组织化学技术--酶组化课件.ppt

酶组织化学（EnzymeHistochemistry）是利用组织细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。一般是用冻结或固定的切片，再一定条件下（具有酶的底物等）全酶进行催化作用，产生一种可见产物，沉淀在酶所在的部位，最终通过显微镜对酶的活性进行定位或定量研究。,第二章酶组织化学,Inruduction,2019/12/13,1,特点：在原位检测检测酶的活性而不是酶分子本身酶的分类：按生物化学分类六大类氧化还原酶转移酶水解酶裂解酶异构酶连接酶常用检测方法1沉淀法金属沉淀法：Ca+Co+法；Pb法偶联法：重氮盐法靛原法四唑盐法,2,2后偶联法Post-coupling（ACP）3合成法4底物膜法设计半透膜切片/孵育法影响酶组化实验的关键因素酶活性的保存a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不同的酶适用不同的固定剂抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。慎用醛,3,b）取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮氯仿=11）4，510分钟，但脂溶性蛋白脱落。底物浓度A）量要足够120V/VB）孵育法只能用一次，配制时要适量（节俭）PH和渗透压应以缓冲液调节温度控制与时间：室温37（40min）4（510min）,4,捕获剂亦要求一定浓度，要以反应原位瞬时沉淀。激活剂与抑制剂（对照）a）两者的选择都应具有特异性。b）要有适当的浓度范围时间：通过实验自行摸索。任何配方都是一个很大的范围（指时间），受多种因素的影响，因药品的质量、环境因素的变化而变化。故不可轻信之。扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻切片孵育尤应注意）,5,对照：必须设立对照，以防非特异反应。这对结果的解释非常重要。对结果的分析，应考虑如下几个问题：经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟能保留多少？酶是否在原位？反应中多少酶起了作用？酶的活性是否代表细胞生活时的活性？沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延长，会不会改变？是否有扩散移位,6,一、钙钴法显示碱性磷酸酶AlkalinePhosphatase（ALP）,原理以天然存在的甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下：,7,方法标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）厚6微米。固定：丙酮氯仿（11）混合液。425切片标本入下列孵育液中，37，5分钟孵育液：3甘油磷酸钠6ml底物保2巴比妥钠6ml调PH证2氯化钙（无水）9ml沉淀剂新2硫酸镁6ml激活剂鲜蒸馏水3ml30ml将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。,流水流水洗2分钟后入蒸馏水入2硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟）置换流水洗5分钟，入蒸馏水。入0.5硫化胺，2分钟。置换流水洗10分钟，入蒸馏水。入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟流水洗5分钟蒸馏水。甘油明胶或Apathy糖胶封固。,结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛纹状缘和血管内皮出现黑色的硫化钴沉淀，显示ALP活性强。ALP为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、乳腺及卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。对照无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3甘油磷酸钠，其余各步进行同上。,加热灭活酶活性。加抑制剂，左旋咪唑0.11.0mmol/L注意事项Ca2+要足量硫化钠（NH4）S配置成淡黄色，可提供S2-滴23滴用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性。有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色素）出现，可影响结果。本法可用显示：5核苷酸酶、肌蛋白ATPase、ALP,二、铅法显示酸性磷酸酶（Gomori，1950Lojda，1979）,原理以甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被ACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅沉淀。在被S2-置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。反应式如下：酸性磷酸酶AcidPhosphatas（ACP）,ACP的特性PH4.55.5适宜激活剂：Mn2+抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。ACP定位溶酶体（颗粒状）内；溶酶体外ACP存在于ER和胞液。该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。,方法标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可用甲醛，但影响活性。