（环境科学专业论文）黄酮类化合物抑制过亚硝酸根损伤酪氨酸的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t p e r o x y n i t r i t ei sf 0 彻e db y 廿l er c a c t i o o fn i 仃i co x i d ea 1 1 ds u p e r o x i d ea i l i o n d 嘶n gn o r l a lp h y s i 0 1 0 9 i c a lp r o c e s s e s ，a n dp e r o x 姗t r i ca c i di st h ep r o d u c to f h y d i o g e n i z a t i o n b 础p e r o x 河t r i t ea n dp e r o x y n i m ca c i dc a u s ed 锄a g et ob i 0 1 0 9 i c a l b o d yb yr e a c t i o n 谢血b i o l o g i c a lm 0 1 e c l l l e sa ss 打o n go x i d a n t s t h c r c f o r e ，i ti s i m p o r t a n tt os t u d yt 1 1 ed 锄a g ec a l 硌e db yp e r o x y n 埘t ea n dp e r o x 河埘ca c i da i l dt l l e i n h i b i t o r s f i r s t l y ，s o m ef a c t o r s ，s u c ha sd e t e c t i o nw a v d c n g m ，m o b i l ep h a s ea 1 1 ds oo n ， w e r e 咖d i e d b ym e 锄so f 肿l cf o ra c c u m t ed e t e c t i o no ft y r o s kd 锄a g ei n d u c e d b y p e r o x 删t r i t ea n di n l l i b i t i 】1 9a c t i v “yo fn a v o n o i d s a n d l em o s ta p p r o p r i a t ed 烈e c t i o n c o r l d i t i o n sw e r e 鼬df o rt y r o s i n e ，i t sd 锄a g ep r o d u c t sa n df i v en a v o n o i d s ( q l l e r c e t i i l ， c a t e c l l i l l ，n a r i n g e i 血，d a i d z e i na 1 1 dn a v o n e ) f u r 山e m o r e ，t h er e c o v c 时e so fp e r c e n t a n dt h ea i l a l y s i so f a c c u r a c yo fs a m p l e si n d i c 砷e d 也a tt h em e m o dw a sa v a i l a b l e n e x ti tw a st l l es t u d yo n 哆r o s 洒ed a m a g ei n d u c e db yp e r o x y n i t r i t ci nt h et y r o s i n e s o l u _ 【i o np hr a l l g e4 o 10 4 ，a n dt h e r ew a s 缸恤e rd i s c u s s i o no ft l l ed 锄a g c p m c e s s e sa td i f r e r e mp h a tt l l es 锄et 蛔e ，t l l e 丘er a d i c a lp r o c e s sw a sr e c o g n j z e d b yc a p t l l r ea g e n t ，h y d r o ) ( y l - b e n z o i ca c i da n dd m a n l l i t 0 1 1 m r d l