究内容和意义 本论文主要通过g a t e w 对o m 克隆技术将所挑选的1 0 0 个未知结构的蛋白质基因构建 到表达载体p e t 2 1 a - d e s t 上，并转化到e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 、e c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) 中，使用 i p t g 诱导表达。通过超声波破碎菌株，离心获得可溶性的蛋白质。再利用n i 亲和层析， 凝胶过滤等方法分离提纯目的蛋白质。并使用坐滴法筛选蛋白质晶体生长条件，使用悬 滴法筛选优化蛋白质生长条件，获得可衍射的蛋白质晶体。 本论文完成了1 0 0 个未知结构蛋白质表达载体的构建，筛选出了具有较高可溶性， 可纯化的蛋白，以上工作都为这些蛋白质结晶和结构的解析奠定了基础。我们还获得了 c o q 3 蛋白质的晶体，为c o q 3 的结构解析和功能研究打下了基础。本文还进一步优化 了高通量蛋白质结构基因组学的研究方法。 东北师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 一、蛋白质的结构 1 9 5 4 年p a u l i n gl 因发现蛋白质a 螺旋结构获得诺贝尔化学奖，从而证实了蛋白质 存在规则的空间结构。1 9 5 9 年m ep e r u t z 和j c k e n d r e w 用x 射线衍射解析了肌红蛋 白分子的三维结构模型，进一步揭示了蛋白质具有稳定的独特的和功能相联系的三维空 间结构。自此拉开了蛋白质结构与功能研究的篇章。现在已经证实蛋白质并不是完全伸 展的多肽链，而是以紧密的折叠结构存在的，并且一个特定的蛋白质行使其功能的能力 经常是由它的三维结构或构象决定的。蛋白质的结构被分成一级结构、二级结构、三级 结构以及四级结构几个层次。按稳定化学键的种类被分为蛋白质共价结构和三维结构。 稳定蛋白质三维结构的力主要包括氢键、范德华力、疏水作用力、和离子键【1 2 】。 ( 一)蛋白质的一级结构 蛋白质是由一条或者几条具有确定氨基酸序列的多肽链构成的大分子。蛋白质一级 结构即指蛋白质多肽链的氨基酸残基序列。一条肽链由l 型氨基酸按照一定序列排列， 相邻氨基酸之间通过缩合脱去一分子水而形成肽键，肽键由羰基碳和酰胺氮连接而成 【1 3 】 o 蛋白质的一级结构决定了蛋白质的空间构象，序列相近的蛋白质在三维结构上有着 明显的相似性，这种相似性称为序列同源，通过比对同源序列可以分析预测蛋白质的三 维结构以及可能的功能【1 4 ，15 1 。 ( 二)蛋白质的二级结构 蛋白质在一级结构的基础上，利用氢键作用形成的盘曲和折叠就是蛋白质的二级结 构。蛋白质的二级结构主要分为q 螺旋( 0 【h e l i x ) ，b 折叠( b - s h e e t ) 和无规卷曲( r a n d o m c o i l ) 。 1 螺旋结构 蛋白质内最常见的二级结构为q 螺旋，a 螺旋为右手螺旋，每圈有3 6 个残基，每 圈螺旋沿螺旋轴方向上升0 5 4 n m ，每个残基绕轴旋转1 0 0 0 ，沿轴上升o 15 n m 。不计侧 链螺旋直径为0 5 n m 。相邻螺圈之间形成氢键，氢键取向与螺旋轴平行。氢键封闭的环 是1 3 元环，因此q 螺旋也称3 6 1 3 螺旋。 2 东北师范大学硕士学位论文 萋 h 筏 麟j 爱：。 二 帅d r i 一 图11 四种i 芏l 示的n 螺旋从左至右依次为。螺旋的氢键、肽平面、电子密度、彩带图示。( 摘自g a r r e t r h ，g f i s h a m c mb i o c h e m i s t r y s e c o n dn e w y o r k ：s a u n d e r s c o l l e g ep u b l i s h i n g , 1 9 9 ：1 1 0 - 1 1 1 ) 蛋白质中还发现几种小常见的螺旋类型，包括3 - 。螺旋，n - 螺旋等。3 1 0 螺旋为 右手螺旋每圈上升3 n m ，为1 0 元环。