（影像医学与核医学专业论文）补益药活性成分对帕金森病的调节作用及其机制探讨.pdf

上海交通大学上： 母父迥大罕 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 寺蔹专 日期：伽6 年f 月c ，日 上海交通大学上海父逋大字 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密囱，在五年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：气管弄坞 指导教师签名：苞碱研毛u 日期：印6 年f 月( o 日 日期：刊；年r 月t1 日 补益药活性成分对帕金森病的调节作用及其机制探讨 摘要 帕金森病( p d ) 是中老年常见的一种中枢神经退行性疾病。其主要特征是中脑 黑质多巴胺神经元进行性变性坏死，其标志性病理变化是酪氨酸羟化酶显著减少， 使酪氨酸不能有效地转化为多巴。目前临床上主要用多巴胺前体或其类似物治疗， 但是属于对症疗法，往往随着病程延长而失效，正在大力研究能延缓或逆转细胞退 行性变化的措施，以细胞植入为主的基因治疗也在积极研究中，但是距离可供临床 应用的成熟疗法还相当远。根据中医理论认为本病患者多为肝肾阴虚、气血两虚， 因此滋阴、补气、补血药物在抗p d 方剂中常用。 我们以往的实验表明滋阴药知母的活性成分知母皂甙元z m s 及其2 5 位异构体 异菝葜皂甙元s m i ( 5 d ，2 0 a ，2 2 a ，2 5 r s p i r o s t a n 一3 d - 0 1 ) 能改善老年及拟痴呆大鼠 学习和记忆功能，增加脑内b d n f 分泌，具有神经保护和神经营养作用。最近我们 又发现，z m s 和s m i 对中枢神经系统的多巴胺神经元也有明显的保护作用。受此启 发，我们筛选了不同类型补益药对体外p d 细胞模型中多巴胺神经元的作用，发现 滋阴药物对损伤的多巴胺神经元有保护作用。进而我们对其机制进行了探讨，发现 药物的保护作用与g d n f 表达增加有关。现报道如下： 本课题分为三部分： 1 、补益药对老年大鼠多巴胺神经系统的影响 通过放射配基结合分析法及免疫组化研究老年大鼠脑内多巴胺d 1 、d 2 受体密 度及酪氨酸羟化酶( t h ) 阳性神经元的变化以及药物s m i 的调节作用。结果表明老年 大鼠脑内d l 、d 2 受体密度，t h 阳性神经元数目与青年组相比下降，药物s m i 能够 明显上调d 1 、d 2 受体密度，增加d a 神经元数量，提示s m i 与l - d o p a 联用治疗p d 将具有良好的疗效。 2 、补益药对离体多巴胺神经元的作用 建立6 一o h d a s h m p p + 两种p d 细胞模型，通过免疫细胞化学、免疫荧光和m t t 等方法 观察各种补益药对细胞模型损伤的神经元的作用。结果表明滋阴药知母皂甙元、梓 醇能够明显减少毒素诱导的多巴胺神经元的减少及突起的缩短，并能促进非多巴胺 神经元的存活，补气药人参皂甙能够防止m p p + 诱导的多巴胺神经元突起缩短，而助 阳药去甲乌药碱、淫羊霍甙、活血药川芎嗪对损伤的神经元没有明显影响。 3 、补益药对离体多巴胺神经元调节作用的分子机制 应用e l i s a 、r t - p c r 和和应用中和抗体阻断的方法，观察了药物s m i 对损伤的多 巴胺神经元的胶质细胞源性神经营养因子( g d n f ) 及其受体的影响，实验结果表明药 物作用4 8 h 后能够明显增力i g d n f 分泌，提高药物g d n f m r n a 的表达，对g d n f 受体r e t m r n a 的表达无明显影响，进一步，我们证实了加入g d n f 中和抗体能够部分消除药物 对多巴胺神经元的作用。然而，实验发现药物对g d n f 受体的调节不明显。 从上述实验，我们得出以下结论： 滋阴药物知母皂甙元和梓醇对离体的多巴胺神经元有明显的保护作用，提示这 些药物可能延缓p d 进程，减轻l - d o p a 等药物的副作用。通过对药物机制的研究发 现，g d n f 确实参与了药物对多巴胺神经元数量及突起长度的调节，从而发现了药 物作用的一条新途径，为药物在p d 治疗中的应用提供实验依据。 创新性：本课题所有部分均为创新性研究，目前国内外尚无有关知母皂甙元与 老年动物多巴胺系统关系的研究，对不同类型补益药物对离体多巴胺神经元的作用 也未见系统的报道。我们也是首次证实了知母皂甙元的作用机制与增加g d n f m r n a 表达有关，开辟了一条治疗p d 等神经退行性疾病的新途径。 