yi t 邯也er e s e a r c hi n t of i v et ) ，p i c a in a v o n o i d s ( n a v o n o l s q u e r c e t i i l ， n a v 锄o l s c a t e c l l i n ，n 删o n e s n a 血g e i l i l l ，i s o f l a v o n o i d s d a i d z e i l la n dn a v o n e 谢t h o ma n yg r o u p ) i n h i b i t i o 丘d mt y 】s i n ed a m a g ei n d u c e db yp e r o x y n i 仃i t e t h c i 1 1 l l i b “i n ga c t i v 时o ff i v e 伺v o n o i d s 、v 鹤玎e c o 掣l i z e db y3 - n i 们t y r o s i n e a n d 3 - h y d r o x ”o s i n cr c s p e c d v e l ya tp h7 4a n dp h5 4 ，a n dt l l er e l a t i o nb e t w e e n 血e s t r l l c n l r ea n d 也ea c 6 v i 啦w 髂d i s c u s s e d f i n a l l y ，m er e s m to f 吐l es ”e r g i s t i ci i l l l i b m o nb e 铆e e nv i 协m m ca 1 1 dq u e r c e t i n i n m c a t e d 仕m tv i t a r 山cp a n i c i p a t e di n 也ei 1 1 h i b i t 堍s y s t e mb yr e d u c i n gq u e r c e t i n 丘e er a d i c a l st oq u e r c e t i nb yo 矗色r i n gd e c 仰璐 k e yw o i m s ： p e r o x 河，呻s 曲，n a v o n o i d s ，r e s 蜘m r i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得j b 塞王些塞堂或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名擗 关于论文使用授权的说明 日期：塑o f 本人完全了解a 塞王些盔堂有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签 导师签名：掣日期：业 第一章绪论 第一章绪论 1 1 过亚硝酸根的研究进展 1 1 1 过亚硝酸根的产生及其生理作用 1 9 9 0 年，b e c k m a n 等人就提出生物系统中有o n o o 生成l l j ，o n o o 。研究成 为生命科学研究中的热点之一。 在生物系统中，为了抵御入侵的细菌和病毒，生物体巨噬细胞和嗜中性粒细 胞通过辅酶i i 将0 2 还原为0 2 - 2 】：同时，免疫系统还会产生一氧化氮自由 基一一n o ( 在血管舒张、神经传导和血小板抑制等过程中也会产生- n o ) 1 3 】。一 部分超氧根阴离子( 0 2 一) 和一氧化氮自由基( n o ) 反应生成毒性物质0 n o o ， 在巨噬细胞和嗜中性细胞中都检测到o n o o 的存在j 。 n o + 。0 f _ 旺_ n o o 0 2 与n o 反应的速率非常快( k = 6 7 1 0 9 r n 0 1 l s 。1 ) ，为扩散控制型反应， 比o i 与超氧化物歧化酶s o d 的反应o f 2 1 旷m 0 1 “l s “) 要快，也快于n 0 与铁的配位反应( k 黄酮类 黄烷醇类【3 0 】。这一研究小组又于1 9 9 3 年通过电子 顺磁技术进一步证明了，黄酮醇类被以上自由基氧化后的自由基产物不稳定，而 是转变为醌式共振结构叫】。 g a v i l le 等人进行了表儿茶酸的单聚体和多聚体( 属黄烷醇类) 清除过亚硝 酸根的试验。