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摘要 本文首先概述了国内外近年来在低聚壳聚糖的制备、结构分析及生物活性功 能等方面的研究进展。系统研究了在过氧化氢氧化降解壳聚糖过程中反应介质、 介质浓度、反应温度、反应时问以及过氧化氢用量等因素对降解产物脱乙酰度和 平均分子量等性质的影n 向，为靶向制备特定分子量范围内的低聚壳聚糖提供了科 学依据。在此基础上首次探讨了3 9 糖的最佳制备。l ，：艺条件。并运用高效液相色 谱( ( h p l c ) 、傅立叶红外光谱( ( f t i r ) 等现代分析手段表征了产物组成及结构， 证明了壳聚糖经过氧化氢氧化降解后，低聚壳聚糖基本保持了原有的结构单元， 并未丧失壳聚糖原有的生理活性。本文还研究了低聚壳聚糖的吸湿、保湿性能， 并首次合成了水溶性的低聚壳聚糖亚铁离子配合物，系统研究了反应时间、反应 温度、亚铁离子浓度等对吸附量的影响，为低聚壳聚糖亚铁离子配合物这一优良 的补铁药物的应用奠定了基础。 关键词：壳聚糖、过氧化氢、低聚壳聚糖、吸湿保湿性、f e ( i i ) 一低聚壳聚糖配 合物 a b s t r a c t t h e p a p e r f t r s t b r i e f l y i n t r o d u c e st h e p r e p a r a t i o n o fc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e i n c l u d i n gc h e m i c a l ，p h y s i c a lf i e l d ，s y n t h e s i s ，e n z y m em e t h o d s ；a n d r e v i e w si t s f i m c t i o n sa n d a p p l i c a t i o ni nf o o d ，m e d i c i n e ，c o s m e t i ca n da g r i c u l t u r ef i e l d a n dt h e n i td i s c u s s e dt h em e t h o do fp r e p a r i n gc h i t o o l i g o s a c c h a d d e s i tw a ss t u d i e dt h a t h y d r o g e np e r o x i d e a f f e c t e dt h e o x y g e n a t i o nd e g r a d a t i o nr e a c t i o n o fc h i t o s a no n d i f f e r e n tc o n d i t i o n s t h ev a r i o u sf a c t o r so fh y d r o g e np e r o x i d ed e n s i t y , d o s a g ea n d r e a c t i o n t e m p e r a t u r e e t cw h i c ha f f e c t e d o x y g e n a t i o nd e g r a d a t i o n r e a c t i o nw e r e d i s c u s s e d n es t r u c t u r eo ft h e c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s o fh y d r o l y t i cc h i t o s a nw a s d e t e r m i n e d b ya n a l y s i s o fi r s p e c t r o s c o p y , a n d t h e p o l y m e r i z a t i o nd e g r e e w a s m e a s u r e db yh l c rt h i sp a p e ra l s oi n v e s t i g a t e dt h ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s m o i s t u r e a b s o r b a b i l i t y a n dm o i s t u r er e t e n t i v i t y t h ea b s o r p t i o nc o n d i t i o n sa n da b s o r p t i o n b e h a v i o ro ff e ( i i1o l l c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h ec o o r d i n a t i o n p o l y m e ro ff e ( i i ) w i t hc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sw a ss y n t h e s i z e d u