关键词：帕金森，知母活性成分，梓醇，多巴胺神经元，胶质细胞源性神经生长因 子 r e g u l a t i o ne f f e c to f a c t i v ec o m p o n e n t o ft o n i ch e r b s o np a r k i n s o n sd i s e a s ea n di t sm e c h a n i s m a b s t r a c t p a r k i n s o n sd i s e a s ei sac o m m o na g e r e l a t e dn e u r o d e g e n e r a t i v ed i s o r d e r c h a r a c t e r i s e db yp r o g r e s s i v el o s so fd o p a m i n e r g i cc e l l si nt h es u b s t a n t i an i g r a t h e h a l l m a r ko ft h i sp a t h o l o g yi ss i g n i f i c a n tr e d u c e dl e v e lo ft y r o s i n eh y d r o x y l a s e ( t h ) w h i c hr e s u l t si ni n e f f e c t i v et r a n s f o r m a t i o nf r o mt y r o s i n et od o p a t h ec u r r e n t p h a r m a c o l o g i c a lt r e a t m e n t sf o rp a r k i n s o n sd i s e a s ei sm a i n l yd o p a m i n ep r e c u r o s o ra n d i t sa n a l o g u e ，b u tt h ee f f e c ti sm o s t l y p a l l i a t i v ea n dp r o l o n g e du s a g eo ft h ed r u gm a yb e u n r e s p o n s i v e n e wt h e r a p e u t i ca p p r o a c h e si n v o l v e di nd e l a y i n go rr e v e r s i n gn e u r o n n e u r o d e g e n e r a t i o no rg e n et h e r a p ya r eu n d e ra c t i v ei n v e s t i g a t i o n s h o w e v e lt h es t e p s t o w a r d st h i ss t r a t e g yi nc l i n i c a lp r a c t i c es t i l lh a v eal o n gw a yt og ot ob ef u l l ya c h i e v e d b a s e do nt h et h e o r yo ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ，p a r k i n s o n sd i s e a s eu s u a l l y m a n i f e s t e di t s e l fa sk i d n e yy i nd e f i c i e n c ya n dq id e f i c i e n c ya n db l o o ds t a s i s ，y i nt o n i c s ， q it o n i c sa n dh e r b sa c t i v a t i n gb l o o dc i r c u l a t i o na r e 仔e q u e n t l yu s e d i np r e v i o u ss t u d i e s ，w ef o u n dt h a tt h ew a t e re x t r a c to ft h et r a d i t i o n a lc h i n e s eh e r b r h i z o aa n e m a r r h e n a ec a ni m p r o v em e m o r ya n dr a i s et h eb r a i nm r e c e p t o rd e n s i t yi n a g e da n i m a l sa n ds o m en e u r o d e g e n e r a t i o nr a tm o d e l s t h ea c t i v ec o m p o n e n tr e s p o n s i b l e f o rt h e s ea c t i o n si ss a r s a s a p o g e n i n ( 5 p ，2 0 c t ，2 2 c t ，2 5 s - s p i r o s t a n 一3 d - o l ，a b b r e v i a t e da s z m s ) i t s2 5 r - a n a l o g u e ( s m i ) w a se q u a l l ye f f e c t i v e r e c e n t l yw ef o u n dt h a tz m sa n d s m ic o u l da l s oi n c r e a s