内标化合物为3 羟基4 硝基苯甲酸，以硝基酪氨酸的浓度变化作为 抗氧化剂强弱的标记，利用，l c 分离检测手段，对多酚类化合物可有效抑制过 亚硝酸根硝化酪氨酸残基、损伤d n a 进行了验证；证明了表儿茶酸四聚体的抗 氧化性能优于单聚体。g a v i ne 等人从表儿茶酸无法阻断过亚硝酸根氧化谷胱甘 肽的实验结果认为：黄烷醇类化合物不是直接与过亚硝酸根反应，而是呈一级动 力学反应一一和氧化中间体和硝化中间体作用；黄烷醇类化合物的氧化产物在体 内如何再循环是亟待研究的问题【3 2 j 。 t a k a i l 耐t s u d a ，y o j ik l t o 等人通过u v s p e 咖， 玎l c p d a ，h p l c m s 的 检测分析手段，进行了花葵素( 属花色素类) 抑制过亚硝酸根硝化酪氨酸的研究。 该研究小组认为：p 一羟基苯甲酸和4 羟基3 硝基苯甲酸是花葵素与过亚硝酸根反 第一章绪论 应后的产物【3 3 】。 国内的研究人员已从多种植物中提取了相应的黄酮类化合物。如黄芪总黄 酮，具有显著的清除羟基自由基等多种自由基的功能；银杏叶总黄酮含有3 5 种黄 酮类化合物，其中双黄酮类6 种，黄酮苷1 7 种，银杏外种皮中也含有黄酮类化合 物，主要是双黄酮类化合物；还有槲皮素和槲皮素苷等黄酮类化合物 3 4 d ”。利用 天然产物中的黄酮类化合物研究开发新药，具有广阔的应用前景。 1 2 1 2 酚酸类化合物( p h e n o l i ca c i d l 酚酸类化合物约占酚类的1 3 ，仅次于黄酮类化合物，该类化合物以酯的形 式存在。酚酸类化合物一般按其母体结构划分为羟基苯甲酸类化合物和羟基肉桂 酸类化合物( 如p 羟苯基丙氨酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、芥子酸和姜黄色素 等) 【3 ”。近年，研究人员又从植物迷迭香中提取出迷迭香酸这一多酚酸化合物( 见 图1 - 3 ) ，它的特点是：天然无毒；是人工合成抗氧化剂的2 到4 倍；不易分解， 可耐1 9 0 至2 4 0 高温，克服了维生素c 、茶多酚等大多数天然抗氧化剂遇高 温分解的弱点1 3 8 ，3 9 j 。 o h 图1 5 迷迭香酸 f 遮1 5r o s e m 撕n u s 一些抗氧化剂对比试验表明，酚酸类化合物的抗氧化活性比许多已知的内源 性抗氧化剂( 如维生素c ，e ) 要强几倍甚至上百倍 4 0 】。 另外，有研究人员认为：单羟基酚酸化合物与过亚硝酸根反应生成硝化产物， 如p 羟苯基丙氨酸( 香豆酸) 、阿魏酸；儿茶酚酸盐、咖啡酸和绿原酸等多羟基酚 酸化合物( 邻位多羟基化合物) 在反应后生成o 苯醌【4 1 ，4 2 】。t o s h j o n i w a 等人以3 硝基酪氨酸的形成做标记，他们用三种酚酸化合物：p 羟苯基丙氨酸( 香豆酸) 及 其衍生物一一咖啡酸和芥子酸分别与过亚硝酸根反应，经h p l c - u v 方法检测分 析得到如下结果：咖啡酸和芥子酸对3 硝基酪氨酸形成的抑制效果最为显著。又 通过核磁共振对芥子酸和过亚硝酸反应的产物进行了分析，产物为一元酸内酯的 二聚体。他们认为这是芥子酸被过亚硝酸根单电子氧化的结果：芥子酸( 单羟基 酚酸化合物) 氧化后经历了醌式中间体，最后的产物为二聚体。这证明了单羟基 酚酸化合物产物的非单一性【4 3 1 。 1 2 2 类胡萝l 、素( c a 阳t e n o i d s ) 北京工业大学工学硕士学位论文 类胡萝h 素是源于植物的抗氧化剂，现已知结构的类胡萝h 素将近6 0 0 种， 类胡萝h 素结构上的特点就是大量的共轭双键畔耶】。 m o r t e i l s e n 等人利用脉冲技术对类胡萝h 素与自由基反应的动力学进行了研 究，认为在清除二氧化氮自由基的机理是：类胡萝h 素化合物失去一个电子成为 自由基，自由基再与其它抗氧化剂作用被还原，反应式：n 0 2 + c a r n 0 2 + c 一 ( c a r ：类胡萝h 素化台物) i 舶j 。 fb 6 h m 等人把经维生素e 、维生素c 和b 胡萝h 素单独处理的淋巴细胞、三 种抗氧化剂联合处理的淋巴细胞分别与过亚硝酸根溶液反应，实验结果显示：三 种抗氧化剂的协同效果比单独使用高出了十倍 4 7 】。 