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南京医科大学硕士学位论文 论文独创性声明 本论文垒隆! ! 照垒监坚喳堕坌! 且幽苎超! 是我个人在导师 指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注 和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成 果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声 明并表示了谢意。 专业：燃! 糊玉作者签名：堑堑 日期： 论文使用授权声明 矽7 一l 悼 本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：雄导师签名： 南京医科大学硕士学位论文 p a x f l f i n 在大鼠胰腺发育不同时期的表达 硕士研究生郭静 导师德伟教授 南京医科大学生物化学与分子生物学系，南京，2 1 0 0 2 9 中文摘要 运用高密度寡核苷酸芯片建立大鼠胰腺发育不同阶段( 胚胎( e ) 1 2 5 ，e 1 5 5 ，e 1 8 5 ，新生和成年) 的基因表达谱，经过生物信息学数 据分析发现许多与胰腺功能相关的基因在e 1 8 5 相对高表达，这一时 期正是胰岛细胞迁移聚集形成典型胰岛结构的关键阶段，而典型的胰 岛结构是胰腺发挥正常生物学功能的基础。本研究从基因表达谱中筛 选出一条在e 1 5 5 和e 1 8 5 相对高表达的基因p a x i l l m ( 桩蛋白， v x n ) ，旨在初步探讨该基因在胰岛细胞迁移、黏附及胰岛结构维持中 的作用。 运用r t - p c r 技术进一步检测p x n 在大鼠胰腺发育不同阶段的 m r n a 表达水平；应用免疫印迹检测不同时期桩蛋白表达；运用免疫 组织化学检测不同时期桩蛋白在胰腺的定位。r t - p c r 与基因芯片中 检测的m r n a 表达趋势一致，表达量胚胎期高于新生和成年期；免 疫印迹结果显示p x n 蛋白在大鼠胰腺发育不同阶段的表达趋势与 m r n a 表达趋势相反，表达量出生后远高于胚胎期；免疫组织化学结 果显示在不同发育时期桩蛋白不仅在外分泌胰腺有表达，而且在胰岛 也有表达。 基于以上实验结果，我们推测具有调节细胞聚集，黏附功能的桩 南京医科大学硕士学位论文 蛋白可能参与出生后胰岛重塑。p x n 在大鼠胰腺发育过程中蛋白和 m r n a 表达趋势相反，其存在的机制可能在于基因转录后水平的调 控 关键词：p a x i l l i n 胰岛重塑细胞迁移黏附r t - p c r 高密度寡核 苷酸芯片w e s t e r nb l o t t i n g 免疫组织化学 南京医科大学硕士学位论文 t h e e x p r e s s i o no fp a x i l l i nd u r i n gr a tp a n c r e a sd e v e l o p m e n t m d c a n d i d a t eg u oj i n g s u p e r v i s o r d ew e i d e p a r t m e n to f b i o c h e m i s t r y ，n a n j i n gm e d i c a lu n i v e r s i t y , n a n j i n g ， 2 1 0 0 2 9 a b s t r a e t w ee x p e c t e dt ou s eh i g h - d e n s i t ym i c r o a r r a y ( a f f y m e t r i x ) t oa n a l y z e t h e e x p r e s s i o np r o f i l e s o fp a n c r e a s d e v e l o p m e n t w eg e n e r a t e d t r a n s c r i p t i o n a lp r o f i l e so fp a n c r e a t i ct i s s u ei s o l a t e df r o mf i v eb i o l o g i c a l l y s i g n i f i c a n ts t a g e so f d e v e l o p m e n t ：e m b r y o n i cd a y ) 1 2 5 ，e 1 5 5 ，e 1 8 5 ， n e w b o r na n da d u l tp a n c r e a s t h e s ea n a l y s e si m p l i c a t e dt h a tm a n yg e n e s r e l a t e dw i t hp a n c r e a t i cf u n c t i o nw e r ee n r i c h e di nt h el a t e rg e s t a t i o nw h e n i s l e ta r c h i t e c t u r ea n df u n c