（遗传学专业论文）snf1a基因转基因果蝇的构建.pdf

摘要 利用模式生物进行基因功能研究是“后基因组时代”一个非常有效的方法。而果 蝇由于具有诸多优点则成为最受欢迎的模式生物之一研究表明，在果蝇、线虫和酵 母中有约2 3 的基因利用传统的缺失突变不能产生表型变化，这一比例在哺乳动物中 可能更高。基因的过量表达或异位表达却有可能提供一些有用的信息。果蝇的g a l 4 一u a s 系统由于其可以控制靶基因在一定的时空高表达成为一个理想的研究基因功 能的工具。 果蝇的s n f l a a m p - a c t f v a t e dp r o t e i nk i n a s e 基因( 简写为翮f ，d ) 从其序列分 析，编码s n f l a a 聍激活的蛋白激酶，参与蛋白质氨基酸的磷酸化过程。进一步的同 源性分析和序列比较提示该基因产物可能在b 一肾上腺素能受体和光受体视紫红质 这两种g 蛋白偶联受体介导的信号传导途径中起着关键作用。然而，关于果蝇s n f l a 基因的功能目前主要还是从其序列的分析中推测得到的。 作者利用显微注射技术构建转基因果蝇，并对其进行检测。先把果蝇s n f l a 基因 构建到p u a s t 表达载体中，利用显微注射技术将构建好的载体注射入果蝇受精卵，得 到转基因果蝇品系，将这些转基因品系定位平衡后，将它们分别与不同的g a l 4 品系 交配，然后利用p c r 和荧光检测以进一步鉴定用果蝇g a l 4 - - u a s 系统研究s n f l a 基因 功能的可行性。 关键讯函刚基因显警岁转琴果蝇；l 4 系 。 a b s t r a c t c o n s t r u c t i o no f s n f l ag e n e t r a n s g e n i cf l i e s a b s t r a c t ：w ec o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tv e c t o ru a s s n f l a g f pw h i c h h a r b o r st h ef u s i o ng e n eo fd r o s o p h i l ag e n es n f i aa n dg f rt h e nw em i c r o i n j e c t e d t h ec o n s t r u c t si n t ot h ee g g so fd r o s o p h i l aa n dg o tt h r e ei n d e p e n d e n tt r a n s g e n i cf l y l i n e s a f t e rb a l a n c i n gt h e s e f l yl i n e s ，w ef u r t h e rc o n f i r mt h ei n t e g r a t i o n o ft h e t r a n s g e n ei n t od r o s o p h i l ag e n o m eb yp c r a n dw ec r o s s e dt h et r a n s g e n i cf l yl i n e s w i t ht h r e ed i f f e r e n tg a l 4 f l yl i n e sr e s p e c t i v e l ya n dd e t e c t e dt h ee x p r e s s i o no ft h e t r a n s g e n eb yu s i n g f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s t h e s e r e s u l t ss h o w e dt h a tw eh a v e s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e df o r e i g ng e n et r a n s g e n i cf l ys y s t e m k e y w o r d s ：s n f l ag e n e ；m i c r o i n j e c t i o n ；t r a n s g e n i cf l y ；g a l 4l i n e s 前言 1 9 9 0 年启动的人类基因组计划带动了大规模测序技术的飞速发展，测序速度 一直呈现加速度增长。在此推动下，人类基因组比原定计划提前4 年得以完成，同 时，多种生物的基因组计划也相继开展并先后顺利完成，其中包括2 0 多种细菌， 以及酵母( 1 2 m b ) 、线虫( 9 7 m b ) 、黑腹果蝇( 1 2 0 m b ) 、拟南芥、水稻等。随着这 些生物基因组序列不断公布于众，人们在为之振奋的同时，也日益感到研究基因功 能的迫切性和必要性。 目前，研究基因功能的方法有许多。比如检测蛋白相互作用的酵母双杂交系统、 d n a 芯片，还有细胞获个体水平上的转基因、基因剔除( k n o c ko u t ) 等技术。