（遗传学专业论文）农杆菌介导的gna基因对杂交稻亲本的遗传转化及分析.pdf

复旦大学博上论文 摘要 世界范围内，虫害造成的直接损失约占粮食总收获量的1 5 以 ：，同时害虫 作为病毒载体又加重植物的病害，从而僮产量损失更大。水稻是我旧最晕要的粮 食作物，杂交稻的推广和应用大幅度地提高了水稻的单产，但部分亲本却w 划稻 飞虱敏感丽受到虫害的威胁。传统的抗虫育种也面临很多困难寸本研究建妒r 农 杆菌介导的水稻转化体系，构建了用于转化的三个双元载体并将褐1 5 i 虱抗。p l ：堆闪 ( 雪花莲凝集素基因，础因) 导入三个水稻品种，得到了大孱转基闪植株： 对转基因植株进行了分子生物学及生物学鉴定，同时对外源基因神擀基冈植株段 其后代中的遗传情况进行了研究。结果表明：g n a - 基因已整合入水稻基i 对纰l i ) 并 得到了稳定表达：转基因植株具有明显的抗虫性；外源基因能通过有性结典遗传 给后代，大部分转基因植株的遗传符合孟德尔规律。( 具体结果如h 一、几种处理对水稻植株再生的影响 试验了愈伤组织再生植株前高渗、干燥及提高培养基r f l 的植物凝胶 ( p h y l a g e l ) 浓度等几种处理对再生的影响，结果表明：再生前在j j n 3 l i i 梨醇的 培养基上高渗处理愈伤组织2 3 周可以使胚性细胞的发生频率提高2 0 ，使植株 再生频率提高2 3 倍；再生前进行4 5 分钟的快速干燥可以使再生频率提高5 0 ， 而再生前2 天的缓慢干燥则可以使再生频率提高2 3 倍；再生培养基中不同的植物 凝胶含量对再生的影响很大，愈伤组织在含0 3 5 植物凝胶的培养基i 1 比存禽 0 2 5 植物凝胶的培养基( 对照) 中再生植株的频率提高2 3 倍，而采用含0 5 植 物凝胶的培养基可使愈伤组织再生植株频率比对照提高5 6 倍，在供试的一i 个，】j ； 1 种( 鄂宜1 0 5 、n 5 0 8 8 s 和培矮6 4 s ) 中均获得这一结果。 二、农杆菌双元载体的构建 选用p c a m b i a l 3 0 0 及p w b v e c 8 两个双元载体，其中p w b v e c 8 所含的潮癣素 抗性基因内含一个内含子。分别将r s s l - g n a - n o s u b i q i u t i n - g n a n o s 入 p c a m b i a l 3 0 0 、将r 醯j 谬蝴胡插入p w b v e c 8 ，获得用于转化的禽言埘摹闪的双 元载体；并将以上载体分别转入农杆菌系l b a 4 t 4 0 4 a s g a g l 0 ，用于水稻的转化研 究。 i l 壅堑堕坌量墼鲤! 苎里盟塑奎塑童查箜垫焦壁些垦坌堑 一一一一 三、转基因植株的获得 以愈伤组织及幼胚为受体进行基因转化，最终获得大量转基闪水稻植株t 包 括2 4 0 株n 5 0 8 8 s 、2 4 株培矮6 4 s 及2 0 株鄂宜1 0 5 转基因植株。 四、对转基因植株的分子验证及抗虫性鉴定 1 ) 对转基因植株的s o u t h e r nb l o t 及w e s t e r nb l o t 分析 以非转基因植株d n a 为阴性对照，质粒d n a 为阳性对照，对转綦植株 进行s o u t h e mb l o t 和w e s t e mb l o t 分析，结果显示：外源觥闪已整合入受 体基因组，并能检测到麒因的表达。 2 ) 对转基因植株的抗虫性鉴定 以非转基因植株为阴性对照，检测转基因水稻对灰飞虱的抗性，结果裎 示转基因水稻植株具有明显的抗虫性。 五、外源基因在转基因植株后代中的遗传分析 以选择标记潮霉素( h y g r o m y c i n ) 基因对潮霉素的抗性为标、匠，对l o 株不同 的转基因植株后代( r i 代) 进行分离鉴定，并对其中三个株系进行p c r 分析。缔 果表明：供试株系的遗传均符合盂德尔规律。 抗稻飞虱转基因杂交稻亲本的获得为培育抗稻飞虱杂交稻组合打f 了拱 础，在理论和实践上都具有重要意义。j 关键词：杂交稻y 雪花莲凝集素基因鲤畦蓟基因转化，转基因植株y 抗虫性 i i l a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o no fr i c eh y b r i dp a r e n t a l a b s t r a e t l i n e su s i n g s n o w d r o p l e c t i ng e n e ( g n a ) d i r e c ty i e l dl o s s e sd u et op e s t sh a v eb e e ne s t i m a t e da t 】5 o ft o t a jc e r e aj c r o p p r o d u c t i o nw o r l d w i d e f u r t h e r m o r e t h ey i e l d1 0 s s e sa r ee x a c e r b a t e dd u e t ot h ei n s e c t p e s t sa c t i n g a sv e c t o r sf o r a g r o n o m i c a l l yi m p o r t a n