（材料学专业论文）芯壳结构超细纤维及人工血管支架研究.pdf

摘要 外科临床迫切需要直径小于6 m m 小口径的人工血管替代物。采用同轴电纺 制备的超细纤维管既具有电纺纤维膜的高孔隙率和比表面积的特点，又与天然细 胞外基质结构相近，同时亦能够通过芯部载入生长因子，从而实现其控制释放。 聚l 丙交酯具有良好的生物相容性和可降解性，通过在其分子结构中引入亲水 性的聚乙二醇和柔性好的聚一己内酯链段，从而得到改善亲疏水性和力学性能的 聚( 乙二醇bl 丙交酯c o 己内酯) 共聚物( p e l c l ) 。 本文采用开环聚合的方法制备了p e l c l 共聚物，通过1 h 核磁共振和差式扫 描量热分析对产物结构进行了表征，并采用凝胶渗透色谱法测定了共聚物的相对 分子质量及其分布。以合成的p e l c l 共聚物与聚丙交酯c o 一乙交酯( p l g a ) 分 别为壳层原料，以右旋糖苷( d e x ) 为芯层原料，通过同轴电纺的方法制备了具有 芯壳结构的超细纤维，并利用扫描电镜和透射电镜观察超细纤维的微观形貌。 将血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 和血小板衍生生长因子b b ( p d g f b b ) 分别载入 芯部，考察肝素( h p ) 对v e g f 的结合作用，分别得到了d e x ( v e g f ) p l g a 、 d e x ( v e g f h p ) p l g a 、d e x ( v e g f h p ) p e l c l 、d e x ( p d g f - b b ) p e l c l 四种 样品，研究样品中生长因子的释放情况。在0 2 天的突释阶段，d e x ( v e g f ) p l g a 中v e g f 突释量为4 8 8 3 - 4 - 0 9 8 ，d e x ( v e g f h p ) p l g a 则为4 2 6 2 + 0 2 4 ， d e x ( v e g f h p ) p l c l 中v e g f 亦释放了3 9 8 6 a ：0 0 4 ，而d e x ( p d g f b b ) p l c l 中p d g f b b 累计释放了5 4 2 4 a ：0 4 。可见前期在d e x p l g a 体系样品中加载 h p 的比未加载h p 的v e g f 的累计释放量稍低，四种电纺纤维膜在电纺初期均 表现出严重的突释现象。 通过同轴电纺方法，以内层为d e x ( v e g f h p ) p e l c l 、外层为 d e x ( p d g f b b ) p e l c l 制备超细纤维管，并将其移植入大鼠腹主动脉，分别于 1 w 和4 w 后将材料取出，通过与d e x p e l c l 空白对照组的对比研究表明，载入 生长因子的电纺纤维管与对照组炎症反应均较大，但载入生长因子的电纺纤维管 具有良好的促纤维原细胞生长和血管生成作用。 关键词：人工血管同轴电纺控制释放生长因子生物相容性 a b s t r a c t a r t i f i c i a lb l o o dv e s s e lw i t hd i a m e t e rl e s st h a n6 m mi sc l i n i c a l l yn e e d e da s r e g e n e r a t i o n b i o m a t e r i a l s t h eu l t r a f i n ef i b r o u st u b e p r e p a r e d f r o mc o a x i a l e l e c t r o s p i n i n gi ss i m i l a rt on a t u r a le x t r a c e l l u l a rm a t r i x , a n dp o s s e s sh i g hp o r o s i t ya n d s p e c i f i cs u r f a c ea r e a a l s o ，c o n t r o l l e dr e l e a s eo fg r o w t hf a c t o rc o u l db er e a l i z e db y l o a d i n gt h e mi nt h ec o r e t h u s ，c o a x i a le l e c t r o s p i n i n gi s ag o o dw a yt op r e p a r e a r t i f i c i a lb l o o dv e s s e ls c a f f o l d sw i t hp e r f e c tb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s p o l y ( l l a c t i c a c i d ) ，p o l y ( e - c a p r o l a c t o n e ) a n d t h e i r c o p o l y m e r s a r eu s e d a st h e i r g o o d