vs p e c t r ar e s u l t s s h o w e dt h a tt h ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s 谢t l lf e ( i i1f o r m e dac o o r d i n a t i o np o l y m e r , w h i c ha b s o r b e d p a r t i c a lf e ( i i ) t o o k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，h y d r o g e np e r o x i d e ，c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ， m o i s t u r e a b s o r b a b i l i t ya n dm o i s t u r er e t e n t i v i t y , f e ( i i ) 一c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s c o o r d i n a t i o n p o l y m e r y 6 2 ；7 69 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：) 衅年7 月，日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 驴年7 月，日 硕士论文 低聚壳聚糖的制各及应用研究 1 绪论 1 1 甲壳素壳聚糖的结构及性能 甲壳素( c h i t i n ) ，是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖，学 名为b 一( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一2 一脱氧一d 一葡萄糖，是由n - 乙酰氨基葡萄糖以b 一( i ，4 ) 糖苷键缩合而成的，其结构式如下： c h z o h c h 2 0 h 其中m 链节在链中占8 0 以上。甲壳素为无定型，成片状固体，由于一0 h 一0 型 及0 h n 型氢键的作用，使甲壳素大分子间存在着有序结构，因此由于晶态结 构的不同，有c 1 、b 、y 三种晶形物。在虾、蟹甲壳中的甲壳素，相邻分子链的 方向是逆向的，为a 一型，这种结晶比较稳定。动物甲壳素的分子量在i 0 0 2 0 0 万，经提取后在1 0 2 0 万。由于有序结构的存在，使得甲壳素的溶解性能较差， 不溶于一般溶剂，这种状况当甲壳素通过脱乙酰基转化为壳聚糖时会明显改观， 这时由于游离氨基产生，溶解性能大大提高，可溶解于稀酸。 c h ，0 h 壳聚糖( c h i t o s a n ) ， 乙酰基的衍生物，结构为 c h 2 0 h 煮沸 c h 2 0 h 又名脱乙酰甲壳素，可溶性甲壳素。它是甲壳素脱去 c h 2 0 h 其中n 链节在链中占8 0 以上，学名为1 5 一( 1 ，4 ) 一2 - 氨基一2 一脱氧一d 一葡聚糖 硕士论文 低聚壳聚糖的制各及应用研究 分子量约为1 2 5 9 万，1 8 5 。c 分解。脱乙酰度在8 0 8 5 的产品呈白色或黄色结 晶性粉末或者片状固体，表观密度0 1 5 0 0 5k g l ，p k 为6 3 。 甲壳素在自然界的存量仅次于纤维素，而且一直在默默地为人类做出贡献， 然而直到1 8 i i 年，才被法国的一位研究自然科学史的h b r a c o n n o t 发现。1 8 5 9 年，法国人c r o u g e t 将甲壳素( c h i t i n ) 与盐酸共煮，发现了壳聚糖。此后一 百多年，对他们的研究时断时续，直到5 0 年代才对甲壳素的化学结构、性质和 制造方法有了较透彻的了解。几十年来，科学家们对甲壳素和壳聚糖的医疗保健 作用及在农业上的应用投入了很大的力量，搞清楚了许多机理，取得了很多成果。 欧美的科学家们认为，低聚甲壳素和低聚壳聚糖将会在医疗保健作用方面和药物 研究方面为人们打开一扇大门，会让人们看到一片广阔的天空。 1 2 壳聚糖的化学性质 壳聚糖的化学性质的研究，内容十分广泛，是认识壳聚糖的本质。开发产品 的重要基础。研究壳聚糖的化学反应，有两个重要的目的，一是解决它在水中或 有机溶剂中的溶解性，二是获得性能很好甚至是独特性能的产品。 ( 1 ) o - 酰化和n 一酰化 甲壳素和壳聚糖可与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤( 主要是酰氯) 等反 应，导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基。这是壳聚糖化学反应中研究的最多 的一种反应。 ( 2 ) 含氧无机酸酯化 甲壳素和壳聚糖的羟基，尤其是c b 一o h ，可与一些含氧无机酸( 或其酸酐) 发生酯化反应，这类反应类似于纤维素的反应。在壳聚糖的氨基上也可能发生这 种反应。 ( 3 ) 醚化 甲壳素和壳聚糖的羟基可与烃基化试剂反应生成醚，如甲基醚、乙基醚、苄 基醚、羟乙基醚、羟丙基醚等。