et h eb d n fl e v e la n dt h es t a b i l i t yo fm 2m r n a i m p l y i n gt h a t t h e s ed r u g sm i g h ta f f e c tt h en e u r o d e g e n e r a t i o np r o c e s sa n dh e n c em i g h ta l s oh a v e b e n e f i c i a le f f e c to np a r k i n s o n sd i s e a s e b a s e do nt h e s eo b s e r v a t i o n s ，w et e s t e dt h ee f f e c t o fs m io nt h ed e n s i t i e so fd o p a m i n er e c e p t o rs u b t y p e1a n d2a n do nt h ec o n c e n t r a t i o no f t hi na g e dr a t s ，s c r e e n e dt h et h e r a p e u t i cp o t e n t i a lo fc e r t a i na c t i v ec o m p o n e n t so fy i n t o n i c s ，y a n gt o n i c s ，q it o n i c sa n dh e r b sa c t i v a t i n gb l o o dc i r c u l a t i o nw i t hc e l lm o d e l so f p a r k i n s o n sd i s e a s e ，a n da s s e s s e dt h ei n t e r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee f f e c to fs m io nt h e n e u r o d e g e n e r a t i o nc h a n g e sa n do nt h el e v e l so fg d n fa n dg d n fr e c e p t o r t h es t u d y w a sd i v i d e di n t ot h r e ep a r t sa n dt h er e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w i n g ： p a r t1 ：e f f e c to fr u n i ch e r b so nd o p a m i n e s y s t e m d e n s i t i e so fd o p a m i n er e c e p t o rs u b t y p e1a n d2 ( d 1a m dd 2 r e c e p t o r s ) a n dt h e n u m b e ro ft h p o s i t i v en e u r o n si na g e dr a tb r a i nw e r ea s s e s s e db yr a d i o l i g a n db i n d i n g a s s a y ( r b a ) a n di m m u n o h i s c h e m i s t r yr e s p e c t i v e l y t h ed a t as h o w e dt h a tb o t hd 1a n d d 2 r e c e p t o rd e n s i t i e sa n dt hp o s i t i v en e u r o n sw e r em a r k e d l yl o w e r e di na g e dr a t sw h e n c o m p a r e dw i t hy o u n gr a t s s m lw a se f f e c t i v ei nu p - r e g u l a t i n gd 1a n dd 2 r e c e p t o r d e n s i t i e sa n dp r e v e n t i n gd o p a m i n en e a r o nl o s s e s p a r t2e f f e c t so fa c t i v ec o m p o n e n t so fc e r t a i nt o n i ch e r b so nd o p a m i n en e u r o n s a p p l i c a t i o no f n e u r o t o x i n6 - o h d ao rm p p + t op r i m a r yc u l t u r eo f m e s e n c e p h a l i c n e u r o n sl st h ec o m m o n l yu s e