每残基上升02 n r n ，螺距上升06 r i m 。- 螺旋， 又称4 4 w 螺旋，右手螺旋，每圈上升4 4 n m ，为1 6 元环。残基高度0 1 2 n m ，螺距05 2 n m - l ”。 2 折叠结构 由于局部协同性氢键形成，蛋白质中还存在一类常见的二级结构称为b 折叠片或 1 3 构象。折叠片包含两种形式，一种是平行1 3 折叠片，一种是反平行b 折叠片。b 折叠结 构肽链处于最伸展的状态，主链成一个方向成锯齿状，a 碳原子位于折线顶端。相邻的 肽键相瓦平行，以氢键相互连接，形成片层结构。如果相邻的半行的肽键肽链走向都是 由n 到c 的，称为平行日结构，恰好相反的则为反平行的b 结构“。 ，p o 。p k l p 太 ，丫，工。，、y ，工v 1 1 土。 丫l j 】1 j了1 j i ，。 ，r o j r l k r 人 幽12 、m ，和反f 行的日折叠红色虚线代在氢键，黑色删球代表a 碱原于，监色代表氨原f ，红乜 代表伽链，闩色代表氯原子。( a ) 为r 行的b 折硅，片层之司怕氢键址弯曲的。( b ) 为反平行的b 折叠，片层2 间的氢键是直的。( 摘自g a r r e tr h ，g r i s h a m c mb i o c h e m i s t r y s e c o n dn e w y o r k ： s a u n d e r s c o l l e g ep u b l i s h i n g 1 9 9 ：l i3 - 1 1 4 ) 3 黢斟 东北师范大学硕士学位论文 3 回折结构 在蛋白质中多肽链必须弯曲、回折以形成更高级具有功能的结构，在蛋白质中观察 到一类转角结构和突起结构，称为b 转角( b - t u m ) 和b 突起( 1 3 - - b u g l e ) 。0 转角肯有四 个残基，第一个氨基酸残基的c - o 和第四个氨基酸残基的n h 之间形成一个氢键， 使肽链走向旋转了1 8 0 。脯氨酸和甘氨酸经常出现在1 3 转角结构中。由于甘氨酸缺少 侧链( 只有一个h ) ，在b 一转角中能很好的调整其他残基的空间阻碍，因此使立体化学上最 合适的氨基酸；而脯氨酸具有环状结构和固定的角，因此在定程度上迫使p 一转角形成， 促使多肽自身回折且这些回折有助于反平行0 折叠片的形成。 广， 。每j 。 一， 幽14 两种主要类型的b 转角白色虚线代表氢键，黑色圆球代表。碳原子，蓝色代表氮原于，红色 代表侧链，白色代表氢原子。( a ) 为顺式b 转角，c b ) 为反式b 转角。( 摘自g a r r e t r h ，g n s h a m c m b i o c h e m i s t r y s e c o n d n e w y o r k ：s a t m d e r s c o l l e g ep u b l i s h i n 9 1 9 9 ：1 1 5 1 1 6 ) 还有一类转角，在第三个氨基酸残疾开始改变方向，靠两个氢键维持转角结构这 种转角被称为y 转角。 b 凸起经常作为反甲行b 折叠片中不规则的情况出现，可以认为是b 折叠片中插入 一个氨基酸残基，它使b 折叠片的走向发生改变，但角度较小”。 幽15 左侧肚链较右侧肚键多一个氧基醴残基，形成向右侧弯曲的b 凸起( 摘自王镜岩r 朱长庚 徐长法牛物化学上册第三版北京高等教育山版社，2 0 0 4 ：2 1 1 - 2 1 2 ) 。 东北师范大学硕士学位论文 4 无规卷曲 无规卷曲是蛋白质肽链中没有确定规律、结构比较松散的肽段构象，不能被归入明 确的二级结构，但是它们有明确而稳定的结构。它们受侧链相互作用的影响很大。这类 有序的非重复性结构经常构成酶活性部位和其他蛋白质特异的功能部位，如氧铁还原蛋 白的结合铁硫串的肽环，钙结合蛋白的e f 手结构【1 8 。2 0 l 。 ( 三)蛋白质的三级结构 自然界的蛋白质分为纤维状蛋白和球形蛋白。纤维状蛋白质虽然含量丰富，但结构 简单且种类较少。蛋白质结构的复杂性和功能的多样性主要体现在球状蛋白质上。