b i o c o m p a t i b i l i t y a n d b i o d e g r a d a b i l i t y w a t e r - s o l u b l ep o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) i s i n t r o d u c e di nb i o d e g r a d a b l ep o l y e s t e r st of o r mb l o c kc o p o l y m e r s ( p e l c l ) i nt h ep a p e r , r i n g - o p e n i n gc o p o l y m e r i z a t i o nw a su t i l i z e dt op r e p a r ep e l c l t h e o b t a i n e dc o p o l y m e ri sc h a r a c t e r i z e db y1 hn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c ea n d d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t e r , a n di t sr e l a t i v em o l e c u l a rm a s sw a sd e t e r m i n e db y g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h c o r e s h e l lu l t r a f i n ef i b e r sw e r ep r e p a r e db yc o a x i a l e l e c t r o s p i n i n gu s i n gs y n t h e s i z e dp e l c lo rp o l y ( 1 a c t i c - c o g l y c o l i ca c i d ) ( p l g a ) a s t h es h e l la n da na q u e o u ss o l u t i o no fd e x t r a n ( d e x ) a st h ec o r e t h em o r p h o l o g yo f e l e c t r o s p u nf i b e r sw e r eo b s e r v e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ea n dt r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ( v e g f ) a n dp l a t e l e td e r i v e d g r o w t hf a c t o r - b b ( p d g f - b b ) w e r el o a d e di nt h ec o r eo fd e x p l g a o rd e x p e l c l ， r e s p e c t i v e l y a n dt h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nh e p a r i n ( h p ) a n dv e g fw a ss t u d i e d s a m p l e so fd e x ( v e g f ) p l g a ，d e x ( v e g f h p ) p l g a ，d e x ( v e g f h p ) p e l c l ， d e x ( p d g f b b ) p e l c lw e r eo b t a i n e da n dt h er e l e a s ep r o f i l e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e b u r s tr e l e a s eo fv e g fi nd e x ( v e g f ) p l g aa tt h ei n i t i a lp e r i o dw a s4 8 8 3 4 - 0 9 8 w h i l ei nd e x ( v e g f h p ) p l g aa n dd e x ( v e g f - h p ) p e l c lw a s4 2 6 2 4 - 0 2 4 a n d3 9 8 6 + 0 0 4 ，r e s p e c t i v e l y t h er e l e a s eo fg r o w t hf a c t o r sw i t hh e p a r i nw a sl o w e r t h a nt h a to f w i t h o u th e p a f i n a l lo f t h e ms h o w e db u r s tr e l e a s ep h e n o m e n o