《生物化学工程》课程设计-青霉素发酵生产及其生物反应器的设计.doc

生物化学工程课程设计青霉素发酵生产及其生物反应器的设计学院：理学院班级：化072学号：30908218129姓名：李子清指导老师：西安理工大学理学院应用化学系 二O一0年一月16目录一、前言 21.1青霉素的简介21.2青霉素的特点2二、青霉素的发酵生产 32.1所用菌种32.2发酵培养控制32.2.1培养基32.2.2温度32.2.3pH值42.2.4溶氧42.2.5菌丝生长速度与形态、浓度42.2.6消沫52.3 发酵过程52.4 工艺流程92.4.1 生产孢子的制备92.4.2 种子罐和发酵罐培养工艺 102.5 青霉素的提炼工艺102.5.1 预处理 102.5.2 过滤102.5.3 萃取 112.5.4 脱色112.5.5 结晶11三、生物反应器123.1 青霉素生物反应器的控制参数 123.2 青霉素生物反应器的设计 123.3 生物反应器的控制13 参考文献16青霉素发酵生产及其生物反应器的设计一、前言1.1 青霉素的简介青霉素的结构式：青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称。早在唐朝时，长安城的裁缝会把长有绿毛的糨糊涂在被剪刀划破的手指上来帮助伤口愈合，就是因为绿毛产生的物质（青霉素素菌）有杀菌的作用，也就是人们最早发现并使用青霉素。近代，1928年英国细菌学家弗莱明首先发现了世界上第一种抗生素青霉素，1941年前后英国牛津大学病理学家霍华德弗洛里与生物化学家钱恩实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，弗莱明、弗洛里、钱恩三人共同获得1945年诺贝尔奖。目前所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的，有些抗生素已能人工合成。由于不同种类的抗生素的化学成分不一，因此它们对微生物的作用机理也很不相同，有些抑制蛋白质的合成，有些抑制核酸的合成，有些则抑制细胞壁的合成。1.2 青霉素的特点青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称，由于-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显，但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、钠盐之分，钾盐不仅不能直接静注，静脉滴注时，也要仔细计算钾离子量，以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。青霉素类抗生素的毒性很小，是化疗指数最大的抗生素。但其青霉素类抗生素常见的过敏反应在各种药物中居首位，发生率最高可达5%10% ，为皮肤反应 ，表现皮疹、血管性水肿，最严重者为过敏性休克，多在注射后数分钟内发生，症状为呼吸困难、发绀、血压下降、昏迷、肢体强直，最后惊厥，抢救不及时可造成死亡。各种给药途径或应用各种制剂都能引起过敏性休克，但以注射用药的发生率最高。过敏反应的发生与药物剂量大小无关。对本品高度过敏者，虽极微量亦能引起休克。注入体内可致癫痫样发作。大剂量长时间注射对中枢神经系统有毒性(如引起抽搐、昏迷等)，停药或降低剂量可以恢复。二、青霉素的发酵生产2.1 所用菌种产黄青霉（Penicillium chrysogenum）JS94-18菌种，以青霉素生产菌丝状产黄青霉JS-18为出发菌株制备菌丝原生质体，并对原生质体进行了紫外诱变，筛选到变异猪株JS94-18-58，该菌株摇瓶发酵效价比生产菌株提高8.6312.2 发酵培养控制2.2.1 培养基 碳源：采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。 氮源：玉米浆、花生饼、锦子饼、麸质粉、尿素等。 无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁有毒，控制在30g/ml以下。 苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。2.2.2 温度青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别，温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化率。青霉素发酵温度一般为25-26，分别用25和26两种温度的种子罐培养，考察温度对新菌种生长代谢速度的影响，结果如下表2：不同温度对菌种生长的影响所以最适温度为25。2.2.3 pH值青霉素发酵的最适pH值一般认为在6.5左右，有时也可以略高或略低一些，但应尽量避免pH值超过7.0，因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中，pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。2.2.4 溶氧溶氧30饱和度，产率急剧下降，低于10，则造成不可逆的损害。所以不能低于30饱和溶氧浓度。溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥。适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。