t i o na r eg r a d u a l l yf o r m i n g t h ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o no fp a x i l l i nm r n a w i l t sv e r i f i e db yr t p e r m o r e o v e r ，t h e d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fp a x i l l i n p r o t e i nw a si d e n t i f i e db yw e s t e r n b l o t t i n g ，w i t h d i f f e r e n te x p r e s s i o np r o f i l e a g a i n s tm r n a p a x i l l i n l o c a l i z e db o t hi ni s l e t sa n de x o c r i n ep a n c r e a s ，w h i c hw a sd e t e c t e db y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o u rp r e s e n tp r e l i m i n a r ye v i d e n c es u g g e s t e dt h a t p a x i l l i nm i g h tp l a yr o l e si nm a i n t a i n i n gi s l e ts t r u c t u r ea n df u n c t i o n , e s p e c i a l l yi ni s l e tr e m o d e l i n ga f t e rb i r t h k e y w o r d s ：p a x i l l i n i s l e tr e m o d e l i n gc e l lm i g r a t i o na n da d h e s i o n r t - p c r g e n e c h i p w e s t e r nb l o t t i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 3 南京医科大学硕士学位论文 第一章引言 胰腺主要行使两种生物学功能：产生消化酶；分泌四种内分泌激 素( 胰岛素一i n s u l i n 、胰高糖素g l u c a g o n 、生长激素抑制素s o m a t o s t a t i n 、 胰多肽一p a n c r e a t i cp o l y p e p t i d e ) 以调节血糖的动态平衡。而这些功能 的发挥依赖于完整的胰腺结构：腺泡和导管组成的胰腺外分泌部是消 化酶产生的结构基础；四种内分泌细胞( 0 【、p 、6 、p p 细胞) 组成的内 分泌胰腺即胰岛是血糖调节的结构基础( n 。正是由于胰腺的重要生物 学功能，胰腺发育一直都是发育生物学家关注和研究的焦点之一。胰 岛素分泌相对或绝对不足引起糖尿病，有些糖尿病患者的胰岛结构严 重破坏，糖尿病发病率的不断上升使得对胰腺发育尤其是胰岛形成过 程的研究显得更为重要但- 4 ) 胰腺起源于胚胎内胚层上皮细胞，大鼠胰腺在胚胎8 5 天( e 8 5 ) 左右开始发育，e 1 0 5 背侧胰芽和腹侧胰芽开始融合，导管土皮细胞 开始分化为b 细胞；e 1 2 5 r 大鼠胚胎胰腺中仅存在胰腺导管上皮细胞 和问充质细胞，前者是胰腺发育的根源，而后者为胰腺的发育提供了 空间环境；e 1 4 胰腺导管上皮分化为腺泡，内分泌细胞o 【、1 3 、6 细胞 分化成熟，能够分泌胰岛素和胰高血糖素等；e 1 5 5 左右分化成熟的内 分泌细胞开始突破基底膜向周围间充质迁移，内分泌细胞相互聚集， a 、8 、p p 细胞围绕b 细胞形成胰岛结构；e 1 8 5 周围腺泡结构逐渐清晰， 典型胰岛结构基本形成并不断完善成熟直至出生后( 5 拂出生后两周 内，内分泌细胞大量凋亡，随后的一周内内分泌细胞大量增生。到出 生2 l 天( p 2 1 ) 哺乳期结束，胰岛完成结构重塑和功能成熟( 1 m l n 。 南京医科大学硕士学位论文 p a ) 【i l l m ( 桩蛋白，p x n ) 基因的表达产物是一种细胞骨架上的磷酸 蛋白，c d n a 全长3 7 3 7 b p ，分子量6 8 k d a ，主要定位于黏着斑，构成 细胞外基质( e c m ) 与细胞骨架联系纽带，也是信号转导的主要部位， 促进信号从细胞外基质经整合素途径向细胞内传递，参与动态调节焦 点黏附，调节细胞的移动和播散。在真核细胞中已经发现三种不同的 桩蛋白剪接体，n 、p 和丫桩蛋白。p 和1 ，亚型在a 亚型的2 7 7 2 7 8 位氨基 酸之间分别插入了3 4 和4 8 个氨基醚1 2 ) 。 p x n 最早在被s r c 基因转染的细胞中发现，是迄今为止所发现的惟 一能与癌基因结合的舍酪氨酸的焦点黏附调节蛋白，是整合素信号通 路中的重要成员。