尽 管通过生物信息学，体外和细胞水平的研究，可以对基因功能作出初步的推测，但 如果要对其功能进行深入的了解，目前最有效的方法是借助模式生物。尤其值得注 意的是，人类基因组计划完成之后，人们推测人类的基因数目在3 万个左右( j o h n d m c p h e r s o n m a y o m a r r a ，e ta 1 2 0 0 1 ) ，远低于原先的估计，这说明在高等生物中， 基因产物之间的相互作用可能非常复杂。这更加说明对基因功能的研究仅仅停留于 体外或细胞水平是远远不够的，这样所得到的信息是只是非常初步的，有时候，甚 至会于它真正在生物体内的功能大相径庭。因此，在“后基因组时代”，用合适的 模式生物来研究基因功能就显得尤为重要。 在长时间的遗传学探索中，人们已经对酵母、线虫、黑腹果蝇、小鼠等几种生 物做了广泛而深入的研究，建立了深厚的遗传学背景，相应也发展了很多非常有用 的遗传学技术，这些都对我们现在利用它们研究基因功能有很大的帮助。其中黑腹 果蝇由于其诸多优点而成为最常用的模式生物之一。 果蝇属于节肢动物门的昆虫纲，双翅目，d r o s o p h i l i d a e 属。野生型成虫体长 3 - 4 r a m ，淡黄或黄褐色。复眼红色，单眼只能感光，不能成像。口器为舐吸式。果 蝇分为雌雄两性，雌蝇腹部末端光滑而雄蝇则有黑色粒状突出物，且个体比雌蝇小。 果蝇性别决定为x y 型，x 染色体与常染色体数目之比是1 的为雌蝇，比例是0 5 的为雄蝇。到目前为止，d r o s o p h i l i d a e 科共发现有6 i 属，共3 0 2 0 种。其中1 6 7 7 种属于果蝇属，黑腹果蝇种即为我们常说的果蝇，它起源于中非现广泛分布于温暖 地区。果蝇的生活史共分四个阶段：卵，幼虫，蛹与成虫。生命周期比较短，完成 一世代所需时间视种类及生态环境而异( m i c h a e la ，1 9 8 9 ) 。在2 5 。c 时的生活周 期参见下图： 黑腹果蝇的生活史，在2 5 。c 下，整个生活周期只需约1 0 天。 作为模式生物的果蝇有很多适于研究的特点： 1 作为研究历史悠久的生物，果蝇具有深厚的遗传学背景，从缺陷系， 平衡系，唾线染色体图谱到最薪的g a l 4 系，f l p f r t 系统等等都是很有 用的工具。 2 饲养简单，对环境条件要求比较低。 3 生命周期短。世代时间跨度小，在短时间内可完成跨越几个世代的 观察研究。 4 生殖能力强。每只雌蝇在生殖高峰期一般每天产卵1 0 0 个。在其 一生中，一般为7 0 0 1 0 0 0 个，最高可产卵3 0 0 0 个。雄蝇一生可有一万到一 万四千多个后代。因此在短期内可获得大量个体，有利于作筛选突变等工 作o 5 果蝇的基因组较小，仅为人类的1 2 0 。并且只有4 对染色体，易于 分析与操作。 6 果蝇作为真核生物与原核生物相比，基因组的组成与人类更接近。 大约人类基因的8 0 在果蝇中都有同源基因。而且，这种相似性不仅变现 在序列上，更变现在它们的功能上。 7 果蝇幼虫唾液腺具有巨大的多线染色体，便于直接观察染色体畸变 和基因的染色体定位。 8 雄性果蝇中减数分裂过程中不发生重组。 9 果蝇的刚毛、翅脉、复眼等外骨骼结构易受基因突变的影响产生表 型，便于观察( a d a m sm d ，s e k e l s k yj j ，2 0 0 2 ) 。 1 0 现在，针对果蝇的x 染色体、第二与第三染色体都有许多平衡系。 如c y o 和t m 6 系列等。再用另一个与上述致死基因不发生交换重组的致 死基因而平衡就可以永久保存杂和状态的致死品系。这项工作直到最近才 刚能够在线虫中做到，而在小鼠中至今还不能做到。 另外，果蝇作为模式生物还有一个得天独厚的优势，那就是果蝇基因组计划的 完成( a d a m sm d ，c e l n i k e rs e ，h o l tr a ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。果蝇作为模式生物的优秀价 值更加突出。同时，这项工作也成为近百年来果蝇研究的里程碑。通过基于e s t 比较，蛋白同源性对比及生物信息学等工作表明，果蝇、线虫和酵母这三种模式生 物中，有2 0 的果蝇蛋白与线虫、酵母的蛋白有同源保守区。同时，有5 0 的果 蝇蛋白顺序与哺乳动物蛋白有相似性。通过选择人类2 8 9 个致病基因在果蝇中比较 发现，其中1 7 7 个有保守同源区域包括著名的p 5 3 等。这些保守蛋白所覆盖的发育 机制包括细胞形态形成、细胞分裂、信号传导和细胞调亡等等。并且，果蝇与哺乳 动物的相似性不仅体现在诸如转录因予、结构蛋白、信号蛋白等，还牵扯到更复杂 的机制诸如发育、行为、生理反应等等。 这些研究结果进一步证明用果蝇这种模式生物研究基因功能，包括哺乳动物的 基因功能都是可行的，所得到的结果往往是具有普适意义的。 传统上利用果蝇研究基因功能的方法是先人工诱变基因，然后通过检测某一表 型进行遗传筛选( p e r r i m o nn ，1 9 9 8 ) 。早在1 9 2 7 年，穆勒证明离子射线如x 射线 可以造成遗传伤害，如突变：染色体重排等。3 0 年代，又有工作表明可以用x 一射 线来产生染色体缺失与重复。