（遗传学专业论文）腈水合酶高产菌的基因组重排育种及其发酵过程控制的研究.pdf

，r 夫t 鼻2 0 0 5j i 簟j 掣童叫位- 弛- 文 摘要 腈水合酶是一种催化丙烯腈产生丙烯酰胺的酶类，该酶的活性大小是微生物法生产丙烯 酰胺的关键，直接影响着丙烯酰胺的产量，质量和经济效益。丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ，a m ) 是 一种重要的精细有机化工原料，主要是用来生产聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺作为絮凝剂、增稠 剂、增强剂等，被广泛用于石油开采、水处理、造纸、印染、煤炭等许多经济领域，并在食 品、制糖、医药等行业有着广泛应用随着丙烯酰胺的需求量不断增大，在腈水合酶产生菌 方面的研究已成为一个热点，国内外的学者在腈水合酶产生菌的分离选育、酶的形成条件和 发酵优化等方面做了大量工作，并取得了可喜的成果。近年来，学者们对腑水合酶的分子结 构和性质进行了深入研究，从分子水平上揭示了腈水合酶的催化机理，这些性质的研究对提 高酶的催化活性和稳定酶有重要的意义。 优良菌种选育技术是发酵工程的核心技术。常规的诱变育种方法是以紫外线、辐射或化 学诱变剂处理徽生物( 基因组) ，产生大量突变，然后以所需指标进行缔选。由于负突变的比 例非常高，一般要筛选1 0 0 0 0 个突变体才能发现一个正突变。经过长期诱变获得的菌株在特 定性状有所改善的同时，也往往积累了根多不直接和特定性状关联的有害突变，比如生长条 件要求苛刻。生存能力变差，细胞变。脆弱”等。杂交育种选用已知性状的供体和受体菌株 作为亲本，因此无论在方向性还是自觉性方面，都比诱交育种前进了一大步。但由于杂交育 种的方法较复杂，工作进度较慢，因此还很像诱变育种技术培育高产菌株的例子还不多见 分子育种( m o l e c u l a rb r e e d i n g ) 继承和发展了杂交育种引起新的概念和方法加速了育种进 度。因此它的应用前景很广，可以用于基因，代谢甚至全基因组的育种。 本文采用的g e n o m es h u f f l i n g ( 基因组重捧) 的分子育种对象是整个细胞，它能弥补诱变 育种的不足，把通过诱变育种改良的突变株进行杂交育种，使得不同菌株来源的基因组能够 得到充分的重组，不同正向突变整合到同一重组子中的机会大大增加，同时积累的有害突变 可被其它菌株的野生型序列所代替，由此得到一批性能改善的熏组子被高通量检出，再进入 下一轮的基因组重捧，大大提高了正变率。 本课愚以艚水合酶( n i t r i l eh y d r a t a s e ) 产生菌诺卡氏菌( n o c a r d i as p ) 如9 5 n 为出 发菌株，以抗生紊抗性为标记，通过原生质体的制各、原生质俸的微波诱变：原生质体反复 j 才暗 l j r 的| i 田u t 育种墨j 慷嗵i 捌 _ 的研，巴 融合，使细胞进行基因组重捧，而筛选出一株产膪水合酶活力高的菌株，从而提高丙烯酰胺 的生产效率。最后对筛选出的突变株进行生理学及发酵代谢过程控制的研究，进一步提高了菌 株的产酶能力和适应能力。工作内容主要有以下几个方面： 1 采用基因组重排法对舰a r d i as p h d 9 6 1 1 进行育种，筛选到的两株菌酶活力分别为5 4 6 7 0 u g m 1 h i - 和5 3 9 6 0 u g a 1 h r 。通过遗传稳定性试验，突变株经发酵分析其酶活力比出发菌株 提高了3 6 4 ，发酵周期也缩短了2 0 h r ，培养条件并没有明显改变，适合现有的工艺条件。 易于工业化生产。 2 n o c a r d i as p f m 9 6 1 1 原生质体的制备与再生：通过对预处理剂浓度、酶浓度、酶解时间、 菌龄等影响因素的考察及正交实验确定了腑水合酶产生菌一诺卡氏菌h i ) 9 6 1 1 原生质体制鲁与 再生的最佳条件。实验结果表明。其最佳制备条件为菌龄3 6 h r ，甘氨酸浓度0 2 ，酶浓度 2 m g m l ，酶解时间4 0 r a i n 的组合，原生质体的形成率为9 5 0 3 。 。 3 n o c a r d i as p b d 9 6 1 1 原生质体的微波诱变；通过对诱变时间、波长、功率等条件的煮察， 得出最佳的诱变时问。实验结果表明，采用频率2 4 5 0 班i z 、输出功率7 5 0 w ，微波辐射时间1 2 s ， 致死率为9 9 5 2 。 4 原生质体的融合：ns p ( j n 懈，) 和ns p ( g i p s t t ) 作为融合的两亲本，其原生质体 经诱变后融合，融台予为抗性互补的双耐药菌株( s t g r i i s ) 将融合后的菌株不经筛选就进 行下一轮融合，经过这样反复多次的操作才进行筛选，使得不同菌株来源的基因组能够得到 充分的重组，不同正向突变整合到同一重组子中的机会增加，从而使得再生菌落的基因组重 组程度大幅度提高( 5 0 1 0 5 倍) 。