桩蛋白在血管并口子宫壁等平滑肌组织中的含量最丰 富，其他组织中含量较低，大脑中也可少量发现( ”) 研究表明其在 胚胎的发育过程中发挥至关重要的作用，p x n 等位基因缺失的小鼠易 发生胚胎期死亡，而该基因缺失的成纤维细胞表现为细胞迁移能力缺 陷，表明p x n 具有控制细胞播散和移动的能力。p x n 含有一些介导蛋白 问相互作用的基序：包括l d ( 富含亮氨酸) 重复序列、l i m 区域( 富含 半胱氨酸类似双锌指区域) 及s r c 同源区2 ( s h 2 ) 和s r c 源区3 ( s h 3 ) ，这 些基序能与整合素的胞质区、细胞骨架蛋白、酪氨酸激酶( - 如f a k ) 、 丝氨酸苏氨酸激酶、g t p 酶激活蛋白及其他一些调节蛋白结合形成 特异的信号分子复合物将信号向下游传递。虽然p x n 本身不表现酶的 活性，但因其含有一系列的结合部位决定了p x n 可作为一种码头或脚 手架反应底物或是为信号反应提供场所来发挥作用。p x n 磷酸化位点 众多，包括酪氨酸，丝氨酸苏氨酸磷酸化位点，其中最为重要的是 南京医科大学硕士学位论文 y 3 1 ，y 1 1 8 ，s * s s 并口s 1 9 0 ，p ) ( 1 1 磷酸化对生物学功能的发挥至关重要p x n 介导的信号通路为参与胚胎发育、损伤修复、肿瘤转移相关的细胞迁 移活动所必需1 牟。 本研究应用基因芯片技术检测到在大鼠胰腺发育过程中，桩蛋白 m r n a 的表达高峰出现在胰岛形成的关键阶段，即胚胎1 5 5 天至胚胎 1 8 5 天，r t - p c r 的结果验证了这样的表达趋势。另外，本实验运用 免疫印迹技术确立p x n 在大鼠胰腺不同发育阶段的蛋白差异表达，从 e 1 5 5 到成年表达量逐步递增，两种蛋白亚型呈现完全不同的表达趋 势，胚胎期仅有小分子量亚型表达，出生后有大分子量亚型表达；运 用免疫组织化学技术确定了p m 在不同发育时期胰腺的组织定位，桩 蛋白在不同发育时期的外分泌胰腺都有表达，而生后在胰岛部位出现 表达。 6 南京医科大学硕士学位论文 一、材料与试剂 ( 一) 试剂： 第二章材料与方法 t r k o lr e a g e n t i n v i 订o g c nl i f et e c h n o l c g i e s r n e a s ym i n ik i t0 i a g e n s u p e r s c r i p ti ii n v i t r o g e nl i f et e c h n o l o g i e s t 7 _ o l i g o ( d t ) 2 4p r i m e r o p e r o n ec o l id n a l i g a s e n e b ec o l id n a p o l y m e r a s ei n e b ec o l fr n a s e h i n v i t r o g e nl 汝t e c h n o l o g i e s t 4d n a p o l y m e r a s e n e b 5 xs e c o n ds t r a n db u f f e r i n v i t r o g e nl i f et e c h n o l o g i e s 1 0r m mm q t p i n v i t r o g e nl i f et e c h n o l o g i e s p h a s el o c kg e l e p p e n d o r f p h e n o l c h l o r o f o r m i s o a m y la l c o h o l a m b i o n e n z or n a t r a n s c r i p tl a b e l i n gk i t a f f y m e t r i x r n e a s ym i n ik i t ( u s e di tc l e a n u p )q i a o e n d e p c t r e a t e dw a t e r a m b i o n t r i z m ab a s e s i g m a - a l d r i c h m a g n e s i u ma c e t a t e ( m 9 0 a c )s i g m a - a l d r i c h p o t a s s i u ma c e t a t e ( k o a c ) s i g m a - a l d r i c h g l a c i a la c e t i ca c i d s i g m a - a l d r i c h 7 5ma m m o n i u ma c e t a t em h 4 0 a c ) s i g m a - a l d r i c h a b s o l u t ee t h a n o l 7 5 e t h a n o l 3ms o d i u ma c e t a t e ( n a o a c ) s i g m a - a l d r i c h e t i l i d i u mb r o m i d e s i g m a - a l d r i c h o 