目前人工诱变基因的方法包括电离辐射，化学诱变剂 以及转座因子介导的突变等等。用这些方法获得的基因突变大多数都是功能部分或 完全丧失型突变，只有极少数突变会使基因活性增强，而这类突变对于我们了解基 因功能往往能够提供非常有价值的信息。人工诱变后，人们就可以利用果蝇系统检 测表型进行遗传筛选，正如前面提到过的，果蝇的刚毛、翅脉、复眼等外骨骼系统 均易受基因突变的影响产生表型，除此之外，这种表型还可能是果蝇的生殖能力和 存活率，幼虫和成虫的内部结构和外部结构，肿瘤发生，学习和记忆能力，生物节 律以及行为，神经系统等等。 然而，现在的研究表明，在果蝇、线虫和酵母中约有2 3 的基因利用传统的缺 失突变不能产生明显的表型变化( m i k l o sg l ，r u b i ng m ，1 9 9 6 ) ，这一比例在哺乳动 物中可能更高。因此，通过表型筛选突变的常规方法对这些基因是无效的，而基因 的过量表达或异位表达却有可能提供些有用的信息。如一些同源基因在果蝇中异 位表达后可以造成明显的表型变化。最近，果蝇遗传学发展出的p 因子介导转化技 术和g a l 4 - - u a s 二元表达系统由于其可以控制靶基因在一定的时空高量表达，因 而成为一个理想的研究基因功能的系统。 p 因子是一种转座因子。当将携带有p 因子的雄果蝇p ( p a t e m a l l yc o n t r i b u t i n g ) 与不带有得p 因子( v i r g i ng e n o m e ) 的雌果蝇m ( m a t e r n a l l yc o m r i b u t i n g ) 交配时， 会导致子代不育、高频率的基因突变、染色体重排、畸变等一系列现象，称为杂交 退化( h y b r i dd y s g e n e s i s ) 。而其他形式的交配，如p 品系雌果蝇与m 品系雄果蝇 交配则没有杂交退化。同时，杂交退化所造成的基因突变其回复突变频率也很高， 随后的研究表明这主要是因为p 品系的基因组上的多处特异顺序造成，而m 品系 则没有，这种特异顺序被称为p 因子。许多数据表明，果蝇中最早出现p 因子是在 5 0 年代初，可能是由果蝇的近亲d w i l l i s t o n i 通过螨虫介导水平转移( h o r i z o n t a l t r a n s f e r ) 而来。但是自那以后，p 品系迅速扩散，目前，所有野生群体果蝇中都带 有了p 因子，而m 品系只存在于与自然界隔绝的实验室里( c o a nd ，l e m a i t r eb ， d e l a t t r em ，e ta 1 1 9 9 4 ) 。 p 因子结构见下图： 霉 警i 堇鐾 ；嚣g g i i 罩 l| i 詈 l il 罩 p 因子全长2 9 0 7 b p ，两端有精确的3 l b p 的反向重复序列，而内部还有1 l b p 反向重复序列。有人认为3 l b p 为转座酶的作用位点，但也有研究表明，结合位点 在更内部的位置，并且有1 0 b p 的特异序列，两端大约1 5 0 b p 都为转座所必须。p 因子的有义链含三长一短四个开放阅读框，三个内含子。在生殖系组织细胞中，p 因子转录产物为2 5 k bm r n a ，翻译产物为含7 5 1 个氨基酸，8 7 k d 的转座酶，负责 转座与剪切。而在体细胞组织中，由于其他蛋白于扰转录剪切蛋白与m r n a 作用， 内含子3 不被剪切，所包含的终止密码子终止翻译，因此翻译产物只有6 6 k d ，与 转座酶竞争d n a 结合位点而抑制转座，所以在体细胞中p 因子不能转座。 而作为转基因载体的p 因子经人工改造去除了编码转座酶序列，取而代之的是 标记基因和克隆位点。把外源基因克隆入p 因予载体后，与另一个编码转座酶序列， 但又缺乏末端反向重复序列的辅助质粒一起显微注射进果蝇卵中，这样，在转座酶 的作用下，p 因子将携带外源基因以一定比例整合进果蝇生殖细胞的基因组中。 而辅助质粒本身因缺乏末端反向重复序列而无法整合。旦外源基因整合入果蝇基 因组，且处于染色体可表达区域，其子代就可以方便的由携带的标记筛选出来 ( r u b i nq m ，s p r a d l i n ga c ，1 9 8 2 ) 。 将p 因子应用于转基因载体还得益于研究过程中一个有趣的发现：由于p 因子 转座时d n a 复制错误而导致内部缺失，因此在果蝇的基因组中有很多缺失程度不同 不完整p 因子拷贝。但只要是包含有起始1 3 8 个与最后2 1 6 个碱基尤其是最重要的 3 i 碱基重复序列，这些不完整p 因子就能在有转座酶的情况下，进行依赖性转座。 并且其转座效率比全长的p 因子更高。如果人为地将p 因子内含子3 与末端3 1 碱 基去除，这样在体细胞中仍然可以翻译出8 7 k d 的转座酶支持转座，但本身不能转 座。这些发现为利用p 因子作为转基因工具奠定了基础。1 9 8 2 年，r u b i ng m 与 s p r a d l i n ga s 发表文章，开创了以p 因子作为转基因的载体将外源基因高效转入 果蝇基因组的研究。他们首先尝试将完整的p 因子微注射到m 型果蝇卵的尾部( 将 来发育成极细胞处) 。