（纺织材料与纺织品设计专业论文）丝素蛋白羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能[纺织材料与纺织品设计专业优秀论文].pdf

丝素蛋白i 羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能中文摘要 中文摘要 本文用层铺模压成型法，将自行制备的羟基磷灰石( h a ) 粉末和丝素( s f ) 粉末 复合，以n a c i 为致孔剂，制得s f h a 梯度多孔复合材料，对梯度材料的结构和性能 进行表征，并与非梯度材料进行对比研究，为软骨一骨组织再生的支架提供一种新材 料。 首先，用喷雾干燥法制备了平均粒径为2 9 6 8r l f l l ，结构以无定型为主的s f 粉末； 冷冻干燥一球磨法制备h a 粉末，平均粒径为8 0 6 7n m 。研究了s f 、h a 、n a c i 三种物 料配比对s f h a 非梯度多孔复合材料孔结构参数的影响，结果表明，随着s f h a 比例 的增大及n a c i 添加量的减小，经模压成型制成的s f 姒非梯度多孔复合材料的孔隙 率、平均孔径和密度都呈减小趋势。 其次，用层铺模压成型法制备线性梯度的、孔结构参数可调节的s f h a 梯度多孔 复合材料，用电子探针、电子激发能谱、x - 射线衍射、红外光谱、扫描电镜对梯度材 料进行表征。结果表明，s f 和眦在材料厚度方向呈梯度分布；当n a c l 添加量达到 6 0 0 n 5 时，梯度材料内的孔开始贯通。 最后，对梯度材料和非梯度材料的结构、力学性能进行对比研究。研究表明，s f h a 梯度多孔材料的抗压断裂能和抗弯断裂能显著大于同组分的非梯度复合材料；添加 n a c l 颗粒，对s f 眦梯度复合材料的致孔作用比对s f 非梯度材料的致孔作用强。 关键词：丝素蛋白，羟基磷灰石，梯度材料，骨一软骨修复 作者：徐巍巍 指导教师：李明忠教授 p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fg r a d i e n ts f h p r o u sc o m p o s i t e s a b s t r a c t p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fg r a d i e n ts i l kf i b r o i n h y d r o x y a p a t i t ep o r o u sc o m p o s i t e s a b s t r a c t t h eg r a d i e n ts f h ap o r o u sc o m p o s i t eu s e df o rt h es c a f f o l do f t h ec a r t i l a g e b o n et i s s u e r e g e n e r a t i o nw a sp r e p a r e dw i t hs i l kf i b m i n ( s f ) p o w d e ra n dh y d r o x y a p a t i t e ( h a ) p o w d e r c o m p o s i t e dw h i c ho b t a i n e db yl a y e r - b y l a y e rm o u l dp r e s s i n gm e t h o da n d n a c la sp o r o g e n , c a r r i e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c so fs t r u c t u r ea n dp e r f o r m a n c ea n di n v e s t i g a t e dt h em a t e r i a l s c o m p a r e dt on o n - g r a d i e n tm a t e r i a l s f i r s t l y , t h es fp o w d e rw a so b t a i n e db ys p r a yd r y i n gm e t h o d ，t h ec r y s t a ls t r u c t u r eo f w h i c hw a sm a i n l ya m o r p h o u sa n dm e a nd i a m e t e r2 9 6 8 姗h ap o w d e rw a so b t a i n e db y f r e e z ed r y i n g m i l l i n gm e t h o d ，a n dt h ea v e r a g ed i a m e t e ro fh aw a s8 0 6 7n l n t h ep a p e r r e s e a r c h e dh o wt h ep o r es 扛u c 眦p a r a m e t e rw s se f f e c t e db yt h ep r o p o r t i o no f 腿s fa n d n a c l t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ep