5me d t a s i g m a - a 1 d r i c h 焦碳酸二乙酯( d e p c ) s i g m a 逆转象试剂盒融a r a 2 xt a g m a nu i l i v c ! r s a lp c rm a s t e rm i x a b i a n t i p a x i l l i n s a n t ac r u z a n t i g l u c a g o ns i g m a - a l d r i c h a n t i i n s u l i ns a n t ac r u z 兔抗山羊抗体中衫金桥 驴抗小鼠抗体 m i l l i p o r e s u p e r s i g n a lw e s tp i c oc h e m i l u m i n e s c e n ts u b s t r a t e p i e c e ( 二) 仪器： 匀浆机 7 南京医科大学硕士学位论文 显微解剖镜 高速低温离心机 a f f y m e t r i x 固f l u i d i c ss t a t i o n4 0 0 a f f 3 a n e t r i x 雪h y b r i d i z a t i o no v e n6 4 0 a f f y m e t r i x 雪g 2 5 0 0 a g e n e a r r a ys c a n n e r a b i7 7 0 0s e q u e n c ed e t e c t o r 电泳仪 转膜仪 显影液，定影液 x 片 捷达戎像系统 ( 三) 、软件： a f f y m e t r i x 。m i e r o a r r a ys u i t e v e r s i o n5 0 a f f y m e t r i x 雪m i e r o d b v e r s i o n2 0 a f f y m e t r i x 啦d a t am i n i n gt o o l v e r s i o n2 0 m o t i c s i g m a b i o r a d l k b 乐凯 k o d a r k t a n o ng i v 2 0 0 9 ( 四) 、材料： 成年s d 大鼠9 0 只( 雌3 0 只，雄6 0 只) ，均2 5 0 9 左右，由南 京医科大学动物中心提供。于1 8 ：0 0 时，将雌雄以1 ：2 合笼，次日 检测有阴栓者，定为受精第o 5 天( e 0 5 ) ，取e 1 2 5 ，e 1 5 5 ，e 1 8 5 胚 胎胰腺以及初生、新生1 4 天、新生2 l 天和成年大鼠胰腺。同一孕 鼠至少取1 0 个胚胎，以消除同一发育阶段胚胎之间的个体差异；每 个时间点至少取5 只孕鼠进行混合以消除同一孕龄母鼠之间的差 异。 二、实验方法 ( 一) 组织分离： 取孕1 2 5 天、孕1 5 5 天、孕1 8 5 天母鼠，引颈处死，分离出 胚胎，显微解剖镜下用显微镊子取出胰腺后，迅速在液氮中冷冻 南京医科大学硕士学位论文 新生和成年大鼠直接分离出胰腺r 乃。 ( 二) 总r n a 的提取和纯化： 1 、提取总r n a a 提取( 用i n v i t r o g e n 的t r i z o l 提取) 1 ) 取分离得到的胰腺组织( 保存在8 0 。c ) ，在液氮中研磨成粉末。 2 ) 待液氮挥发干，立即加入也o l ，每1 0 0 i i l g 组织加l m lt r i z o l ， 融化后，用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，移入2 0 m l 离心管中，室温静置3 5 分钟。 3 ) 在离心管中每l m l t r i z o l 起始量加2 0 0 止氯仿，振荡混匀。 4 ) 将离心管在4 c ，1 2 0 0 0 9 ，离心1 5 分钟 5 ) 用移液器小心吸出上层水相，加入另一离心管中，加入与上层 水相相同体积的异丙醇。 6 ) 一2 0 c ，沉淀3 0 m i n 7 ) 4 c ，1 2 0 0 0 9 ，离心1 0 分钟。 8 ) 小心移出上清。 9 ) 沉淀中加入l m l 7 5 乙醇，4 4 c ，7 5 0 0 9 ，离心5 分钟 1 0 ) 重复用7 5 乙醇洗涤一次r n a 沉淀 1 1 ) 去上清，稍微晾干，r n a 略显透明，加入适当体积的r n a s e - f r e e 水，充分溶解。 2 、定量和检测总r n a a ) 紫外定量和检测 南京医科大学硕士学位论文 1 ) 用紫外分光光度计检测r n a 的产量，在2 6 0 n m 处的吸光度， 1 0 d = 4 0 嵋“l l 2 1 根据在2 6 0 n m 和2 8 0 n m 处的吸光值，检测r n a 的纯度，纯 r n a 的o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值应4 , 妻i f r 2 o ( 比值最好在1 9 2 1 之间) 。 