1 2 3 谷胱甘肽( l g l u t a t h i 咖e ) 谷胱甘肽，分子式为c 1 0 h 1 7 n 3 0 6 s ，是一种具有重要生理功能的活性三肽， 它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，因其含有游离的- s h 基，所以 常用g s h 来表示。谷胱甘肽广泛存在于动植物细胞内，在动物的肝脏中含量较 多，属于内源性的抗氧化剂”。 m i c h lb a l a z y 等人探讨了谷胱甘肽的抗氧化机理。在谷胱甘肽与过亚硝酸 根反应后，以g s n 0 2 和g s n o 作为外标，经r p h p l c u v 分离纯化后，通过质谱 的方法得到了谷胱甘肽的氧化产物，由此认为谷胱甘肽的抗氧化机理是：谷胱甘 肽经硝化后生成g s n 0 2 ，一方面，产物和另一个g s h 分子反应得到g s s g 和n 0 2 。， 另一方面，g s n 0 2 的两种共振结构释放出。n o 【4 9 】。而n o 在人体的神经系统和血 液循环系统中起着重要的信使作用口】。 1 2 4 有机硒( o r g a n o s e l e n i u mc o m p o u n d s ) 生物源有机硒( 指源于植物的有机硒) 在吸收率、生理和药理功能上优于一 般有机硒，而一般有机硒又优于无机硒1 5 。 对于大蒜中硒的生物富集的研究发现：大蒜中有机硒的主要存在形式是硒蛋 白、硒多糖、硒核糖核酸以及包括含硒氨基酸在内的有机化合物，其中，以硒蛋 白含量最多。通过加入硒蛋白前后谷胱甘肽过氧化物酶9 g s h - p x ) 活性变化实验， 初步认为硒蛋白的抗氧化作用有可能是作为谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 的 活化因子，以提高g s h - p x 的含量和活性来实现的，有关这方面的机理还需进一 步探讨队5 2 1 。 k a r l i s 等人比较了s e c y s ( 硒代半胱氨酸) 和s e m 酏( 硒代甲硫氨酸) 及其相 应的硫化物的抗氧化活性，研究发现：o 1 m m 0 1 l 的s e m c t 和1 i n i i l 0 1 l 的s e c y s 比 相应的硫化物能更有效地降低5 0 岫o l l 过亚硝酸根所引发的d n a 开环反应，且 第一章绪论 0 1m m o l 几s e m e t 能抑制7 5 的d n a 单链断裂。这表明含硒化合物可以有效地保 护d n a 不受过亚硝酸根的损伤 5 3 - 5 5 。 1 2 5 硫辛酸( a l p h a - l i p o i ca c i d ) 硫辛酸是一种新型抗氧化剂，它是生物体内的一种重要的辅酶，体内可以产 生硫辛酸，但它的量并不能满足体内的需要。硫辛酸清除自由基的反应历程如图 1 6 所示。 f 蛐 二j 疆一。 ；勘) 4。严4 3 0 0 h：o 。h 图1 - 6 硫辛酸 f i g 1 6a l p h a l i p o i ca c i d 硫辛酸的氧化产物可以通过其它抗氧化剂如维生素c 或维生素e 再还原为二 氢硫辛酸。 硫辛酸具有一个特性一一既是水溶性的，又是脂溶性的，可以相当高的浓度 存在于细胞内及细胞外，可以减活脂溶性或水溶性自由基，从而保护脂蛋白及其 膜【5 6 。5 吼。 1 2 6 维生素类化合物( v i t a m i n s ) 维生素类化合物最主要的是以调节因子或辅酶的形式参与抗氧化体系，即与 其它类抗氧化剂协同作用；另外，不同维生素间的联用也会进步加强抗氧化效 果。例如，抗坏血酸( 维生素c ) 能与生育酚( 维生素e ) 自由基反应重新还原 生成生育酚，反应生成的抗坏血酸自由基在一定条件下被n a d p 体系酶( 辅酶i i ， 即三磷酸吡啶核苷酸) 还原成抗坏血酸；维生素c 、e 、b 2 联用后的抗氧化效果 在动物试验中也得到了证型5 9 引j ： 1 3 本课题研究内容 本文采用所建立的检测分析方法，在不同p h 值条件下进行过亚硝酸根损伤 酪氨酸和自由基捕获实验，对过亚硝酸根损伤生物分子的过程做进一步的探讨； 北京工业大学工学硕士学位论文 并且，针对这种引发机体各种疾病的强氧化物质，本文选取了目前正在被深入研 究的黄酮类化合物，通过对其中五种典型物质抑制能力的研究，进一步讨论黄酮 类化合物的构效关系。本文具体的研究内容是： ( 1 ) 经实验筛选，确定合适的液相色谱条件，以用于损伤实验和抑制剂实验。 ( 2 ) 采用以上检测方法，对过亚硝酸根损伤酪氨酸的过程做了进一步的验证和 探讨。