o r o s i t y , d e n s i t ya n da v e r a g ep o r es i z eo fn o n - g r a d i e n t c o m p o s i t e sb ym o u l dp r e s s i n gm e t h o dw e r ei n c r e a s i n ga st h ep r o p o r t i o no fh a s fa n d n a c ii n c r e a s i n g s e c o n d l y , t h el i n e a rg r a d i e n ts f h ap o r o u sc o m p o s i t e sw h i c hp o r es t r u c t u r ec o u l db e a d j u s t e dw a sp r e p a r e db yl a y e r b y - l a y e rm o u l dp r e s s i n gm e t h o d , a n dc h a r a c t e r i z e db y e l e c t r o nm i c r o p r o b e , e d s ，x r d ，s e ma n df r 乙i ti n d i c a t e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o no fs f a n dh a p r e s e n t e dg r a d i e n ta l o n gt h i c k n e s sd i r e c t i o no ft h em a t e r i a l s ，a n dt h ep o r eo f t h e g r a d i e n tm a t e r i a l sw a si n t e r c o n n e c t e dw h e nt h ec o n t e n to f n a c lw a su pt o6 0 0 l a s t l y , c o m p a r i n gt h es t r u c t u r ea n dm e c h a n i c so f t h eg r a d i e n ts f h ac o m p o s i t e sa n d n o n - g r a d i e n tm a t e r i a l s ，i ti n d i c a t e dt h a tt h ef l e x u r eb r e a ke n e r g ya n dc o m p r e s sb r e a k e n e r g yo ft h eg r a d i e n ts f h as u r p a s s e dt h es f h an o n g r a d i e n tc o m p o s i t e s ，a n di tw a s e a s i e rt 0f o r m e di n t e r c o n n e c t e dp o r es t r u c t u r e si nt h eg r a d i e n ts f h at h a ni ns f n o n - g r a d i e n tm a t e r i a l sw h e nn a c ip a r t i c l e sw e r ea d d e d k e y w o r d s ：s i l kf i b r o i n , h y d r o x y a p n t i t e ，g r a d i e n tc o m p o s i t e s ，b o n e - c a r t i l a g er e p a i r w r i t t e nb y ：x uw e i w e i s u p e r v i s e db y ：p r o f l im i n g z h o n g 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它 教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人 和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 研究生签名：墅垒盏差蔑日期：兰! z ! ：1 2 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文 合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文懿 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本 人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文 外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分 内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：! 