dc e l l u l a rm o d e l so f p a r k i n s o n sd i s e a s e t h ee f 凳c to f d i f f e r e n tk i n d so ft o n i ch e r b so nd a m a g e d d o p a m i n en e u r o n sw a sm e a s u r e db v i m m u n o c y t o c h e m i s t r y , i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n dm t t a s s a y p r e t r e a t m e n tw i t hs m io r c a t a l p o l ( a na c t i v ec o m p o n e n to fa n o t h e ry i nt o n i cd i h u a n g ) c o u l di n h i b i tm e i e d u c t i o n o ft hp o s i t i v en e u r o n sa n dn e u r i t el e n g t h a c t i v ec o m p o n e n to f t h eq it o n i cg i n s e n g t h e g i n s e n o s i d e sr g la n dr b l ，p r o t e c t e dt h es h o r t e n i n go f t h et h p o s i t i v ec e l ln e 谢t e sb u t d i dn o ts h o we f f e c to nc e l ll o s sc a u s e db ym p p + t h ea c t i v ec o m p o n e n t s o f y a n gt o n i c s d e m e t h y l c o c l a u r i n e ，e p i m e d i u ma n dt h ea c t i v ec o m p o n e n to ft h eh e r ba c t i v a t i o n gb l o o d c i r c u l a t i o n ，l i g u s t r a z i n es h o w e dn oe f f e c to nd o p a m i n e r g i cn e u r o n s p a r t3m o l e c u l a rm e c h a n i s mo f p r o t e c t i v ee f f e c to ft o n i ch e r b so nd o p a m i n e r g i c n e u r o n s i nt h i sp a r t ，w eo b s e r v e dt h ee f f e c to fs m i o ng d n fa n di t sr e c e p t o ri na p r i m a r y m e s e n c e p h a l i cc u l t u r es y s t e md a m a g e db ym p p + u s i n gt h eg d n f e l i s a ，g d n fa n d r e tm r n ar t - p c ra n dn e u t r a l i z a t i o na n t i b o d i e s ，t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tm e r a d d i t i o no fs m if o r4 8 h ，i n c r e a s e dm r n a e x p r e s s i o nl e v e l so fg d n f 、张r ef o u n di nt 1 1 e s m i - t r e a t e dm e s e n c e p h a l i cc e l l sa l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo f g d n fl e v e i si nt h ec u l t l 聪 m e d i u m h o w e v e rs m ih a sn os i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo ng d n f r e c e p t o r w h e nt h e f u n c t i o nb l o c k i n ga n t i b o d i e s ，a n t i g d n fo ra n t i g d n f r e c e p t o ra l p h a ，w a sa d d e dt ot h e c u l t u r em e d i u mt o g e t h