b ) 变性胶电泳质检 1 ) 配制1 2 的电泳胶 1 0 m o p sg e lb u f f 醯1 0 m l a g r o s e r n a s e f r e ew 敏e r 加热溶解a g r o s e ，稍微冷却，加入 3 7 吁r 醛 e b ( 10 m g m l ) 1 2 9 9 0 m l 1 8 m l 1 曲 摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于l xm o p sg e l b u f f e r 中平衡1 0 分钟，待用 2 ) 样品变性 5 x l o a d i n gb u f f e r r n a 样品 2 此 1 岭 r n a s e f r e ew a t e r 调节至1 0 皿 在6 5 c ，变性5 分钟，立即置于冰上冷却。 3 、电泳 将处理好的r n a 样品，稍微离心，加入加样孔中，7 0 v 恒压电泳 1 小时。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果 1 0 南京医科大学硕士学位论文 3 、纯化总r n a ( 用q i a g e n 的r n e a s y m i n ik i t 纯化总r n a ) 1 ) 将总r n a 的体积用r n a s e f r e e 的水调整到1 0 0 p l ，( 因q i a g e n 纯化柱的最大上样量为1 0 0 p g r n a ，所以一般取r n a 不大于 1 0 0 p g ) 。 2 ) 加入3 5 0 止r l t 工作液( 1 i i l lr l t 中加1 0 皿2 - m e ，混匀而成) ， 充分混匀 3 ) 加入2 5 0 此无水乙醇，充分混匀( 不要离心) 。 4 ) 将混好的7 0 0 p l 样品加到q i a g e n 纯化柱中， 8 0 0 0 r p m ，离心 1 5 秒。 5 ) 倒掉收集管中的流出液，在柱中加入5 0 0 l 皿r p e 工作液( 一份r p e 加入4 份无水乙醇混匀而成) ， 8 0 0 0 r p m ，离心1 5 秒。 6 ) 倒掉收集管中的流出液，在柱中加入5 0 1 3 l 止r p e 工作液( 一份r p e 加入4 份无水乙醇混匀而成) ， 8 0 0 0 r p m ，离心2 分钟。 7 ) 将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速，离心1 分钟。 8 ) 将纯化柱换入一个e p 管中，在纯化柱膜中问加2 5 止r n a s e f r e e 水，室温放置1 分钟，最大转速，离心1 分钟。 9 ) 将e p 管中的样品移入一个新的e p 管中。 4 ，纯化总r n a 的定量和检测 a 紫外定量和检测：总r n a 的浓度并口o d 2 6 0 o d 2 8 0 。 b 变性胶电泳质检。 ( 三) e d n a 的合成和纯化： 南京医科大学硕士学位论文 1 i d n a 的合成( a f f y m e t r i xo n e c y c l ec d n as y n t h e s i sk i t ) 幻总r n a r n a s e f r e ew a t e r t 7 一( d t ) 2 4p r i m e r ( 5 0 u m ) 5 1 6 i t g 补至1 c i g l 2 u l 混匀，7 0 温浴1 0 分钟，置于冰上至少2 分钟，离心片刻； c ) 5 x l s ts t r a n db u f f e r d t t ( 0 1 m ) d n t p ( 1 0 m m ) 混匀，4 2 c ，温浴2 分钟； ms u p e r s c r i p t i i r t ( 2 0 0 u i x l ) e 、混匀，4 2 c ，温浴1 小时。 4 此 2 u l 1 u l 2 2 n d c d n a , ( a f f y m e t r i xo n e c y c l ec d n as y n t h e s i sk i t ) 幻将1 s te d n a 合成产物置于冰上，加入下列试剂： r n a s e f r e ew a t e r 5 x 2 n ds t r a n db u f f e r d n t p ( i o e m ) e c o l id n a l i g a s e ( 1 0 u p l ) e c o l id n a p o l y m e r a s e ( 1 0 u i x l ) 2 u l 9 1 u l 3 0 止 3 止 1 皿 4 皿 t o t a lv o l u m e 混匀，1 6 ，反应2 小时： 1 3 0 止 b 、加入2 x l t 4 d n a p o l y m e r a s e ，混匀，1 6 c ，5 分钟； 1 2 南京医科大学硕士学位论文 c ) 加入1 0 江e d t a ( 0 5 d ，混匀，终止反应。 一2 0 c 保存或进行下步纯化。 3 纯化e d n a ( a f f y m e t r i xg e n e c h i ps a m p l ec l e a n u pm o d u l e ) _ a ) 将6 0 0 皿e d n a b i n d i n g b u f f e r 加入e d n a 合成产物中 b 、振荡混匀3 秒。 