近几年来对这种反应比较重视，可以开发出一些 新型材料。 ( 4 ) n 一烷基化 壳聚糖的氨基是一级氨基，有一孤对电子。具有很强的亲核性，能发生很多 反应，n 一烷基化是除n 一酰化以外的另一类重要的反应。甲壳素的乙酰氨基的n 上只有一个h ，很稳定，但在一些强烈的条件下，也能发生取代反应。 ( 5 ) 氧化 2 硕士论文 低聚壳聚糖的制备及应用研究 甲壳素和壳聚糖可以被氧化剂氧化，氧化反应的机理很复杂。氧化剂不同， 反应的p h 值不同，氧化机理和氧化产物也不同，既可使c 。o h 氧化成醛基或羧 基，也可使c 。o h 氧化成羰基( 成酮反应) ，还可能发生部分脱氨基或脱乙酰胺 基，甚至破坏吡喃环及糖苷键。 ( 6 ) 鳌合 甲壳素和壳聚糖的糖残基在c 。上有一个乙酰氨基或氨基，在c ，上有一个羟 基。从构象上来看，它们都是平伏键，这种特殊结构，使得它们对具有一定离子 半径的一些金属离子在一定p h 值条件下具有鳌合作用。尤其是壳聚糖，与金属 离子的鳌合更广泛一些，更具特色，这使得壳聚糖成为一类新的天然高分子鳌台 剂，而且无毒、无副作用。甲壳素和壳聚糖的这一特点，使它们具有更广泛的应 用价值和应用领域。 ( 7 ) 对酸的吸附 壳聚糖是一种碱性多糖，其氨基能结合溶液中的h + ，许多无机酸、有机酸 和酸性化合物，甚至是两性化合物，都能被壳聚糖吸附结合。壳聚糖的这一特点， 可应用于食品、药物、生物制品的脱酸，避免用碱中和而增加盐分，也可应用于 从溶液、发酵液中提取酸性化合物，如氨基酸、核苷酸、青霉素等。 ( 8 ) 接枝共聚 甲壳素和壳聚糖分子链上的活性基团很多，可以进行按枝共聚( g r a f t c o p o l y m e r i z a t i o n ) 反应，从而改进它们的性能，满足特殊需要。 ( 9 ) 交联 甲壳素和壳聚糖可通过双官能团的醛或酸酐等进行交联( c r o s s l i n k e d ) 交 联的目的是使产物不溶解，甚至溶胀也很小，性质很稳定，这对于它们被用作层 析的载体或作固定化酶载体是十分重要的，尤其是壳聚糖常常需要交联。 3 壳聚糖产品开发的新动向 目前，甲壳素壳聚糖产品的开发主要集中在以下几个方面： ( 1 ) 降低分子量，增加水溶性 壳聚糖降解制备低聚壳聚糖及更小分子量的水溶性壳聚糖是目前研究的热 点之一。就其用途而言，低聚或者更小分子量的水溶性壳聚糖可用作具有生理功 能的保健食品，有降低血脂、降低胆固醇、增强身体免疫力和抵抗疾病的能力； 亦可利用水溶性壳聚糖良好的保湿功能，用作化妆品添加剂；或者从中提取抗肿 瘤制剂。 硕士论文 低聚壳聚糖的制备及应用研究 ( 2 ) 化学修饰，改善性能。 对甲壳素壳聚糖进行化学修饰制备具有不同性能、不同用途的甲壳素壳聚 糖的衍生物，这也是很重要的一个研究方向。这些化学修饰包括甲壳素壳聚糖 的酰基化、羧甲基化、季氨化、硫酸酯化等等。通过这些化学修饰作用在甲壳素 壳聚糖分子结构中引入了各种官能团，改善了甲壳素壳聚糖的物化性质。从而 使其具有不同的功能及功效。 ( 3 ) 提高纯度，扩大应用。 一般工业品甲壳素壳聚糖的纯度有限，而经过纯化处理的壳聚糖则在食品、 医药、生化等方面有着广泛的用途。如壳聚糖可用于饮用水的净化、工业废水的 处理、贵重金属的回收；在日化用品方面，可用作固发剂、整理剂、保湿剂等； 纺织工业中的上浆剂、固色剂、处理剂等；农业方面的果蔬保鲜剂、可生物降解 膜等；医用方面的抗癌药剂、人造皮肤、隐形眼镜等。 1 4 低聚壳聚糖 1 4 1 概述 壳聚糖( c h i t o s a n ) 学名b 一( 1 ，4 ) 一2 - 氨基一2 一脱氧一d 一葡聚糖，是甲壳索 经脱乙酰化处理的产物。甲壳索( c h i t i n ) 学名0 一( 1 ，4 ) 一2 - 乙酰氨基一2 脱 氧- d - 葡萄糖，是一种天然高分子化合物，也属于碳水化合物中的多糖，一般而 言，脱乙酰度超过5 5 的甲壳素即成为壳聚糖。聚合度( 多糖的糖基数) 在2 0 以下的壳聚糖就被称为壳寡糖或低聚糖。 1 4 2 低聚壳聚糖的性质 同大分子壳聚糖相比，低聚壳聚糖具有一些独特的功能性质，这些性质包括 低聚壳聚糖良好的水溶性，保湿性，抑菌抗菌作用等。 ( 1 ) 水溶性 壳聚糖是含氨基多糖类天然生物活性物质，在其大分子链结构中含有大量的 一n h ：和0 h 基团。当壳聚糖降解时，平均分子量降低，壳聚糖分子内的氢键作 用随之减弱，这不但使壳聚糖分子在溶液中具有更大的扩散趋势，而且引起壳聚 糖分子构象发生一定的变化。另一方面链长度的缩短和分子构象的变化使得壳聚 糖在7 k 溶液中的无序程度增加，综合作用的结果使其水溶性大为改善。 4 硕士论文 低聚壳聚糖的制各及应用研究 ( 2 ) 吸湿保湿性质 低聚壳聚糖分子中大量的一n h ：和o h 强极性基团的存在，不仅使低聚壳聚 糖的水溶性大为改观，也使其具有良好的吸湿保湿功能。研究表明：低聚壳聚 糖与人体皮肤中的透明质酸相似，其保湿效果比传统的保湿剂( 如透明质酸、甘 油等) 更好。 ( 3 ) 抗菌抑菌作用 低聚壳聚糖具有明显的抗菌抑菌作用。无锡轻工业大学的夏文水等通过对大 肠杆菌的抑菌抗菌活性试验，证明壳聚糖的抑菌作用也是随着壳聚糖的分子量的 降低而逐渐增加的，尤以均分子量在1 5 0 0 左右的低聚壳聚糖的抗菌抑菌效果最 好。