e rw i t hs m i ，t h ep o s i t i v en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c to fs m i ，a l s l a r g e l yb u tn o tc o m p l e t e l ya b o l i s h e d t a k i n gt o g e t h e r , w ec a m e t ot h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： a c t i v ec o m p o n e n t so fy i nt o n i ch e r b ss m ia n dc a p a l t o lh a v es i g n i f i c a n t n e u r o p r o t e c t i v ee f f e c to nd o p a m i n e r g i cc e l l si nv i t r oi m p l y i n gt h a tt h e s ea c t i v e c o m p o n e n tm a yb e c o m ee f f e c t i v et h e r a p e u t i cs t r a t e g i e sa i m i n ga th a l t i n gt h ep r o g r e s s i v e p r o c e s so fp d a n dp o s s i b l ya tl e s s e n i n gt h es i d ee f f e c t so fl - d o p a s t u d y i n go nt h e m e c h a n i s mo fs m i ，w ec o n f i r m e dt h a tg d n fi si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no fs m io n d o p a m i n e r g i cn e u r o nn u m b e ra n dn e u r i t eo u t g r o w t hi nv i t r o i tp r o v i d e da n e wf i e l d a b o u tt h ea c t i o no fs m i i n n o v a t i o n ：t h e s et h r e ep a r t so fe x p e r i m e n t sw e r ec r e a t i v er e s e a r c h t od a t e ，t h e r e h a sb e e nn or e p o r ta b o u tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns m i ，z m s ，c a t a l p o la n dd o p a m i n e s y s t e mi na g e da n i m a l sa n do t h e ri nv i t r oo ri nv i v om o d e l sr e l a t e dt op a r k i n s o n sd i s e a s e a tt h es a m et i m e ，w ef i r s td e m o n s t r a t e dt h a ts m ii n d u c e sg d n fm r n ae x p r e s s i o nt h a t i sb e n e f i c i a lt of e t a lm e s e n c e p h a l i cd o p a m i n e r g i cn e u r o n s t h e yp r o v i d ee v i d e n c ea b o u t t h ey i n - y a n gt h e o r yo ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n er e l a t e dt op a r k i n s o n sd i s e a s ea n d w o u l dp a v ean e ww a yt op dt r e a t m e n t k e yw o r d s ：p a r k i n s o n sd i s e a s e ，a c t i v ec o m p o n e n to f z h i m u ，s m i l a g e n i n ，c a t a l p o l ， d o p a m i n e r g i cn e u r o n s ，g l i a lc e l ll i n e - d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r 第一部分 第二部分 第三部分 结论 讨论 参考文献 附录 致谢 