实验方案包括：在八种p h 值条件下损伤产物的变化，两种p h 值条件下 的自由基捕获实验。 ( 3 ) 本文选择了五种典型黄酮类化合物抑制过亚硝酸根对氨基酸损伤的实验。 本文所挑选的五种典型结构的黄酮类化合物为：黄酮醇类的槲皮素、羟基黄烷醇 类的一水和儿茶素、三羟基黄烷酮类的柚苷配基、二羟基异黄酮的黄豆苷原和无 任何取代基的黄酮。通过实验，对黄酮类化合物抑制损伤的构效关系进行了探讨。 ( 4 ) 本文对槲皮素和维生素c 之间的协同作用进行了初步研究，为今后进一步 研究黄酮类化合物与维生素之间的协同作用做探索性工作。 第二章检测方法的确定 第二章检测方法的确定 本实验中所检测的是多组分混合物，每一种组分在光谱检测中都存在多个不 同的波长吸收，例如，槲皮素以甲醇做溶剂，经紫外可见光光谱仪检测，分别 在2 5 5 衄、2 6 9 n m ( 肩峰) 、3 0 1 n m ( 肩峰) 和3 7 0 i 】m 处存在吸收，黄酮在2 5 0 衄、 2 9 4 m 和3 0 7 n m ( 肩峰) 处有吸收。因而，若采用光谱检测方法，组分之间会存 在相互干扰，影响检测的准确性。所以，本文实验中采用的检测方法是高效液相 色谱法。 目前，在过亚硝酸根损伤酪氨酸以及相关抑制剂的研究中，所采用的液相色 谱流动相为水+ 磷酸盐缓冲溶液；在梯度洗脱过程中，磷酸盐缓冲溶液与水在流 动相中的最高体积比为9 5 ：5 ，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度5 0 m m o l l 。但是使 用磷酸盐缓冲溶液对色谱柱的影响很大，会降低色谱柱对物质的分离能力，缩短 色谱柱的使用寿命。所以，本文将采用对色谱柱影响较小、且不影响分离度的流 动相。 本文参考了分析化学手册中1 9 种氨基酸分离色谱图和类黄酮标样混合 物分离谱图。1 9 种氨基酸类分离采用了极性流动相：乙腈+ 水( + 磷酸胺p h6 叫， 通过梯度洗脱实现；在类黄酮标样混合物分离中采用的流动相是a ：水+ 甲酸( 体 积比：9 5 ：5 ) 和b ：甲醇，通过梯度洗脱将1 9 种类黄酮化合物较好地分离开。 另外，以流动相水+ 磷酸+ 甲醇可分离出黄酮类化合物混合溶液中的槲皮素【6 2 罔j 。 综合以上文献报道，本文采用水+ 磷酸+ 甲醇作为流动相，以磷酸调节p h 值。流 动相所用水为二次去离子水、甲醇为色谱纯m 】。 2 1 实验部分 2 1 1 主要试剂和仪器 主要试剂：l 酪氨酸( 北京试剂公司) ，3 硝基酪氨酸( f l u k a 公司) ，3 羟 基酪氨酸( s i 印= l a 公司) ，槲皮素( s i g m a 公司) ，一水合儿茶素( f 1 u k a 公司) ， 黄豆苷原，即4 ，7 二羟基异黄酮( f 1 1 l k a 公司) ，柚苷配基即4 ，5 ，7 - 三羟基黄烷 酮( f 1 1 l k a 公司) ，黄酮( s i 肿a 公司) ，以上试剂均为分析纯。将l 酪氨酸、3 一 硝基酪氨酸和3 羟基酪氨酸用磷酸盐缓冲溶液( 口h7 4 ) 分别配制成1r 衄o l l 、 5 0 0l lm o n ，和5 0 0hm o l l 的溶液备用，将槲皮素、一水合儿茶素、黄豆苷原、 北京工业大学工学硕士学位论文 柚苷配基和黄酮用甲醇分别配制成5 0 0um o l 几的溶液备用。 主要仪器：l c 6 a 高效液相色谱仪( 岛津公司) ，紫外可见分光光度计u 3 0 1 0 ( 日本日立公司) 为了模拟体内的p h 值，配制标准样品溶液所用溶剂为磷酸盐缓冲溶液( p h 7 4 ) ，温度为3 7 。标准样品溶液中各物质浓度为：酪氨酸( 1 0 0um o l 几) ，3 硝基酪氨酸( 1 0 0 u m o l 几) ，3 羟基酪氨酸( 1 0 0 u m 0 1 l ) ，八种黄酮类化合物一一 槲皮素、一水台儿茶素、黄豆苷原( 4 ，7 二羟基异黄酮) 、柚苷配基( 4 ，5 ，7 三羟 基黄烷酮) 和黄酮的浓度均为5 0um o l l 。 2 1 2 标准样品的分离检测 为了提高混合组分的分离度( 其中作为检测分析指标的酪氨酸、损伤产物和 抑制剂之间必须达到完全分离) ，本实验采用调整流动相组成配比和柱温的方法。 