t v i r u s e s r i c ei st h em o s t i m p o r t a n tc e r e a lc r o pi n c h i n a r i c ep r o d u c t i o nh a sb e e ng r e a t l yi m p r o v e db yt h e a p p l i c a t i o no fh y b r i dr i c e h o w e v e r s o m ep a r e n t a ll i n e so fh y b r i dr i c ea r es e n s i t i v et o r i c e p l a n t h o p p e rt h a t t h r e a t e n sr i c e p r o d u c t i o n i nt h ep r e s e n ts t u d y ，a n e f f i c i e n t a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dr i c et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e d b yt h eu s eo f3 c o n s t r u c t e db i n a r yv e c t o r sh a r b o r i n gt h es n o w d r o pl e c i ng e n e ( t h eg n ag e n e ) ，f ll a r g e a m o u n to ft r a n s g e n i cr i c ep l a n t sf r o m3 r i c ev a r i e t i e sw e r ep r o d u c e d m o l e c u l a r a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h eg n ag e n ew a si n t e g r a t e di n t or i c eg e n o m ea n dt h et r a n s g e n e w a si n h e r i t e di n t or 1p r o g e n ya sam e n d e l i a np a t t e r n t h ee x p r e s s i o no fg n ai n t r a n s g e n i cr i c ew a sd e t e c t e da n di n s e c tb i o a s s a yr e s u l t ss h o w e dt r a n s g e n i cp l a n t s e x p r e s s i n gg n a h a de n h a n c e dr e s i s t a n c et op l a n t h o p p e r 1 1 1 em a i nr e s u l t sp r e s e n t e d i nt h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s 1 t r e a t m e n t si n f l u e n c i n gp l a n tr e g e n e r a t i o n s e v e r a lf a e t o r si n f l u e n c i n gp l a n tr e g e n e r a t i o nf r o mc a l l u s e sw e r ei n v e s t i g a t e d i n c l u d i n gp r e c u l t u r e o fc a l l u so nh i g ho s m o t i c u mm e d i u m ，d e h y d r a t i o no f c a l l u sb e f o r ep l a n tr e g e n e r a t i o na n di n c r e a s i n g p h y t a g e l c o n c e n t r a t i o n si n r e g e n e r a t i o nm e d i u m r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r e c u l t u r eo fc a l l u so nh i g h o s m o t i c u m m e d i u m ( m s 2 + 3 s o r b i t 0 1 ) b e f o r ep l a n tr e g e n e r a t i o nf o ra b o u t2 - 3 w e e k sc o u l di n c r e a s et h ee m b r y o g e n i cc a l l u sp r o d u c t i o no f2 0 a n di r e p r o v e p l a n tr e g e n e r a t i o n