发表文章 目录 补益药对老年大鼠多巴胺神经系统的影响 第一节补益药对老年大鼠多巴胺受体密度的影响 第二节补益药对老年大鼠多巴胺受体密度的影响 补益药对离体多巴胺神经元的作用 第一节6 - o h d a 诱导的多巴胺神经元毒性作用及植物药活性 成分对神经元损伤的干预 第二节m p p + 诱导的多巴胺神经元毒性作用及植物药活性成 分对神经元损伤的干预 补益药对离体多巴胺神经元调节作用的分子机制 4他甜 船 卯贝铉钌铝加饥 上海交通大学博士学位论文 第一部分补益药对老年大鼠多巴胺神经系统的影响 本章主要内容 1 1 补益药对老年大鼠脑内多巴胺受体密度的影响 1 2 补益药对老年大鼠脑内酪氨酸羟化酶的影响 帕金森病( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 是一种常见的中枢神经系统退行性疾病， 主要见于中老年人，严重影响患者的生存质量。p d 病理改变主要是中脑黑质致密带 ( s u b s t a n t i an i g r az o n ac o m p a c t a ，s n c ) 多巴胺( d o p a m i n e ，d a ) 神经元死亡，以及纹 状体多巴胺分泌减少，临床上出现肌强直、肢体震颤和运动减少等症状n 。因此， 该病患者多为多巴胺神经系统发生退行性改变。 药物治疗的原理主要是恢复多巴胺神经系统功能，保护残留的多巴胺神经元， 以及调节纹状体多巴胺和乙酰胆碱两大递质系统的平衡，包括多种改善d a 递质功能 药物和抗胆碱能药物。目前治疗p d 常用的药物主要有以下几种： 1 多巴类制剂：l - d o p a 仍是目前治疗p d 最常用最有效的药物之一，由于d a 不能通过 血脑屏障，给予d a 的前体，经血脑屏障进入脑内，被d a 能神经元摄取后转变成d a 发 挥替代治疗作用。l - d o p a 副作用较大。为减少其外周副作用、增强疗效，临床多用 l - d o p a 与多巴脱羧酶抑制剂制成复方制剂。常用的有美多巴( m a d o p a r ) ，由l d o p a 力h 苄丝肼组成。副作用为：( 1 ) 胃肠道反应，恶心、呕吐；( 2 ) 加药过程中出现体位性低 血压、心律失常；( 3 ) 长期服用出现异动症；( 4 ) 运动波动，“开关”现象等口1 。 2 多巴胺受体激动剂：常用的有溴隐亭和培高利特，分子构象与d a 相似，能直接作 用于d a 受体，改善l - d o p a 治疗相关的运动症状波动和运动障碍。其作用机制可能是： ( 1 ) 直接作用于多巴胺神经元受体，不参与d a 的代谢过程，减少d a 代谢毒性h 1 ；( 2 ) 抗自由基作用，可能与d a 受体激动剂多具有羟化苯环结构有关晦3 ；( 3 ) 抗凋亡作用， 减少由r o s 引发的凋亡信号通路阳3 ；( 4 ) 稳定线粒体膜电位的作用n 1 及神经营养作 用等1 。副作用是长期使用可能引起多巴胺受体失敏。 3 抗胆碱能药物：常用药物有安坦( a r t a n e ) ，通过拮抗胆碱受体而减弱黑质一纹状 上海交通大学博士学位论文 体通路中a c h 的作用。副作用是口干，视物模糊，并可能加重p d 病人的痴呆症状阳3 。 4 、多巴胺降解酶抑制剂：单胺氧化酶( m a o - b ) 抑制剂：丙炔苯丙胺( s e l e g i l i n e ) ，能 抑制单胺氧化酶对m p t p 氧化及形成神经毒性的m p p + 的过程，又能减少自由基的生成而 保护神经组织口0 1 。但有报道该种药物可能发生房颤n 。儿茶酚邻位甲基转移酶( c o m t ) 抑制剂：c o m t 抑制剂可使不具活性的3 一氧甲基多巴减少，从而使更多的l - d o p a 通过 血脑屏障在纹状体脱羧，增2 3 h d a ，提高疗效：还能延长血浆l - d o p a 半衰期，保持平稳、 不出现运动波动。c o m t 抑制剂最常见的副作用是运动障碍和肝脏损害n 2 1 。 5 抗炎药物：脑组织中小胶质细胞产生的炎性物质和神经毒性因子如细胞因子、自 由基、一氧化氮等，参与了神经变性过程，抗炎药物能阻止炎症介导的神经变性。 6 、其它药物： ( 1 ) 雌激素：p d 的患者有性别差异，男性明显多于女性。在中枢神经系统内，雌激 素可能通过多种机制提供神经保护作用，其发挥神经保护作用的机制可能包括抗氧 化作用对抗氧化应激，调节细胞内钙离子稳态水平，上调d l 和d 2 受体密度，增3 n b c l - 2 表达，激活m a p k 和c a m p 信号转导途径，以及上调神经营养因子b d n f ( 脑衍生神经营 养因子) 与g d n f ( 胶质细胞衍生神经营养因子) 表达等n 3 j 钔。 ( 2 ) 神经营养因子的保护作用：许多神经营养因子能够保护体外培养的神经元尤其 是多巴胺神经元生存和分化，这些营养因子包括g d n f ，f g f - 2 ，e g f ，t g f 一，c n t f ， b d n f 和n t 4 5 等，其中以g d n f ，f g f 一2 和b d n f 研究最深入。g d n f 处理过的动物模型苍白 球内可观察到永久性的轴突生长。