n u l t r a f i n ef i b e rt u b ew a sp r e p a r e d b y c o a x i a le l e c t r o s p i n i n g ，u s i n gd e x w e g f - h p ) p e l c la n dd e x ( p d g f b b ) p e l c la st h ec o r ea n ds h e l l ，r e s p e c t i v e l y t h e n ，f i b e rt u b ew a st r a n s p l a n t e di n t ot h ea o r t ao fr a t sa b d o m e n ，a n dt a k e no u ta f t e r1 w e e ko r4w e e k s t h eb i o c o m p a t i b i l i t yo fe l e c t r o s p u nf i b e rt u b ea n dg r o w t hf a c t o r s e f f e c t so fi m p r o v i n gc e l lw e r ei n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w e dt h a te l e c t r o s p u nf i b r et u b e l o a d i n gw i t hg r o w t hf a c t o rh a ds e r i o u si n f l a m m a t i o nc o m p a r e dw i t hd e x p e l c l ， w h i l ew i t he x c e l l e n te f f e c tt oi m p r o v ef i b r o b l a s t sg r o w i n ga n dv e s s e lg r o w t h k e yw o r d s ：a r t i f i c i a lb l o o dv e s s e l ，c o a x i a le l e c t r o s p i n i n g ，c o n t r o l l e dr e l e a s e ， g r o w t hf a c t o r , b i o c o m p a t i b i l i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：漕灰奸 签字嗍 工7 年 石月 ；r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 嘈丈轩 多月 弓r 导师签名： 签字嗍：叫年妇了同 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 影响人类健康的主要原因之一就是人体器官的衰退、缺损、丧失。当人体器 官或组织因疾病或外伤受到损坏时，迫切需要器官移植，然而，只有在很少的情 况下，自体器官可以满足需要。采用同种异体移植或异种移植，往往具有排异反 应，严重时导致移植失败。全世界每年有成千上万的人由于心血管疾病而导致死 亡，特别是患有冠心病以及外部血管疾病而死亡的人居多。而相应的健康的自体 组织移植血管( 通常采用乳内动脉或者隐静脉) 作为旁路血管使用的人群很匮乏， 这就需要大量经过改良的人工血管来满足日益增长的血管移植的要求。因此，人 造血管支架具有广阔的应用空剧1 1 。 再生医学主要研究组织器官的修复、再生和功能重建。而生物医学材料是用 于对生物体进行诊断、治疗、修复，或替换其病损组织、器官，或增进其功能的 新型高技术材料。利用生物医用材料可以为再生医学提供有效的物质支持。 近几十年来，电纺技术在生物医用工程方面引起了人们注意。采用电纺的方 法制备的聚合物纤维其直径最小可以达到纳米级别【2 】，同时具有孔隙率高、比表 面积大的特点，因此在制备生物医学材料方面具有广泛的应用。早在1 9 7 8 年， a n n i s 和b o r n a t 就发表了采用聚亚胺酯电纺纤维制作血管支架的文章【3 】，更早在 1 9 8 5 年，由f i s h e r 和a n n i s l 4 】在动物体内对电纺制备的动脉支架性能进行了长期 的实验。因而采用聚合物进行电纺处理的方法在组织工程以及药物释放方面都有 较为广泛的应用。而近年来出现的同轴电纺技术能够制备一种芯壳结构的复合 纤维，利用这种结构，通过将生物活性因子负载于纤维支架芯部制备超细纤维管 作为人造血管，保持生物活性，从而有效的促进组织血管的形成、再生。 1 2 生物相容性材料 生物相容性【5 】是一个描述材料在特殊用途中与宿主的相互作用能力的概念。 某种材料的生物相容性好，是指这种材料能够与肌体相互适应，即材料对肌体没 有显著或严重的不良反应，肌体也不引起材料性能的改变。一般说来，材料的生 物相容性包括血液相容性和组织相容性。材料与生物体相互影响的原因在于生物 体处于动态平衡之中。一旦材料进入体内，就会使这种平衡遭到破坏，肌体就会 第一章绪论 做出反应。