分离度( r e s 0 1 u t i o n ，r s ) 定义是：相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也 叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当黜= 1 时，表示两峰基本分离，裸露峰 面积为9 5 4 ，内侧峰基重叠约2 ；r s = 1 5 时，裸露峰面积为9 9 7 ，当r q l 5 时，称为完全分离。 2 1 2 1 检测波长的确定 因为本实验中采用的紫外检测器是单通道，不能进行全波长扫描，所以需要 在紫外可见分光光度计上分别测量以上八种标准样品液( 以甲醇为溶剂) 的吸 收光谱，以选择合适的混合标准样品的测量波长。各标准样品的最大紫外吸收波 长见表2 1 。 表2 1 八种物质的最大紫外吸收波长 标准样品最大紫外吸收波长( 1 l m ) 酪氨酸2 7 5 羟基酪氨酸2 8 0 硝基酪氨酸 2 8 0 槲皮素 2 9 4 儿茶素2 8 0 柚苷配基2 9 0 黄豆苷原2 5 3 黄酮3 1 0 从表2 1 得出以下结论：在扣2 8 0 姗附近，除黄豆苷原和黄酮外，其它样 第二章检测方法的确定 品在波长为2 8 0 玎m 附近都有最大吸收；黄豆苷原在3 1 0 n m 处还有吸收( 有肩峰) ； 设检测波长为2 8 0 r l 1 ，通过液相色谱仪可检测到黄酮色谱峰。因此，将检测器的 检测波长设为2 8 0 n m 。 2 1 2 2 流动相的确定 1 梯度洗脱方法的确定 本实验流动相的确定是以较难分离物质间的分离度为依据。即，以羟基酪氨 酸与酪氨酸的分离度、儿茶素、黄豆苷原和柚苷配基之间的分离度为依据。 根据各类氨基酸以及类黄酮类化合物的色谱分离文献，再结合初步实验结 果，得到以下结论：洗脱氨基酸类化合物所要求的流动相极性大于黄酮类化合物， 需要改变甲醇的体积以调节流动相的极性，即采用梯度洗脱方法分离氨基酸类化 合物和黄酮类化合物。实验中最初所选用的流动相组成是：a ：二次去离子水+ b ： 甲醇，以确定分离混合标准样品的合适流动相配比。 首先，确定二次去离子水和甲醇的最佳比例，将酪氨酸、羟基酪氨酸和硝基 酪氨酸完全分离。因为羟基酪氨酸和酪氨酸两种物质的色谱峰保留时间相近，所 以主要根据羟基酪氨酸酪氨酸色谱峰的分离度确定分离酪氨酸、羟基酪氨酸和 硝基酪氨酸的合适流动相配比。经反复实验，二次去离子水和甲醇的最佳比例为 9 0 ：1 0 。 第二步，增加流动相中甲醇的体积进行黄酮类化合物的分离。从各黄酮类化 合物单独进样后的色谱图看出：儿茶素、柚苷配基和黄豆苷原三种物质的保留时 间相近，色谱峰重叠大，较难分离，因此实验根据黄豆苷原儿茶素和柚苷配基 黄豆苷原色谱峰的分离度确定分离五种黄酮类化合物的流动相配比，实验结果显 示：1 0 二次去离子水+ 9 0 甲醇是分离黄酮类化合物的合适流动相配比。 通过分别对酪氨酸、羟基酪氨酸、硝基酪氨酸和三种黄酮类化合物的分离实 验，结果表明：流动相组成为9 0 二次去离子水+ 1 0 甲醇时，可以完全分离酪 氨酸、羟基酪氨酸和硝基酪氨酸；流动相组成为1 0 二次去离子水+ 9 0 甲醇时， 可以基本分离开儿茶素、黄豆苷原和柚苷配基。在此流动相条件下、柱温3 0 时，标样平均总分离时间为4 8 1 6 m i n 。 在进行色谱检测时，为了避免色谱柱中流动相极性的急剧变化，并获得比较 平稳的基线，梯度洗脱的顺序为：9 0 a + 1 0 b 一4 5 a + 5 5 b 一9 0 a + 1 0 b ， 其中，a 相为二次去离子水，b 相为甲醇。 2 磷酸加入量的确定 加入磷酸调节流动相的p h 值是为了缩短分析时间、对黄酮类化合物的分离 度，特别是对儿茶素、黄豆苷原和柚苷配基分离度有进一步的改善。本实验所用 色谱柱允许的p h 值范围是2 8 ，太低的p h 值会使键合的烷基脱落，所以要尽 北京工业大学工学硕士学位论文 可能减小磷酸的用量。确定合适的磷酸加入量，既会获得较好的黄酮类化合物分 离效果，也可以保护色谱柱，不影响色谱柱的稳定性。在流动相配比为 9 0 a + 1 0 b 的条件下，在a 相( 1 0 0 0 m l 二次去离子水) 中加入不同体积的磷 酸，分别测定p h 值( 见表2 2 ) 。测定值均在色谱柱允许的范围内。但是为了延 长色谱柱的寿命，保持柱的稳定性，本实验选定磷酸的最大用量为4 0 0 u l 。 