蛋白 质的三级结构也多指球状蛋白的三级结构，即在蛋白质二级结构的基础上，在多种非共 价键的作用下构成的蛋白质三维空间的结构【2 1 1 。 三级结构与二级结构之间有的人还细分为超二级结构( 相邻二级结构的组合方式) 和结构域( 具有功能和结构特点的紧凑的局部三级结构) ，但是按维持蛋白质结构作用 力分类均属于三级结构【2 2 , 2 3 】。 球状蛋白三级结构可根据结构域分为四大类：全d 结构( 包括四螺旋束、珠蛋白螺 旋等) ，全1 3 结构( 包括反平行b 桶、单绕平行b 桶等结构，q 1 3 结构( 平行1 3 桶、双 绕平行1 3 桶等) 及富含金属二硫键结构。这些结构都有明确的折叠样式，具有明显的结 构和功能特征，是蛋白质行使功能的结构基础【2 4 j 。 ( 四)蛋白质的四级结构 在自然界中许多蛋白质是以独立折叠的球状蛋白质通过相互作用形成聚合体的形式 存在的。这些球状蛋白质通过非共价键彼此结合成聚合体的方式构成了蛋白质的四级结 构。四级结构的蛋白质中每个球蛋白称为亚基，也称为单体。由两个亚基组成的蛋白质 称为二聚体，两个或两个以上亚基组成的蛋白质称为寡聚或多聚蛋白质。由结构相同， 序列相同的亚基组成的蛋白质称为同多聚，反之，则是异多聚【2 5 1 。 亚基之间的极性相互作用、疏水作用、氢键、离子键成为缔合蛋白质四级结构的主 要作用力，有些亚基之间还形成二硫键，以此来稳定四级结构。 四级结构是蛋白质最高级的结构，四级结构增加了蛋白质的稳定性，提高了遗传经 济性和效率，亚基间的协同性和别构效应对蛋白质在发挥蛋白质功能方面起着巨大作 用。 二、蛋白质晶体学 ( 一)蛋白质晶体学的发展 蛋白质晶体学是应用x 射线衍射方法研究蛋白质的晶体，揭示蛋白分子空间结构 与功能关系的科学。通常采用低波长，高亮度的x 射线( 约为0 1 n m ) 对蛋白质晶体 进行衍射，获得最高可达1 1a 的蛋白质空间结构【2 6 1 。 x 射线是波长在0 0 1 1 0 0 0i l i n ( o 1 一l o o o a ) 之间的一种电磁辐射，在1 8 9 5 年由 w i l h e l mc o n r a dr o e n t g e n ( 1 8 4 5 1 9 2 3 ) 发现，由于当时对其属性了解较少，所以将其命名 为x 射线。m a xy o nl a u e ( 1 8 7 9 1 9 6 0 ) 在1 9 1 2 年提出用晶体来作为x 射线光栅，在 5 东北师范大学硕士学位论文 x 射线和晶体相互作用时，出现了衍射现象。晶体的长程和三维有序的特征，使组成晶 体的任一分子产生的衍射加强，因此记录并分析一个可以被探测到的衍射效应，可以推 导出晶体和分子的结构。w i l l i a mh e n r yb r a g g ( 1 8 6 2 1 9 4 2 ) 和他儿子w i l l i a ml a w r e n c e b r a g g ( 1 8 9 0 1 9 7 1 ) 首次利用x 射线测定晶体结构。l a u e 和两位b r a g g 分别获得了1 9 1 4 年和1 9 1 5 年的诺贝尔物理学奖【2 7 】。1 9 3 4 年b e m a l 和c r o w f o o t 拍摄了第一张蛋白质 ( 胃蛋白酶) 单晶x 衍射照片。1 9 5 7 年，j c k e n d r e w 和他的同事们解析了抹香鲸 肌红蛋白的晶体结构，当时他们只采用了衍射花样中间的4 0 0 个斑点，相当于6 a 分 辨率，经过傅立叶合成，最后得到了可以解释的电子密度图，为一个蛋白质构建了三维 构象，k e n d r e w 和他的同事们看到前人未见的东西，这项成果成为了分子生物学的一个 里程碑，证明了x 射线晶体学可以用于解析蛋白质等生物大分子的结构。从此以后， x 射线晶体学成为研究蛋白质空间结构的最有效的方法【2 8 】。 ( 二)蛋白质结晶原理 蛋白质在溶液中的结晶是一种缓慢沉淀的过程，在一定的溶液环境中，溶液中的成 分和蛋白质分子之间的相互作用( 如疏水相互作用、静电作用和氢键等) 相对稳定时， 折叠完整并且类型一致的蛋白质分子按照一定的作用方式规则地堆积起来，达到一定的 数量以上就以空间排列有序的固体形式析出，即为晶体。