垒巍盎 导师签名；蕉蜩显 日期：川7 f 2 z 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能 引言 引言 第一节关节软骨及修复方法 由创伤、骨关节炎、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎和其他各种疾病引起的 关节软骨病损在临床上十分常见，根据美国统计，每年约有三千六百万人患有各种类 型的关节炎或创伤引起的关节软骨病损( 3 0 岁以上的人群中9 患有膝关节骨性关节 炎) 【。 关节软骨是覆盖大部分关节表面的一种特殊结缔组织，主要由软骨细胞和基质组 成。成人关节软骨既无血供也无淋巴引流，甚至没有神经组织与体内其他躯体系统相 连。关节软骨的营养主要来自关节液，其次为软骨下方的骨组织血液和关节囊与关节 软骨交界处的骨膜下血管。软骨细胞代谢缓慢，自我修复能力也十分有限，局限于软 骨浅层的缺损。 根据软骨细胞及基质的形态差异可将软骨分为四层口3 1 ：表层、中层、深层和钙 化层。各层的分界不明显，结构模式见图1 1 2 图1 关节软骨结构( 模式图) f q l 1 表层；2 中层：3 深层：4 钙化层；5 软骨下骨 表层：最薄，又分为两层。外层为纤维膜，类似透明薄膜覆盖于关节表面，无细 胞成分，亦少有多糖。在某些区域，该层可能从关节面上剥离。内层为致密的胶原纤 丝素蛋白，羟基礴灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能引言 维层，内含扁平的椭圆形细胞，胶原纤维和软骨细胞长轴均与关节面平行。 中层：其形态和基质成分介于表层和深层之间，体积约为表层的数倍，细胞内细 胞器含量较多。 深层：细胞为类圆形，呈柱状排列并与关节面垂直。该层内胶原纤维最粗，蛋白 多糖含量最高，水分含量最低。 钙化层：较薄，细胞体积较小，细胞器含量少。其间含有骨小梁，环绕于软骨下 方。在关节软骨中层和钙化层之间有宽为2 5 u m ，略呈波浪状的线，称为“潮线”( t i d e m a r k ) ，它的机械功能是钩住非钙化区的胶原纤维，同时又钩住软骨下骨板，这种连 接可不受剪切力的破坏。钙化层的另一功能是防止水和溶剂弥散至骨与软骨内而造成 危害。 软骨下骨为松质骨，骨小梁呈拱型排列，受力时有一定的压缩，可吸收、缓冲压 力，对保护软骨起到重要的作用。 临床常用治疗关节缺损的方法有： ( 1 ) “关节软骨钻孔”“微骨折”方法】：其目的是通过在关节软骨上，钻出一 些直通软骨下骨的小孔，从而连通软骨下骨内的血液循环，促进缺损的修复。然而研 究发现此种方法治疗软骨缺损，所产生的主要是纤维软骨，主要由1 型胶原和蛋白聚 糖组成，具有较低的抗压能力，最终导致修复软骨、周围组织的退变和缺损修复的失 败。此种方法临床上仅适用于小范围的软骨软化、软骨与软骨下骨分离的患者。 ( 2 ) 自体软骨膜、骨膜移植：1 9 8 9 年k w a n ”1 报告应用自体软骨膜移植修复关节软 骨全层缺损，近期( 1 年) 效果满意，缺损区9 0 被软骨样组织修复，但是远期( 8 年) 效果不理想，6 0 患者治疗失败。0 d r i s e o l l ”1 应用自体骨膜移植6 0 9 6 患者较满意， 4 0 9 6 远期治疗失败。这些结果显示软骨膜、骨膜移植并不能维持长期的疗效，主要表 现为移植物脱离和软骨内化骨。同时存在供体数量有限的缺陷。 ( 3 ) 骨一软骨的自体和异体移植阱：骨一软骨的自体移植，是取自体非负重部位的 圆柱形骨一软骨组织嵌入缺损区。亦称自体软骨马赛克成形法：用小的圆柱形环锯切 取非负重区正常的骨一软骨块，关节切开或关节镜下，去掉负重区病变骨一软骨全层， 将自体圆柱形的骨一软骨块植入。临床观察显示移植物的骨性部分可以愈合，但是软 骨部分长期存活能力和生物机械性能仍需进一步研究；另外取材部位造成新的创伤。 应用异体正常的骨一软骨组织移植替代骨一软骨损伤，临床效果比较满意。但是存在供 2 丝素蛋白羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能 引言 体缺乏、宿主可能对移植物的排斥反应和可能传播疾病的危险，其次是移植物的结构、 机械性能的长期变化，仍需进一步研究。 ( 4 ) 人工假体的植入：由钛合金、不锈钢、高分子聚合物等人工关节假体置换， 仅适用于后期严重的软骨损伤、退变引起的关节疼痛、不稳、畸形，严重影响日常生 活活动的患者，不适宜关节软骨损伤的年轻患者。人工假体远期易继发感染或松动， 而且不像活体软骨组织和骨组织那样适应周围组织的应力变化 无论是自体或异体软骨移植、软骨膜或骨膜移植、软骨细胞移植，都仅能在早期 生成透明和类透明软骨组织，且随后不可避免会发生退变“”。而这些再生的软骨组织， 无论是其结构、生物化学或者生物力学特性都与正常透明软骨不同。 第二节骨一软骨复合组织构建 组织工程一词，首先由w o l t e r 于1 9 8 4 年提出，当时特指血管组织的体外构建。 1 9 8 7 年美国国家科学基金会( n s f ) 正式确立广义的组织工程概念：“应用工程学和 生命科学的原理和方法，认识哺乳动物正常和病理组织结构一功能关系，并开发生物 代用品，以恢复、维持或改善组织功能” 1 1 1 。组织工程技术的基本原理是：将大量体 外扩增的种子细胞接种在可降解的生物支架材料上进行体外培养或植入体内组织器 官缺损部位，随着生物材料的逐渐降解和吸收，细胞不断增殖并分泌细胞外基质，最 终形成具有正常结构和功能的活体组织。