2.2.5 菌丝生长速度与形态、浓度对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUROTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。在发酵稳定期，湿菌浓可达1520%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。有丝状生长和球状生长两种。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触，比生产率高，发酵粘度低，气/液两相中氧的传递率提高，允许更多菌丝生长。球状菌丝形态的控制，与碳、氮源的流加状况，搅拌的剪切强度及稀释度相关。2.2.6 消沫发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。 青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2h取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况放过滤提取，因为染菌后pH值波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。2.3 发酵过程第一阶段：葡萄糖转化为丙酮酸（EMP）3EMP反应式：葡萄糖+2NAD+2ADP+2磷酸2NADH+2丙酮酸+2ATP+2H2O+2H+第二阶段：丙酮酸转化为乙酰辅酶A通过EMP途径产生的丙酮酸，在有氧条件下透过线粒体膜进入线粒体后，在丙酮酸脱氢酶系（为一复合酶系，包含有丙酮酸脱羧酶等）的催化下进行氧化脱羧，并与辅酶A（以HS-CoA表示）结合生成乙酰辅酶A，反应如下：NAD NADH2丙酮酸脱氢酶系CH3COCOOH+HS-CoA CH3COSCoA+CO2第三阶段： 乙酰辅酶A进入三羧酸循环，先接受酵解及丙酮酸脱氢酶产生的乙酰CoA，形成六碳三羧酸，连续两步脱羧后，六碳三羧酸转化为五碳、四碳二羧酸。乙酰辅酶A CoA-SH 柠檬酸 丙酮酸 H2O CO2 顺乌头酸 乙酰乳酸 H2O 异柠檬酸 己醛酸 二羟基异戊酸 CO2 H2O -酮戊二酸 甘氨酸 -氧-异戊酸 乙酰CoA 谷氨酸 -酮戊二酸 高柠檬酸 丝氨酸 L-缬氨酸 高乌头酸 L-半胱氨酸 高异柠檬酸 酮基己二酸L-氨基己二酸青霉素的合成途径4：通过三羧酸循环得到的中间产物-酮戊二酸、异柠檬酸和乙酰乳酸进一步转化得到3个前体氨基酸：L-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸。第一步是3个前体氨基酸缩合生成三肽，这一反应是由pcbAB基因编码的单一多功能酶ACV合成酶（ACVS）催化，它包括两个肽键的形成和缬氨酸的差向异构；第二步是由pcbC基因编码的异青霉素N合成酶（IPNS）催化LLD-ACV脱去4个氢，消耗1mol分子氧；最后，在侧链前体的存在下，IPN由pcbDE基因编码的酰基辅酶A异青霉素N酰基转移酶（AAT）转化为青霉素。最后一步反应可能有两种不同的路线：一是前体苯乙酸或苯氧乙酸通过一步反应机制与IPN的-氨基己二酸侧链交换而不释放6-氨基青霉烷酸（6-APA）；二是IPN通过两步反应机制先裂解释放-氨基己二酸，而6-APA被结合到酶上，然后转化为青霉素。青霉素总的合成途径可简要概括如下图：2.4 工艺流程青霉素的工艺生成产流程图2.4.1 生产孢子的制备将砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度在2526 ，培养68天，得单菌落，再传斜面，培养7天，得斜面孢子。移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7天，25，制得小米孢子。每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。2.4.2 种子罐和发酵罐培养工艺种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。青霉素采用三级发酵：一级种子发酵：发芽罐。小罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。培养基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。通无菌空气，空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300350r/min；4050小时；pH自然，温度271。二级发酵罐：繁殖罐。大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。1：11.5；250280r/min；pH自然，251；014h。三级发酵罐：生产罐。花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。接种量为1215%。青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制0.71.8；150200r/min；要求高功率搅拌，100 m3的发酵罐搅拌功率在200300 Kw，罐压控制0.040.05 MPa，于2526 下培养，发酵周期在200h左右。前60h，pH5.76.3，后6.36.6；前60h为26，以后24。2.5 青霉素的提炼工艺 青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。