通过对融合时间、温度、融合剂等因素的考察，得到最佳的 融合率：融合温度3 1 c ，融台时间5 = i n ，采用5 0 p e g 6 0 0 0 ，其融合率达到4 x1 0 4 。 5 突变株的工业化放大培养及发酵参数的控制。将突变株在自控发酵罐上进行工业化放大培 养，并对发酵控制条件进行了研究，得出发酵罐的发酵控制条件为：发酵温度为2 8 ，p h 7 2 。 装料系数为0 5 ，搅拌速率为4 0 0 f r a i n ，消泡剂用量为2 0 0 p p m ，通气量控制在2 i s l p m ，酶 活力比出发菌株提高了3 6 4 ，发酵周期也缩短了2 0 h r 。为工业化生产提供了依据。 关键词：腈水合酶；诺卡氏菌；微生物法；丙烯酰胺：原生质体；诱变育种；基因组重排育 神；发酵过程控制 2 河r ，洋2 0 0 5 _ | - b ，巳 _ ”宣惦走 a b s t r a c t n i l r i l eh y d r a t a s ei sa ne n z y m ew h i c hc a r lc a t a l y s ea c r y l o n i t r i l et oa c r y l a m i d e t h eg e n e r a t i o n o f n i t r i l eh y d r a t a s ew & st h ec r u c i a ls t e pi np r o d u c i n g a c r y l a m i d eu s i n g b i o u a n s f o r m a t i o nm e t h o d , i t a f f e c t e dt h ey i e l d , t h eq u a l i t ya n dt h ee c o n o m i cb e n e f i to fa c r y l a m i d ed i r e c t l y a c r y l a m i d ei sa p r e c i s eo r g a n i cc h e m i c a li n d u s t r ym a r t i a lw h i c hp r o d u c e sp o l y u c r y l a m i d e p o l y a c r y l a m i d ei su s e d a so i ld e v e l o p m e n t , w a t e rt r e a t m e n t , p a p e r m a n u f a c t u r e ，p r i n t i n ga n dd y e i n g , c o a l e ta l ，a n dh a v ea w i d ea p p l i c a t i o ni nf o o d s s u g a r m m m 内c t 州，骗m e d i c i n e w i t h t h e g r o w i n gd e m a n d f o ra c r y l a m i d e , c h i n e s ea n d f o r e i g ns c h o l a r sh a v eaw i d e l yr e s e a r c hi nn i t r i l eh y d r a t a p r o d u c i n gs t r a i n t h e yd i d m a n ys t u d i e si nm i c m b i a ls t r a i ns e l e c t i o n , f o r mc o n d i t i o no fd l l z y m ea n df e r m e n t a t i o nc o u r s e o p t i m i z a t i o nc o n t r o l ，s oh a v eb o r n ef r u i t i nr e c e n ty e a r s , t h e ym a k e 8 ni n t e n s i v es t u d yo f e n z y m e s t r u c t u r ea n dp r o p e r t y , a n dd i s c l o s et h ec a t a l y t i cm e c h a n i s mo f n i t r i l eh y d r a t a s et om o l e c u l el e v e l t h e s es t u d i e sh