软骨是应用组织工程技术最早构建的组织， 早期主要是进行组织工程化软骨构建的初步探索，从实践中证实组织工程基本原理的 可行性。其中具有代表性的研究是1 9 9 1 年v a t a n t i 等0 4 用牛关节软骨细胞与可降解 的生物材料在裸鼠皮下成功构建出透明软骨组织。他在实践中证实了组织工程技术能 够构建出结构与功能正常的成熟软骨组织。曹谊林等“”在裸鼠体内成功构建出具有皮 肤覆盖的人耳廓形态软骨，该项研究标志着组织工程技术可以形成具有复杂三维空间 结构的软骨。组织工程研究者们还对复合软骨组织的构建进行了初步的探讨，如 v a c a n t i 等“”用组织工程技术构建出复合组织f f 气管( 含软骨和气管纤毛上皮细 胞) ，并替代动物自身的气管，在修复后的短期内，组织工程化气管不仅具有良好的 形态而且能维持动物正常的呼吸功能。 采用组织工程学方法构建骨一软骨复合组织的时间并不长。k r e k l a 等“”1 9 9 9 年首 先报道将聚乙交酯和左旋聚丙交酯共聚物接种软骨细胞培养后安置于天然珊瑚或人 3 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能引言 工合成的碳酸钙材料上，两者之间的界面用纤维蛋白凝胶固定封闭，继续体外培养后 可见软骨细胞少量迁移至界面周围并在界面上下分泌细胞外基质：设计这种双层结构 植入物旨在预想植入体内后构建软骨组织与下方支撑物之间有良好的啮合固定作用。 随后s c h a e f e r 等“”在p g 无纺纤维网状支架上接种软骨细胞后进行体外培养构建软 骨：以聚丙交酯一聚乙交酯共聚物和聚乙二醇的混合物( 8 0 ：2 0 ) 接种成骨细胞进行 体外培养构建骨。两者首先单独按促进成骨和成软骨的条件分开培养l 周或4 周，然 后将形成的软骨、骨组织块用缝线缝合后体外继续共同培养4 周，结果显示两者结合 形成了骨一软骨复合组织，两者之间的界面基本结合，两部件单独培养1 周后即缝合 在一起共同培养者的界面结合优于单独培养4 周后才缝合在一起共同培养者。 s c h a e f e r 等继续报道按类似上述方法体外构建骨一软骨复合组织块，并按紧密匹配 方法植入兔股骨髁间窝部位的骨一软骨缺损( 大小：7 唧x 5 眦5 岫) ，通过形 态、力学、图像分析、组织学观察和生化成分测试证实，该方法成功修复了局部骨一 软骨缺损，组织学观察结果表明骨一软骨界面有潮标形成，软骨下骨与周围宿主骨结 合好，但构建的软骨与周围宿主软骨整合仍然欠佳。 组织工程软骨修复单纯关节软骨缺损时，移植体与移植床的愈合是软骨软骨界 面的整合；若合并软骨下骨缺损，则尚有软骨骨界面的整合。上述两种界面的整合 较慢，移植体在移植床存在潜在的不稳定因素。骨组织之间的整合比骨和软骨间整合 快而且更加牢固“”删。 第三节羟基磷灰石( h a ) 羟基磷灰石晶体( c a 。( p o 。) 。( o h ) 。，眦) 为六方晶系，晶胞参数为：a 产0 9 4 0 0 9 4 5 n m ，c o = o 6 8 6 0 6 8 9 册。单位晶胞含有1 0 个c a “，6 个 p o 和2 个 0 h 。羟基 磷灰石晶体在( 0 0 0 1 ) 面上的投影如图2 嘲1 所示。 羟基磷灰石的理论密度为3 1 5 6g c m ，折射率为2 6 4 一1 6 5 ，莫氏硬度为5 ， 微溶于水，呈弱碱性( p h = 7 - 9 ) ，易溶于酸，而难溶于碱。羟基磷灰石离子交换能力 强，c a “容易被c 矿、h g “等有害金属离子和s r ”、a a + 等重金属离子置换隰矧，o i l 也容易被f 一置换，也可和含有羟基的氨基酸、蛋白质、有机酸等结合。 4 丝素蛋白艟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能引言 图2 羟基磷灰石晶体在( 0 0 0 1 ) 面上的投影示意图 羟基磷灰石的生物活性嘲：由于羟基磷灰石的分子结构和钙磷比与正常骨的无 机成分非常近似，具有优异的生物相容性。大量的体外和体内试验表明羟基磷灰石在 与成骨细胞共同培养时，羟基磷灰石表面有成骨细胞聚集；植入骨缺损部位时，骨组 织与羟基磷灰石之间无纤维组织界面；植入体内后表面类骨磷灰石形成。羟基磷灰石 具有骨传导性和骨诱导性。 羟基磷灰石具有生物活性，原因在于能与组织在界面上形成化学键性结合。具体 表现在；( 1 ) 新骨和羟基磷灰石植入体在界面上直接接触，其间无纤维组织存在；( 2 ) 羟基磷灰石植入体和骨界面的结合强度等于甚至超过了植入体或骨自身的结合强度， 如果发生断裂往往是在植入体或骨的内部，而不是在界面上；( 3 ) 羟基磷灰石植入体 一骨界面的高分辨率透射电镜显示，新生骨中盐晶体是由植入体中晶粒外延生长形成 陬川。1 9 9 2 年，t o t h 、c 1 e i n 、v a r g e r i k 和y a m a s a k e 脚到也报导了 i a 陶瓷的异位成 骨现象。多孔羟基磷灰石陶瓷的多孔结构和巨大的内比表面积，增加了其溶解度。大 量的钙、磷离子溶出并在孔隙内营造一个特殊的环境，加以多孔羟基磷灰石陶瓷稳定 结构和对b 1 4 p 的优良吸附性能，最终产生一个能诱导骨形成的材料。y u a n 。”