本实验不固定或固定于丙酮氯仿（11）混合液，4，25min步骤：将标本放于下列孵育液中37，1015孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH5.215ml0.24硝酸铅15ml,3甘油磷酸钠3ml33ml混匀，置37水浴中1530分钟后，过滤。于37蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温蒸馏水洗）入5硫化胺，12分钟。流水冲洗35分钟后，换蒸馏水。（可用Mayer苏木素复染核）用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。,结果酶活性部位棕黑色硫化铅沉淀。分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。对照孵育液内加0.01MNaF（13.9mg/33ml）（）注意事项铅离子的浓度关键问题，没有底物，有些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF抑制酶活性排除假阳性反应。孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。,2019/12/13,19,可编辑,应用范围“铅法”适用于：ACP，5-核苷酸酶G6P酶;膜ATPaseMitoATPaseTTPase（硫胺素焦磷酸酶）三、偶氮偶联法显示ACP原理以奈酚的衍生物磷酸脂NaphtholASBLPhosphate为底物，在酸性PH（5.2）下，经酸性磷酸酶水解释放出NapholASBI，立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。,方法标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。不固定或固定于丙酮氯仿（11）混合液内，4，25min标本入下列孵育液，37，3060分钟。孵育液：磷酸奈酚ASBI15mg溶于二甲基亚砜0.6ml六氮化对品红缓冲液30ml30.6ml,充分混匀并过滤蒸馏水洗入Mayer苏木精内染1分钟。流水冲5分钟后入蒸馏水。用Apathy糖胶或甘油明胶封固。结果酶的活性部位呈红色，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。ACP是溶酶体的标志酶。六氮化对品红液的配制（30ml）,4对品红盐酸溶液碱性品红400mg浓盐酸2ml蒸馏水8ml4NaNO3配好后于冰箱保存用时取1ml。+等量混匀（各取1ml），盖严并置室温静止一分钟，待混合液变为淡黄色倒入28ml2.72醋酸钠溶液，用1NNaOH调PH至55.5即成。,四、四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶,对照用抑制剂NaF浓度为10mmol/LCa2+浓度为10mmol/L注意事项六氮盐浓度不能太高背景会略带黄色应用范围本法用于ALP、ACP、非特异性脂酶。,原理利用利用H受体的H2，使四唑还原成甲月替：反应式如下：,本实验：以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（nitroBT）为受H体，其接受H后被还原成甲月替呈紫色以代表琥珀酸脱氢酶的活性。琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。抑制物：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制）凡与-SH基化合的作用剂皆抑制其活性。方法,标本：大白鼠肝、肾或心肌。横冷箱切片，后6微米不固定。步骤：将标本放入下列孵育液中，37，约5分钟。孵育液：nitroBT10mg0.1MPBS，PH7.810mlPMS（吩嗪硫酸甲酯）1mg徐徐加温，使其溶解，冷却过滤。再加入琥珀酸钠80mg蒸馏水洗净,Apathy氏液糖胶封固结果酶活性部位成蓝紫色沉淀。此标本内所见蓝紫色颗粒即线粒体。对照孵育液去底物，加入等量蒸馏水，同时孵育（）注意甲月替易溶于脂，反应扩散时组织内脂滴被染。加入PMS（中间递氢体）定位更加准确。如果聚乙烯醇PVA，可以保护线粒体膜，使反应局限在线粒体内。应用范围适用于：甲胺氧化酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶。,五、DAB法显示过氧化物酶,原理过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物、的酶底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。,光镜显示方法（1）孵育液的配置：预孵育液：DAB4HCL10mg溶于蒸馏水5ml0.2M磷酸缓冲液（PH6.5）5mlFahimi孵育液:DAB4HCL10ml溶于蒸馏水5ml0.2M磷酸缓冲液（PH6.57.0）5ml,0.3H2O20.1mlGrahamK孵育液：DAB4HCL5mg0.05MTH缓冲液（PH7.6）10ml1H2O210mlLojda孵育液：0.1N苯基对次甲苯二胺25ml0.1-萘酚25ml0.3H2O2（新配）1ml,方法固定：温度4，30分钟（3戊二醛固定液：20戊二醛15ml，或25戊二醛12ml0.2M磷酸缓冲液50ml，蒸馏水加至100ml止）；洗涤：洗涤三次以上，每次15分钟，或过滤。切片：Cryostat制成切片（510m）染色步骤切片入下列孵育液中,a预孵液：室温下1030分钟b后孵液：Fahimi孵育液，室温560分钟Gropam-Karnovsky液，室温，310分钟洗涤：蒸馏水漂洗染核：亚甲蓝染核封固：甘油明胶封固髓性过氧化物酶显示法。固定