使蛋白质沉淀的常用方法是加 入高浓度的盐( 比如硫酸铵) 或者聚乙二醇作为沉淀剂，降低水的流动性以增加蛋白质 的有效浓度。或者是使用有机溶剂，改变溶液的酸碱度，改变结晶的温度，通过减小蛋 白质分子间的排斥力或是增大它们之间的吸引力导致蛋白质聚集而发生沉淀【2 ”2 1 。当 然，高分辨率、高质量的x 射线衍射数据所需的高质量的蛋白质晶体，必然是堆积紧 密的、长程有序的单晶，并且具备一定尺度。影响晶体质量的因素主要是蛋白质溶液本 身和结晶条件，晶体筛选策略应该从这两个方面入手。蛋白质本身的因素主要包括蛋白 质纯度、蛋白质浓度、缓冲液成分和缓冲液性质，因此高纯度和高均质性的蛋白质样品 是基本的要求。另外，实践证明，与蛋白质特异性相互作用的配基或者小分子底物能够 促进蛋白质结晶。蛋白质的结晶条件主要包括环境温度、沉淀剂浓度、离子强度和酸碱 度，为了获得高质量的单晶，就要对所有这些条件进行精细的优化。结晶过程首先是晶 核的形成，然后以此为核心进行蛋白质分子有序堆积，只要条件合适并且稳定，晶体就 会越长越大。结晶过程中使体系缓慢地趋向溶解度最小，逐渐达到过饱和状态，防止晶 核形成过多，控制结晶速度，有利于培养质量较高的单晶【3 3 。硎。 ( 三)蛋白质晶体学特点 当前生物大分子的空间结构研究领域已经发展了很多新的技术，比如蛋白质电子晶 体学，多维核磁共振( n m r ) 和中子衍射，但x 射线蛋白质晶体学仍然是揭示蛋白质 空间结构最主要的手段。这得益于x 射线蛋白质晶体学实验的三个组成部分：x 射线 光源，蛋白质晶体和检测器的设备和技术的飞速发展【3 7 】。首先，高强度、高性能的x 衍 射仪的发展，使得晶体衍射能力加强，衍射数据的质量大幅度提高，最重要的是同步辐 射x 光源的开发和应用。同步辐射是以接近光速运动的荷电粒子在改变运动方向时放 出的电磁辐射，是使用储存环中的电子或正电子放出的同步辐射，其原理是在垂直的均 6 东j l - v i l i 范大学硕士学位论文 匀磁场中电子的运动是圆周运动，它沿着运动轨道的法线方向放出同步辐射。同步辐射 装置应用于晶体学研究是x 射线光源的重大突破，经过一些单色器等光学设备分离得到 的x 射线比普通室内衍射仪光源强度高出两三个数量级，在很大程度上弥补了晶体衍 射能力不足的缺陷，并且其发散度较低，衍射点的清晰度高，信噪比也高。另外一个突 出的优点是其波长可调，可以根据实验目的不同选择不同波长的x 射线。同步辐射x 光源的高偏振性，使得原子的反常散射效应加大，适用于同步辐射光源的多波长反常散 射( 煳) 法已经得到了广泛的应用。第二，高效率的结构基因组学的研究使得基因 克隆和表达、蛋白纯化和晶体生长条件筛选过程的自动化趋势加速，因而大幅度加快了 晶体筛选的速度，提高了获得高分辨率衍射能力晶体的成功率。第三，高精密度探测器 的发展使得对衍射信号的探测更加敏感，收集到的衍射数据也更加全面，提高了衍射数 据质量，配合晶体结构解析方法研究的进展和计算机技术的飞速发展，使得相位问题的 解析变得更加快捷和准确。第四，蛋白质晶体学并不严格受到蛋白质性质的影响，无论 是分子量较大的蛋白质，蛋白质复合物，还是较小的多肽；无论是球蛋白，还是膜蛋白， 或者是分泌蛋白，都可以尝试蛋白质晶体的培养，并且也有很多成功的实例【3 8 , 3 9 。截至 到2 0 0 9 年1 月1 日，在p d b 数据库中提交的生物大分子结构已达5 0 8 5 4 个，其中约4 3 9 6 9 来由x 射线晶体学方法获得的【加】。 ( 四)蛋白质晶体学发展及应用 蛋白质的一级结构决定了蛋白质的空间结构，进一步决定了蛋白的功能。蛋白质的 主链折叠框架，与侧链共同构建的功能区域，精细结构中显示的原子间的相互作用并由 此显示的基本的物理和化学事件为研究者提供了大量的信息去了解蛋白结构与功能，这 些信息在基础理论研究，蛋白质工程、酶工程研究以及基于结构的药物设计和药理学研 究等领域是非常重要的【4 1 1 。 三、结构基因组学 目前已经测定了很多物种的基因组序列，人类面临的挑战将是如何更进一步认识和 了解这些基因组序列，让这些资料能够服务于人类的健康。