在受损的黑质一纹状体神经轴突，一旦注入g d n f ， 损伤明显恢复n 5 1 。说明g d n f 是一种有效的神经保护因子和轴突生长刺激剂。 ( 3 ) 其他类型铁鳌合剂：抑制氧自由基生成和膜的脂质过氧化n 6 1 。兴奋性氨基酸受 体相关药物，如常用的金刚烷胺，通过降低兴奋性递质转运，对d a 神经元具有保护 作用n 7 1 。肌酸：阻断电子传递链复合物i 从而提供神经保护作用n 8 1 。 在上述药物中目前最常用也是最有效的方法仍然是摄入多巴胺前体左旋多巴补 充脑内多巴胺以缓解症状，但是左旋多巴能够被代谢为包括醌类和自由基在内的神 经毒性产物，加重对多巴胺神经元的损伤n 引，加速p d 进程。左旋多巴的副作用也不 2 上海交通大学博士学位论文 容忽视，如长期摄入引起运动障碍及精神方面的副作用，由于多巴胺受体的敏感性 改变会出现药物效应的开一关现象导致药物失效啪3 。 中药目前研究进展： p d 属于祖国医学“颤证 “震颤”“颤振 “掉”等的范畴。中医药认为本病 病在筋脉，与肝肾脾脏关系密切，多因年老体虚、情志过极、饮食不节、劳逸适当等 原因导致气血阴精亏虚，不能濡养筋脉：或痰浊瘀血壅阻经脉，气血运行不畅，筋脉失 养而致。其病理性质总属本虚标实。 目前研究的抗p d 中药及其作用机理有： 1 ) 抗氧化及抗自由基作用：近来的研究表明，j i l 芎、白芍、田七等具有明显的抗过 氧化损伤作用乜，另有研究证实人参、红参、太子参、党参、沙参、玄参、首乌、 当归、构祀果、熟地、狗脊、淫羊霍等2 0 余种补药对活性氧均有清除作用昭2 j 。 2 ) 抗多巴胺细胞凋亡的作用：银杏平颤方及其拆方可能通过部分抑制脑内线粒体酶 复合体活性下降，维持线粒体的功能，阻止中脑多巴胺神经元的凋亡，以减缓帕金森 病的进展窿引。滋补肝肾通络解毒中药对神经元细胞凋亡也有明显抑制作用乜钔。 3 ) 多巴胺受体激动剂的作用：从我国云南河谷地中提取的生物碱左旋千金藤定碱，当 应用6 0 h d a 损毁黑质致密部的d a 能神经元，左旋千金藤定碱表现为d a 受体的激动作 用2 朝。 4 ) 抑制兴奋性氨基酸作用：中药抗震止痉胶囊可改善p d 大鼠的旋转行为，能够减少 兴奋性氨基酸的过度释放，对抗其神经毒性，有保护d a 神经元的作用心6 j 。贺娟等 报道草果知母汤( 草果、知母、黄芩、厚朴、半夏、营蒲、赤芍、乌梅、甘草) 可通 过降低n m d a 受体m r n a 的表达来降低n m d a 受体的含量。 5 ) 促神经生长作用：曹学兵等他8 1 在对不同中药方剂治疗p d 大鼠的研究中发现，由白 芍、木瓜、当归、鸡血藤、全蝎、当归等组成的p di 号方可以明显改善p d 大鼠的旋 转行为，显著提高碱性成纤维细胞生长因子和降低胶质纤维蛋白的表达，具有治疗实 验性p d 的作用。 中药具有不易产生耐受性，副作用小，适应性广等优点，近年来中西药联合应 上海交通大学博士学位论文 用治疗本病，可以有效改善p d 患者的症状，减轻单纯长期使用西药带来的副作用， 延缓p d 症状的进展。 1 1 补益药对老年大鼠脑内多巴胺受体密度的影响 1 1 一 日u 舌： 我们科室对中药抗脑衰老研究已多年，根据黄帝内经的基本理论，有“阳常有余， 阴常不足”( 朱丹溪) ，“阳非有余，真阴不足”( 张景岳) 等学说，认为中药延缓衰 老及治疗神经退行性疾病着重调整机体的内环境及人体与外界环境的和谐平衡，阴 阳平衡失调是衰老及神经系统退行性变老年人的根本原因。因此提出滋阴药物及补 血、补气中药在治疗衰老及神经退行性变中应该具有重要作用。 我们以往的实验表明滋阴药知母的活性成分知母皂甙元z m s 及其2 5 位异构体异 菝葜皂甙元s m i ( 5 p ，2 0 a ，2 2 a ，2 5 r - s p i r o s t a n 一3 p 0 1 ) 能提高老年及拟痴呆大鼠的 脑m 受体密度，改善学习和记忆功能，也能上调降低的原代培养神经细胞和转基因 细胞m l 和m 2 受体密度，同时发现药物能增加老年大鼠脑内b d n f 分泌，具有神经保护 和神经营养作用油棚3 1 3 船。由此推测药物是否对多巴胺系统也有类似的作用，因此 本部分观察滋阴药知母皂甙元对老年大鼠多巴胺受体密度的影响，初步探讨知母皂 甙元对老龄大鼠多巴胺神经系统的作用。 一、实验材料 1 动物：2 0 只清洁级s d 大鼠，2 0 月龄，雌雄各半，雌性体重3 0 0 9 一4 0 0 9 ，雄 性体重4 0 0 9 5 5 0 9 ，另l o 只清洁级s d 大鼠，3 月龄，均购自上海西普尔必凯公司。 2 试剂：3 h s p i p e r o n e 和3 h s c h 2 3 3 9 0 ( 比活度分别为3 4 8 t b q m m o l 和 3 2 6 t b q m m 0 1 ) 购自a m e r s h a m 公司，t e t a n s e r i n e 、s c h 2 3 3 9 0 购自s i g m a ；h a l o p a r i d o l 购自上海永福制药厂；s m i 由英国p h y t o p h a r m 公司提供，纯度 9 8 。p e i 购自英国 b d h 。玻璃纤维滤膜为国产红光6 9 型。