发现p 因子可以整合八基因组，并且能够翻译出正确的转座 酶，进行转座，造成了果蝇刚毛表型的变化。然后他们又将p 因子内部顺序换上 l o s ) ：基因，保留了p 因子两端的重复序列，采用与完整p 因子共同注射m 型白眼 果蝇的方式来转移外源d n a 。结果表明，在完整p 因子编码转座酶的帮助下，缺陷 p 因子将r o s y 基因带入基因组中。并且这些基因的转入并没有造成明显的基因组 紊乱。这些实验为以后的果蝇转基因工作奠定了坚实的物质基础。 g a l 4 一u a s 系统介绍 g a l 4 u a s 系统是一个二元表达系统o o h a s t o am 19 8 7 ) ，包括g a l 4 品系和 u a s 品系。 g a l 4 是来源于酵母的转录因子，专一识别u a s 启动子并诱导其下游基因表 达。g a l 4 蛋白是果蝇g a l 4 一u a s 系统中一个重要的控制因子。它最初来源于酵 母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 。在酵母的新陈代谢过程中，没有葡萄糖的情况下酵母 可以利用g a l a c t o s e ( 半乳糖) 。通过l e l o i rp a t h w a y 将它转变为6 - 磷酸葡萄糖，然后 进入糖酵解的过程，产生能量。这个过程中涉及到许多基因，包括g a l l 编码激酶、 g a l 7 编码转移酶、g a l l 0 编码差向异构酶、g a l 5 编码变位酶、m e l l 编码q 一 半乳糖酶和g a l 2 编码诱导酶。g a l 4 编码蛋白通过作用于他们编码顺序的上游顺 序u a s ，启动g a l l 7 、g a l i o 、g a l 2 和m e l l 五个基因的转录。 g a l 4 共有8 8 t 个氨基酸，9 9 k d 。包含几个功能域：其中n 端7 4 个氨基酸 为d n a 结合域。转录激活区域。( 9 g a l 8 0 结合区。为核定位信号区。因为 g a l 4 蛋白为胞内翻译，核内作用必有核定位信号。下图表示了g a l 4 蛋白的作用 途径。 g a l 4 蛋白的作用途径 一图 g a l 4 蛋白质所以能够启动其余5 个基因的转录，在于这些基因的上游部分都 含有相同的上游激活序列，称之为u a s ( u p s t r e a ma c t i v a t i o ns e q u e n c e ) ，是g a l 4 蛋白的结合位点。其作用于方向和距离无关。有点类似于高等生物的增强子序列。 每一个u a s 含有数目不同的结合单元，一个结合单元为1 7 个碱基r 顺序为 c g g a g ( c ) g a ( t ) c a c a g g ( c ) a g g c 。例如g a l l 上游有4 个，而g a l 7 则只有2 个。1 7 碱基顺序回文对称，且结合双体g a l 4 蛋白分子。在一般情况下，两个结 合单元会比个结合单元的基因表达量多，但超过两个未必有递增的结果。也有相 反的情况，原因可能是不同的结合单元有不同作用。 1 9 8 8 年，f i s h e r 报道了在果蝇中用g a l 4 蛋白来启动转录的工作。他将g a l 4 基因放在a d hp r o m o t e r 后面，蛋白表达在脂肪体、马氏管、前中肠以及中中肠四个 组织中。在报告基因( l a c z ) 品系中，h s p 7 0p r o m o t e r 之前放进了四个u a s l 7 碱 基顺序的拷贝。通过p 转座予转化进相同的品系中，共做了2 7 个交配，其中在脂 肪体与前中肠都检测到高表达。在另外两组织中也有b - 半乳糖甘酶活性。实验证 明，g a l 4 蛋白在果蝇中同样可以启动转录，这样就为g a l 4 一u a s 系统奠定了基 础。 随后，研究者用“e n h a n c e r t r a p ”( 0 k a n e c j ，g e h r i n g w j 1 9 8 7 ) 方法构建g a l 4 品系。所谓“e n h a n c e rt r a p ”就是将报告基因连接在一个弱的启动子上，这个启 动子弱却足以启动基因表达。然后通过p 因子介导随机插入，如果恰好位于某一基 因的转录增强子附近，那么报告基因的表达就会受此基因增强子的控制而展现一种 与之相同的时空方式。通过这种方法就可以猎取许多不同的增强子( e n h a n c e r ) ， 建立不同的品系，每种品系中报告基因有不同的表达方式。然后可以用质粒拯救 ( d l a s m i dr e s c u e ) 的方法来克隆此基因( r o b e r td b 1 9 9 8 ) 。1 9 8 8 年，f i s h e r 报 道了在果蝇中利用酵母g a l 4 蛋白来控制启动转录的工作( f i s c h e rj a ，g i n i g e r e ，e ta l 1 9 8 8 ) 。可以建立一系列的g a l 4 品系，每个品系在不同的时间和空间表达g a l 4 蛋 白，通过大规模的e n h a n c e rt r a p ，再用g a l 4 的单克隆抗体来标记。