将烧 结的大孔眦陶瓷植入狒狒的腹直肌中，在没有外源性骨形成蛋白存在时，植入3 0 5 丝素蛋白腥基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能引言 天后，在h a 的孔壁中就发现了骨形成蛋白，植入9 0 天后，4 1 的样品中出现伴随骨 髓的新骨组织，充分显示了大孔眦陶瓷的骨诱导性。 h a 几乎不溶于水，但是研究发现它有缓慢的降解性嘲。有两种细胞可能参与 h a 陶瓷的生物降解，即破骨细胞和吞噬细胞。破骨细胞为体内对活骨组织进行吸收 的细胞，吸收过程为m 1 ：破骨细胞首先粘附于骨表面形成个封闭吸收区，细胞内代谢 产生c 仉，溶于水中形成h ：c o , ，电解后再形成h 和h c 0 产；胞内的 r 通过细胞膜上耗 能质子泵( r k - - a t p 酶) 转移至细胞外封闭的吸收区，形成局部酸性环境，由于 r 的活化作用，c a + 与p o 的牢固结合被解离。另一方面，体内巨噬细胞的细胞内降 解和细胞外降解也对生物降解产生很大的作用。眦材料降解后释放的c a 、p 可参与 植入区新骨形成，被成骨细胞摄取，构成新骨基质中的无机成分，同时释放的c a 、p 还可刺激局部新骨形成，发挥成骨作用。 第四节丝素蛋白( s f ) 桑( 家) 蚕丝是由2 种蛋白组成，包围在蚕丝外层的是丝胶蛋白，内部为丝素蛋 白( s f ) 。丝素蛋白占蚕丝总质量的7 0 一8 0 ，是一种纤维状蛋白，由h 链( 约5 1 1 2 个氨基酸残基，分子量3 5 0k d a ) ，l 链( 约2 4 4 个氨基酸残基，分子量2 5 8k d a ) 及p 2 5 糖蛋白( 2 0 3 个氨基酸残基，分子量2 3 5 5k d a ，另加3 个寡糖链) 组成。h 链和l 链由各自c 末端的二硫键相互连接，形成复合体h - l ，p 2 5 糖蛋白以非共价的 相互作用参加舯l 复合体中。家蚕丝素蛋白的基本单位是( 6 h + 6 l + l p 2 5 ) ，分子量约 2 2 8 6k d a 。固态的家蚕丝素蛋白由无定形区和结晶区构成，其中结晶区的结晶形态主 要可能有两种，分别称为s i l ki 型和s i l k i i 型。s i l ki 晶体立体构象呈曲柄形，是 介于e 一折叠与a 一螺旋之间的一种中间形态；s i l k l i 晶体呈反平行b 一折叠层结构， 属单斜晶系1 。s i l k l i 中肽链的链段排列整齐，相邻链段之间的氢键和分子间引力 使它们结合得相当紧密，抵抗外力拉伸的能力强，柔软度低，在水中难以溶解，对酸、 碱、盐、酶及热的抵抗力较强。而无定形丝素中肽链的链段排列不整齐，链段之间的 结合力较弱，易溶于水，柔软度高，抵抗外力拉伸的能力弱，吸湿性强，对酸、碱、 盐、酶和热的抵抗力较弱。 将蚕丝用作外科手术缝合线已经数十年，近几年来由于丝素蛋白具备优良的生物 相容性和理化性质，引起众多科研工作者的关注。另外丝素蛋白凝聚态结构的可控性 6 丝紊蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能 引言 和表面改性的可能性对于扩大其在生物医学领域的应用范围是有利条件。丝素蛋白以 多种材料形式，在生物医学领域已展开广泛研究，较典型的研究列于表1 表1 丝素蛋白材料制备方法及在生物医学领域应用的可能性 材料形式制备方法特点可能的应用参考文献 薄膜( f i l m ) 流延法生物相容性好涂覆材料 3 6 4 9 逐层沉积水氧透过性好伤口敷料 表面易改性生物传感器 水凝胶溶胶凝胶( 添生物相容性好骨修复 s o s 8 ( h y d r o g c l ) 加酸、离子凝胶方式多样化药物缓释 等)注射性能好软骨组织工程 无纺织物 纤维聚集生物相容性好伤口敷料 5 9 6 0 ( n o n - w o v e n 静电纺强度好骨修复 m a t n e t m e m b r 表面易改性 组织工程 a n e ) 三维多孔海绵盐沥滤法生物相容性好 骨组织工程 6 1 6 5 体( 3 dp o r o u s冷冻干燥法孔隙率高软骨组织工程 s p o n g e ) 冷冻融化法强度好 表面易改性 在与软骨组织修复相关的蚕丝丝素材料研究方面，吴海涛等采用蚕丝与软骨细胞 进行复合培养，探索蚕丝作为软骨细胞体外培养支架的可行性，结果显示蚕丝对软骨 细胞具有良好的吸附作用。并能维持软骨细胞正常形态和功能，是适合软骨细胞立体 培养的良好天然支架删。日本a o k ih 等嘶3 研制出丝素蛋白凝胶海绵体，兔关节软骨 细胞种在其中培养，增殖良好，不分化为成纤维样细胞，并能够形成透明软骨组织。 以胶原凝胶海绵作对照，整个细胞培养过程中丝素蛋白海绵体中细胞的增殖能力更 强，细胞表形更好。再生软骨的力学性能随培养时间而改善，因为细胞外基质沉积逐 渐增多矧。k o j iy a m a m o t o t 6 t 1 对软骨细胞在丝素蛋白基质上的黏附力进行了研究， 发现黏附力在细胞种植后的6 1 2h 里出现了明显的峰值，这与软骨细胞在玻璃表面 7 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能引言 上的黏附力单调增加不一致w a n gy 等帆蚓通过实时r r t - p c r 对细胞外基质、软骨 特异性基因标志物的分析，以及用组织学和免疫组化手段对细胞外基质软骨特异组分 的评估证明，m s c s 在丝素支架上具有成软骨特性。