这种反应的强度以及这种反应是正向性还是负向性发展，决定着材料 的生物相容性。异体材料与生物接触时，在生物体方面往往出现血栓、炎症、毒 性反应、变态反应以及致癌等各种生物化学性拒绝反应。所以作为生物医学材料 必不可少的条件是生物相容性。另外，同一种生物医学纤维在体内和体外的降解 速度是有差别的，而用于生物组织治疗的生物吸收性纤维材料吸收速度则必须与 组织愈合速度同步。因此了解生物医学纤维材料的降解吸收性十分重要。一般认 为，影响可降解性的因素有化学结构、结晶性、亲水性疏水性平衡、外形和形态 结构等。 1 2 2 聚乳酸 聚乳酸( p l a 。又称聚丙交酯) ，是一种线形聚酯类高分子，是以乳酸为单体 经过化学合成或生物合成得到的一种高分子材料，无毒无刺激性，具有优良的生 物相容性，可被生物分解吸收或通过代谢排出体外，强度高，可塑性强，易加工 成型。它易被自然界中的多种微生物或动植物体内的酶分解代谢，最终形成水和 二氧化碳，不污染环境。经美国食品药物管理局( f d a ) 批准，其可以用作骨折内 固定材料和外科手术缝合线以及药物控释载体【6 j ，亦可用其或其共聚物做组织工 程支架材料等，因此在生物医学领域有广泛的应用，被认为是最有前途的可生物 降解的高分子材料。 p l a 的化学结构式为： h 。一重= _ 亘去佣 聚乳酸水解中间产物为乳酸，它是体内糖的正常代谢产物，可循乳酸的代谢 途径参与体内生化代谢，最终生成无害的小分子水和二氧化碳，故该聚合物 无毒、无刺激性、体内可吸收，具有良好的生物相容性。 由于聚乳酸的均聚物为疏水性物质，降解周期不易控制，因此通过共聚的方 法来合成乳酸共聚物改善其性能成为近年来医用生物降解高分子材料的研究热 点之一。近年来已相继合成了一系列的乳酸共聚物，如丙交酯乙交酯己内酯 嵌段共聚物，乙二醇丙交酯共聚物、三乙醇胺丙交酯共聚物等。采用不同种 类和配比单体与乳酸( 丙交酯) 共聚，能得到具有不同组成和特定结构( 如二嵌 段、三嵌段、多嵌段、星形、臂形结构) 的p l a 共聚物，使得共聚物具有不同材 料的特点，可以改变材料的亲疏水性、结晶性，并通过控制分子量大小制备可降 解速率适宜的共聚物。 2 第一章绪论 1 2 3 聚己内酯 聚己内酯( p c l ) 是一种半结晶性的聚合物，其熔点为5 9 6 4 ，玻璃化温度为 6 0 。其结构重复单元上有5 个非极性亚甲基和1 个极性酯基，这样的结构使 得p c l 具有良好的柔韧性和加工性，具有良好的生物相容性和生物降解性，可 做为大分子材料的增塑剂，可参与多种聚合物的合成与电纺纤维的制备。如 s a n d a 等【7 】利用多羟基化和物质子酸引发剂与c l 作用合成星状高分子材料； d a l t o n 等1 8 】则通过合成p e g b p c l 在6 0 和9 0 c 条件下进行熔融纺丝。 p c l 的降解速率主要受相对分子质量和结晶度的影响，其中结晶度的影响尤 为显著。因为p c l 的降解优先发生在无定形区，随降解时间增加，材料的结晶度随 之增加，经过一段时间的发展，最后结晶区也逐渐降解，细菌、微生物以及牛物酶的 存在可加速p c l 的降解，表现出生物降解特征。p c l 的降解主要为水解控制，因此 适度引入亲水性基团有助于增加降解速率，随降解时间增加，产物相对分子质量降 低，但相对分子质量分布变化不明显，最后材料质量开始减少。期间，材料的力学性 能也发生明显变化，主要表现为柔韧性降低，最后变成脆性物质，由连续的薄膜材 料变为碎片状物质一j 。 1 2 4 聚( l 丙交酯- c o - - e 内酉匕) ( p l c l ) 通过丙交酯与c l 的开环聚合，可以制备p l c l 的共聚物。而改变反应单体 的投料比，可以调节共聚物的平均相对分子质量、降解速率和力学性能。c o h n 等o 】就通过两步合成的方法，以六亚甲基二异氰酸酯( h d i ) 作为催化剂合成制备 了p c l p l a 的多嵌段共聚物，使得聚合物的力学性能如抗张强度，杨氏模量以 及断裂伸长率都获得极大改善，并与其他均聚物相比减缓了的降解速率。h u a n g 等l 则通过以z n 为催化剂采用两步合成的方法制备合成了p c l b p l a 嵌段共聚 物，其两步反应如图1 1 所示。 k i m 等1 1 2 1 则是通过以辛酸亚锡为催化剂分别制备了不同分子量的 p l l a b p c l 和p l l a - r - p c l 。一般而言，采用分步合成的方法多用于嵌段 共聚物的合成，而多数无规共聚物则是采用单体混合物一次性投料共聚制 备的。 由于p c l 柔性链段的引入，使得p l c l 共聚物的结晶度得以降低，同时p l c l 嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物降解性，由于其中不同组分的规则排 列，使得其结晶性较强，降解速度慢，力学性能好。而无规共聚物相对力学性能 差，降解速度快。k i m 掣1 3 】和z h u 掣m 】分别采用凝胶纺丝法和挤出法将p l c l ( c l l a = i 1 ) 制作为血管组织工程支架材料，研究表明采用该聚合物制备的 第。章绪论 血管支架具有良好的断裂伸长率和拉伸强度。 