也可用u a s 一 报告基因来观察g a l 4 蛋白的表达情况。虽然后者要比抗体标记复杂一些，但它更 大程度的反映了异位表达目标基因的情况。最常用的报告基因如l a c 基因、g f p 蛋 白等。目前已有6 0 0 多种g a l 4 果蝇品系可供使用，如受热诱导表达的热休克g a l 4 ( h s - g a l 4 ) ，增殖中的眼芽( e y ei m a g i n a ld i s c ) 细胞专一的e y e l e s s g a l 4 ( e y 一 6 a l 4 ) ，分化的眼细胞专一的6 m r - g a l 4 ，运动神经元专一表达的d 4 2 一g a l 4 等等。 显然，另一项重要的工作就是建立u a s 品系。把u a s 启动子序列通过p 因子 介导转座随机插入果蝇基因组中，如果其正好位于某内源基因上游，该基因地表达 就可以受g a l 4 调控( r o r t hr1 9 9 6 ) 。亦可将外源基因构建到含5 个g a l 4 蛋白结合 位点的p u a s t 上。最好目的基因带上标签( t a g ) 以区分内源蛋白与外源蛋白。由 于位置效应，不同的插入位置会表现出不同的表达水平，因而有必要保存多一点的 转基因品系来选择所需的表达水平。与不同平衡系交配后能稳定遗传的品系就可以 与不同的g a l 4 系交配，使目的基因在特定的时间和空间表达，在子一代中就可以 通过检测标签是否存在、蛋白抗体、原位杂交检测m r n 等方法来观察基因表达的 情况，再进一步通过观察表型变化或其他的工作就可以分析该异位表达基因的生物 功能。 由于u a s 品系果蝇和g a l 4 品系果蝇是相互独立的，在g a l 4 品系中，g a l 4 蛋 白组成型表达，但并没有其识别的启动子u a s 存在。在u a s 品系中，靶基因在没有 g a l 4 蛋白存在的情况下是沉默的。因此，用该系统也可以来研究那些过量表达致 死的基因，而以前如何研究这些基因一直是让研究者头痛的问题。 当然g a l 4 一u a s 系统也仍然存在一些应用上的局限性。例如如果g a l 4 蛋白不能 及时降解，就会延长激活时间，这样就会对分析某些基因功能，特别是在研究某些 基因的时间效应时造成困难。此外，由于g a l 4 蛋白高表达目的基因，某些情况下 可能造成大量表达的蛋白影响它在细胞内的正常定位，甚至出现阻遏现象。如果由 于表达的g a l 4 蛋白量还不足以达到能激活u a s - 目的基因的量，目的基因的表达就 会出现滞后效应等等。 不过，通过人们对g a l 4 u a s 系统进行某些改进，有些局限性还是可以克服 的。例如利用酵母中g a l 4 蛋白的负调控因子g a l 8 0 来调节g a l 4 的表达量。不仅如 此，人们还不断发展g a l 4 u a s 系统使其适应于不同的研究需要。如利用同源的 温度敏感型g a l 4 蛋白来做条件依赖的研究；以及用v p l 6 的激活域来替代g a l 4 蛋 白的激活域就可以避免在果蝇卵形成的3 - 4 小时之前g a l 4 蛋白不能表达的情况； 还可以通过表达毒性基因如r i n i n a 或r e a p e r 基因来定点致死某些细胞。还有一个 非常重要的发展就是与f l p f r t 系统结合( g o l i ck g ，l i n d q u ( s ts ，1 9 8 9 ) ，在此系统 中u a s 与目的基因之间被f r t 所阻隔，不能表达，只有通过热激启动子启动f l p 重 组酶的表达才可以使f r t 顺序之间发生重组，u a s 与基因之间的顺序被剪切掉，目 的基因才可以表达。 一个经典的利用g a l 4 - u a s 系统研究基因功能的例子是h a l d e r 等的工作( h a l d e r g ，c a l l a e r t s 只g e h r i n gw j 1 9 9 5 ) ，他们将e y e l e s s 基因异位表达在果蝇的触角、翅 膀、腿等处，结果在这些位置出现了异位表达的限，并且证明这些异位表达的眼在 形态上是完全正常的，包括完全分化的小眼与整套的感光细胞，从而成功地验证了 基因是果蝇复眼发育的一个主导基因。而当利用p g m r - g a l 4 品系将杆状病毒p 3 5 表达在果蝇复眼中( b 。n i n in m 2 0 0 0 ) ，使复日i 发育过程中原来程序性死亡的细胞 继续存活，从而推测p 3 5 也许通过激活一个平行途径来抑制细胞死亡。 删基因 g 蛋白偶联受体介导对细胞外的很多类型的刺激做出反应，这些胞外刺激包括荷 尔蒙、神经递质、多肽、气味、以及光等。这些受体通常在结构上有以下几个共性： 均包括7 个可能的穿膜域；在受体分子的c 末端( 位于细胞质内) 有聚积的丝氨酸 苏氨酸残基；在细胞质内第二个和第三个环状结构之间e h - - 硫键连接。 g 蛋白偶联受体超级家族至少已发现1 0 0 多个成员( p i t c h e rj a ，f r e e d m a nn j ， l e f k o w i t zr j1 9 9 8 ) 。其中b 一肾上腺素能受体和光受体视紫红质是相对研究的最清 楚的。