表2 - 2 a 相中的p h 值 磷酸加入量( 乩)5 01 0 02 0 03 0 04 0 04 5 0 p h 4 74 23 73 4 3 o2 5 以1 0 廿9 0 b 为流动相配比，在a 相( 1 0 0 0 m l 二次去离子水) 中加入不 同体积的磷酸，对黄酮类化合物进行分离。根据色谱峰保留时间差( 见表2 3 ) 可确定磷酸的加入量为4 0 0 此。 表2 - 3 加入不同体积磷酸后黄酮类化合物的分离结果 磷酸加入量( 此)5 01 0 02 0 03 0 04 0 0 槲皮素 t r ( m m ) 2 5 0 72 4 5 12 3 6 52 2 8 62 1 5 2 t r ( m j l l ) 28 6 82 8 “ 2 8 2 12 8 0 32 7 2 2 儿茶素 t r 儿茶素一t r 槲皮素 3 6 14 1 34 5 65 1 75 7 0 t r ) 2 9 1 12 9 0 72 8 7 92 8 6 52 8 0 5 黄豆苷原 r 黄豆苷鹰厂r 儿茶素 o 4 30 4 30 5 8o 6 2o 8 3 t r ( m i l l ) 2 9 7 72 9 7 32 9 6 72 9 6 52 9 1 7 柚苷配基 t r 柚苷配基一t r 黄豆苷原 o 6 60 6 60 8 81 0 01 1 2 黄酮 t r ( m i l l ) 5 1 2 24 9 9 14 7 6 34 7 6 34 4 6 1 i r ( m j ) 表示保留时间平均值 在1 0 0 0 m l 的a 相中加入4 0 0 u l 磷酸后测定不同流动相配比条件下流动相 的p h 值( 见表2 4 ) 。在实验中流动相p h 值范围从3 o 6 5 ，为酸性混合液。 第二章检测方法的确定 v a v b 表示a 相与b 相的体积比。 表2 4 流动相中的p h 值 v a v b 9 0 ：1 08 0 ：2 0 7 0 ：3 0 6 0 ：4 05 0 ：5 04 0 ：6 0 3 0 ：7 0 2 0 ：8 01 0 ：9 0 p h 值 3 o3 33 7 4 3 4 75 1 5 66 26 5 3 标准样品的检测结果 按照9 0 a + 1 0 b ( 1 8 m m ) 一4 5 a + 5 5 b ( 1 5 m i n ) 一9 0 a + 1 0 b ( 2 4 m i n ) 对标准样品进行梯度洗脱，其中，a ：1 0 0 0 m l 二次去离子水+ 4 0 0 此磷酸( p h3 o ) ， b ：甲醇。洗脱后根据色谱图和所计算的分离度可看出：本文所确定的梯度洗脱 方法可以对标准样品进行较好地分离。 图2 - 5 磷酸盐缓冲溶液色谱峰 f 追2 - 5t h ec h r o m a t o g m mo f p h o s p h a t eb u 丘h 色谱图2 5 中的色谱峰是磷酸盐缓冲溶液的特征峰。 北京工业大学工学硕士学位论文 图2 6 酪氨酸、羟基酪氨酸、硝基酪氨酸分离色谱图 f i g 2 _ 6n ec h m m 砒0 9 r a m o f m i x e ds 锄p l e ss 0 1 l l t i o no f t y r o s i n e h y d r o x y l t y m s i n e ，n i 廿。帅s 址 色谱图2 6 中l 号峰是磷酸盐缓冲溶液的特征峰，2 号峰是羟基酪氨酸色谱 峰，3 号峰是酪氨酸色谱峰，4 号峰是硝基酪氨酸色谱峰。 图2 7 混合标准样品分离色谱图 f i g 2 - 7t h ec h r o m a t o 蛐o f m 硫ds a i n p l e ss o o n 在所采用的色谱条件下，可同时将标准样品溶液中的八种物质较好分离。1 号峰是磷酸盐缓冲溶液，2 号峰是羟基酪氨酸，3 号峰是酪氨酸，4 号峰是硝基 酪氨酸，5 号峰是槲皮素，6 号峰是儿茶素，7 号峰是柚苷配基，8 号峰是黄豆苷 原，9 号峰是黄酮。 第二章检测方法的确定 羟基酪氨酸与酪氨酸之间的分离度、儿茶素、黄豆苷原和柚苷配基之间的分 离度见表2 8 和表2 9 。 