1 。通过比较实验，还证明了游离的氨基的存在是壳聚糖抗菌抑菌作用的基础。 1 4 3 低聚壳聚糖的制备 目前制备低聚壳聚糖的制备方法主要有化学降解法、物理场降解法、合成法、 酶解法四大类。其中化学降解法包括酸解法和氧化降解法；物理场降解法则包括 微波降解法、超声波降解法和y 射线降解法；合成法包括化学合成法和酶合成法； 酶解法则包括使用专一性的壳聚糖酶降解，以及利用非专一性的其他酶降解，如 蛋白酶、溶菌酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和脂肪酶等来降解壳聚糖。现 分别论述如下。 1 4 3 1 化学降解法：包括酸降解法和氧化降解法 ( 1 ) 酸降解法 壳聚糖很容易溶于稀酸溶液中，适当强化反应条件就可以用酸对壳聚糖进行 降解以制备低聚水溶性壳聚糖。早在本世纪5 0 年代就有人用酸对壳聚糖进行降 解，得到了低聚水溶性壳聚糖。目前，已有多种以酸为主要反应试剂的降解壳聚 糖的方法。 盐酸降解法。1 ：用酸和碱将壳聚糖纯化后，加入浓盐酸溶液进行降解反应。 反应4 8 小时后溶液在真空瓶中冷却，然后用乙醇洗涤，浓硫酸真空干燥制得聚 合度小于1 0 的产品壳聚糖一盐酸盐( c 。h 0n h c l ) 。若反应时间达到7 2 小时， 则可得到其单糖一盐酸盐。用这种方法得到的低聚水溶性壳聚糖一盐酸盐的分子量 分布比较宽。 酸一亚硝酸盐法“5 。”：壳聚糖溶于乙酸或者盐酸稀溶液中，然后加入亚硝酸 盐( 如n a n o ：) 进行降解反应；或是先将壳聚糖分散予硝酸盐的水溶液中，然后 硕士论文低聚壳聚糖的制各及应用研究 在室温下慢慢将一定浓度的酸加入进行反应；反应2 4 小时后，用碱调节溶液 的p h 值为5 6 ，经净化分离得到降解产物，利用该法可制备均分子量为2 0 0 0 3 0 0 0 、分子量分布相对窄的低聚水溶性壳聚糖 过醋酸法“：用商品过醋酸或以浓硫酸为催化剂，用h ：0 2 先将醋酸酐( a c ：0 ) 氧化成过醋酸( c h 。c 0 0 0 h ) ，加入到壳聚糖的乙酸溶液中进行降解反应。利用这 种方法制备的低聚水溶性壳聚糖产品具有可以长期保存的优点，特别适合于食品 及化妆品用低聚水溶性壳聚糖的生产。 其他酸解法。3 ：除上述几种酸解法外，其他的酸解法还有浓硫酸法和氢氟 酸法。浓硫酸法是在某些无机酸( 如h c l ) 中加入6 5 的浓硫酸对壳聚糖进行降 解反应，反应一定时间后再用体积比为( 5 7 ) 1 的m e c o 。h 。s o , 混合液进 行处理，得到较高收率的低聚水溶性壳聚糖产品。氢氟酸法是将壳聚糖溶于稀酸 中，加入h f 溶液进行降解反应。反应1 5 小时后，以适量c a c o 。中和未反应的h f ， 过滤，将滤液冷冻干燥分离，可得到聚合度为2 6 的壳聚糖寡糖。 酸降解法是壳聚糖降解制备低聚水溶性壳聚糖的一种较好的方法，利用这种 方法可分离得到低至单糖的各种低聚壳聚糖。其降解反应所用的试剂廉价易得， 易于实现工业化。 ( 2 ) 氧化降解法 氧化降解是目前研究比较多的一种壳聚糖的降解方法，较有代表性的几种氧 化降解法如下。 h 。o 。氧化法”“4 ”1 将壳聚糖溶于1 乙酸溶液中，在催化剂的存在下，2 h , k 适量的过氧化氢溶液， 调节溶液的p h 值为3 5 进行降解反应；也可以在碱性溶液中反应，调节溶液的 p h 值为1 1 ，温度为7 0 。c 左右，分批加入一定量的3 5 的过氧化氢溶液进行降解 反应。据文献报道，过氧化氢法制备的低聚壳聚糖的均分子量可达到2 6 0 0 。 h 2 0 广n a c ! 0 2 法“o 在0 0 0 4 1 0 的n a c i o 。及0 0 1 3 5 0 h z o ：的过氧化氢溶液中加入适量的 盐酸进行降解反应；反应在8 0 0 c 进行1 小时后，用n a o h 中和，再经n a b h a 处理 后可得到均分子量为6 0 0 左右的低聚水溶性壳聚糖。 h 2 0 厂h c l 法“2 1 将壳聚糖溶解在稀盐酸溶液中，加入适量的n a o t t 溶液使其形成悬浊液，然 后加入一定量的h ：o ：溶液在7 0 。c 进行氧化降解反应。也可以在壳聚糖的稀酸溶 液中，直接加入2 8 的h 2 0 2 和浓盐酸在8 0 。c 进行降解反应，得到低聚水溶性壳 聚糖产物。 硕士论文 低聚壳聚糖的制各及应用研究 其他一些氧化降解方法 除上面所述的几种心0 ：氧化法外，其他的一些氧化法还有( i ) n a b o ，法“”。 该法是将壳聚糖与n a b o 。在水溶液中进行非均相降解反应，得到无色或者略带微 黄色的低聚水溶性壳聚糖产品。这种降解法的最大优点是降解反应是通过开裂壳 聚糖的o ( 1 ，4 ) 糖苷键来进行的，反应前后的n h 2 _ 一含量无任何变化。( i i ) c i o 。“ 将0 0 5 的c i o 。溶液加入酸性壳聚糖溶液中，在6 0 0 c 进行降解反应，得到无色 低聚壳聚糖产品。( i i i ) c 12 14 氧化法。将壳聚糖溶于稀酸溶液中，然后通入一定 量的c l 。进行降解反应。反应结束后，加入n a b h 。和n a o h 处理得到降解产物。