通过体外对这两种受体的激活和失活实验表明，快速失活这些受体需要a t p 。 同时，当这类受体被离子或光激活时，会激活其下游的种特定激酶，该激酶能够磷 酸化受体分子的c 末端聚积的丝氨酸苏氨酸残基。尽管磷酸化本身只会导致受体 活性轻微的下降，但磷酸化还会使得受体成为与抑制蛋白( a r r e s t i n ) 高度亲和的底 物。而抑制蛋白的结合可以阻止受体与g 蛋白偶联，从而将原处于活性状态的受体关 闭。 负责将活性的口一肾上腺素能受体和光受体视紫红质磷酸化的激酶分别是口一 肾上腺素能受体受体( b a r k ) 和视紫红质激酶( r o k ) 。体外的生化实验发现一个有趣 的现象，即b 一肾上腺素能受体和光受体在激活状态肘均能够被对方的激酶磷酸化， 尽管亲和力要差一些。 综上所述，在g 蛋白偶联受体的c 末端存在潜在的磷酸化位点，并且，磷酸化受 体可以使受体失活，这些实验证据揭示g 蛋白偶联受体激酶( g p r k s ) 是一个丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶家族。 虽然通过分子水平的体外实验，无论在脊椎动物和非脊椎动物中都已经发现了很 多参与g 蛋白信号传导的细胞内成分，但对该途径的体内过程仍知之甚少。 在这里，作者选取了果蝇的s n f i a a m p - a c t v a t e d p 2 o r e i nk i n a s e 基因( 简写为 毋协( c a s s i l lj a ，w h i t n e ym ，j o a z e i r oc a ，e ta 1 1 9 9 1 ) 。从其序列分析，该基因编码 s n f l a a 卿激活的蛋白激酶，参与蛋白质氨基酸的磷酸化过程。其氨基酸序列包括一 个真核生物蛋白激酶和一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族活性位点。在酿酒酵母、 线虫、小鼠、大鼠以及人类的基因组中均发现与s n f i a 基因类似的序列，提示s n f l a 是一个比较保守的基因。进步的同源性分析和序列比较提示该基因产物可能在f 3 一 肾上腺素能受体和光受体视紫红质这两种g 蛋白偶联受体介导的信号传导途径中起 着关键作用。然而，关于果蝇s n f i a 基因的功能目前主要还是从其序列的分析中推测 得到的。 材料与方法 一材料 1 果蝇品系：白眼品系：w 1 1 1 8 平衡系：，w ? a d v c y o , s b t m 6 b 黄体，白眼，翘翅且多翅脉，刚毛短粗，肩上刚毛成簇 y w ? a d v c y o 黄体，白眼，翘翅且多翅脉 y w ? s b t m 6 b 黄体，白眼，刚毛短粗，肩上刚毛成簇 y w ef m 7 c f m 6 c 黄体，白眼，棒状眼 g a l 4 品系：e y g a l 4 a c t i n g a l 4 p g m r g a l 4 所有果蝇品系都在2 5 c 下培养在维持培养基上。 2 菌种与载体：d h 5q 基因型s u p e 4 4 h s d r l 7 r e c a l g y r a 9 6 t h i - i r e l a l 克隆有s n f l a 基因的质粒，质粒p o a s t 、p ( 2 - 3 ) 均 由耶鲁大学副教授，复旦大学客座教授许田提供。 p e e p n 2 为p r o m e g a 公司产品 3 引物：s n f i a 基因引物 ( + ) 5 g c g g c g a a t t c t g g c g t g g a c t a t t g c ： ( 一) 5 a t c a g g a t c c a g c g a g c c a g t t g a a t g 。 引物由上海生工生物公司合成。 4 培养基： l b ( 1 l ) ：y e s a t e x t r a c t5 9 t r y p t o n e1 0 9 n a c i1 0 9 n a o h 调节p h 值至7 0 x l l ) ：y e a s t e x t r a c t5 9 t r y p t o n e2 0 9 m g s 0 42 4 4 9 k c l 0 7 6 9 k o h 调节到p h 值至7 6 果蝇玉米培养基 果蝇苹果培养基 常用试剂： 玉米粉6 2 9 蔗糖5 8 9 琼脂粉7 9 酵母粉8 9 丙酸 4 m l 水8 0 0 m l 琼脂粉2 9 蔗糖1 2 5 9 苹果汁2 5 m l 水7 5 m l ( 1 ) t e ( p h 8 0 1 ：l o m m o l lt r i s c i ( p h 8 0 ) 0 1 m m o l le d t a ( p h 8 0 1 质粒碱法抽提试剂溶液i 、i i 、i i i ，5 0 x t a e 等试剂配方都可参见分 子克隆 试剂盒：m i d ip r e pk i t 、凝胶回收、p c rp u r i f i c a t i o n 试剂盒均购自 g i a g e n 公司 ( 2 )显微注射缓冲液4 b u f f e r ：5 mm k c i ，o 