o f2 3t i m e s h i g h e rc o m p a r e d t ot h ec o n t r 0 1 f a s t d e h y d r a t i o n t r e a t m e n to fc a l l u sf o r4 5m i n u t e sb e f o r e t r a n s f e r r i n g t o r e g e n e r a t i o nm e d i u mi n c r e a s e dp l a n tr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yf o ra b o u t5 0 w h i l es l o wd e h y d r a t i o no fc a l l u sb e f o r et r a n s f e r r i n gt or e g e n e r a t i o nm e d i u m i m p r o v e dp l a n tr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c y2 - 3 t i m e sb i g h e rc o m p a r e dt ot h e c o n t r 0 1 t h ec o n c e n t r a t i o n so f p h y t a g e la sas o l i d i f y i n gr e a g e n ti nr e g e n e r a t i o n m e d i u ma l s oi n f l u e n c e dp l a n tr e g e n e r a t i o n p l a n t r e g e n e r a t i o nw a sh i g h e rw h e n c a l l u s e sw e r ec u l t u r e di nt h em e d i u mc o n t a d n i n g0 ，3 5 p h y t a g e lt h a nj nt h e m e d i u mc o n t a i n i n g o 2 5 p h y t a g e l t h e u s eo fo 5 o fp h y t a g e li nt h e r e g e n e r a t i o nm e d i u mc o u l di m p r o v ep l a n tr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c y5 - 6t i m e s h i g h e rc o m p a r e d t ot h ec o n t r 0 1 t h e s er e s u l t sw e r ec o n s i s t e n ti na l lt h et e s t e d3 v a r i e t i e s 。 2 c o n s t r u c t i o no f b i n a r y v e c t o r si na g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dr i c et r a n s f o r m a t i o n r s s 1 - g n a - n o sf r a g m e n tw a si n s e r t e dj n t ot w ok i n d so fb i n a r yv e c t o r s ，n a m e l y p c a m b i a l 3 0 0a n dp w v e c 8r e s p e c t i v e l y w h i l eu b i q i u t i n - g n a - n o sf r a g m e n t w a si n s e r t e di n t op c a m b i a l 3 0 0 t h ec o n s t r u c t c db i n a r yv e c t o r sw e r et h e n t r a n s f e r r e di n t oa g r o b a c t e r i u ms t r a i nl b a 4 4 0 4o ra g l 0a n dt h er e s u l t i n g s t r a i n sw e r eu s e di nr i c et r a n s f o r m a t i o ns t u d y 3 p r o d u c t i o no f t r a n s g e n i cr i c ep l a n t s t r a n s f o r m a t i o no ft h r e er i c ev a r i e t i e s ( n 5 0 8 8 s p e ia i6 4 sa n de y il0 5 1w a s c o n d u c t e du s i n gc a l l u s e sa n di m m a t u r ee m b r y o sa sd o n o