2.5.1 预处理发酵液结束后，目标产物存在于发酵液中，而且浓度较低，如青霉素只10-30Kg/m3，含有大量杂质，它们影响后续工艺的有效提取，因此必须对其进行的预处理，目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。是进行分离纯化的一个工序。2.5.2 过滤发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10 以下，过滤收率一般90%左右。（1） 菌丝体粗长10m，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。（2） 改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。2.5.3 萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取23次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择1.8-2.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.4。发酵滤液与乙酸丁酯的体积比为1.5-2.1，即一次浓缩倍数为1.5-2.1。为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。发酵液与溶剂比例为34。几次萃取后，浓缩10倍，浓度几乎达到结晶要求。萃取总收率在85左右。所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调pH2.03.0，加入醋酸丁酯，用量为滤液体积的三分之一，反萃取时常用碳酸氢钠溶液调pH7.08.0。在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。第一次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取条件：为减少青霉素降解，整个萃取过程应在低温下进行（10 以下）。萃取罐冷冻盐水冷却。2.5.4 脱色萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。2.5.5 结晶萃取液一般通过结晶提纯。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出。然后采用重结晶方法，进一步提高纯度，将钾盐溶于KOH溶液，调pH至中性，加无水丁醇，在真空条件下，共沸蒸馏结晶得纯品。3、 生物反应器3.1 青霉素生物反应器的控制参数青霉素的发酵属于好氧性发酵系统，发酵参数可以分为物理参数、化学参数和生物参数如下表：3.2 青霉素生物反应器的设计（1）微生物增长的动力学方程cs Ks + csMonod方程： =m 当cs KS时，接近于m 。微生物的KS一般都很低，所以在分批培养时，尽管由于细胞的增长，基质浓度会不断下降，但在一段时间（对数期）内，生长速率还是接近m，且保持恒定。（2）描述酶催化反应的动力学方程max cs Km + cs米氏方程： =这个方程定量的关联了反应速率与底物浓度cs之间的关系。当底物浓度低时，cs比Km小得多，此时=(maxcs)/Km，即反应速率与底物浓度成正比，反应成一级。而当底物浓度很高时，cs比Km大得多，=max ，表明活性部位已全部被底物占据，反应速率达到最大，反应成零级。青霉素发酵罐可采用通用式发酵罐或者机械搅拌式发酵罐，发酵罐主要由搅拌容器、搅拌装置、传动装置、轴封装置、支座、人孔、工艺接管和一些附件组成。搅拌容器分罐体和夹套两部分，主要由封头和筒体组成，多为中、低压压力容器；搅拌装置由搅拌器和搅拌轴组成，其形式通常由工艺设计而定；传动装置是为带动搅拌装置设置的，主要由电机、减速器、联轴器和传动轴等组成；封头装置为动密封；它们与支座、人孔、工艺接管等附件一起，构成完整的青霉素发酵罐。发酵罐的主要计算：发酵罐基本尺寸的确定：V=V1/式中 V1发酵罐内的有效容积（m3） 装满系数 =0.80.88发酵罐各部分尺寸比例关系：H=（1.11.6）Dh1=（0.10.3）Dh2=（0.080.1）D式中 H罐的圆柱体部分高度D罐的直径h1罐底部分的高度h2罐顶部分的高度3.3 生物反应器的控制（1）过程控制:补料分批操作控制基质浓度前40小时：培养基中的主要营养物40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。半饥饿状态：延长合成期，提高产量。碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。糖与6APA（6-氨基青霉烷酸）结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。（2）流加碳源控制：根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。残糖0.3-0.6左右，pH开始升高时流加糖。（3）流加氮源控制：补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素氨基氮浓度：0.01-0.05%。（4）盐离子控制：无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁对青霉素合成有毒，30-40 ug/ml以下。