将m s c s 在丝素支架上培养3 周后， 细胞的空间分布和i i 型胶原的分布与关节软骨组织中的类似，表明用m s c s 和可降解 丝素蛋白支架结合，修复关节组织是可能的后来把成人软骨细胞种植在此三维多孔 丝素蛋白支架上，发现成人软骨细胞黏附、增殖、分化并能够表达胶原i i 、g a g s 等。 这些研究都表明丝素蛋白是软骨组织工程的较理想支架材料。 第五节梯度功能材料 梯度功能材料( f u n c t i o n a l l yg r a d i e n tm a t e r i a l s ，简称f g m ) 是将两种或两 种以上具有不同性质的原料组分，采用复合技术使材料内部的微观要素( 包括组成、 结构和孔隙等) 在某特定方向呈连续的梯度变化，从而使材料的物性参数也呈连续梯 度变化的一类新型复合材料。f g m 的概念由日本学者在上个世纪8 0 年代提出，首先 在金属陶瓷复合体系中得到应用，其主要目的是为宇宙航空领域提供超耐热材料， 之后这一概念逐渐被扩展到其它材料领域。 制备梯度功能材料的方法很多，可分为构造法、传输法两大类型及若干方法删。 其中构造法常常从f g m 组元的合理分布开始，在构件的初期形式中逐层精确构造 f g m ；而传输法则是利用质量和能量的传输在局部的微观结构中或有用的成分中制造 梯度。下面就其中的一些主要方法作一概述。 ( i ) 等离子喷涂法 该法是将原料粉末送至等离子射流中，以熔融状直接喷射到基体表面形成涂层， 喷涂过程中改变混合材料的比例，调节等离子射流的温度和流速，获得f g m 涂层。 由于等离子可获得高温、超高速的热源，其沉积速率高、无须烧结，不受基材截面积 大小的限制。但因等离子射流温度很高，所以一般不适合于高分子生物材料睁删。 ( 2 ) 激光熔敷法 这种方法是将混合后的粉末经喷嘴布于基体上，通过改变激光功率、光斑尺寸和 扫描速度来加热粉体，使其在基体表面形成熔池，在此基础上进一步改变组成向熔池 中布粉，然后重复以上过程，即可获得梯度涂层的一种方法，主要适用于金属材料 e e - 7 0 3 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能引言 ( 3 ) 气相沉积法 c v d 法是通过气相物质间在一定条件下发生化学反应，使生成的固相物质在基体 上沉积来制备f g 4 的方法。借助于这一原理，可以通过控制反应温度和原料气体的 流量及压力等来控制弥散相的浓度，从而达到调节和控制薄膜的组织和结构制成梯度 功能薄膜材料的目的陋“1 。 ( 4 ) 光共聚法 光共聚法是将具有不同折射率和聚合反应速度的单体注入一垂直的聚合管中，在 旋转的情况下，通过光或热引发，使之发生共聚。由于各单体的竞聚率不同，所以转 化率和共聚物组成都随时问发生变化。又由于离心力的作用及管壁处的光强较大，因 而共聚物从管壁向轴心逐渐析出，而且组成不断变化，最终获得折射率由里到外逐渐 下降呈抛物线分布的棒状产物7 2 书1 。 ( 5 ) 互穿网络( i p n ) 法 将一种交联聚合物在溶剂或另一单体中溶胀，由于单体的扩散速度不同，若对其 浓度和扩散速度加以控制，然后再引发聚合，则可形成一种聚合物在另一聚合物中的 梯度分布的i p n 材料。引发聚合的方式有光引发、热引发和引发剂引发等。例如， - l u r a y a m a 等首先用本体聚合法制备了交联p h e m a ( 聚甲基丙烯酸羟乙酯) ，然后在共 溶剂d m f 二甲基甲酞胺) 中用光引发第二单体苯乙烯进行聚合，得到了具有梯度组成 的i p n 材料，其中p s ( 聚苯乙烯) 的含量由表面向中心逐渐减少“1 。 ( 6 ) 界面聚合法 c h e k a n o v m l 报道了一种通过界面聚合制备梯度功能聚合物材料的方法，方法中， 单体的聚合反应是在热的固体聚合物界面上进行的，反应时通过连续改变单体的浓度 使生成的聚合物具有了梯度化的组成。 ( 7 ) 纤维排列法 该制备方法是纤维增强聚合物材料的一个分支。具体做法为：以聚合物为基体相， 金属或非金属纤维为增强相，成型前先将增强纤维进行梯度化排列，进行成型后的整 体则成为梯度功能材料。例如h u a n g 和j a n g 等分别用长纤维编织和短纤维堆砌的方 法制备了不同品种的纤维增强聚合物梯度功能材料 7 7 7 8 1 。 ( 8 ) 喷射印刷法 该法受到喷墨打印机喷碳印刷的启示，其制备过程是：首先将原料粉末制备成悬 9 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能引言 浮液以取代传统打印用碳粉，而后将悬浮液通过打印头喷出形成梯度层。通过控制悬 浮液进入打印头的组成就可以获得组分连续的梯度材料。英国的mm o t t 和jrg e v a n s m l 就利用印刷法制备出了z r q a 1 2 0 3 梯度材料。他们将i b m 产的3 8 5 2 - - 2 型打 印机的打印头同装有z r 如和a l 籼悬浮液的打印盒相连，通过计算机控制悬浮液的混 合比例，并通过打印头喷涂到基板上，获得组分连续变化的梯度喷涂层。最后干燥烧 结，制成梯度材料。 ( 9 ) 叠层填充法 叠层填充法是将原料粉末按一定比例混合，逐层填充使之呈梯度分布，在压制成 型后烧结。目前已从手工操作发展到适用于各种几何尺寸的高度自动化系统。一种先 进的颗粒排布法是通过计算机控制不同的粉末混合比，采用喷雾法进行铺排，这种方 法适用于大规模生产，这种方法己成功制备s i g n s u s ( 不锈钢) 和z r o j s u s 等多种 带材产品m “。 