这 几种氧化降解方法，从目前研究进展来看，还只能得到分子量较高的降解产物， 其均分子量大约在2 5 万左右。 ( 3 ) 酶降解法 非专一性酶降解法 目前，已经发现3 0 多种非专一性的酶可以降解壳聚糖，其中，效果较为显 著的酶包括来自t r i c h o d e r m av i r i d e 以及a s p e r g i l l u sn i g e r 的纤维素酶，来 自a s p e r g i l l u so r y z s e 的半纤维素酶，来自a s p e r g i l l u sn i g e r 的果胶酶，来 自a s p e r g i l l u sn i g e r 的脂肪酶，来自a s p e r g i l l u sn i g e r 的真菌蛋白酶等。“。 这些酶降解底物的模式不符合米氏动力学”。 采用非专一性酶降解壳聚糖，从而获得低聚壳聚糖是目前研究的热点，也是 颇具前途的方向。在目前没有办法获得大量而廉价的壳聚糖专一性酶的情况下， 采用非专一性的酶降解壳聚糖无疑具有很高的现实意义。国内外都已经在这方面 做了大量的研究工作。但是壳聚糖的非专一性酶降解的许多具体的反应细节尚不 清楚，有待进一步研究。 专一性酶降解法 利用专一性的壳聚糖酶降解壳聚糖，主要有以下几种： 溶菌酶“：可以水解细菌肽聚糖的n 一乙酰葡萄糖胺长链的b 一( 1 ，4 ) 一糖 昔键，由于甲壳素与肽聚糖的结构十分相似，因此，溶菌酶同样可以水解甲壳素 的b 一( 1 ，4 ) 一糖苷键。 甲壳素内切酶“”：来源广泛，在许多植物微生物中都存在。该酶可以降解部 分或者完全乙酰化的甲壳素生成低聚壳聚糖，但不能降解完全脱乙酰化的壳聚 糖。该酶的底物特异性是要求水解的0 一( 1 ，4 ) 一糖苷键的两侧至少有侧是 n 一乙酰葡萄糖胺。甲壳素的乙酰化程度对该酶水解壳聚糖的效率有较大影响。 壳聚糖酶1 ；在自然界中的分布比较广泛，现已发现许多细菌，放线菌和真 菌菌株可以生产此酶，在一些植物组织中也发现了该酶。该酶可以降解部分或完 硕士论文低聚壳聚糖的制各及应用研究 全脱乙酰基的壳聚糖，生成低聚壳聚糖，但不能降解完全没有脱乙酰化的甲壳素。 该酶的底物特异性要求水解的葡萄糖胺长链的b 一( 1 ，4 ) 一糖苷键的两侧至少有 一侧是葡萄糖胺，这一点正与甲壳素酶相反。壳聚糖酶适合于水解乙酰化度较低 的壳聚糖，这也与甲壳素酶相反。 1 。4 3 2 合成法 ( 1 ) 化学合成法： 合成过程涉及基团的保护和基团的脱去等过程，步骤较为复杂，大量合成三 糖以上的低聚体在实践上几乎是不可能的。 ( 2 ) 酶法合成”“： 酶法合成条件温和，不需要对羟基进行保护。酶法合成的过程是低聚合度寡 糖在某些具有转糖苷作用的甲壳素酶及溶菌酶的作用下，延长糖链成为高聚合度 的低聚壳聚糖。例如利用酶法可以由( g l c n a c ) 。及( g l c n a c ) 。制备( g l c n a c ) 。和( g l c n a c ) ，。 目前合成法仍处于研究阶段，即使成功，其应用也只能是局限在某些寡糖的 合成上。 从上所述，对壳聚糖进行降解处理的方法和途径比较多，这些方法都可以得 到水溶性低聚壳聚糖。酶降解法可以特异她有选择性的切断壳聚糖的1 3 ( 1 ，4 ) 糖苷键，降解条件温和，反应过程易于控制，易于得到所需分子量范围的壳聚糖 产品，但在选择合适的酶种以适合工业化大规模生产上尚存在困难。酸降解法是 非特异性的降解过程，降解过程较难控制，所得降解产物的分子量范围较宽。虽 然这种方法早已用于工业化生产，各种分子量范围的壳聚糖产品都能得到，但要 得到特定分子量范围的壳聚糖产品且有较高的收率还是比较困难的；另外酸解过 程引入了强酸，还造成一定的环境污染。氧化降解法目前发展较快，不断有新的 氧化降解方法见诸报道，特别在日本，把这种方法用于工业化生产，已有多种壳 聚糖产品上市。不过氧化降解普遍采用了多种试剂进行降解反应或者降解产物的 后处理，这给产品的分离纯化增添了困难。总之，利用降解反应制备低聚水溶性 壳聚糖用于保健食品、药物和化妆品等方面是一个非常有前途的研究课题。目前， 大多的降解方法还只是处于实验室研究阶段，要最终实现工业化大生产，产生显 著的社会经济效益还必须在其降解机理、降解效率、降解产物的分子量分布、降 解产物的分离纯化等方面进行更为深入的研究，并探索新的经济可行的降解方 法，开发新的生产工艺。 硕士论文低聚壳聚糖的制各及应用研究 1 4 4 低聚壳聚糖的应用 i 4 4 1 低聚壳聚糖在保健食品方面的应用 低聚壳聚糖作为一种生物活性的天然高分子化合物，具有低甜度，低热值， 降血脂和降血糖等功效，而且无毒无副作用。“。以低聚壳聚糖为主要原料生产的 生物保健品，不仅有利于人体肠内双歧杆菌的增殖，同时可抑制肠内有毒菌和腐 败物质的生成，增加人体内纤维索的质和量，提高机体的免疫力”2 4 。“”。 低聚壳聚糖的保健功能并不限于某些特定的器官，而是可以作用于人体全 身。甲壳素的基本单位n 一乙酰基葡萄糖也是构成人体的重要物质透明质酸 的组成单元，于人体有很好的亲和性，不会对人体产生排斥作用”。目前，各国 以壳聚糖为主要原料的生物保健品已有几十种之多，其中大多数都是壳聚糖的大 分予产品。