z i 留髻 三! h + n ：f 他5g n - r 啦r 印甘芒旷；_ 1 2 ) 5 n 靠 tj 焱，- 咖挚吣j 龟p ( h l - c t t l c l 4 旆咖啼鼬 。 f ：， 图1 1 以p e g 为引发剂的c l 和d l l a 的嵌段共聚物的合成 f i g u r el - 1b l o c kc o p o l y m e r i z a t i o no f e - c a p r o l a c t o n ea n dd l l a c t i d ei n i t i a t e db yd i h y d r o x y lp e g 1 2 5 聚丙交酯c o - - 乙交酯 聚丙交酯一c o - 乙交酯 p o l y ( 1 a c t i d e c o - g l y c o l i d e ) ，p l g a ，是由丙交酯和乙交酯 经开环反应制备的共聚物，是一类生物可降解大分子高聚物，在组织工程方面具 有广泛的应用，其多被采用为药物释放以及骨修复材料【l 5 1 。 p l g a 的物理化学性质可由两者的共聚比例不同所决定，通常具有结晶区 ( c r y s t a l l i n i t y ) 和非结晶区( a m o r p h o u s ) 两种结构。结晶程度在共聚比为5 0 5 0 时最 低，它的水分解速率也最快，而结晶程度越高，其水解速率常数越小。单体所占 比例不同的p l g a ，其降解速度、力学性能、玻璃化转变温度和熔点均介于p l a 和p g a 之间，溶解性也有所提甜1 6 j 。 在细胞生长、组织重建和宿主反应等组织工程中p l g a 的降解速率对细胞和 组织都产生较大的影响【1 7 】。p l g a 为疏水性材料，不易被水溶液浸润，在组织工 程中，可以在一定程度上保持支架的外形，具有一定的力学性能，所以多被采用 制备骨修复材料。 1 2 6 右旋糖苷 右旋糖苷( d e x t r a n ，d e x ) ，又叫葡聚糖，其分子式为( c 6 h l 0 0 6 ) n ，白色或类白 色粉末，溶于水，微呈浑浊现象，不溶于乙醇，是若干葡萄糖脱水形成的聚合物， 它是最早发现的微生物多糖，也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，是较 早作为代血浆应用的微生物多糖，具有良好的生物相容性。它是由葡萄糖经l ， 6 q d 吡喃葡萄糖酐连接而成的大分子聚合物，其化学结构如图1 2 所示【l5 1 。 由于聚合的葡萄糖分子数目的不同可以得到不同分子量的产品。临床上应用 4 。产l 却 步 扣 一聊 阱 第一章绪论 的有中分子量的d e x ( 平均分子量7 0 0 0 0 ) ，低分子量d e x ( 平均分子量为4 0 0 0 0 ) 和小分子量d e x ( 平均分子量1 0 0 0 0 ) 。右旋糖苷分子量较大，不易渗出血管， 可提高血浆渗透压，从而扩充血容量，维持血压。可用作血浆的代替品，以恢复 血蛋白质。其作用强度与维持时间依中、低、小分子量而逐渐缩小。低分子和小 图1 2d e x 的化学结构 f i g u r e1 - 2 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fd e x 分子d e x 能抑制血小板和红细胞聚集，降低血液粘滞性，并对凝血因子i i 有抑 制作用，因而能防止血栓形成和改善微循环，可用于血栓形成性疾病，如脑血栓 形成、心肌梗塞、心绞痛、血管闭塞性脉管炎、视网膜动静脉血栓等。此外还具 有渗透性利尿作用。 在侧链结构上包含一部分甲基丙烯酸酯和通过对右旋糖苷衍生物放射的方法 而得到的d e x 化学水凝胶，由于其光交联反应能够有效避免一般情况下采用化 学交联基质的劣势而被广泛进行研究”6 1 。这种水凝胶也能在水介质中膨大，在葡 聚糖酶的参与下溶解。此外，缩水甘油基甲基丙烯酸右旋糖苷亦可在蛋白质( 溶 解酵素，白蛋白，b s a ，免疫球蛋白g 和i g g ) 的参与下引发自由基聚合反应。 d e x 在骨再生的组织工程的研究方面也占有重要的位置。在慢性牙斑疾病细菌 的参与下可以采用d e x 衍生微球传输骨成形蛋白来检测牙周重建过程中组织损 失的情况7 1 。 d e x 水凝胶可作为活性药物、蛋白药物的载体，既控制药物释放，又能避免 药物在体内因为体液和酶的作用而失活，从而为其提供在组织工程领域的应用 空间。作为多种蛋白药物载体其取得了成功，降解产物对人多种种子细胞的生长 增殖无任何影响，生物相容性良好。作为载药系统，d e x 水凝胶具有载药量大， 易吸收、给药方便及性能稳定，是目前控释给药和组织工程领域研究的热点之一。 1 3 组织工程与生物活性因子 生长因子是指一类通过与细胞膜特异受体结合，在细胞间传递生物信息并发 第一章绪论 挥调节细胞生长用的一些肽类分子，它们通过自分泌和或旁分泌方式调节各种细 胞的增殖和分化。如今被广泛应用的生长因子主要有表皮生长因子、血管内皮生 长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , v e g f ) ，血小板衍生生长因子( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r , p d g f ) 、骨形成蛋白、转化生长因子等。