a v es i g n i f i c a n c ei ni m p r o v i n g e i l z y m a l i ca c t i v i t ya n ds t a b i l i z i n ga 蜢y m e s u , i i n - i m p r o v i n gi st h ec o 托t e c h n o l o g yo f s u a l ni m p r o v e m e n t , t h eg e n e r a lm u t a t i o nb r e e d i n gi s t ot r e a , m i c 啪r s a n l q nw i t hu v 。r e d i m i o no rc h e m i c a lm u t a g a n , t h e n 埘协rs t r a i n f o r w a r dm u t a t i o n r a t ei sv e r yl o w , o r d i n a r i l yl 矿t h et r a i ne v o l v e do u to f a l o n gp r o c e s so f m u t a t i o n , s oi t ss p e c i f i c o h a r a o t e nw i m p r o v e d , s i m u l t a n e i t y 扯n 枷如gd e t r i m e m a lm u t a t i o n sw h i c he x t r a n e dt o s p e c i f i cc h a r a c t e r s , f o re x a m p l e ：g r o w t hc o n d i t i o n st u r n e d 蛳，v i a b i t i l yw a sw e a k , t h ec e l lt u r n e d b r i t t l a n e s s ，e ta 1 c f o 籍h d m gu s e dd o n o ra n dr e c e p t o rw h i c hc h a r a c t e 幅w e r eg i v e n 船p a r e n t s ，s o i ta d v a n c e dm u c hm o l et h a nm u t a t i o nb r e e d i n gw h e t h e ri nd i r e 甜哪o rc o n s c i o u s n e s s s i n c e c r o s s b r e e d i n gi sv e r yc o m p l e x , i ti sm o r ed i f f i c u l tt h a nm u t a t i o nb r e e d i n gt os p r e a da n du s e ， e s p e c i a l l yi nt h ef i e l do f p r o k a r y o t e , i ti sr m 3 , t ob r e e dh i g h - y i e l ds t r a i nb yu s i n gg e n o m es h u f f l i n g m o l e c u l a rb f 曲唱i n h e r i t e da n di m p r o v e dc r o s s b e d i n gi ta c c e l e r a t e dt h eb r e e d i n g - s c h e d u l eb y u s i n si l 删l l o t i n n a n d m e t h o d , s o i t sf o r e g r o u n di s 越l 妁a d 讧u s e di n 眺m e t a b o l i c p a t h w a y i nw h o l e g e n o m eb r e e d 岵 t h eo b j e c to f g a n o m es h u f f l i n gi st h ew h o l ec e l l ，i tm a d ec r o s sb l 俄d i n gt om u t a t i o ns t r a i n , a n dc 卸啪d i f f e r e n ts u m sg a n o m et or e c o m b i n e c o m p l c t o l y , t h ec h a n c eo fv a r i o u sf o r w a r d 3 卜托t - ，j 嘈的| i 目i 潍r 种a j 鼻j 强| | 擅蚰研竞 