re x p l a n t s t r a n s g e n i c p l a n t sw e r ep r o d u c e di n c l u d i n g2 4 0f o rn 5 0 8 9 s 2 4f o rp e ia i6 4 sa n d2 0 p l a n t sf o re y i l 0 5 4 m o l e c u l a r a n a l y s i sa n d i n s e c tb i o a s s a yt e s to f t r a n s g e n i cp l a n t s t r a n s g e n i c r i c e p l a n t s w e r e a n a l y z e db y s o u t h e r nb l o ta n dw e s t e r nb l o t r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg n a g e n ew a si n t e g r a t e di n t or i c eg e n o m e a n dw e s t e r n b l o tc o n f i r m e dg n a e x p r e s s i o ni nt r a n s e g n i cp l a n t s b i o a s s a yr e s u l t ss h o w e d t h a tg n a e x p r e s s i n gr 1p l a n t sh a de n h a n c e dr e s i s t a n c et or i c el i t t l eb r o w n p l a n t h o p p e r 5 i n h e r i t a n c eo f t h e t r a n s g e n e si nt r a n s g e n i cr i c ep r o g e n y s e g r e g a t i o no f r 1p r o g e n yd e r i v e df r o m10i n d e p e n d e n tt r a n s g e n i cp l a n t sw a s a n a l y z e db yg e r m i n a t i n gs e e d si nh y g r o m y c i n c o n t a i n i n gm e d i u mo rb yp c r a n a l y s i s r e s u l t s s h o w e dt h a t t r a n s g e n e s i n h e r i t e di n t or 1 p r o g e n y a s m e n d e l i a n3 ：l s e g r e g a t i o np a t t e r n t h e p r o d u c t i o n o f t r a n s g e n i c r i c e h y b r i dp a r e n t a l l i n e sr e s i s t a n tt or i c e p l a n t h o p p e rp r o v i d e sa b a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n to fe o m m e r e i f l p l a n t h o p p e r r e s i s t a n t h y b r i dc o m b i n a t i o n s ，w h i c hi ss i g n i f i c a n ti nb o t hr e s e a r c ha n da p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：h y b r i dr i c e ，s n o w d r o pl e c t i n g e n e ( g n a ) ，a g r o b a c t e r m n v m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ，t r a n s g e n i cr i c e , i n s e c tr e s i s t a n c e v 致谢 本论文是在我的导师谈家桢教授，唐克轩教授的关心和指 导下完成的，感谢他们对我的鼓励、教诲和关怀指导。他们渊 博的学识和严谨的治学态度令我获益匪浅并将受益终身。 特别感谢沈大棱教授、杨金水教授、曲志才博二e 、黄建牛 博士、孙小芬老师和叶鸣明老师对我的指导和帮助。 感谢郝峥嵘博士、刘庆法博士、周伟国博= 卜、沈先荣博：卜、 赵凌侠博士、左开井博士及赵恩鹏、刘琼明、郑培和、卜子斌、 张红宇、庞永珍、费炯、许虹、窦同海、陈慧、孙建龙、兰和 魁、王东、张宏伟、曹清玉、张晓宁、白逢伟、蒋道军、万由 衷等同学给我帮助；感谢上海交大的潘重光老师及赵艳同学给 我的帮助。 最后感谢温孚江老师、郑成超老师、邢金亮老师及我的家 人和女友对我的关爱、支持和鼓励。 复旦大学博士论文 壅堑堕坌昱塑旦! 