如日本研制的“救多善”和中国青岛药物研究所研制的“喜多安”的 分子量约为1 0 6 ：上海伟康生物保健品公司生产的“鲟之宝”的分子量约为1 0 4 ， 而以分子量为1 0 3 ，特别是分子量为1 5 0 0 左右的低聚壳聚糖来生产有特定功效的 保健食品则品种较少。鉴于人体对壳聚糖产品的吸收是通过人体中的生物酶降 解后吸收的，低分予量的壳聚糖产品更有利于人体的快速吸收。 总之，大力开发以低聚壳聚糖为主要原料的壳聚糖保健食品，壳聚糖口服液， 壳聚糖功能饮料等系列产品，是有着巨大的市场潜力的，应该在这方面有更大的 投入，开展更广泛的研究。 1 4 4 2 低聚壳聚糖在生物医药方面的应用 低聚壳聚糖在生物医药方面的重要用途之一是利用低聚壳聚糖的抑制肿瘤 的作用来制取抗癌药剂，低聚壳聚糖特别是低聚6 - 8 糖可通过活化人体中的淋 巴细胞，抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌抑癌作用” 癌细胞的形成伴随大量的癌毒素的释放。癌毒素会降低人体血清中的铁质， 使人贫血，食欲减退，而低聚壳聚糖在人体肠内形成的小分子基团会很容易被肠 吸收，从而抑制癌毒素在人体内的释放；同时，壳聚糖作为一种良好的聚电解质， 能很好地吸附在血管壁细胞的表面，从而可抑制癌细胞的转移。另外低聚壳聚糖 可有效地活化人体淋巴细胞，增强人体抵抗病菌的能力。人体中的淋巴细胞具有 分辨正常细胞，杀死病菌细胞的效能，从而使人具有免疫力”“。淋巴细胞的生 理活性与周围环境的p h 值有很大关系，以p h 值稍显碱性为最佳。通常癌细胞的 硕士论文 低聚壳聚糖的制备及应用研究 周围为酸性，而低聚壳聚糖上的氨基碱性基团可适当调节体内的p h 值，并通过 这种调节作用改变机体处于病态时的生物化学平衡，加强淋巴细胞的生理活性， 从而对癌细胞的繁殖进行抑制。 采用适当的降解方法将壳聚糖降解为低聚产品，分离制各以壳聚糖低聚6 8 糖为主的抗癌口服药剂及注射针剂等是很有应用价值的一项研究工作，如能尽 快实现经济规模工业化生产，将是广大癌症患者的福音。 另外，均分子量在1 5 0 0 左右的低聚壳聚糖对治疗骨病也极有疗效，其药理 活性与它在骨组织中碱性磷性酶的活性有很大关系。 低聚壳聚糖保持了壳聚糖大分子所具有的其他功能性质，包括降胆固醇，降 血压，防治糖尿病，强化肝脏机能。“，治疗烧烫伤o ”等等。 1 4 4 3 低聚壳聚糖在化妆品方面的应用 低聚壳聚糖在化妆品方面的应用主要是利用其优良的保湿增湿性能。低聚壳 聚糖本身具有成膜功能，又具有良好的透气性能，是一种强的吸湿与保湿剂，与 传统的保湿增湿剂相比，低聚壳聚糖的保湿增湿性效果更佳，在洗面奶及各类膏 霜中的使用更显其优越性。护肤化妆品最重要的性能之一是调湿作用，即化妆品 的保湿增湿作用，通常护肤品的有效性就是依据其调湿能力而言的”。在护肤化 妆品中添加一定量的低聚壳聚糖，既可以防止化妆品配方中水分的逸失，又可以 对表皮水分进行水合，从而起到保湿增湿作用。而且，低聚壳聚糖良好的透气性 又不干扰表皮对废物和毒素的排泄，不会造成皮肤粉刺。如含有适量低聚壳聚糖 的面膜弹性好，对皮肤有明显的滋润剂保护作用。其他添加低聚壳聚糖的护肤产 品也有易被皮肤吸收，促进血液循环的作用。 l 。4 。4 4 低聚壳聚糖在农业方面的应用 低聚壳聚糖对植物病害有防治作用，其机理是：诱导植物产生广谱抗菌性， 增强植物自身的防卫能力，抑制多种病源微生物的生长。同时低聚壳聚糖本身 还对植物病原微生物有直接的抑制作用。”。研究发现，壳聚糖对大多数真菌都有 一定的抑制作用3 5 , 3 6 可作为食品保鲜剂。低聚壳聚糖还可以作为新型植物生 长调节剂。它可以促进植物生长，提高种子发芽率，提高产量和抗病性。”。 1 0 硕士论文低聚壳聚糖的制各及应用研究 1 5 课题的提出及研究内容 甲壳素在自然界中的储量非常丰富，年生成量约有1 0 0 亿吨，产量仅次于纤 维素，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖。以虾和蟹壳为原料制得的壳聚糖的 分子量很大，通常在几十万甚至上百万。由于分子内外氢键的作用，其化学性质 稳定，溶解性差，只能溶于少数的稀酸溶液中而不能直接溶于水，所以在很大程 度上限制了它的应用。低聚糖能直接溶于水，且具有优于壳聚糖大分子的功能性 质，低聚壳聚糖在医药，保健食品和化妆品以及工业上有着广泛的应用前景。壳 低聚糖目前在国内外已经用于食品、化妆品当中，并向医药品转化。寻找能够规 模生产具有生物活性壳低聚糖的方法和途径是目前甲壳素化学研究的热点和难 点，引起了世界关注，我国也列入了高新技术研究和发展的计划。其中具有生物 活性的甲壳素和壳聚糖的五九糖，特别是六糖和七糖在抑制肿瘤方面的作用令 人鼓舞，是当今国内外研究看法的重点领域。 现在的问题在于如何制取低聚壳聚糖。一旦能够批量生产具有生物活性的低 聚甲壳素或者低聚壳聚糖，则甲壳素和壳聚糖的研究和应用将进入一个新时代， 将会形成一个具有相当规模的壳聚糖产业。本次研究按照科学、实用、可行的原 则选择以下几个主要研究内容： ( 1 ) 探讨在过氧化氢降解壳聚糖的过程中，反应温度、反应介质、反应时 间以及过氧化氢用量等对降解产物粘度的影响，为靶向制备特定要求的低分子量 的壳聚糖提供科学依据； ( 2 ) 在前一部分的基础上进一步探讨提高3 9 糖产率的工艺条件； ( 3 ) 低聚壳聚糖吸湿、保湿性能研究； ( 4 ) 与金属离子形成配合物的研究。 