c ) 将5 0 0 皿液体移入e d n ac l e a n u ps p i nc o l u m n 管中，不要 振荡， 1 0 0 0 0 r p m ，室温离心1 分钟；倒掉下层液体。 m 将剩余液体移入e d n ac l e a n u ps p i nc o l u m n 管中，不要振 荡，_ 1 0 0 0 0 r p m ，室温离心1 分钟；倒掉下层液体和收集管。 e ) 开盖最大转速离心5 分钟，倒掉下层液体和收集管。 f ) 将柱子转移至1 5 m l 的收集管中，加入1 4 止的e d n a e l u t i o nb u f f e r 。室温静置1 分钟，最大转速离心1 分钟。 ( 四) e r n a 的合成和纯化： 1 t 合成c r n a ( g e n e c h i pi v tl a b e l i n g t ) t e m p l a t ee d n a r n a s e - f t e ew a t e r 1 0 x i v tl a b e l i n gb u f f e r m l a b e l i n gn t p m i x 1 2 皿 8 皿 4 u l 1 2 u l t o t a lv o l u m e 混匀，稍离心，3 7 温浴1 6 小时。 4 0 p l 南京医科大学硕士学位论文 合成产物可保存在2 0 c 或直接进行下一步纯化。 2 纯化c r n a 用q i a g e n 纯化c r n a ，方法同纯化总r n a 一样，只是步骤7 ) 时用3 0 止r n a s e f r e ew a t e r 洗脱c r n a 。 3 c r n a 的定量和检测 a 用紫外分光光度计测量c r n a 的浓度和0 1 ) 2 6 0 o d 2 8 0 。 b 变性胶检测c r n a ：取2 1 x gc r n a 在1 2 的变性胶上电泳，纯 化的c r n a 应该呈弥散状长条带。 ( 五) c r n a 片段化、配制杂交液： 1 片段化c r n a a 校正c r n a 浓度 根据公式： 校正c r n a = 【c 鼢认】v m r 【c r n a ：c r n a 的测量浓度； v ：c r n a 的洗脱体积： m ：合成c r n a 时所用总r n a 的量； r ：c r n a 的回收得率； 【校正c r n a ：c r n a 校正后的浓度。 b 配制片段化反应体系 根据校正c r n a 的浓度片段化( 4 0 止) ： 1 4 南京医科大学硕士学位论文 c r n a 5 x f r a g m e n t a t i o nb u f f e r r n a s c f r e ew 址e r c 浅段 匕 1 5 p g 6 止 补充至3 0 止， 混匀，9 4 温浴3 5 分钟，之后置于冰上。 d ，片段化c r n a 的质检：变性胶电泳质检，片段化c r n a 约为 3 5 2 0 0 b p 。 2 配制杂交液 根据芯片类型按下表配制适当量的杂交液： ( 六) 芯片杂交： 南京医科大学硕士学位论文 先进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果再杂 交表达谱芯片r a e 2 3 0 a ( 购自a 竭，i l l e t r i x 公司) 。 1 和2 同时进行，直到第3 步： 1 预杂交芯片 1 ) 取出芯片，平衡至室温； 2 ) 加入l x 杂交b u r r ； 3 ) 4 5 ，6 0 r p m ，预杂交1 0 分钟。 2 杂交液的准备 1 ) 杂交液混匀，离心片刻； 2 ) 9 9 ，温浴5 分钟； 3 ) 将杂交液转至4 5 ，温浴5 分钟； 4 ) 离心机最大转速离心5 分钟。 3 杂交芯片 1 ) 吸出芯片中的l 杂交b u f f e r ； 2 ) 将杂交液力口入到芯片中； 3 ) 4 5 ，6 0 印m ，杂交1 6 小时； 4 ) 杂交结束后，吸出芯片中的杂交液，加入洗液a ，进行后面 的洗染过程。 ( 七) 洗脱芯片： 在洗脱工作站上按照芯片类型，运行洗脱程序。 南京医科大学硕士学位论文 ( 八) 扫描芯片： 扫描仪上扫描芯片。 ( 九) 数据分析： 杂交后的芯片用g e n e a r r a ys c a n n e r 扫描，存为$ d a t 图片文件， 并经标准化存为 c e l 图片文件：图片用m i c r o a r r a ys u i t ev e r s i o n5 0 软 件进行杂交结果分析，将检测报告生成幸c p 报告文件，并将基因检 测结果转换成s 文件；最后将* x l s 文件中的基因探针号登陆 a f f y m e t r i x n 站( w w w a f f y m e t r i x c o r n ) 进行批处理查询( b a t c hq u e r y ) ， 得出探针相对应的基因及相关信息。 ( 十) r t - p c r ： 1 取1 峙的e 1 2 5 ，e 1 5 5 ，e 1 8 5 ，初生和成年5 个时期胰腺组织总r n a 进行反转录：3 0 。