目前，生物功能梯度材料的研究在国际上也刚起步，涉及人工齿根、人工骨、人 工关节、人工心瓣等人工器官、人工血管以及辅助感觉器官等领域。在这些生物功能 梯度材料中，通常与人体体液或血液直接接触的材料表面需要极好的生物相容性、耐 磨性、耐蚀性来避免或减弱不良排异反应，而材料内部则需要极好的强度和韧性来保 证好的力学性能，所以，从材料内部高力学性能到材料表面高生物学性能的功能渐变 需要材料成分和结构也相应的渐变。当前主要采用生物陶瓷一生物金属梯度体系，即 从材料表面生物相容性和生物活性好的生物陶瓷( 包括经基磷灰石和生物活性玻璃 等) 渐变到材料内部强度韧性好的金属m 侧。 文献检索结果表明，用丝素蛋白制备梯度材料，尤其是生物医用材料，在国内外 尚无报道。 第六节本课题的研究目的和内容 正常关节软骨如本章第一节所述分四层，不同层区内的软骨细胞及外基质具有各 自的特点。理想的组织工程支架应模拟关节软骨分界不明显的分层结构，植入细胞后， 在各层内形成相应的软骨组织，形成真正的关节软骨组织。理想的组织工程培养形成 的软骨组织，植入体内后，不仅是填充软骨缺损，也应该有良好的机械性能，并能与 移植床的骨质有较为牢固的结合，从而利于关节功能，尤其是力学功能的恢复，否则 1 0 丝素蛋白羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制各及其性能引言 植入物的结构或位置的变化，均可导致修复的失败。而组织工程软骨植入缺损区后， 与缺损区的整合界面是软骨一软骨及软骨一骨界面间的愈合，愈合慢故而存在潜在的 不稳定因素，如果将软骨一骨的界面改变为 骨一骨的界面，将会加速移植体与缺损区的 整合过程。基于上述思想，本文设计了如图 所示五层梯度多孔材料。a - b 利用羟基磷灰 石诱导骨组织再生和超强骨界面结合强度 的特性，形成软骨下骨并在缺损形成良好固 定。b - c 、c d 、d f 、f - e 支持植入细胞在每 一个区域内增殖、分化、代谢，分别形成关 节软骨的钙化层、深层、中层和表层，应更图2梯度材料示意图 有利于构建出关节软骨。 因此，本课题研究目的是用具有骨诱导性、超强骨界面结合能力的羟基磷灰石和 对软骨组织工程种子细胞具有优良生物相溶性的丝素蛋白，制备丝素蛋白( s f ) 羟 基磷灰石( h a ) 梯度多孔复合材料。对其结构与理化性能进行研究，获得制备多孔 s f h a 梯度支架材料的制备技术，为其未来作为骨一软骨组织再生的支架，用于骨一软 骨组织的诱导修复或组织工程提供材料基础。 围绕本课题的研究目的，具体研究内容为： ( 1 )制备丝素蛋白和羟基磷灰石粉末，研究其结构和性质； ( 2 )研究丝素蛋白与羟基磷灰石比例及致孔剂n a c l 添加量对非梯度材料孔结构参 数的影响，为制备梯度多孔材料作准备； ( 3 )以n a c l 为致孔剂，用层铺模压法制备s f h a 梯度多孔材料，并表征其结构； ( 4 )进行s f h a 梯度多孔材料与非梯度材料结构、性能的比较研究。 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制各及其性能第一章 第一章丝素蛋白( s f ) 和羟基磷灰石( h a ) 粉末的制备 及其性质 第一节材料与方法 1 1 实验材料 碳酸钙，磷酸，无水乙醇，均为分析纯。家蚕生丝，广泛p h 试纸，普通滤纸， 双面胶等。 1 2 实验器械 a l c 一2 1 0 2 型电子天平、高温炉、k q - - 8 0 0 t d e 型高频数控超声波清洗器、s h z d ( ) 型循环水式真空泵、低温冰箱、v i r t i sg e h e s i s 2 5 - l e 型冷冻手燥机、脚型快速研磨 机、冰箱、h i t a c h i s - 5 7 0 型扫描电子显微镜( 日本日立公司) 、j y d - 9 0 0 智能型超声 波细胞粉碎机、l s 8 0 0 型静态粒径分析仪( 欧美克公司) 、m a t t s o na l p h ac e n t a u r i 红外光谱仪、l a b r a m - i b 型显微拉曼光谱仪( 法国d i l o r 公司) 、d m a x - 3 c 型全自动 x 射线衍射仪( 日本理学电机株式会社) 、d w g s 一2 喷雾干燥器( 上海科得有限公司) 玻璃棒、橡胶管等。 1 3 丝素( s f ) 粉末的制备 1 3 1 丝素溶液的制备 取1 0 0g 家蚕生丝在5 0 0 0m l 、浓度为0 5 的n a c o 。溶液中，沸煮3 0 分钟，重 复煮三次，前两次用自来水，最后一次用蒸馏水。沸煮的过程中，不断搅拌。脱胶后 的纤维用自来水洗净、拉松，在6 0 的烘箱中烘干将脱胶、烘干后的家蚕丝素纤 维放入三元溶液中，浴比1 ：1 0 ，7 2 溶解1 小时，取出装入透析袋，自来水透析 4 8h ，去离子水透析4 8h ，即得浓度约3v t 的再生家蚕丝素溶液。 1 3 2 丝素粉末的制备 将透析好的丝素溶液装入喷雾干燥器的顶端容器中，喷雾干燥条件为塔顶1 2 0 ，塔底6 0 7 0 ，丝素溶液流量为2 滴s 。 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的翻各及其性能 第一章 1 4 羟基磷灰石( i 认) 粉末的制备 1 4 1 氧化钙的制备 将碳酸钙倒入坩埚放入高温炉，达到1 0 5 0 后保持温度4h 。