薹堕塑垄窑塑塞查盟望堡壁垡壁坌堑一一 一、植物抗虫基因工程研究进展 目前，植物抗虫基因工程中，己被广泛应用的抗虫基因有四类： 。类是柬n 细菌苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s i n s e c t i c i d a l c r y s t a lp r o t e i ng e n e ) ，简称b t ，毒蛋白基因f 4 j ：第二类为植物外源凝集素( j e c t i n ) 螭 因) ；第三类为植物蛋白酶抑制剂基因( p r o t e i n a s ei n h i b i t o rg e n e ) 1 5 , 6 1 ；此外还干淀 粉酶抑制剂基因等其他基因【7 , 8 1 。 1 1b t 毒蛋白基因 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) ，是一种非常重要的昆虫病原菌一f ，能 产生多种有杀虫活性的毒素，如：蛋白质晶体毒素、耐热性外毒素、卵磷脂酶c 等，现在为人们广泛应用于基因工程的是蛋白质晶体毒素即蛋白质晶体毒蛋n 。 苏云金杆菌在生长后期于芽孢形成的同时能形成一种菱形或其它形状的蛋l i 质 结晶体，对昆虫主要是鳞翅目类昆虫具有很高的毒性。完整的晶体并不具毒忭， 伴孢晶体随着昆虫的摄食进入到昆虫的消化道，并释放出分子罱为2 7 1 4 0 k d ( i j 杀虫结晶蛋i 自( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n ，简写i c p ) ，i c p 通常以原毒素的彤式仃 在，在昆虫幼虫的中肠道中，借助于蛋白酶的水解，原毒素转型为毒性的多肽分 子，毒性被活化1 9 j 。活化了的毒素可以与敏感昆虫中肠道上皮细胞表丽的特异 受体相互作用，诱导细胞膜产生些孔道，扰乱细胞的渗透平衡，并引起细胞肿 胀甚至裂解。伴随着上述过程昆虫将停止进食，从而达到杀虫的目的f m f 。j ： 毒素只能与昆虫肠道内表皮细胞膜上的专一受体相互作用，其作用具有特异悱， 所以理论上讲该毒蛋白对人、畜及害虫的天敌无害。 s c h n e p t 等于1 9 8 1 年首次将苏云金杆菌k u r s t a k ih d 1 的b t 毒蛋白基冈克降， 并于1 9 8 5 年完成其核苷酸序列分析。1 9 8 9 年h o t = t e 和w h i t e l e y 根据基闪结构的十似 性及其抗虫谱将已知的b t 毒蛋白基因分为四大类及若干亚类( 如表1 1 ) 。b t 谗蛋 白基因家族在不断地发展和扩大，目前已有二十多种b t 毒蛋白基闪被分离干fj 兜 隆。 塞呈盔堂堡：! 堡= 塞；一 表1 1b t 毒蛋白基因的分类 耋型垫圈 查皇遒塞塑堕 一型垒一 c r y lc r y l a ( a 1 lk u r s t a b ih d + k a i z a w a i ；e n t o m o c i d u s 45 k b 基闻tc r y l _ i c r y l a ( b ) lb e r l i n e l | 7 1 5 ；k u r s t a k ih dl ；a i z a w a i 53 k b 基p = | r u r h d i ；b 1 2 ， c r y l a ( c ) c 删b c r y l c ( a ) c r y l c ( b ) c ，y i d c r y l e k u r s t a k ih d 7 3 e n t o m o c i d u s a i z a w a i e n t o m o e i d u s ，8 i g a w 8 l k e n y a c a i z a w a i k e n y a e4 f i c r y l 2 6 6 k b 基因 c r y a 4 ；t y p e b t y p e c ，b t l v b t a 型g型墼燮 一一一 c r y c r y i i a 【巾 k u r s t a k ip 2 基冈c r y 8 1 c r yi fb lk u r s t a k ic r y f h c r y l l lc r y l i i a c s a n d i e g o t e n e b r i o n i s t e g 2 ts sc r y c c r y l l l br a l ct o l w o f l h ie g 2 t 3 s c r y l l l b ( b ) ct o l w o r t h ie g 4 9 1 6 c r y l l l c c? c r y l l l d ck u r s t a k ib t i l 0 9 p c r y wc r y i v e d s r a e l e n s i s1 3 0 - k d 毒蛋白基州i r h l c f y l v e di s r a e l c n s i s1 3 5 k d 毒蛋白基闲，i s r i l 4 - b t s c r y l v e di s r a e l e n s i so r f i c w w e d s r a d e n s i sc r y d o y vc r y v e l c? 