cl o m i n ，4 2 c2 0 m i n ，9 9 。c5 m i n ，4 。c5 m i n ，合 成e d n a 。 2 p c r 扩增：p a x i l l i n 上游引物：5 - g g a g c a g a a c g a c a a g c c 一3 ， 下游引物：5 - g c a c a g a g c c c a g g a g a 3 ，预计扩增产物 2 5 6 b p 。 3 a c t o p a x i n 上游引物：5 - g g a g g a g a a t g a g g t g c g 3 。下游引 物：5 一g c c g a g g r r r a g g c 闻一3 ，预计扩增产物8 1 2 b p 。 4 1 8 sr r n a 上游引物：5 - a c g a a c c a g a g c g a a a g c 3 ，下游引 物：5 - g g ac a t c t a a g g g c a t c a c a g 3 ，预计扩增产物5 1 4 b p 。 5 p a x i l l i n 和1 8 sr r n a 的p c r 条件：9 4 。c2 m i n ；9 4 c3 0 s e c ，5 2 2 c 1 7 南京医科大学硕士学位论文 l m i n ，7 2 。c2 m i n ，3 5 个循环。a c t o p a x i n 的p c r 条件：9 4 。c2 m i n ； 9 4 c3 0 s e c ，5 3 4 c3 0 s e c ，7 2 c4 5 s e c ，3 2 个循环。r t p c r 均重 复3 次 ( 十一) 对数据进行生物信息学分析 所用网站主要涉及： h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v l o c u s l i n k h t t p ：w w w n e b i n l m n i h ，g o v e n t r e z q u e r y f c g i ? d b - - - p u b m e d h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v e n t r e z q u e r y f c g i ? d b = o m i m h t t p ：w w w n e b i n l m n i h g o v b l a s t ( 十二) 总蛋白的提取 1 ) 总蛋白的提取 a 加裂解液，按照l ：5 ( 重量体积) ，o 1 9 组织加5 0 1 3 i 止裂解液。 b 冰上匀浆6 0 0 0 r m i n x 5 s x 5 次。 c 静置l o m i n ，4 c1 5 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 。 d 取上清，测蛋白含量，余蛋白上样缓冲液变性后分装，2 0 c 冻存。 2 1b r a d f o r d 法测定蛋白质浓度 分别在各个e p 管中加入o 5 t g 0 5 m 的b s a ( 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5 i _ t 1 ) 各两组，以0 9 n a c i 溶液补足l o o p l ，同时以l o o p l 的o 9 n a c i 作空白对照。每管加入l m l 考马斯亮蓝溶液( b r a d f o r d 液) ，振荡混 匀，室温放置3 分钟用波长为5 9 5 n m 、光径为l c m 的微量比色法 1 8 南京医科大学硕士学位论文 检测，取5 9 5 n m 吸先度值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，用 e x c e l 求出标准方程。取已经抽提的蛋白质样品1 山加入9 9 皿 0 9 n a c l 溶液及考马斯亮蓝溶液l m l ，摇匀，室温静置3 分钟后同 法测定吸光度值，将吸光度值代入标准方程，算出样品的蛋白质浓度。 ( 十三) 蛋白免疫印迹 1 )s d s p a g e 电泳 a 清洗玻璃板，陶瓷片 b 配分离胶，3 7 静置2 5 m i n 。 1 2 分离胶( 1 0 m l ) 水 3 0 a c r - b i s 分离胶缓冲液 1 0 s d s 1 0 a p t e m 匝d 3 3 m l 4 m l 2 5 m l 1 0 0 u l 1 0 0 皿 8 止 c 配浓缩胶，室温静置2 0 m i n 。 5 浓缩胶( 5 n 1 l ) 水3 4 m l 0 8 3 m l 浓缩胶缓冲液 0 6 3 m l 1 0 s d s5 c l u l 1 9 南京医科大学硕士学位论文 1 0 a p t e m 匣d 5 0 u l 1 0 此 d 加样，每个时期蛋白上样量均为4 0 9 9 。 e 恒压电泳( 浓缩胶8 0 v ，分离胶1 6 0 v ) 2 )半干式转膜 a 电泳结束后，戴手套，切膜、滤纸和胶( 切角标记) b 转膜缓冲液中浸泡1 0 m i n c 从下至上：6 层滤纸，膜，凝胶，6 层滤纸，赶除气泡，尤其注意 膜扣凝胶之间禁留气泡。