当然，因因生长因 子不一，其功能也多样。例如转化生长因子a 通过与细胞表面的受体表皮生长因 子受体( e g f r ) 结合而起作用【1 8 ，l9 1 ，可以诱导上皮发育，可以使多种细胞转化； 骨形成蛋白则是刺激骨细胞的分化：而血管内皮生长因子刺激促进血管内皮细胞 增殖。 组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的 方法和技术以及组织工程的临床应用。目前临床上常用的组织修复途径大致有3 种：即自体组织移植、异体组织移植或应用人工代用品。而生长因子是组织工程 应用中重要的细胞营养物质，通过调节细胞的增殖、迁移、分化及蛋白表达，从 而能够有效地促进血管和组织的修复和再生，在组织工程中起到了重要的调节作 用。 1 3 1 血管内皮细胞生长因子 v e g f 最初是i 主i s e n g e r t 2 0 】在肿瘤细胞分泌物中发现。具有高度的血管渗透性， 可引起肿瘤血管中的蛋白质外渗。后来g o s p o d a r o w i c z 等【2 l j 发现的内皮细胞特异 的新生血管因子，经鉴定亦是v e g f 。v e g f 是新生血管形成的主要调控者之一。 用中和性抗体等抑带i j v e g f ，则可阻断其诱导新生血管活性1 2 即3 1 。 v e g f 是一种糖基化分泌性多肽因子，分子质量约4 3k d a 。v e g fm r n a 不 同剪接，形成5 种v e g f 变异体，分别含有1 2 1 、1 4 5 、1 6 5 、1 8 9 和2 0 6 个氨基酸残 基( v e g f l 2 1 2 2 0 6 ) ，以二硫键连接成同源二聚体。肝素或硫酸肝素能增强v e g f 与 其受体的亲和力。v e g f 与细胞表面的肝素或胞外基质的硫酸肝素蛋白聚糖结合， 可释放储藏在蛋白聚糖上的新生血管因子如碱性纤维母细胞生长因子。 v e g f 是血管和淋巴血管的关键调控者【2 4 1 ，同时也对神经细胞有着关键的影 响。缺氧、低血糖是v e g f 表达的主要刺激物。缺氧使v e g f 诱导新生血管，最典 型的就是视网膜发育及视网膜血管网络的形成1 25 1 。视网膜发育时，星形细胞和神 经元前体细胞芽生并从存在的血管移出：随着移出距离增加，逐渐处于缺氧环境。 星形细胞缺氧性较之神经元更敏感，可作为缺氧敏感器。缺氧刺激v e g f 产生，启 动新生血管反应。 1 3 2 血小板衍生生长因子 6 第一章绪论 p d g f 是由多种细胞产生能刺激平滑肌细胞、胶质等细胞增生的多肽，具有 广泛的生理活性。最初其从血小板a 颗粒中分离得到，主要由巨核细胞合成，在 生理状态下主要存在于血小板a 颗粒中，当血小板被凝血酶、胶原、a t p 等激 活后释放人血。p d g f 是由a 、b 两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型 二聚体。主要包括三种形式：p d g f a a 、p d g f b b 、p d g f a b 。分子量为2 8 - - - 3 5 k d a 。 a 链分子量为1 6 k d a ，b 链为1 4 k d a 。a 、b 链基因分别位于第7 、2 2 号染色体。 p d g f 发挥其作用必须与靶细胞上的酪氨酸激酶受体相结合。p d g f 和p d g f 受体结合后引起受体的自动磷酸化，为底物蛋白与之结合提供了位点，这些底物 蛋白均有一个保守的结构片段，即同源片段2 ( h 2 ) 。h 2 是一段大约含有1 0 0 个氨 基酸残基的保守序列，其在介导受体信号传导中起重要作用。p d g f 性质很稳定， 暴露到1 的十二烷基硫酸钠、4 m 的胍盐酸或加热到10 0 仍保持其生物学活性。 血浆内p d g f 含量较低，半衰期一般短于2 r a i n 。p d g f 生物学特征主要有三方 面，一是促分裂效应，p d g fz 日匕l - 刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的 分裂增生。二是趋化活性，对中性粒细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞有趋化性。 三是具有缩血管活性。 1 3 3 牛血清蛋白 牛血清蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 是牛血清中的简单蛋白，是血液 中的主要组成部分，分子量为6 8 k d a 。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0 2 。 白蛋白由5 8 1 个氨基酸残基组成，其中3 5 个半胱氨酸组成1 7 个二硫键，在肽链 的第3 4 位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结 合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、p h 缓冲作用、载体作用和营养作 用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作 用。 