m u t a t i o nc o n c o r d a n c et oar e c o ni m p r o v e d s i m u l t a n e i t y , a c c u m u l a t i v ed e t r i m e n t a lm u t a t i o nw a s r q ) l a c , e db y t l l es e q u e n c eo f w i l d t y p es t r a i n h e n c e , i m p r o v e d 踟v t d s d e t e c t e db y h i g l lf l u x ，t h e n e n t e r e dt h en e x t 舻n o m e s h u f f l i n g , t h ef o r w a r dm u t a t i o nr a t e c a l lb ee n h a n c e d g r e a t l y s o ，u s m gn o e a r d i as p a so r i g i n a ls t r a i n , w h i c hp r o d u c e sn i t r i l eh y d r a t a s e ，t h i sr e s e a r c h s u b j e c tu s e da n t i b i o t i e - r e s i s t m a e ea ss i g n , t h e np r e p a r e dp r o p l a s t sa n dm a d em i c r o w a v em u t a g i _ s m a n df u s i o nt ot h e m t h e nw es e l e c t e das t r a i nw i t ht h eh i g h e re n z y m a t i c a c t i v i t yb yg e n o m e s h u f f l i n g c o n s e q u e n t l y , w er a i s e de f f i c i e n tp r o d u c t i o no fa c r y l a m i d e f i n a l l y , w es t u d i e dt h e p h y s i o l o g yp r o p e r t ya n df e r m e n t a t i o nc o u r s eo p t i m i z a t i o nc o n t r o lo f t h em u t a t i o ns t r a i n a snr e s u l t , w ei m p r o v e dt h ee n z y m e - p r o d u c i n go ft h es t r a i na n dt h e i re d a p t a b i l i 吐t h er e s u l t si n c l u d e dt h e f o l l o w i n gs e v e r a l p e c 协： 1 - s c r e e no u to fa a t i b i o t i c - r e s i s t a n c es u a l n sb y g e n o m es h u m h 唱t h e n , t h ee n z y m a t i ca c t i v i t i e s z f t h et w os t r a i n sw h i c hw m o b t a i n l w e r e 5 4 6 7 0u g m l h ra n d5 3 9 6 0u g m l h rr e s p c c t l y a f t e r s e v e r a lg e n e r a t i o n sc u l t u r e , t h ef e r m e n t a t i o nt e s t ss h o w e d t h a t 町ma c t i v i t yi si m p r o v e d3 6 4 f e r m e n t a t i o np e r i o di s2 0 h rs h o r t e ri nf c r m e n a a l i o nt a n k c o n d i t i o n so fc u l t m ew e i n oc h a n g e d e v i d e n c e l y , s oi ts u i t sf b r 协ee x i s t i n gp r o c e s sc o n d i t i o n s 。