1 m m a h 2 p 0 4 p h 6 8 除卵壳处理液：白猫漂水5 0 ( 上海白猫有限公司) a m p ：1 0 0 m g m l ( 华美生化试剂公司) 限制性内切酶： e c o r l 、x b a i 、n o ti 、b a m h i 等购自b i o l a b 公司 r n a s e a d n a t a q 、i o x p c r b u f f e r 、m g c l 2 、d n t p 等购自p r o m e g a 公司 t 4d n a 连接酶购自b i o l a b 公司 主要仪器与设备 c d i c x d s i b 型倒置显微镜及恒温装置 p n - 3 型拉针仪( n a r i s h i g es c i e n t i f i c i n s t r u m e n tl a b 公司) m p - 1 显微注射仪( n a r i s h i g es c i e n t i f i c i n s t r u m e n tl a b 公司) 显微注射用针( w o r l dp r e c i s i o ni n s t r u m e n t sg 1 b ss lb b lw f i l 1 o m m4i n i t e mn o 1 8 1 0 0 f 一4 ) p c r 仪p c r 扩增仪g e n e a m p p c rs y s t e m 2 4 0 0 ( 美国p e r k i ne l m e r 公司) b i o f u g e1 5 r 高速台式冷冻离心机( 德国h a r a e u s 公司) 2 0 p r 一5 2 d 高速冷冻离心机( 日本h i t a c h i 公司) 6 t g l 一1 6 高速台式离心机( 上海医用分析仪器厂) p s5 0 0 x td c 电泳仪( 美国h o e f e r s c i e n t i f i ci n s t r u m e n t s 公司) f s - - 3 1 2 ( v ) 多功能紫外投射分析仪( 上海复生生物工程研究所) 电热恒温水浴锅( 上海医疗器械五厂) s h z 一8 2 型水浴恒温振荡器( 江苏省太仓医疗器械厂) h w 一8 b 型超级微量恒温器( 浙江省永嘉分析仪器厂) 隔水式电热恒温培养箱( 上海市跃进医疗器械厂) s c s - 2 4 摇床( 上海市离心机械研究所) d h g - - 9 1 4 0 a 电热恒温鼓风干燥箱( 上海医用恒温设备厂) 分析软件： s m a r tv i e 一生物电泳图像分析软件( 升级版) ：上海复日科技有限公司 d n a s t a r i ) n aa s s i s t a n t p r i m e r 方法 一总体实验规划 到妾入p e g f p n 2 ，形成融合基因 0 构建u a s s n f l a g f p 质粒 二实验方法 1 构建u a s s n f l a g f p 质粒 11p c r 扩增s n f l a 基因的0 r f 并在其两端分别加上e c o ri 和b a m l ti 酶切位 点 p c r 体系( 2 5u1 ) ；l o b u f f e r2 5 9 l m g c l 2 ( 2 5 r e t o o l l ) 2 9 l d n t p ( 2 5 m m o l l ) 2 b l 引物( 2 0 n m o l l ) 正向o 5 9 l ， 反向o 5 t a l t a q r l u g l ) 0 3 9 l 模板质粒( 1 n g 肚) 1 乩 d d h 2 0 1 6 2 1 a l p c r 反应程序：9 5 c 解链4r a i n ， 9 4 c 变性3 0s ，6 5 c 退火4 5 s ，7 2 c 延f 申1m i n ，共3 5 个循环 7 2 c 延伸1 0r a i n ，反应终止。 p c r 产物用1 a g a r o s e 电泳并用q i a g e n 公司g e le x t r a c t i o n 回收 1 2 连入p e g f p n 2 质粒，构建融合基因 p c r 产物纯化后与纯化的p e g f p n 2 质粒分别用e e o ri 和b a m hi 双酶 切，于1 6 c 连接过夜，电击转化后，鉴定所得转化予，命名为p e g f p n 2 一s n f l a g f p 。 1 3 连入p u a s t 质粒 将p e g f p n 2 一s n f l a g f p 质粒与p l j a s t 质粒分别用e e o ri 和n o ti 双 酶切，连接，电击转化，鉴定所得转化子，命名为u a s s n f l a g f p 质 粒。将u a s s n f l a g f p 质粒用q i a g e n 公司的m i d ip r e pk i t 中抽， 得到浓度和纯度都比较理想的质粒( 浓度l p g “1 ) 另用0 i a g e n 公司的m i d ip r e pk i t 中抽编码转座酶的辅助质粒a 2 3 ， 以备显微注射用。 