1 3 4 肝素 肝素( h e p a r i n ，h p ) 是1 9 1 6 年被m c l e a n 2 6 j 首先在肝脏中发现故而得名，是一类 糖醛酸和葡萄糖胺以l - 4 键廉洁起来的重复二糖单位组成的多糖链的混合物，为 硫酸化糖胺聚糖。作为高度硫酸化的蛋白多糖，肝素基本结构是带有硫酸基团和 乙酰化基团的四糖体，结构中含有糖醛酸残基和葡萄糖胺残基。葡萄糖胺的c 1 和糖醛酸的c 4 之间有l - 4 联结键，葡萄糖胺残基的硫酸化大部分在c 6 ，少部分在 c 3 ，含有n 乙酰化的但无硫酸化的艾杜糖醛酸的硫酸化大部分在c 2 ，但只占少 数残基。此外葡萄糖胺的c 3 硫酸化是肝素结合抗凝血酶所必需的，其化学结构 7 第一章绪论 如图1 3 所示。肝素相对分子量40 0 0 2 00 0 0 ，平均相对分子质量为1 20 0 0 。而低 分子肝素( l m w h ) 1 27 j 是由普通肝素分离得到的一些组分或裂解后产生的片断， 近年来研究认为低分子量肝素( 相对分子量在1 20 0 0 以下) 抗血栓作用优于普通 肝素，而抗凝作用无明显差别，能够增强血管内皮细胞抗血栓作用而不干扰血管内 皮细胞其他功能。到目前为止，肝素的精确结构还不清楚，肝素具有强酸性，并 带有很强的负电荷，各链之间可产生排斥力，使肝素链不易卷曲和交叉联结，呈 线性结构。在肝素链中每两个二糖单位问含有2 3 个硫酸根，该基团与抗凝作用 有关。肝素的阴离子活性基团与抗凝血酶i i i ( a t - i i i ) 的阳离子基团结合，加速 抗凝血酶凝血酶复合体形成，因此产生抗凝效应。 h o h0 图1 3 肝素的化学结构 i o h f i g u r e1 - 3c h e m i c a ls t r u c t u r eo fh e p a r i n 普通肝素被临床使用超过5 0 年以至今天仍然是一种重要的抗凝血药剂，特 别是在现在在卫生保健和外科手术中应用较多的一种特效药。而由于其半衰期较 长，在抗血栓作用中较少出血的效果导致其在实验室中不能满足实验的要求。低 分子量的肝素则由于分子量低，化学结构相对简单，在酸性条件下不稳定的性质 使得它能够于体外注射方法能够满足一些门诊病人的需求，且由于其抗血栓效果 好，在近十年已逐步取代普通肝素在预防和抗血栓方面的应用。 1 4 电纺技术 电纺是种简便易行的新型组织工程多孔支架制备方法。电纺支架具有独特 的微观结构和适当的力学性能。由于与天然细胞外基质结构相近的特点，电纺支 架能够仿生细胞外基质，使之有望成为理想的组织工程支架。 1 9 3 4 年，f o m h a j s l 2 8 , 2 9 j 设计了第一套利用聚合物溶液在强电场下的喷射、进 行纺丝加工的装置。到了2 0 世纪6 0 年代，电纺丝开始被应用到纺织工业中，并主 要用于生产各种聚合物纤维无纺布。随着“纳米材料”这一概念的提出，人们发现 由电纺丝制得的纤维的直径最小可以达到纳米级。这一独特优势促使世界各国科 第一章绪论 学家对此展开了广泛的研究。目前成功进行电纺丝加工的聚合物已有多种，如 d n a 、胶原、丝蛋白等天然高分子：聚氧化乙烯、聚丙烯腈、聚乳酸、聚酰亚 胺、尼龙、聚乙烯醇、聚己内酯、聚氨酯等合成高分子。 电纺过程分为三步：1 射流产生和射流沿直线延伸；2 射流的弯曲不稳定 形的生长和进一步拉伸，该步骤允许射流变得很长很细，此时其路径为环形和螺 旋形；3 于接收装置上形成纳米纤维。 传统的静电纺丝支架由于其组分单一已不能满足组织工程的需求，而将多种 组分同时电纺得到的复合纤维的电纺技术如共静电纺丝、乳液静电纺丝以及同轴 电纺等得到了人们的重视。其中同轴电纺是一种制备芯壳结构超细纤维的方法， 原理与传统的电纺相同。其电纺装置图如图1 _ 4 所示。通过在喷口处壳层溶液包 裹芯部溶液在高压电场的作用下，经过高频拉伸、弯曲变形并凝固为超细同轴 c o r k 图1 - 4 同轴电纺装备图【3 0 】 f i g u r e1 - 4s e t u pf o rc o x i a le l e c t r o s p i n i n i n g 复合纤维，根据实验装置的不同进行收集【3 0 1 。影响同轴电纺的因素主要有芯部和 壳层的相容性、粘度比以及芯壳流速等的影响。无论是芯壳相容还是不相容体 系，都有可能制备出芯壳结构的纤维。但不相容体系制备的纤维芯壳结构更加 完善。芯部与壳层流体具有适宜的粘度比也是进行同轴电纺一个重要条件，通过 控制芯壳流体的粘度比，使其在电场作用下于喷丝口形成稳定的液滴，进一步 形成复合t a y l o r 锥。而通过控制芯壳流速从而使得同轴电纺获得连续芯壳结构 的纤维。此外，由于同轴电纺时静电力沿着管的轴向施加，轴向速度是主要分量， 径向速度分量很小( 仅为轴向速度的l o _ 量级) ，但影响芯质和纤维的直径大 小。研究还发现【3 ，内、外管是否严格同轴并不影响芯壳复合结构的形成。z h a o 等1 3 2 j 考察了p l g a 溶液浓度、流速、电场强度等参量对p l g a 电纺纤维的形貌 以及纤维良径分布进行了详细地调查。其结果发现纳水纤维直径随着p l g a 浓度 9 第一章绪论 和流速的增大而增大，而电场强度对纳米纤维平均直径的分布影响很小。