w ec a nu i ti ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o n 2 p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o n ：c o n d i t i o n sa b o u tp r o t o p l s s to p t i m i z m i o np r e p a r a t i o no f n o c a r d i as p ，w h i c hc o u l dp r o d u c en i t f i l eh y d r a t a s e ，w e ms t u d i e db yo r t h o g o n a l 【p 目蛔埘盘， i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fp r e c u l t m ea n dl y s o z y m e , l y r i ct i m e ，h y p h ac u l t m et i m e , e t c a sa r e s u l t , b y p h ac u l t u r et i m e3 6 h r , o l y0 + 2 ，l y s o z y m e2 m g m l , l y t i ct i m e4 0r a i n , a 托t h eo p t i m u m p r e p & - 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2 5 - e n l a r g et h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f m u t a t i o ns u a i na n d c o n t r o lt h ef e r m e n t a t i o np a r a m e t e rf a c t o r s e n l a r g et h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fm u t a t i o ns u a i ni nf e r l n 4 舭a t i o nt a n k t h e n 。d r a wt h ec u r v eo f g r o w t ha n dc x m t r o lt h ef e r m e n t a t i o np a r a m e t e r f e a m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 ，p h t 2 ，t h ed o s eo f a n t i f o a m2 0 0 p p m ，v e n t i l a t o r yc a p a c i t y2 1 s l p m , t h er a t eo fa g i t a d o n4 0 0 r m i l l l i q u i dm e s s i e e c o e f f i c i e n t 0 5 ，e n z y m ea c t i v i t y i s i m p r o v e d3 6 4 ，f e n n e n t a t i o np e r i o di s s h o r t e r2 0 h ri n f e r m e n t a t i o nt a n k g t , yw o r d s ：n i t r i l eh y d r a t a s e ；n o c a r d i as p ；m i c r o n t g m f i s mm e t h o d ；a = y l a m i d e ；p m t o p l a s t ； m u t a g e n e s i sb , e d i n g ；g e n o m es h u f f l i n g ；f e r m e n t a t i o nc o 删c o n t r o l 5 q 暗i 离产怕| 。目l t 嘴种a 囊鼍肆垃曩拉_ 曲研，巴 1 前言 1 1 生物法生产丙烯酰胺的发展历史 丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ) 是一种用途广泛的重要有机化工原料，以它为单体合成的产品不 下百种，其中主要用于生产聚丙烯酰胺( p o l y a c r y l a m i d e ) 。聚丙烯酰胺作为絮凝荆、增稠剂、 增强剂等，在石油开采、造纸工业、选矿、洗矿、洗煤、冶金、水处理、制糖、建材、织物 处理及化工等各个领域中被广泛使用“一。