人类基因组序列测定虽然已 经完成，但是仍然有超过半数的人类基因的功能是未知的，因此，以全基因组为背景， 开展人类基因及其编码蛋白的功能研究是后基因时代的重要任务。结构基因组学，通过 高效率的蛋白质三维结构解析，为蛋白质功能研究和药物设计提供了基础。 ( 一)高效率的结构基因组学 高效率结构基因组学就是利用大规模高效克隆表达系统快速、大量地进行蛋白质结 构解析。其研究的一般操作流程是从靶基因的筛选开始，然后进行大规模的基因克隆、 蛋白纯化和晶体筛选，晶体结构数据收集，结构解析以及系统的结构分析。靶基因的选 择，根据实验室研究方向的不同，标准也不同。一般包括以下几个阶段：首先是靶基因 门类的选择，比如物种的确定，某种疾病相关或者某种组织表达谱的基因，或者某种特 征性的蛋白结构域、蛋白类型等；第二是排除所选靶基因编码蛋白中已知高度同源蛋白 结构的基因；最后一步是根据实验室的条件，比如克隆表达系统，纯化设备和工作环境 7 东北师范大学硕士学位论文 选择分子量适当，热稳定性较好的蛋 4 2 , 4 3 】。 一般情况下，大肠杆菌表达系统是高效率结构基因组学研究首选的系统，优点是容 易得到较多的目标蛋白，培养时间较短，分离纯化步骤简单，制约因素比较少。缺点是 容易形成包涵体，原因主要是大量外源基因表达速度过快，并且与蛋白本身的性质也有 关系。因此，通过改变克隆表达条件，如载体、诱导条件、表达菌株等，改善表达状况。 真核表达系统因为操作较为麻烦，所用材料比较昂贵，周期较长，一般不用作大规模、 高效率结构基因组研究【4 4 j 。 目前结构基因组学研究流程规模化和自动化操作在基因克隆、蛋白表达和纯化、晶 体生长条件筛选等方面已经取得了很好的进展。商业化的g a t e w d m 克隆表达系统和高 效率常规克隆表达技术的开发和应用使得大批量的基因克隆操作简单易行；蛋白质纯化 技术和设备的发展使蛋白纯化流程更加快捷；自动化晶体筛选和结晶检测图像自动收集 系统已经纳入应用；高效率晶体衍射数据收集和结构确定也得到了较好发展，进展还涉 及到晶体上载自动化装置，同步辐射x 光源和室内x 衍射设备，铬靶发生器的应用， 数据处理及呈递的结构解析，结构精修和最终确定等整个流程【4 3 。 用于蛋白质结构研究的多是已知功能的蛋白质，以空间结构解释蛋白质的生物化学 功能。测定未知生化功能的蛋白质结构研究一直较少有研究者从事，尽管蛋白质的空间 结构信息能在一定程度上对蛋白质功能预测提供重要线索，但是完整地解释蛋白质功能 还是比较困难。伴随着蛋白质组学和结构基因组学研究，越来越多的蛋白质结构被解析， 越来越多的空间折叠模式及与功能的关系被了解，相关的生物信息学资源也日益增多， 未知功能蛋白质的空间精细结构信息已经能够展示出越来越多的功能特征。所以，结构 基因组学的研究已经向未知功能蛋白质拓展了它的领地。 ( - - )g a t e w a y 住基因克隆技术 作为实验室大规模、高效率基因表达实验平台建立的起始阶段，为了同步处理大批 量基因，尽可能使构建的实验平台规范化和标准化，我们采用了美国生命技术公司( l t i ) 在1 9 9 9 年度推出的g a t e 、a y o m 克隆技术。这是一项为多系统基因表达和功能分析的 d n a 序列克隆的通用技术。这项技术是通过位点特异性的重组整合，使得d n a 片断 在不同的载体之间转移，代替常规克隆实验操作中的采用的限制性内切酶和连接酶分别 催化的酶切和连接反应的克隆策略，简化了许多d n a 产物的回收和纯化步骤，不仅能 够忠实地保持基因的转录方向和阅读框架，而且其阳性克隆比率可达9 0 以上，因此， 极大地方便了目标基因的克隆和表达过程。针对大批量基因进行平行的克隆表达操作 ( 所谓高效率) 也使得进一步释放手工作业，自动化处理大批量的基因成为可能。另外， 该技术能使克隆载体的变换过程更加简洁，很方便应用于目标基因的功能研究。 g a t e w 对1 m 技术原理是来自天然的九噬菌体基因组进入大肠杆菌基因组和从中抽出 的过程中发生的整合切割进程的启发。这是九噬菌体在其宿主菌大肠杆菌体内生活周 期中的溶源和溶菌状态转换时发生的反应。