擦干多余液体，0 8 m a x 膜面积( c m 2 ) 电流转膜1 5 - 2 h 。 3 )免疫印迹 a 转膜结束，检验m a r k e r 是否已转至膜上5 脱脂奶粉4 。c 封闭过 夜。 b 加一抗( 1 ：5 0 0 ) ，室温摇动2 h 。 c 。t b s t 漂洗3 次，每次1 0 m i n 。 d 加二抗( 1 ：2 0 0 0 ) ，室温摇动1 h 。 e t b s t 漂洗3 次，每次1 0 m i n 。 4 )e c l 检测 a a b 液混合，待膜干后，平铺其上。 b 待反应5 m i n 后，根据荧光强度暗室压片5 s - - 3 0 m i n 。 c 显影1 5 3 0 s ，水洗，定影1 - 3 m i n 。 d 图片扫描和定量 南京医科大学硕士学位论文 ( 十四) 免疫组织化学 1 固定：取e 1 5 5 ，e 1 8 5 、初生、p 1 4 ，p 2 1 扣成年胰腺，4 多聚甲 醛固定1 6 小时以上。 2 脱水：自甲醛中取出标本，放在特制铁筐中，并用自来水持续轻 微冲淋2 小时93 0 酒精中浸泡5 分钟；5 0 酒精中浸泡1 0 分钟； 7 0 酒精中浸泡2 0 分钟98 0 酒精中浸泡3 0 分钟；9 0 酒精中浸 泡3 0 分钟99 5 酒精i 中浸泡3 0 分钟；9 5 酒精i i 中浸泡3 0 分 钟；1 0 0 酒精i 中浸泡6 0 分钟91 0 0 酒精中浸泡1 2 0 分钟； 酒牝甲苯1 ：l 中，浸泡3 0 分钟；二甲苯i 中浸泡6 0 分钟；二 甲苯中浸泡9 0 分钟9 石蜡- - _ , 苯1 ：1 中浸泡3 0 分钟；石蜡1 中浸泡6 0 分钟；石蜡2 中浸泡1 2 0 分钟；石蜡3 中浸泡3 0 分钟。 3 包埋：将铜模具按需要摆放在干净的玻璃板上，倒入融化完全的 石蜡液，马上把组织块从石蜡3 中镊出，浸入模块中，室温下1 4 小时后待蜡干透 4 切片：用特制烙铁铜片融化蜡块一面，并将蜡液滴在蜡浸过的特 制木块表面，迅速将蜡块粘于木块上，将木块固定在石蜡切片机 上即可切片 5 脱蜡：二甲苯3 x 5 m i n ，1 0 0 乙醇1 x 5 m i n ，1 0 0 乙醇l x l m i n ， 9 5 乙醇2 x l m i n ，7 0 l , 醇l x l m i n ，蒸馏水浸泡，洗去乙醇。 6 抗原修复：烧杯中盛放6 0 0 m l 蒸馏水+ 5 6 m l 抗原修复液，将玻 片架于塑料架上，浸入，置微波炉大火3 - 5 r a i n ，一沸腾就调成小 火，1 5 2 0 m i n 。 南京医科大学硕士学位论文 7 抗原封闭：用p b s 配制5 脱脂奶粉滴加，自然冷却后3 0 分钟。 8 抗体孵育：一抗室温孵育1 小时3 0 分( i n s u l i n1 ：3 0 0 ，p a x i l l i n 1 ：1 0 0 ) ，p b s 清洗，二抗室温孵育1 小时( 1 ：1 0 0 0 ) 。 9 显色：按说明书滴加d a b ，染色反应出现后( 约3 m i n ) ，立即用 p b s 或h 2 0 2 终止。 1 0 苏木素复染。 1 1 封片，显微镜观察拍片。 南京医科大学硕士学位论文 第三章结果 一，r n a 的质量分析 大鼠e 1 2 5 、e 1 5 5 、e 1 8 5 、初生及成年胰腺组织r n a 浓度平均 为o 8 鹏，儿o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值均在1 9 - 2 1 之间，电泳显示2 8 s 和1 8 s 两条清晰的条带，后带荧光亮度大约是前带的2 倍，且无明显的拖尾 现象，两者比值约为2 ：1 ，表明r n a 无降解，可用于下一步的基因芯 片检测( 见f i 9 1 ) f i g l ：五个时期大鼠胰腺心i a 变性胶 二，样品代表性及准确性i k - i l 本研究以e 1 2 5 、e 1 5 5 、e 1 8 8 、初生及成年的大鼠胰腺组织为研 究对象，而同一发育阶段的大鼠胚胎往往存在一些差异，这是研究胚 胎发育学最常碰到的问题为此，我们采取扩大样本含量的方法来消 除这种客观存在的差异，即同一孕鼠取至少l o 个胚胎进行混合，以消 除同一发育阶段胚胎之间的个体差异，而每个时间点至少5 只孕鼠进 行混合，以消除同一孕龄母鼠之间的差异通过以上的处理我们可以 认为实验结果代表了某一特定发育阶段胰腺表达谱的特点 为了确保我们取材的准确性，我们用r t - p c r 技术检测各个时期 样品i n s u l i n 的表达情况，以确定我们取材样品是胰腺组织( r t - p c r 结果如f i 9 2 ) r t - p c r 结果显示所取样品中均有i n s u l i n 的表达，因此 2 3 南京医科大学硕士学位论文 我们所取组织为不同发育阶段的胰腺组织，可以用于下游实验。 f i 9 2 ：胰岛素基因在e 1 2 5 ，e 1 5 5 ，e 1 8 5 ，初生和成年胰腺r t - p c r 结果 三，细胞迁移、聚集黏附相关基因在基因芯片中表达变化 m m p s ( m a t r i xm e t a