硕士论文 低聚壳聚糖的制各及应用研究 2 低聚壳聚糖的制备 2 1 方案的确定 目前，低聚糖的制备方法大致有酸降解法、酶降解法、氧化降解法以及外场 辅助降解法。 ( 1 ) 酸降解法 壳聚糖在酸性溶液中会发生水解( 即糖苷键的断裂) ，酸在其中主要起催化 作用。酸水解法的特点是工艺简单，但是其生产效率较低，产物分子量分布较难 控制。而且酸水解产生大量的d 一葡糖胺使得分离过程非常复杂，生产过程会造 成较严重的环境污染，故不适于工业规模生产。 ( 2 ) 酶降解法 酶降解法是利用壳聚糖降解酶对壳聚糖进行降解制备低聚糖的一种生化方 法。能降解壳聚糖的酶可分为专一性酶和非专一性酶。专一性酶有壳聚糖酶，它 主要存在于细菌，真菌和高等植物中。对壳聚糖具有降解作用的非专一性酶目前 发现有3 7 种，如蛋白酶，脂肪酶，溶菌酶，纤维素酶等。酶降解是在较温和的 条件下进行的，过程中没有其他反应试剂的加入，不发生其他副反应，对环境污 染少；另外酶降解的过程和降解产物的分子量分布更容易控制。目前酶降解法的 研究还处于实验室阶段。 ( 3 ) 外场辅助降解法 除上述酸降解，氧化降解和酶降解外，还可以通过一些施加外场的方法对壳 聚糖进行降解。如辐射法，微波法，超声波法等。有研究表明：用y 射线可以使 壳聚糖发生降解，分子量从2 7 4 万降至2 4 万，但是分子量还是较高。而且辐 射降解服从无规律降解动力学，即分子链上任何一处的同类化学键都有均等的断 裂机会“1 ，因此该法的缺点是容易引起一些交联和支化反应。 ( 4 ) 氧化降解法 氧化降解法是近年来研究比较多的一种方法，普遍采用多种试剂对壳聚糖进 行降解或降解产物的后处理。氧化法降解速度快，成本低，易于实现产业化，但 是氧化剂的使用增加了降解产物的分离纯化的难度。氧化降解法主要有h 。o ：法， n a c l o h 2 0 2 法，n a b o 。法，c l ：法等。其中h , o 。降解法用的最多。 采用h ：o ：做氧化剂降解壳聚糖是目前研究较多的一种方法。其优点是成本 低、易处理，且对反应产物的后处理影响小，无残毒，易于实现工业化。h , o ：降 硕士论文低聚壳聚糖的制备及应用研究 解可在酸性、碱性和中性条件下进行。在酸性介质中，反应是均相反应，介质可 以是乙酸或者盐酸；在碱性和中性介质中，壳聚糖不溶解，降解反应是非均相反 应，反应既慢且不均匀。在反应过程中，壳聚糖的黏度和脱乙酰度都会发生变化， 其影响因素主要有反应介质以及介质浓度、h 2 0 。用量、反应时间和温度等。对此 研究者做了很多的工作，但都是单独考虑某个或某些因素对降解产物的影响，有 关怎样控制制备条件制备低聚壳聚糖的系统研究未见报道。本实验将综合考虑各 因素设计h 2 0 ：氧化降解壳聚糖正交化实验，讨论各因素对降解产物分子量分布的 影响并得出h 2 0 。氧化降解壳聚糖的最优条件，为靶向制备特定要求的低分子量壳 聚糖提供科学依据，并且在此基础上研究3 9 糖的制备。另外脱乙酰度高低对 于壳聚糖的降解有影响是鲜为人知的，本实验在这方面也将做些初步探讨。 2 2 实验与研究 2 2 1 药品和仪器 壳聚糖( d d 8 6 ，浙江省玉环县海洋生物制品厂) ，壳聚糖( d d 9 9 ，青岛 海汇生物制品有限公司) ，过氧化氢( 3 0 、a r ) ，盐酸( a r ) ，亚硝酸钠( a r ) ， 乙醇( 无水乙醇，a r ) ，氢氧化钠( a r ) ，冰醋酸( a r ) ，氯化钠( a r ) 等。 鸟氏粘度计( 内径为0 6 m m ，上海申立玻璃仪器有限公司) ，电子天平，温 控仪( w m n k 一4 0 1 ，上海医用仪表厂) ，j j l 精密增力电动搅拌器( 常州国华电动 设备公司) ，真空干燥器，真空泵，三颈烧瓶等。 2 2 2 壳聚糖的纯化 由于壳聚糖中含有灰分等一些杂质，在实验之前应将壳聚糖纯化。具体方法 如下：将壳聚糖溶于6 的h c l 溶液中，过滤，除去不溶性的杂质，然后调节p h 值至1 0 1 1 ，抽滤，将沉淀物用大量去离子水冲洗至中性后真空干燥，得到白 色的纯化壳聚糖。 2 2 3 解聚剂的选择 用经过纯化的壳聚糖平行配制3 份相同浓度的壳聚糖醋酸胶体溶液，醋酸浓 度相同。分别加入不同的解聚剂，在表1 所示的条件下反应，观察胶体溶液变成 真溶液所需的时间。 硕士论文 低聚壳聚糖的制备及应用研究 壳聚糖解聚剂可用h ：o ：、h c l 、n a n o ：，但以浓h c l 加水分解壳聚糖时，反应 不均匀，壳聚糖链端分解容易进行，壳聚糖大部分被分解为d 一葡糖胺单糖，从 而难以制备低聚壳聚糖，同时，以传统的酸解分解物中含有大量的有色物和酸， 以往使用活性炭将降解物脱色、脱盐等后处理，但是效果很差，很不经济。三种 解聚剂解聚的效果也不相同，如表l 所示，在相同浓度壳聚糖醋酸溶液中加入三 种不同的解聚剂，虽然n a n 0 2 效果较好但是在酸性条件下反应会产生有害的n o ： 气体，反应差，去除未反应物困难，所以壳聚糖的稳定性差。因此本试验选择 i t ：0 。作解聚剂，因为h 。0 。不但解聚速度快，而且可以脱色，效果较好。 