由于聚丙烯酰胺在以上各领域的市场潜力日趋凸现， 特别是环保产业的逐步兴起，将会对聚丙烯酰胺有更大的需求，当然必定会需求更多的丙烯 酰胺单体，故丙烯酰胺行业有着广阔的开拓前景，这个领域的发展也将大有作为。然而目前 我国丙烯酰胺很大程度上有赖于进口，国内产量远不能满足各行业的需要，特别是不能满足 高纯度聚丙烯酰胺的需求，故此产品的进一步开发将显示出更为广阔的市场前景。 从2 0 世纪5 0 年代至今，以丙烯腈为原料生产丙烯酰胺的工艺，经历了包括硫酸化学水 解、含还原铜金属催化剂的化学水合和微生物腈水合酶( n i t r i l eh y d r a t a s e 。e c 4 2 1 8 4 ) 转化法三个发展阶段“”1 。但前两种方法都分别存在着工艺复杂，产品精制困难、污染环境、 反应温度高、产品中所含的金属离子有阻聚作用等问题。2 0 世纪8 0 年代，t o r un ”，j u ns i k l w a n g ，a s a n oy 等人进行了生物法合成的研究，并开发出生物催化水合制取丙烯酰胺的新 方法。该方法具有化学方法不可比拟的优越性： a 在常温常压下反应，装置结构设计容易，操作安全； b 单程转化率极高，达到9 8 以上，无需分离回收未反应的丙烯腈，每吨丙烯酰胺的丙烯腑 消耗与化学法相比降低了8 ； c 酶的选择性极高，无副反应，无铜离子杂质，可用于生产高分子量高纯度的聚丙烯酰胺； d 不需要脱盐、脱色，使分离精翻操作大为简化，整个过程倚便，有利于小规模生产； e 设备和建筑费用减少1 3 ，生产成本降低1 3 。 ( 1 ) 硫酸水合法 1 9 5 4 年美国氟胺公司首先开发了硫酸水合法生产技术，实现了工业化生产，在此后的近 二十年中一直是唯一工业化生产方法。丙烯腈和水在硫酸存在下水解生成丙烯酰胺硫酸盐， 然后用液胺中和丙烯酰胺溶液，反应物经分离过滤后，将滤渡结晶、干燥即得成品由于该 6 舅r 龠夫掌2 0 0 5 - 曩圣衙竞生摹呻e 塌 童 工艺复杂产品精制困难，环境污染严重，人们在不断地寻找新的生产方法。 ( 2 ) 铜催化水合法 2 0 世纪7 0 年代后期，发明了铜催化水合法。该方法由丙烯腈在8 5 1 2 5 c 和0 3 - 0 4 肝 条件下用骨架铜作催化剂直接水合的一种化学方法。它与传统硫酸水合法相比，工艺得到很 大改进：转化率提高。副产物减小，工艺流程短、投资少、设备腐蚀小、原料消耗低、系统 封闭环境污染减小等特点，所以该法多年来一直占主导地位。但此工艺需在高温下进行，由 于铜离子的残留，使生产得丙烯酰胺难以合成高分子量的聚丙烯酰胺。 ( 3 ) 微生物转化法 微生物腈水合酵转化法是目前具有国际先进水平的新技术新方法。该方法利用生物技术 培养出的细胞体作为酶催化j f ! f ，这种细胞能在适宜环境下利用自身细胞蛋白酶把丙烯腈水合 成丙烯酰胺。与传统化学法相比，该法具有高催化性、高选择性，使丙烯膪有较高的转化率， 并且生成的丙烯酰胺纯度高，没有其它影响丙烯蓑胺聚合的金离子，使后续合成聚丙烯酰 胺的分子量大幅度提高 铜催化水合法反应工艺流程( 圈i - 1 ) 和微生物转化法反应工艺流程( 图l - 2 ) 如下： 圈卜i 悄催化水台法生产丙烯酰胺的工艺流程圈 圈卜2 徽生物法生产丙烯酰胺的工艺流程圈 1 2 高活性腈水台酶菌株的筛选方法 生物催化法制取丙烯酰胺为近年发展起来的绿色化学工艺，并在我国得到推广和发展。 7 庸拳古村产t 的l 焉- t 肆育种丑_ | 毫哗垃覆捷_ 的崭兜 该方法具有反应条件温和、转化率高、选择性高、产品质量高且无污染等优点。而用于此反 应的催化剂就是膪水合酶( n i t r i l eh y d r a t a s ee c4 2 1 8 4 ) 。 1 2 1 腈水合酶简介 产腈水合酶菌的代谢具有多样性，但所有腈水合酶均为胞内酶。腈水合酶的产生取决于 培养基中的碳源、氮源、金属离子及酶表达所需诱导剂等。如需将膪转化为酰胺时，可在培 养基中添加脂肪族腈作为诱导剂以诱导腈水合酶的表达；当需要羧酸时，可在培养基中添加 芳香族腑以诱导水解酶的表达。 根据所含的金属离子不同，将微生物n t t a s e 分为f e - n h a s e ( 铁型) 和c o - n h a s e ( 钴型) 两 类“”。不同来源的m b s e 的分子量有很大差别，因此也可将它们分为高分子量腈水合酶( 简称 h 瑚8 s e ) 和低分子量脂水合酶( 简称i r 瑚8 s e ) 。徽生物菌株r h o d o c u c c s r h o d o c h r o u sj 1 能同时产生h - - n h a s e ( 5 2 0 k d a ) “”和l - a s e ( 1 3 0 k d a ) 1 0 - 1 3 。