丑丛2 纽_ ! 壁麴l 2 1 j 2 世q ：i j2 2 鲤主羹自董里 为h o r e 和w h i t e l e y 提出分类系统后新发现的b i 基因 l ：l e p i d o p t e r n 鳞翅目；d ：咖t c r a 双翅目；c ：c o l e o p t c r a 鞘翅日 c y t a 编码的毒蛋白不仅对双翘目昆虫有毒性。而且对无脊椎动物及脊椎动物也彳 毒 3 l l l l l l 壅堑堕尘呈塑旦! 苎旦壁垫窒塑童查塑垄焦整些垦坌堑 1 9 8 7 年6 月，比利时植物遗传系统公司首次获得了转b t 毒摄r 1 荩的灿m ， 并发现转基因烟草中只保留5 编码毒性核心区域、3 端缺失了f j b t 毒蛋| ，i 琏 因具有与全长基因相同的抗虫活性1 ；同年m o n s a n t o 公司和a g r a c e t u s 公司也获 得了转b t 毒蛋白基因的植株【1 2 1 。以上三个例子中的转化植株均表现刘鳞翅1 1 类害虫的抗性。在此之后，b t 毒蛋白基因又先后被转入了马铃薯、棉花、r 水、 水稻等作物 1 1 , 1 3 , 1 4 , 1 5 j ：也先后获得了其它植物包括向闩葵、菠菜、杨树等的转螭 因植株【”1 ，并表现出对鳞翅目类或鞘翅目类害虫的抗性。早期的转b t 苯i 1 $ f i 株 中普遍存在的一个不足就是b t 毒蛋白基因在转化植株中表达水平低。m u r r a y 等 人【1 7 1 进行了系统的研究，结果表明m r n a 不稳定及翻译效率低是j i 要原t j 要 是因为： ( 1 ) 在植物细胞中某些t r n a 成分含量过低，造成i c pm r n a 转泽的末成熟终i i ：， 而这些未成熟即终止转译的m r n a 将被迅速降解； ( 2 ) i c pm r n a 中含大量的a u 碱基，其中存在有隐含的聚腺苜信号a a u a a a i f 列及内含子切割序列，可造成1 c pm r n a 在不适当位置上的断裂，引起i c pm r n a 代谢速度过快： ( 3 ) i c pm r n a 的二级结构，m r n a 转录起始位点的边周序列等也与植物1 i 同。 以上原因都可能造成1 c p 表达水平不高。v a e c k 等在试验中也证明，全长的野乍犁 b t 基因并不能在植物中充分地表达，因此建议对这种b t 基因进行改造，以使它 更接近植物的基因，从而提高翻译的效率，提高基因表达的水平，最终有效地挖 制作物上的主要害虫鳞翅目类害虫。p e r l a k 等首先对b t 基因进行了两种改造 ”8 】：一是通过定点诱变的方法对基因进行部分地改造( p a r t i a l l ym o d i f i e d ，p m ) ； 另一种是对d n a 属性进行完全改变，既采用植物偏爱的密码予，对基进行个 序列的人工合成( f u l l ym o d i f i e d ，f m ) 。部分改造的b t 基因在植物巾的毒蛋门j “： 量为野生型的l o 倍，而全部改造的b t 毒蛋白产量为野生型的1 0 0 倍，并获得了良 好的抗虫效果【1 9 】。中国农科院生物技术中心也全序合成t b t 杀虫基因，并将此 基因成功地转入棉花，转基因b t 棉花获得了较好的抗虫性。 迄今，已有许多实验室用不同的b t 毒蛋白基因和转化方法获得抗虫转g - 冈机 物，并且有的已进入大田试验( 见表1 2 ) 。 。 一复里查堂堕! ! 堡墨 _ - 一一 表1 2b t 毒蛋白基因的转化植物 _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ - _ - _ - _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ l - 一一 蕉固焦基固焦塑 堡丝复鎏 虽型堕二一 烟草 农杆菌介导c a m v s s s 水稻p e g 、花粉管通道法c a m v _ l s s c r y l a ( 8 ) 花椰菜 农杆菌介导c a m v m 盟垄垄趁笪埋鲎鎏! m 当j 5 一 一一 烟草 农杆菌介导t i 质粒启动r 番茄 农杆菌介导c a m v m 水稻电击法、基冈枪法c a m v m c r y l a ( b 1 马铃薯农杆菌介导c a m v 3 5 s 自云杉基冈枪c a m v s 玉米基冈枪c a m v 3 5 s 塑垄垄塑笪塑堕鎏g ! 丛y 班 马铃薯农杆菌介导c a m v m 烟草 农杆菌介导c a m v m 欧洲落叶松农杆菌介导c a m v 3 5 s 杨树电击法c a m v 3 s s 芥菜农杆菌介导c a m v 3 5 s c r y l a ( c ) 胡桃农杆菌介导t i 质粒启动子 棉花农杆菌介导c a m v ” 欧洲黑杨农杆菌介导c a m v ” 蕃茄农杆菌介导c a m v m 玉鲞士旦蕉越鎏g ! m y 璐 烟草农杆菌介导c a m v m ：查蕉壅堑萱坌曼! m 凇 马铃薯电击法c a m v 3 ，s 塑蔓壅堑堕盆昱! 丛弘蕊 c r y i v d 兰藻电击法c a m v ” 壅笪堕坌曼塑! 