b 1 缓冲液：t r i s h c l 缓冲液，5 0 m m o l ，p h 7 4 ， 含10 m m o l l m g c l 2 3 仪器： 4 上海交通大学博士学位论文 液体闪烁计数仪：l s 6 5 0 0 型，美国b e c k m a n 公司。 h i m a c c r 2 1 f 型高速冷冻离心机：日本日立公司。 z t - i i 型多头细胞样品收集器：浙江绍兴东浦医疗机械厂。 y b d z 2 3 b 电动吸引器：上海医疗仪器厂。 内切式匀浆机：浙江绍兴机械厂。 7 3 1 2 i i 型电动搅拌机：上海标本模型厂。 k e 8 4 电动震荡电热恒温水浴箱：上海新兴医疗仪器厂。 u 2 0 0 0 分光光度计：日本日立公司。 二、实验方法 1 、动物分组( 随机) 及喂药：2 0 月龄s d 大鼠随机分为老年对照组和s m i 处理 组，每组1 0 只，分别每天经胃管喂服0 5 羧甲基纤维素钠( 对照组) 或悬浮于0 5 羧甲基纤维素钠的s m i ( 1 8 m g k g 天) ，连续喂服3 个月。实验前另加一组同来源的 3 月龄的s d 大鼠作为青年对照。 2 、膜蛋白受体的制备：大鼠断头处死，迅速取出大脑，置预冷4 c b l 缓冲液中， 用内切式匀浆器切碎，再用玻璃匀浆器匀浆上下五次，固定转速和时间。差速离心 法制备标本，2 0 0 0 x g1 5 分钟，取上清液2 7 0 0 0 x g1 5 分钟，取沉淀即为膜蛋白受体， 将沉淀悬浮于b 1 缓冲液中备用。上述过程均在4 进行。 3 、d 1 受体密度的测定：参照s w e e t 等和p o p o l i 等报道的方法口3 3 4 3 略加改变，饱 和曲线分析，每管加入l o o 13 h s c h 2 3 3 9 0 ( 0 2 5 一- 5 n m o l l ) 再加入1 0 0 p 1t r i s 缓冲 液或非标记s c h 2 3 3 9 0 ( 5 p , m ) 分别测定总结合和非特异结合。最后加入膜蛋白悬液 2 0 0 p l ，使每管总体积为4 0 0 j t l ，3 7 。c 震荡水浴中反应5 0 分钟，冰冷蒸馏水终止反应， 立即用多头细胞样品收集器抽滤到玻璃纤维滤膜上，淋洗三次，8 0 。cl h 烘干，投入 到l m l0 6 b p b d 闪烁液中用液体闪烁计数器( b e c k m a nl s6 5 0 0 ) 测量放射性。每 个样品的蛋白质浓度通过l o w e r y s 法测定。单点法，3 h s c h 2 3 3 9 0 浓度固定在 5 n m o l l ( 饱和区) ，其它试剂浓度及反应步骤相同。 4 、d 2 受体密度的测定：饱和曲线分析，每管加入1 0 0 13 h s p i p e r o n e ( 0 0 1 5 - - 5 上海交通大学博上学位论文 1 4 n m o l l ) 及终浓度4 2 5 n m 非标记k e t a n s e r i n e ( 用以抑制5 h t 受体的交叉结合) ， 再加入1 0 0 i t lt r i s 缓冲液或h a l o p a r i d o l ( 8 0 n m o l l ) 分别测定总结合和非特异结合。 最后加入膜蛋白悬液2 0 0 肛1 ，使每管总体积为4 0 0 p , 1 ，3 7 0 c 震荡水浴中反应3 0 分钟， 冰冷蒸馏水终止反应，立即用多头细胞样品收集器抽滤到玻璃纤维滤膜上，淋洗三 次，8 0 1 h 烘干，投入到l m l0 6 b p b d 闪烁液中用液体闪烁计数器( b e c k m a nl s 6 5 0 0 ) 测量放射性。每个样品的蛋白质浓度通过l o w e r y s 法测定。单点法，3 h - s p i p e r o n e 浓度固定在1 4 n m o l l ( 饱和区) ，其他试剂浓度及反应步骤相同。 5 、数据处理：饱和分析法使用上海交通大学医学院细胞调控研究室自制软件分 析。单点法使用下列方程计算： r t ( f m o l m g 蛋白) _ 总结合( c p m ) 一非特异结合( c p m ) 测量效率( ) 比活度( d p m f m 0 1 ) 标本蛋白量( m 曲 6 统计学分析：结果用均数标准差表示。数据用s a s 统计软件处理，各组含 量比较用配伍组设计方差分析。 三、实验结果 l 、饱和曲线：d 1 和d 2 受体饱和曲线分析见图1 1 1 ，从图中可见，d l 的k d 值为2 3 9 n m o l l ，d 2 的k d 值为1 0 4 n m o l l ，表明放射配基s c h 2 3 3 9 0 对d 1 受体的 亲和力低于放射配基s p i p e r o n e 对d 2 受体的亲和力。 f i g u r e1 1 1 s a t u r a t i o nc u r v e so fd 1a n dd 2r e c e p t o r sm e a s u r e dw i t h 3 h - s c h 2 3 3 9 0 ( d 1 ) 锄d3 h s p i p e r o n e ( d 2 ) 2 、老年大鼠d 1 受