关于质粒制备、连接、转化等操作详见分子克隆。 u a s s n f l a - - g f p 质粒构建路线可见下图： 克隆有s n f l b , 基因c d n 的质粒g h l 2 5 9 6 上p c r 加上e c 0 r i 和b 础i 酶切位点 p c r 产物p e c , f p - n 2 质粒 u a s s n n a 一鲫 s n f l a a f p 注释：s n f l a 基因蛋白编码序列为1 4 4 1 b p ；g f p 编码序列为7 1 7 b p p e g f p n 2 质粒为4 7 4 0 b p ；p u a s t 质粒为9 0 4 5 b p 2 显微注射 2 1 配制溶液 2 1 1 配制显微注射液( 2 0 p l ) ：u a s s n f l a g f p 质粒( 1 1 t g l a l ) 6 p l ， a 2 3 辅助质粒( 0 8p g 9 1 ) 5 u l ( x 2 3 为人工改造 过的果蝇p 因子，编码转座酶) 显微注射缓冲液4 b u f f e r5 p t l ， d d h 2 04 仙l 2 1 2 卵壳处理剂( 5 0 m 1 ) ：新鲜自猫漂水2 5 m | d h 2 0 2 5 m l 2 1 3 矿物油( 9 m 1 ) ：7 0 0 # 重油6m l 2 # 轻油3 m l 2 2 显微注射针的制备 2 2 1 用拉针仪准备8 根显微注射用针。 2 2 2 在煤气灯上将毛细管拉成细针。 2 2 3 此针内吸入配好的一定浓度d n a 溶液。 2 2 4 把此针尖从显微注射针尾部插入，在每根显微注射针尖端灌入约l ”l 盟 氓一 堕 显微注射液。 2 2 5 将注射针装于注射装置上，适当调节针的高度，在倒置显微镜下用载玻片边 缘轻撞玻璃针使其尖端开口，可见有液体外流。排出气泡，并浸于矿物油中。 2 2 6 其余暂时不用的显微注射针用蜡膜封住注射针的尾部，以一定倾斜角度搁置 于橡皮泥支架上，利用重力使针内溶液全部流入注射针针尖部分。并置于1 8 环境中。 2 3 显微注射卵的采集、准备 2 3 1 上午将大量w “”果蝇( 最好龄长为3 天，至少2 0 0 只) 置于一次性杯中， 盖上果蝇苹果培养基培养皿，p a r a f i l m 封住衔接处，倒置于2 5 。c 环境中适 应数小时。 2 3 2 于准备注射前4 5 m i n 换上一块新鲜的苹果培养基培养皿，倒置。 2 3 3 卵的收集及处理：在产卵培养基上倒入d h 2 0 ，用毛笔轻刷表面，使卵浮起， 倒于尼龙膜中，再淋洗一遍也一并倒入。用d h 2 0 冲洗卵，除去卵表面的酵 母。卵在5 0 白猫漂水中浸泡9 0 s ，用d h 2 0 反复冲洗，彻底除净卵表面的 漂水。 2 3 4 用滤纸吸干，将卵粘附于苹果培养基的背面。 2 3 5 在培养基上以一条划线为基准排卵，卵的头尾要排列方向一致。特别注意 要挑选颜色均一的、未分化的卵来排。该步骤最好在1 2 r a i n 内完成。 2 3 6 将排好的卵用双面胶粘于盖玻片上，放入放有硅胶的瓶中干燥8 r a i n ，取出， 然后滴矿物油将卵覆盖，防止卵干燥致死。 2 4 显微注射 2 4 1 显微注射针从卵尾部( 极细胞处) 刺入深度约为卵的l 5 一l 4 。注射时针 的末端加压，一直呈液体外流状态。针可在卵中停留l 2 1 s 。可见注射局 部浆质变淡。注入d n a 后迅速退出，再注射下一个卵。需要注意的是， 如果发现有已经分化的卵要刺穿杀死。 2 4 2 注射完成后，在解剖镜下去除那些未注射的卵，并且将卵的流出物刮除。 2 4 3 将注射后的果蝇卵放在盛有琼脂培养基的大培养皿中，用油覆盖 整个玻片。1 8 放置7 2 小时等待幼虫孵化。 2 l 3 转基因果蝇筛选 在注射后的3 6 至7 2 小时之间挑幼虫，转移入果蝇玉米培养基，平均每5 0 只 幼虫一瓶。1 8 放置3 4 天后，置于2 5 ，这段时间幼虫逐渐结茧 并开始羽化。及时挑出羽化的果蝇成虫雄蝇和处女蝇分别与w 8 品 系的处女蝇和雄蝇按1 ：3 的比例回交。置于2 5 ，约l o 天后可观 察其子代。在子代中红眼果蝇即为转基因果蝇。 显微注射及转基因果蝇筛选过程可见下图： 攥蠖m 砷一叫一m 一 6w h i t e n早w m t e + 8，妒 脚 懿”熊 匍 d o r 枷 p d a n e n t f d ”m 呻转 。燃h t l p t v p e l e 髀m e n t 熏攥曛寨鬃攥蘸 ( m m s f m m e d ) s u m m a wo f t h e t r a m f e o n a t i o n l x q o c o l m i n t ；4 p l a * m i dc a r y l n 8 w h i t e + t r a n s f o i t m l n 0f l i e s 4 转基因果蝇的平衡、定位 得到的红眼果蝇( 即转基因果蝇) 品系必须平衡、定位，才便于品 系的稳定保存和进一步研究。方法如下： 挑红眼果蝇雄蝇与a d v c y o 处女蝇交配，如果f l 代出现性别分离 现象，即所有雌蝇均为红眼，所有雄蝇均为自眼，则p m i