这两个反应是由三个功能特异的蛋白质共同 作用的，整合酶( h a t ) 和切割酶( x i s ) 由九噬菌体基因组编码，宿主整合因子i h f 由 宿主菌基因编码。特异性的天然重组位点是a t t b 、a t t l 、a t t r 和a t t p ，为了提高重组效 8 东北师范大学硕士学位论文 率和方向明确的克隆需要，这些位点经过了修改。基因重组反应过程如下图1 6 示。通 过b p 重组和l r 蕈维，目的基因构矬到表达载体上【4 54 6 ) 。 n t e r g r a t l o n ( m t ，11 e x c s - 。nc 1n tm s 广、溺叫卜盘 幽1 6 l 噬苗体和大肠杆漪基因组的重组。粘台酶( i n t ) 和宿：鹎台因子( i h f ) 催化了a t 巾和a n b 之间的重组反应( 稚；台) ；在a t l l xa t t r 重纽的割离反府中，割离酶( x i s ) 参与进来共同执行了这 个进程( 摘自i n v i t r o g e n g a t e w a y t e c h n o l o g y i n s t r u c t i o n 眦m iv e r s i o nc 0 6 0 3 0 22 5 _ 0 5 2 2 7 - 8 ) 。 嵩 东北师范大学硕士学位论文 实验材料 菌株及其培养试剂 第二章实验材料与方法 1 e c o b l 2 1 ( d e 3 ) 、e c o r o s e t t a ( d e 3 ) ，购自n o v a g e n 公司。 2 e c o d b 3 1 、e c o d h 5 a 购自i n v i t r o g e n 公司。 3 酵母提取物、胰蛋白胨，购自o x o d 公司。 4 氨苄青霉素、卡那霉素、i p t g 购自r o t h 公司。 ( - - )原始质粒 5 人类e d n a 文库( 质粒浓度约1 0 0n g p 1 ) ，由罗明教授提供( d e p a r t m e n to f m i c r o b i o l o g y , u n i v e r s i t yo f a l a b a m a a tb i r m i n g h a m ，b i r m i n g h a m ，a l ，u s a ) ； 6 p e t 2 1 a - d e s t 载体，由本实验室构建； ( 三)主要试剂及试剂盒 7 质粒小量提取试剂盒( t i a n g e n ，c h i n a ) 8 g a t e w a l b pc l o n a s ee n z y m em i x ，g a t e w 严l rc l o n a s ee n z y m em i xi i ， p d o n r 2 0 1 ，( i n v i t r o g e n ，u s a ) 9 t 7 引物( t i a n g e n ，c h i n a ) 1 0 t a q2xm i x ( t i a n g e n ，c h i n a ) 1 1 蛋白质晶体生长试剂盒i n d e x ，c r y s t a ls c r e e ni ，c r y s t a ls c r e e ni i ，n a t r i x ，m e m b f a e 、 p e g i o n ( h a m p t o nr e s e a r c h ，u s a ) ( 四)实验设备及仪器 实验中所用主要仪器有超净工作台( 艋t e c h ，昌平长城仪器厂) 、台式高速冷冻离心 机( 1 1 5 k s i g m a ) 、电泳仪及电转移装置( e p s 3 0 1 ，a m e r s h a m ) 、凝胶成像仪 ( a l p h a l m a g e - 2 2 0 0 ，a l p h a l c ) 、p c r 仪( t - 1 ，b i o m e t r a ) 、紫外光度计( b g e n e q u a n t ， a m e r s h a m ) 体视显微镜。