2 2 4 反应条件的研究 2 2 4 1 实验操作： 综合有关用h ：0 ：做氧化剂降解壳聚糖的反应条件的报道“”，按表2 所示 因素水平设计l 。( 4 5 ) 正交试验。将壳聚糖按1 ：2 0 ( w v ) 比例加入相应浓度的 介质中，搅拌至完全溶解后，将溶液转移至三颈烧瓶中，水浴加热至所设温度， 打开分液漏斗，在搅拌下按设定的用量比r ( h ：0 。与糖单元摩尔比) 滴加h z o ：。 反应一定时间后停止反应，用2 m o l l 的n a o h 调节p h 值至中性，冷却抽滤。滤 液在5 0 以下减压浓缩，加入三倍量的乙醇( 体积分数) 放置过夜，抽滤，真 空干燥，得到水溶性壳聚糖。然后测定其脱乙酰度和特性粘度。 表2 ；过氧化氢降解壳聚糖影响因素表 硕士论文 低聚壳聚糖的制各及应用研究 2 2 4 2 试验结果与讨论 ( 1 ) 产物的表征 低聚壳聚糖的水溶性： 由于一0 h 一0 型及0 h n 型氢键的存在使得甲壳素分子内具有强烈的氢 键作用及晶型结构。导致了甲壳素不溶于水及一般溶剂，只溶于强无机酸及含5 氯化铝的( n ，n ) 一二甲基乙酰胺“”。壳聚糖经脱乙酰化反应后游离氨基含 量增加，晶体结构受到破坏，但也只能溶于稀酸溶液，这在很大程度上限制了它 们的应用，壳聚糖经过氧化氢氧化降解后，分子链长度减短，分子量下降。这样， 在水溶液中，分子链之间的运动变得无序，分子链上游离氨基的水合作用增强， 有助于提高其水溶性。我们用过氧化氢氧化降解壳聚糖得到的低聚壳聚糖具有 优良的水溶性。 脱乙酰度的测定 脱乙酰度的测定方法很多，如碱量法( 包括酸碱滴定法、电位滴定法、氢溴 酸盐法等) 、红外光谱法、折光指数法、胶体滴定法、热分析法、气相色谱法、 元素分析法、紫外光谱一阶导数法，紫外光谱法、苦味酸分光光度法等。常用的 是酸碱滴定法，其次是红外光谱法、电位滴定法等“”。 酸碱滴定法是最简单的一种测定壳聚糖中自由氨基含量的方法，不需要特殊 仪器，重复性好，特别适合于生产过程中的质量监控。酸碱滴定法的原理，是壳 聚糖的自由氨基呈碱性，可与酸定量地发生质子化反应，形成壳聚糖胶体溶液： 溶液中游离的h + 用碱反滴定，这样，从用于壳聚糖的酸量与滴定用去的碱量之 差，即可推算出壳聚糖自由氨基结合酸的量，从而计算出壳聚糖中自由氨基的含 量。自由氨基的西分数即为壳聚糖试样中的氨基含量占理论氨基的百分数。理论 氨基含量为壳聚糖分子中氨基葡萄糖残基( 链节) 的分子量中氨基( n h 。) 占其 分子量的百分数： 理论氨基含量= 1 6 1 6 1x1 0 0 = 9 9 4 具体测定步骤： 准确称取0 3 o 5 克壳聚糖样品，置于2 5 0 m l 三角瓶中，加入标准0 1 m o l l 盐酸溶液3 0 m l ，在2 0 一2 5 搅拌至溶解完全( - r a n 适量蒸馏水稀释) ，加入2 3 滴指示剂( 采用甲基橙一溴甲酚做指示剂，在滴定过程中由橙色变成蓝紫色，颜 色变化明显) ，用标准0 1 m o l l 氢氧化钠溶液滴定游离的盐酸。另取一份样品， 置于1 0 5 烘干至恒重，测定水分，每个样品要各测三次。 计算：氨基含量： 硕士论文低聚壳聚糖的制各及应用研究 ( - - n h 2 ) ：( c i v i - - c 2 v 2 ) x 0 0 1 6 1 0 0 式中c 。盐酸标准溶液的浓度，m o l l ： c 广氢氧化钠标准溶液的浓度，m o l l v ，加入的盐酸标准溶液的体积，m l ； v ：滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积，m l f i r 样品重，g ： 0 0 1 6 与l m l l m o l l 盐酸相当的氨基量，g 。 脱乙酰度( d d ) = 等1 0 0 注意事项： ( i ) 溶解样品时的温度不宜太高，以免发生盐酸消耗于壳聚糖主链的水解，造 成误差，一般是在室温下溶解样品。 ( i i ) 样品的脱乙酰度越高，溶解越快，反之则越慢，甚至耍放置过夜。 ( i i i ) 壳聚糖的脱乙酰基是不均匀的，常会造成样品溶解不完全，三次测定的数 据相差太大，不能用，必须重做。 ( i v ) 样品必须是中性的，否则会影响测定结果。如果不是中性的，应该重新洗 涤至中性，或者作校正。 ( v ) 大气中的氧对分析结果的影响可忽略不计，无须用氮气保护。 粘度的测定 ( i ) 操作 按一点法测定【4 3 】：把壳聚糖样品干燥恒重，准确称取 1 9 1 2 9 ( 称量精度o 0 0 5 9 ) ，用o 1 m o l l 乙酸o 2 m o l l 氯化钠溶剂配成2 5 0 m l 样品溶液，此样品溶液的浓度为c i ； 将此溶液经3 号砂芯漏斗过滤，精密量取中间部分滤液 1 0 m l ，移入乌氏粘度计侧管( 粗管) ，将粘度计垂直固定予 恒温水浴中保温l o m i n 以上，使管内溶液的温度与水浴的温 度达到平衡。在另外2 根支管口各接1 根乳胶管，将侧管上 面的乳胶管用夹子夹住。用吸球自中间乳胶管吸气，使样品 溶液渐渐上升，直到a 刻度线以上，此时先放开架子，再移 走吸球，使样品溶液在毛吸管内自然下落，用秒表准确测量 并记录溶液下降时通过a b 刻度线之间的时间。 硕士论文 低聚壳菜糖的制各及应用研究 ( i i ) 计算 相对粘度：