虽然这两种酶都可催化腑水解，但 它们的亚单位、生物合成调节及基因表达差异甚大，因而呈现出不同的物理化学特性和底物 专一性，如 h 胁s e 对脂肪族艚有较好的专一性，而l - i t a s e 对芳香族脂有极高的转化性“。 钴型腈水合酶与铁型腑水合酶具有相似性，用x 射线衍射分析臃水合酶亚单位的结构， 显示出金属离子为辅助因子，其中金属离子钴与2 个n 原子和3 个s 原子形成5 价配位键，n 来自主链上的酰胺基团，s 来自酶蛋白中的半胱氨酸硫醇盐，酶分子中的毗咯喹啉锟为氧化还 原反应的辅酶“”，如图卜3 示。 i 一、 ? ，、。j t 镰，。i9 圈1 - 3 腈水合酶亚单位的x 射线衍射结构分析 腈水合酶催化反应特性及其反应机理：丙烯膪的水合反应的终产物为丙烯酸”，如图 8 膏n 啡2 0 0 5j e 士巴主咂健- 支 1 - 4 所示： o + n h 3 h 圈1 - 4 爵僵化下的丙烯席的水台反应 目前工业上使用的产腈水合酶菌是一种酰胺酶和腈水解酶突变菌株，这从根本上解决了 酰胺酶和腑承解酶引起的副产物丙烯酸的生成，使产物丙烯酰胺得到积累，转化液中产物浓 度最高可达6 0 0 9 l “。 下面以一钴型腈水合酶为例描述催化反应历程： 腈水合酶中的钴离子起到l e w i s 酸的作用。首先，钴离子与聃及周匿的水分子结合，激 活腈基中的三键，并在辅酶p q q 的共同作用下发生水合反应。腑基靠近0 i i 一( 或者一个与金 属离子形成共价键的水分子) ，然后，伽一( 如图卜5 所示) 或者水分子( 象广义上的碱一样 被活化，如图卜6 所示) 攻击腈基中的碳负离子，形成一个亚酰胺( r - - c ( 一咖) = 嘲) ，量 后，亚酰胺异构化生成酰胺，正是由于这种独特的催化机理，使脯水合酶能有效地催化腈类 化合物的水解。 r h 圈l _ 6 钻型腈水合酶的催化反应历程= 9 r 一址m c 声 n 6 h h b w r c - - n i t 2 眵 程 r 一 一 、 篡i 尹h 矿：圳。i|矿枷 翻 l 卜 珊 - 融 一 硼 一 一r 一 一 粤 耍 蘑睛i ，r ，r 的| l 园l t a _ 善j 过l 董e i 的习睫 1 2 2 腈水合酶高活性菌株的筛选方法 1 2 2 1 微波诱变育种 电磁场作用于生物体的研究，有两个不同的方向。1 。一个是主要研究电磁波与生物体相 互作用，即所谓热效应。热效应是指一定频率和功率的电磁辐射照射在生物体上，引起局部 温度上升，从而引起一些生理生化反应，甚至死亡。另一个是生物体非热效应，即在电磁波 的作用下，特别是在低强度、长时问的弱电磁场的作用下，生物体不产生明显的温升，或产 生的温升是在生物体自身温度自然起伏的范围内，可以忽略其变化，但却可以产生强烈的生 物响应，使生物体内产生各种生理、生化功能的变化，并表现出频率和功率的选择性。实际 上，电磁波对生物体这两种效应同时存在。 天然和人造电磁场频谱范围很宽，可以从极低频率到能产生电离辐射的极高频率即0 1 0 啦h z “”。频率范围在3 0 0 跚z 一3 0 0g h z ( 波长i m - - l r ) 的徽波电磁场的生物效应同样包括 热效应和非热效应。由于微波这两种效应的存在，从而可以引起生物体产生一系列的正突变 效应或负突变效应。而徽波辐射属于低能电磁辐射的一种，其量子能量在1 0 4 1 0 一勺。它对 作物样品的作用机理是场力和转化能的协同作用，场力即非热效应，转化能即热效应。 微波是一种电磁波，在生物学上，微波主要用于杀菌、刺激植物种子发芽生长o o ”，而用 于微生物诱变育种只是近几年来才有文献报道。微波的生物效应分为热效应和非热效应，人 们感兴趣的是它的非热效应，这也是研究的重点。在研究微波的非热效应时，为了消除微波 的热效应必须采取一定的措施，常用的方法有：分散低温干燥法，分散低温热分散法。”等。 本文在辐照过程中采用了分散低温热分散法，使孢子悬渡温度最终保持在2 0 3 0 c ，较大程 度上消除了微波的热效应，使非热效应凸现出来。 微波对生物的非热效应可能灏于以下几个方面： ( i ) 微波是一种电磁波，其交变电场对微生物细胞内d n a 等极性分子的洛仑兹力作用，强追 其按照电磁场作用的方式运动，从而引起d n a 分子点突变，产生遗传变异。 ( 2 ) 微波极强的穿透效应使胞内外水分予同时产生剧烈转动，从而引起细胞壁通透性发生变 化，更易使胞内代谢物分泌出来。 ( 3 ) 2 4 5 0 h h z 微波能使水分子以1 8 0 。s 的速度来回转动2 4 5 亿余次，强烈的转动摩擦使得 l o 霄龠夫2 0 0 5l | 士确巴j b 堙t i e 寞 胞内d n a 分子氨键和碱基堆积力受损，最终引起d n a 分子结构变化导致遗传变异。 微波诱变育种的研究及应用已经相当广泛，涉及到很多领域。有些已经取得了很大的 成功，但有些依然还只是处于研究阶段，还很不成熟，依然还需要做许多工作。