冷光源( m - - 4 0 0 d ，m o t i c ) ，分光光度计配主机( 4 6 6 ，s a y a n ) ， 生化培养箱( s p x 15 0 b ，上海跃进) ，f p l c ( 五k t au p c 9 0 0 f r a c 9 0 0 ，a m e r s h a m ) 。 二、实验方法 ( 一)目标基因的选择 我们使用生物信息学软件v e c t o rn t i ( i n v i t r o g e n ，u s a ) 来分析筛选目的蛋白。 选择目标基因基本上是按照以下原则：目标基因表达蛋白质的预测分子量通常分布在 2 0 - 6 0 k d a 之间；基因以c d n a 克隆的形式可以从人类c d n a 文库中购买，其编码的蛋 白质包含较少比例的疏水氨基酸残基；没有信号肽，非跨膜蛋白；基因编码的蛋白质没 有较高同源性的( 3 0 以上) 蛋白晶体结构被报道。 1 0 东北师范大学硕士学位论文 ( 二)g a t e w a y 住构建表达载体 我们实验室采用的g a t e w a y t m 技术主要包括两个反应系统：b p 反应系统和l r 反应 系统，具体的实验操作程序如下： 1 a t t b p c r 产物的制备 为了使目标基因能够与通用的包含a t t p 位点的p d o n r 2 0 1 载体进行重组反应，需要 在目标基因的两端加载a t t b 接头。因此，设计的一对引物除了目标基因特异的一段2 4 b p 长的序列之外，在其5 端分别加上a t t b l 和a t t b 2 接头，这两个接头序列稍有不同，是 与系统中确定基因序列方向性相关的。 表2 1a t t b p c r 引物 引物名称核酸序列 引物一a t t b l - g e n e ： 引物二g e n e a t t b 2 ： g g g g a c a a g m g t a c a a a a a a g c a g g c l r a + 2 4b p ( 目标基因互补链d n a 序列) g g g g a c c a c r 几 g 1 a c a a g a a a g c t g g g l + 2 4b p ( 目标基冈特异的d n a 序列) 引物由上海生工合成，离心后加入1 0 0 山重蒸水溶解( 1o d 2 6 0 管) ，放2 0 。c 保存。 p c r 使用5 0 m 体系： p f u2 x m i x 2 5 山 模板llxl 引物一 2 山 引物二 2 9 l d d h t o2 0 i t l _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ o _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一一 5 0 山 p c r 反应程序：9 4 1 0 分钟一9 5 3 0 秒一5 0 3 0 秒- - 7 2 1 5 分钟一7 2 1 0 分钟，第二步至第四步进行3 0 个循环。 a t t b p c r 产物纯化：5 0p la t t b p c r 纯化产物转移到1 5 血e p 管中，加入15 0j _ t l t e 缓冲液( 1 0 m mt r i s h c l ，1m m e d t a ，p n8 0 ) 充分混匀；加入1 0 0 i t l3 0 p e g 8 0 0 0 3 0 m mm g c l 2 ，充分混匀后4 1 3 0 0 0r r a i n 离心；2 0 分钟后移去上清，加入7 5 0g l7 0 乙醇( 4 存放) 洗涤；4 。c1 3 0 0 0r p m 离心5 分钟，4 倒干上清，室温下使乙醇挥发 干净；加入5 0p lt e 缓冲液重悬d n a 沉淀，2 0 存放。 2 a t t b p c r 产物的亚克隆_ b p 反应 b p 反应是目标基因的a t t b p c r 产物与反应系统中p d o n r 2 0 1 质粒进行的 a t t b x a t t p 重组置换过程。