b a n g 等驯则研究了以p c l 作为壳层、载八b s a 的p e g 作为芯层的同轴电纺芯壳纳 米结构纤维情况其中壳层以c h c i g d m f ( 7 3 ，v v ) 作为溶荆配嗣成3 0 0 m g m l 的 p c l 溶液，芯层则采用包载1 0 b s a 的4 0 0 m g m l 的p e g 水溶液进行同轴电纺， 井通过控制其内芯流速分别为0 6 m l m ，l m l h , 2 m l h 来调整芯层和壳层的厚度。其 t e m 照片如图1 - 5 所示。并进步考寨了其中包载b s a 的控制释放情况以及释 放过程中纤维形貌的变化。通过这种内芯载药的方式，对蛋白质的控制释放提供 了一种有效途径，在组织工程中有很大的应用前景 k 醚。 x 囤1 5 不同内芯流建下芯，壳纤维t e m 照片l 。 f i g “ e “5 “。嚆等器篙苗0 ：渊“1 鉴_ ：= ；i 。2 ：黜“i m 时d o 口c w ( 酊氐( b ) 删( c ) m l ，l i 电纺纤维由于其良好的纤维形貌和力学性能在生物医学领域有着广泛的应 用。其纳米纤维结构能够基本满足组织工程支架的要求即支撑并引导细胞增殖。 l i 口悃静电纺丝法制备了乙交醋，丙交醋共聚物细胞支架。他认为其结构与天然 组织细胞外基质类似，具有多孔性、宽的孔径分布和良好的机械性能。a l e x a n d e r 瞰1 利用电纺技术，以聚氨酯、聚四氟乙烯为材料制得的复层人造血管柔顺型好， 孔隙率高、力学性能优良。b e n j a m i n 等 弼则将细胞包埋在电纺制各的双层纤维膜 中形成纤维脚细脚纤维膜结构。其采用骨细胞包埋在聚乳酸制备的双层纤维 膜中，发现这种纤维膜在浸入液氨后能够保持完整，不变脆。同时纤维膜的孔状 结构亦有利于氧气、养分和二氧化碳的传输。 1 4 1 人工血管材料研究进展 外科临床迫切需要各种不同直径大小的人工血管作为重建材料。自体血管来 源有限，异体血管受宿主免疫捧斥，易发生退变、狭窄、形成血栓、动脉癌等， 逐渐被摒弃。从2 0 世纪5 0 年代开始，人工血管就成为研究者关注的目标旧。 对人工血管材料的选择首先要考虑其生物相容性和生物稳定性。生物相容性 是生物体对材料的生物反应，主要是指对血被的反应血液相容性、对生物组织的 第一。章绪论 反应组织相容性和免疫反应等。血液相容性主要是指高分子材料与血液接触时， 不产生凝血和溶血。组织相容性是指与材料接触时活体组织不发生炎症和排斥， 而材料表面不产生异物沉积。生物稳定性是指材料在人体内不会因物理或化学作 用而降解失效。目前应用最多的人造血管材料是聚对苯二甲酸乙二酯( p e t ) 、 聚氨酯( p u ) 和膨化四氟乙烯( e p t f e ) 。 1 9 5 2 年，v o o r h e e s 首先研究将维纶制成多孔性管道作为人工血管p 引，并于年 开始用于临床，带有网孔的人造血管的研制是血管代用品发展史上的里程碑，在 此基础上，大、中直径人造血管的研究和应用已取得满意的效果。对于小直径人 造血管来说，在我们找到一种完全抗血栓的材料之前，大部分开发工作还是集中 于生产具有多孔管壁的管道。尤其需要注意的是，在小直径人工血管设计时更应 注意孔径的大小和孔径的分布情况，它们对人工血管的组织反应起到重要的作 用，影响到内腔“新内膜”的形成【3 9 】，还会影响宿主纤维组织向管壁内生长的深 度，从而影响移植物的愈合性能和顺应性。 用于血管组织工程的纺织基支架，一般采用非织造的方法进行生产，如整体 成型法、静电纺丝法和喷丝成型法。作为体外构建血管的支架材料主要有两种， 一种是不可降解材料，女i ：i e p t f e 、聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 等：另一种是可 降解材料，如聚乙交酯( p g a ) ，p l a 等。而采用可降解材料作为血管支架是最适 宜的。 1 4 2 超细纤维管的制备与动物体内血管移植 随着聚合生物材料的应用多样性的发展，纳米技术引起了人们的广泛关注。 而通过电纺的方法可以制备纳米级别的纤维材料，在纤维形貌方面能够得以控制 且具有多孔结构，实验装置简单【矧，所以采用电纺的方法制备聚合物生物材料具 有较大的优势。b i n i 等【4j j 人就采用电纺的方法，以p l g a 为原料，以旋转的聚 四氟乙烯管作为接收装备制备了纳米级别的纤维直径的超细纤维管，其制各装置 如图l - 6 所示。并将其移植到大鼠1 0 m m 间隙宽度的坐骨神经上，在一个月后成 功获得了神经再生，而所植入纳米纤维管并没有发生破损，说明该纳米纤维导管 具有良好的柔韧性、通透性，并且不易发生溶胀。m a t s u d a 等【4 习则通过分段聚氨 酯在电压在1 3 1 一1 4 1k v ，接收转轴转速在1 5 0 一3 4 0 0 r p m ，横向运动速率为1 5 0 m m m i n 的条件下进行电纺制备纤维管，并考察了纤维管力学性能相关参数。 i n o g u c h i 掣4 3 j 则采用p l c l 为原料电纺制备了弹性纤维管作为小直径血管材料， 并考察了其相关性能。而v a z 掣删则采用