从现有的研 究结果来看，主要有如下几个方面还需要进一步深入研究：( 1 ) 现在许多研究基本上是集中 在高等生物上，而且还依然很不成熟，许多方面的结论暂时还无法作出，现在仅仅是猜测， 不具有实际意义。( 2 ) 许多通过统计得出的结果还不足以令人相信。因为一方面是数据不充 足，因而得出的结果不具有统计意义。另一方面是试验的随机因素太多而无法予以充分考虑， 这样取得的数据可信度不高。( 3 ) 单一采用微波进行诱交的效果不是很理想，比较可行的方法 是采用几种方法联合应用。因为通过几种方法的联合，可以发挥各自的优点，从而取长补短， 这样能够达到比较满意的结果。( 4 ) 就目前来讲，单一微波生物效应的研究基本上集中在2 4 5 0 i l z 的徽波上，且取得的成果也主要是这方面的，因而在这一方面上值得深究可以集中在这 一方面着重进行研究，期望能获得较令人满意的结果。( 5 ) 徽波诱变在徽生物育种方面的研究 及应用还很少，也很不系统。但是，徽生物诱变育种却具有许多优点如基因组小、世代周 期短和易于培养分离等这些优点决定了徽波在徽生物育种方面的应用研究必须得到重视， 徽波诱变作为一种新兴的徽生物育种技术将具有不可估量的潜力。因此，本课题采用徽波诱 变作为主要诱变因子。 1 2 2 2 原生质体融合技术的进展与展望 细胞融合或称原生质体融合，就是在高渗环境中使亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以去 除，释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将亲株的原生质体在高渗条件下混合， 由聚乙：醇( p e g ) 助融，使它们相互凝聚，通过细胞质融合，接着发生基因组之间的接触、 交换，从而发生基因组的遗传重组，再通过合理的筛选程序，从再生细胞中获得重组干微生 物原生质体融合技术也有其缺点，主要是工作量大、定向性差，但作为常规的育种方法，它却 有着以下几方面的优点： 去除了细胞壁的障碍，使得没有有性过程、没有转化和转导系统的微生物，或者是相同 接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，而且可以冲破种、属的界线，广泛地在有生 产价值的微生物种问以至属问进行杂交育种； 嘛育产r 的l | 艚a j 峨翊l 蝗一曲研，e 原生质体融合后两个亲株的整套基因组相互接触，可以有机会发生多次交换，产生各 种各样的基因组合而得到多种类型的重组子； 有p e g 助融，重组频率高； 可以和其他育种方法相结合，把从其他方法得到的优电性状通过原生质体融合再组合到 一个单株中，又可以多个亲株融合一体； 可以进行包含非活性原生质体的融合，即用温度、药物或紫外线照射处理钝化亲株方 的原生质体，然后再与一亲株的活原生质体相融合，这样可以在筛选中除去亲株一方，提高筛 选效率。 1 2 2 3 基因组重排育种 作为现代生物技术核心基础之一的细胞融合技术在近半个世纪来突飞猛进，并已在农牧 业、轻工、医药等领域取得了许多具有开创性的研究成果矧。自2 0 世纪8 0 年代以来，空间细 胞电融合，离子束细胞融合以及非对称细胞融合技术也逐步发展起来，并得到广泛的应用。现 已出现将磁、超声波、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂的新型细胞融合方法。但是 对于微生物育种来说，它只适合用p e g 法近来刚刚出现了一种新兴的微生物育种方法，即基 因分子育种。这种方法的出现将极大的推动微生物细胞融合技术的发展。 优良菌种选育技术是发酵工程的核心技术。常规的诱变育种方法是以紫外线、辐射或化 学诱变；f ! i 处理微生物( 基因组) ，产生大量突变，然后以所需指标进行缔选由于负突变的比例 非常高，一般要筛选1 0 0 0 0 个突变体才能发现一个正突变经过长期诱变获得的菌株在特定性 状有所改善的同时，也往往积累了很多不直接和特定性状关联的有害突变，比如生长条件要求 苛刻，生存能力变差，细胞变“脆弱”等。 杂交育种选用已知性状的供体和受体菌株作为亲本，因此无论在方向性还是自觉性方面， 都比诱变育种前进了一大步。另外，利用杂交育种往往还可以消除菜一菌株在生长期诱变处理 后所出现的产量上升缓慢的现象，因此它是一种重要的育种手段。但由于杂交育种的方法较 复杂，工作进度较慢，因此还很像诱变育种技术培育高产菌株的例子还不多见。分子育种 ( m o l e c u l a rb r e e d i n g ) 继承和发展了杂交育种，引起新的概念和方法加速了育种进度。因此 它的应用前景很广，可以用于基因、代谢甚至全基因组的育种。 霄r 大l e2 0 0 5 习l j b 习 屯1 0 捌啦惦文 基因分子育种即i