结果生成目标基因的e n t r yc l o n e ，它的读码框( o r f ) 与侧面 的两个a t t l 位点结合：a t t l l 和a t t l 2 。p d o n r 2 0 1 载体携带了卡那抗性的基因和一个宿 主菌致死基因c c d b ，所以没有参加反应的p d o n r 2 0 1 转化大肠杆菌后会自然死亡， 而只有目标基因的e n t r yc l o n e 可以被含有卡那霉素的培养基质筛选出来。 东北师范大学硕士学位论文 g a t e w a y t mb p 反应： a t t b - p c rp r o d u c t ( 1 0n g d 1 山 d o n o rv e c t o r ( 1 5 0n g l x l )2 m b pr e a c t b u f f e r 2 m b p e n z y m em i x2 山 亚缓泣渣呈西 1 0 1 t l 2 5 c 反应l 小时，添加1 斗l2 9 9 m l 蛋白酶k 中止反应；取5 1 t lb p 产物加入到5 0 p 1 的d h 5 a 感受态细胞中，4 2 热激处理9 0 秒；冰上放置2 分钟，加入4 0 0 山s o c 液 体培养基，3 7 ( 22 1 0 r r a i n 复苏6 0 分钟；涂布含卡那霉素( 5 0 i t g m l ) l b 固体平板上 进行筛选。 获得e n t r yc l o n e ：挑选阳性克隆接种到3m ll b 液体培养基中( 5 0 肛g m lk a n + ) ， 3 7 c 恒温过夜，收取全部的菌液，提取e n t r yc l o n e s 。 3 e n t r yc l o n e 和d e s t i n a t i o nv e c t o r 之间进行的重组置换反应一r 反应 采用p e t 2 1 a o d e s t 作为d e s t i n a t i o nv e c t o r ，它们包含a t t r l 和a t t r 2 ，并且携带 了氨苄基因和c c d b 基因。p e t 2 1 a - d e s t 在可以在g y r a s e 突变菌株ec o l id b 3 1 中扩 增。经过与携带a t t l 位点的e n t r yc l o n e 进行特异性的重组置换反应，生成携带a t t b 位点 和氨苄基因的表达载体，副产物因携带c c d b 基因而不能被筛选出来。表达载体可以用 于转化e c o f ib l 2 1 ( d e 3 ) 或e c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) 使得目标基因得到表达。作为第一轮的 筛选和鉴定，我们采用p e t 2 1 a - d e s t 和e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 。 g a t e w a l r 反应： e n t r yc l o n el l a p e t 2 1a - d e s t 2 p l l rr e a c t b u f f u l 2 1 d 丛曼堡卫坠金迎苎! i兰丛1 1 0 1 x l 2 5 ( 2 反应1 小时；取5 p lb p 产物加入到5 0 i t l 的d h 5 a 感受态细胞中，4 2 热激处 理9 0 秒；冰上放置2 分钟，加入4 0 0 山s o c 液体培养基，3 7 c2 1 0 r m i n 复苏6 0 分 钟；涂布含卡那霉素( 5 0 g m l ) l b 固体平板上，3 7 。c 恒温过夜，挑选三个单菌落进 行菌落p c r 鉴定。 1 2 东北师范大学硕士学位论文 ! 叫竺! ! 叭 ”“8 影+ 毒商 、 ：i f 、：= = ： 图2i g a l w a y t m 克隆技术流程( 摘白i n v i t r o g 衄g a t e w a y t e c h n o l o g y i n s t r u c t i o