竺薹鬯型塑銮塑童查塑望堡壁垡墨坌堑 一一 1 2 植物外源凝集素基因 外源凝集素( l e c t i n ) 是自然界中广泛分布的一组蛋白质，在多种小物一l 一均 有发现。在豆科植物的种子中含量最为丰富，约占可溶性蛋向的1 0 | j 。外源 凝集素能特异地与单糖、多糖结合或交联，使得不同种类的外源凝集素，j 有嘭j 显的可资区别的特性。外源凝集素对植物具有很重要的生理作用，如：保护功能， 在植物生长的各个阶段，外源凝集素能以不同的方式保护植物免_ j 病虫的危宵： 作为储藏蛋白，包装和运输储藏物质；作为促有丝分裂因子，促进植物细胞的分 裂：另外，外源凝集素还可能参与细胞壁的延伸，细胞间的识别等。外源凝集袭 主要储存于植物细胞的蛋白粒中，一旦被害虫摄食，外源凝集素就会有：昆虫的消 化道中被释放出来，并与肠道围食膜上的糖蛋白相结合，影晌营养物质朐 ：常吸 收；同时，还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，促进消化道内细菌的繁嫡，对昆 虫造成危害【l ”。研究表明，大多数的植物凝集素对哺乳动物的血细胞有定的 毒害，豌豆外源凝集素和雪花莲凝集素等对害虫有很强的毒性，而对人的剐作j | 】 较小或没有【l ”j ：是目前植物抗虫基因工程中最常用的外源凝集素。 1 2 1 豌豆外源凝集素( p e a 。l e c t i n ，p l e e ) 基因 豌豆外源凝集素( p e a - l e c t i n ，p l e e ) 基因跟其他许多外源凝集素基件f ， 不含有内含子，其基因也是单拷贝的。它的初始产物是一个2 5 k d 的前体蛋r f ， 长2 7 5 个氨基酸，该前体被转运到内质网后裂解产生成熟外源凝集素的。和b 、i f 基。前体蛋白从n h 2 末端开始依次是疏水的前导肽、1 3 亚基和io 旺基。另外， 比较a 链的氨基酸序列与编码基因的序列，发现n 链内部还经过了进步的翻泽 和修饰，不同的修饰形成了在豌豆不同组织中存在的同源异型凝集素。昆虫饲喂 实验表明，p - l e c 能抑制豇豆象的生长【1 9 】。g a t e h o u s e 等( 1 9 9 2 年) 证明表达p l e c 基因的转基因烟草可以抑制鳞翅目的烟芽夜蛾的生长【垃7 1 。 1 2 2 雪花莲凝集素( g a l a n t h u s n i v a l i sa g g l u t i n i n ，g n a ) 基因 雪花莲属于石蒜科( a m a r y l i d a c e a e ) 植物，其外源凝集素( g n a ) j i 号 u 别并结合a 一1 ，3 和n 一1 , 6 甘露糖。g n a 存在于雪花莲植物的大多数组织中。s d s p a g e 以及蔗糖梯度离心证明g n a 分子是每个亚基为1 2 5 k d 的同源四聚体蛋 白，而且蛋白分子未被糖基化。g n a 的三维结构是e h - - 个反平行的哑结构域通 过q 环相连组成的一个桶，每个凝集素单体有三个相同的甘露糖结合位点，该彳；_ 7 _ 点由g i n 、a s p 、a s n 和r y r4 个氨基酸组成，通过4 个氢键同甘露糖的0 2 ( a s p 和 墨呈盔堂竖占堡苎一 a s n l 、0 3 ( g 1 n ) 及0 4 ( t y r ) 结合。同时，疏水残基v a l 9 5 、v a l 6 3 ；f l l v a l 3 2 i i | | 露1 i l l f 的 c 一35 i i c 一4 通过疏水作用相互作用；4 个g n a 单体构成个具有儿个充分暴露o , g t , i 合甘露糖位点的四聚体【2 。 g n a 有许多特殊的生理生化性质，由于其具有高度特异结合l f 露糖寡聚体的 a 1 3 和。一1 ，6 位使其在分析、纯化糖蛋白方面成为有用的t ：具，u 成助地臆川 于纯化鼠血清中免疫球蛋白，m 的单克隆抗体。另外，这种凝集素别人类及动物 中的反转录病毒( h i v ) 和巨细胞病毒具有有效和选择性的抑制作用。1 9 9 5 v ， p o w e l l l 2 1 1 等将g n a 、w g a ( 麦胚凝集素) 、l p o ( 大豆脂肪合成酶) 分别以0 1 ( w ，v ) 的浓度人工饲喂成熟的水稻褐飞虱，结果表明，g n a 对褐b 虱的抗。忖最 有效，饲喂含g n a 的褐飞虱蜜露分泌量比对照减少9 6 。对其i 龄幼虫剂最实 验表明，g n a 毒性也最强，浓度范围在0 1 0 0 1 ( w ，、，) 即对害虫发育有5 a 蒋抑 制作用，没有成虫产生，尽管有一些幼虫在最低浓度下存活到2 5 天。1 9 9 6 q i ， s a u v i n 等【2 2 i 研究了g n a 和其他结合甘露糖的凝集素对桃蚜发育和小殖的影响，也 获得了类似结果。 1 9 9 5 年，n e w e l l t 2 3 j 等将印盯( 豇豆胰蛋白酶抑制剂基因) 和g n a 皋冈同叫导入 地瓜，但未有抗虫结果的报道。同年h i l d e r 等【1 28 】将伊嘏冕于c a m v 3 5 s 启动，后存 烟草中得到g n a 高水平表达，叶盘及整株抗蚜实验均表明转基因植物对蚜虫的 抗性增强，其中校正死亡率为3 3 ，而存活的蚜虫其平均大，j 、也显著小二r 对照。 