4h 后关闭高温 炉，开炉门静置2 3h 后取出氧化钙倒入广口瓶，放入干燥器中保存备用。 1 4 2 羟基磷灰石悬浊液制备 将6 6 9 克c a 0 溶于8 0m l 去离子水中，得到饱和c a ( 0 h ) 。悬浊液。6 5m l 浓度 为8 5 的h ，p o 用3 0 m l 去离子水稀释备用。将饱和c a ( 0 h ) ：悬浊液和h , p 0 , 溶液按1 6 7 的钙磷比同时滴入装有5 0 0m l 去离子水圆底三颈瓶中。边滴入边搅拌，同时用超声 波振荡，控制反应p h 值为8 o 9 0 ，温度为6 0 。加样结束后，6 0 1 2 继续搅拌振 荡2h ，后于室温陈化4 8h ，得到羟基磷灰石悬浊液。 1 4 3 羟基磷灰石粉末的制备 真空抽滤羟基磷灰石悬浊液去除多余水分，得到凝胶状物质于低温冰箱中于一4 0 冷冻1 2h ，再经约4 8h 减压干燥后得羟基磷灰石固体。然后放入研磨罐，以质 量比1 ：4 的比例加入陶瓷珠。每研磨1 5m i n 关机静置5m i n ，重复6 次。研磨好的 粉末装入密封袋4 冰箱保存。 1 5 粉末的结构和性能测试 1 5 1 扫描电镜( s e m ) 取1g 丝素粉末于5 0m l 的乙醇中，使用j y d - 9 0 0 智能型超声波细胞粉碎机分散， 功率6 0 0 胃，时间1 2 ，间隔4s ，超声1 0 次。使用胶头滴管取适量丝素粉末悬浊液， 滴1 2 滴于盖玻片上，盖玻片用双面胶固定于电镜台上。用h i t a c h i s - 5 7 0 型扫描 电子显微镜( 日本日立公司) 观察复合粉末的形态结构。 羟基磷灰石粉末制样方法同上。 1 5 2 粒径分析 滴1 2 滴丝素蛋白和羟基磷灰石悬浊液于试管中，用适量乙醇稀释。粒径分析 之前用超声波细胞粉碎机超声震荡。用l s 8 0 0 静态粒径分析仪( 欧美克公司) 测定粉 末的粒径分布。 1 5 3 氨基酸分析 丝素粉末氨基酸组成的测定使用日立l - 8 8 0 0 型氨基酸分析仪。用6m o l l 的 h c l 溶液于“0 将丝素膜水解1 8h ，得到浓度为2 5m g 1 0 0 m l 的溶液，加样量0 0 5 丝素蛋白羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能第一章 l ，测得各种氨基酸的质量分数。 1 5 4 红外吸收光谱 将丝素蛋白和羟基磷灰石粉末分别与溴化钾压片，用n i c l e t5 7 0 0f i i r 红外光 谱仪测得丝素蛋白和羟基磷灰石粉末的红外光谱。 1 5 5 激光拉曼光谱 用显微拉曼光谱仪绘制拉曼光谱，激发光波长6 3 2 8 珊，背散射方法，缝宽1 0 0 | l1 1 1 ，固体样品扫描时间为2 0 0s ，溶液样品扫描时间为8 0 0s 。 1 5 6 煳，线衍射 丝素蛋白和羟基磷灰石粉末压片制样，使用d 陋x 一3 c 型全自动x 射线衍射仪( 日 本理学电机株式会社) ，在管电压4 0k v ，管电流4 0m a ，扫描速度5o m i n 的条件下， 记录得到2o = 5 7 0 0 问的衍射强度曲线 2 1 丝素粉末 第二节结果与讨论 ( a ) 图3 丝素粉末扫描电镜图像： ( a ) 放大1 千倍；( b ) 放大1 万倍 1 4 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材章丰的制各及其性能第一章 5 0 4 0 乎 蓍3 0 暑2 0 1 0 0 s i z ed l s t r i b g t i o r lb yv o l u m e l f f i 1 0 0 d i a n l e t b r ( r i m ) 图4 丝素粉末的粒径分布图 由扫描电镜( 图3 ) 可见丝素粉末颗粒呈椭球形，表面不光滑，有起伏。 图4 表明丝素粉末粒径分布窄，峰宽仅有2 5 1 7 舳，在2 9 4 6 姗处体积分数最大， 为4 9 2 1 ，平均粒径为2 9 6 8 h a 。 对丝素粉末、丝素纤维、丝素膜氨基酸分析结果见表2 。与丝素纤维相比，丝素粉氨 基酸组成没有显著改变，其中谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸的相对含量略有减少。与丝素膜相 比，丝素粉中酪氨酸相对含量有所增大，谷氨酸含量有所减少，其它变化不大。 表2 丝素纤维、丝素膜和丝素粉的氨基酸组成( 1 ) 丝素蛋白，羟基磷灰石梯度多孔复合材料的制备及其性能 第一章 图5 丝素蛋白粉末的x 一射线衍射曲线 w a v e n u m k r ( c m - 图6 丝素蛋白粉末的红外吸收光谱 在丝素的x 一射线衍射曲线上，使用c u kq 射线时s i l ki 的主要衍射峰为1 2 2 。( m s ) 、1 9 7 。( s ) 、2 4 7 。( m ) 、2 8 2 。( m ) ；s i l k i i 的主要衍射峰为9 1 。( m s ) 、 1 8 9 。( m s ) 和2 0 7 。( v s ) 删。丝素粉末的x 一射线衍射曲线( 图5 ) 中无s i l ki 、 s i l k i i 的特征峰，所以丝素粉末基本为无定型。 丝素红外吸收光谱中，无规卷曲结构丝素的酰胺i 、酰胺i i 和酰胺分别在 1 6