蚜虫群体生长率整株实验表i j ) t d ( d o u b l i n gt i m e ) 为2 4 7 天，而对照t d 为】6 2 人。 g a t e h o u s e l 2 4 】等于1 9 9 6 年也证明，表达g n a 的转基因土豆对蚜虫生殖率有鼹著降 低作用，每个雌蚜虫每天产卵数为4 1 4 2 个，而对照为5 4 个；转基闪植株i ：幼虫 产生数也比对照显著降低。 1 3 蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r , p i ) 基因 蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h a b i t o r ，p i ) 是广泛存在于植物各种组织及器官小 的一类天然抗虫蛋白，在大多数植物的种子和块茎中其含量可高达总蛋f 7 i 的l 一1 0 。p i 杀虫的机理在于：它们能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作川，形 成酶一抑制复合物( e 1 ) ，从而阻断或削弱蛋白酶对外源蛋白质的水解作用，导 致蛋白质不能被正常消化。同时，e i 复合物能刺激消化酶的过量分泌，通过神 经系统的反馈，使昆虫发生厌食反应，最终造成昆虫的非正常发育或死i ：l ” 2 “。 目前，在植物中发现有三种p l ，它们是丝氨酸p i 、巯基p i 和盒属p 1 ，蚱i z 分离出多种蛋白酶抑制剂基因或其e d n a 克隆。其中最引人注目的是豇移胰蛋 l 。 壅堑堕盆曼塑星! 叁里堕垄銮塑鲞查塑鲨堡壁些墨坌塑 一 酶抑制剂基因、马铃薯蛋白酶抑制剂基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基闪”“。 豇豆胰蛋白酶抑$ 1 齐l j ( c o w p e at r y p s i ni n h i b i t o r ，c p t i ) 是一类18 0 个几玑氨琏 酸残基构成的小分予多肽，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类。它的抗虫谱j “泛，对包 括鳞翅目、鞘翅目及直翅目的许多昆虫都有毒性【2 6 l 。h i l d e r 等r1 9 8 7 年前先分 离和克隆了c p t i 的c d n a ，并以此作探针，从豇豆品种t v n 2 0 2 7 了叶染色体 d n a 文库中克隆了c p t i 基因，全长为5 5 0 b p l 2 ”。 马铃薯蛋白酶抑$ 1 l 齐u ( p o t a t oi n h i b i t o r ，p i ) ，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类，抗 谱与c p t i 相似。根据它们的分予特点分为两个家族：( 1 ) p 1 1 家族，其成熟肽i 丫i 体分子量为8 1 k d ，只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶；( 2 ) p i 1 1 家族， 其成熟单体分子量为1 2 3 k d ，有两个活性中心，可分别抑制胰凝乳蛋门酶和胰 蛋白酶。因此，p i i i 家族比p i i 家族有更大的应用价值。马铃薯的p i i 和p i 1 i 基因均已被克隆，并完成了测序工作。其中p i i i 基因为2 6 k b ，该摹困禽何个 1 1 7 b p 长的内含子。p i 基因是一类损伤诱导表达型的基因，只有当植物受伤后 或被某种诱导因子( 如茉莉酸、茉莉酸甲酯等) 诱导后才被激活表达。冈此，p i i i 基因的启动子有着广泛的应用潜力。 水稻巯基蛋白酶抑制齐u ( o r y z a c y s t a t i n ) 对于利用巯基蛋白酶消化植物蛋l i f 门 昆虫具有特殊的抗性，因此它的抗虫谱与c p t i 的抗虫谱有互补性。它对讥旺象、 杂拟谷盗、米象、大谷盗等害虫的消化酶有明显的抑制作用，表现 很强的抗虫 性。目前，已克隆到o r a z y c y s t a t i n 基因的c d n a ，该基因含两个内禽了，c d n a 编码1 0 2 个氨基酸的小肽，分子量为1 1 5 k d 2 s 】。 蛋白酶抑制剂基因有其独特的优越性：首先，从杀虫机理来看，e f l ：j r lr 融 虫消化酶的活性中心，这是酶的最保守的部位，产生突变的可能性极小，极火地 降低了昆虫产生耐受性的可能性；其次，蛋白酶抑制剂对人畜是无害的，冈为人 畜的蛋白消化酶主要存在于肠道中，而蛋白酶抑制剂在胄的酸性条件下被胃蛋厂l 酶分解；此外，蛋白酶抑制剂基因的抗虫谱比较广泛。这类基因的不足之处确汁 要达到理想的抗虫效果，其表达量要求远远高于b t 毒蛋白基因的表达最。冈此 通过分子改造来提高其基因的表达水平，将成为人们研究的重点1 2 ”。 1 4 淀粉酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂( c t - - a m y l a s ei n h a b i t o r ，a i ) 是植物界中普遍存在的类蛋r _ i 质，尤其是在禾谷作物和豆科植物的种子中，其含量更为丰富。它能普遍抑制哺 乳动物及昆虫体内的0 c 一淀粉酶活性，但对植