表2 8 酪氨酸和羟基酪氨酸色谱峰分离度 t 曲1 e 2 - 8t h er e s o l l n i o n so f 奄t o s i n ea i l dh y d r o 珂h y r o s i n e 流动相组成配比b ( 体积比) 9 0 ：1 0 t r ( m i n ) 5 3 3 羟基酪氨酸 i w ( i 血) 羟基酪氨酸 0 8 8 t r ( n l i l l ) 6 7 4 酪氨酸 t r 酪氨酸一t r 羟基酪氨酸 1 4 1 i w ( m i n ) 酪氮酸 0 9 8 iw ( i n i n ) 酪氨酸羟基酪氨酸 0 9 3 r s 羟基酪氨酸酪氨酸 1 5 2 表2 9 三种黄酮类化合物的分离度 t 曲l e 2 9 i h er e s o l u 丘0 n so f 廿】r e en a v 甜i o i d s 流动相组成配比a b ( 体积比) 1 0 ：9 0 t r ( 血n ) l 茶素 2 7 2 2 儿茶素 i w ( m i n ) 儿茶紊 1 2 3 i r ( m i l l ) 黄豆昔原 2 8 0 5 t r ( m h ) 黄豆苷原一t r ( m i n ) j l 茶紊 o 8 3 黄豆苷原 w ( 商n ) 黄豆昔原 0 8 2 iw ( m i n ) 黄豆苷原儿茶素 1 0 2 i b 黄豆苷原儿茶素o 8 1 t r ( i n i n ) 柚苷配基 2 9 3 6 柚苷配基 t r ( m i n ) 柚苷配基一1 r ( m m ) 黄豆苷原 1 3 1 w ( i n i n ) 柚苷配基 1 0 1 北京工业大学工学硕士学位论文 iw 蛳n ) 柚苷配基黄豆苷原 o 9 2 柚苷配基 r s 柚苷配基i 黄豆苷原 1 4 3 t 。( m i n )表示色谱峰的平均峰宽值。 i w ( m i ) a b 表示物质a 与b 的平均峰宽值。 黜a _ b 表示物质a 与b 的分离度。 羟基酪氨酸和酪氨酸的分离度为1 5 2 ，属于完全分离；黄豆营原与儿茶素的 分离度为o 8 1 ，虽没达到基本分离，但是不影响今后各抑制剂抑制能力的检测； 柚苷配基与黄豆苷原的分离度为1 4 3 ，已基本分离。 4 加标实验 通过加标实验，证明各色谱峰出峰顺序的准确性。各加标浓度见下表： 表2 1 0 各物质加标浓度 标准样品加标浓度( i i m o l l ) 羟基酪氨酸2 55 01 0 02 0 02 5 0 硝基酪氨酸2 55 01 0 02 0 02 5 0 酪氨酸5 0 1 0 01 5 02 0 0 3 0 0 槲皮素2 03 04 05 06 0 儿茶素 2 03 04 05 06 0 黄豆苷原 2 03 04 05 06 0 柚苷配基 2 03 04 05 0 6 0 黄酮 2 03 04 05 06 0 因在损伤实验和抑制实验中主要以酪氨酸及其损伤产物作为指标，所以，图 2 1 1 中所示为酪氨酸、羟基酪氨酸和硝基酪氨酸的加标色谱图，图中1 号峰为磷 酸盐缓冲溶液的特征峰，2 号峰为羟基酪氨酸色谱峰，3 号峰为酪氨酸色谱峰，4 号峰为硝基酪氨酸色谱峰。 第二章检测方法的确定 未加标 羟基酪氨酸( 加标2 5 0um o l l ) 穗 i ： i l i i “： j ， ：i 攀 匪 i i 蔓， 毒 i ； 髅 = i ? 獭毒4 颤i l 誊 r ! j喀漆j i 北京工业大学工学硕士学位论文 o5 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 0 标样加入浓度( u l 几) 图2 1 2 标准样品色谱峰面积浓度关系曲线( 1 ) f i g 2 - 1 2t h er e l 撕o n s h i p b 咖e e nc h m m a t o g r a p h i cp e a l 【a r e aa n ds 锄p l e - a d d i n gc o n c e n t 曲0 n ( 1 ) 01 02 03 04 05 06 07 0 标样加入浓度( p l 几) 图2 1 3 标准样品色谱峰面积浓度关系曲线( 2 ) f i g 2 1 3n l er e 】a t i o n s h i p b e 帆e e n 蜘a t o 鲫“cp e a ka r c a 皿d 锄p l e - a d d i n gc o n c e n 仃a t i o n ( 2 ) 以上色谱峰面积力口标浓度呈良好线性关系，证明了标准样品分离色谱图中 各物质色谱峰的准确性。 5 柱温的确定 本文进行了不同柱温条件下对标准样品分析时间影响的实验，以确定合适的 柱温，缩短对标准样品的检测分析时间。 以流动相一一1 0 0 0 m l 二次去离子水+ 4 0 0 此磷酸( p h3 0 ) ( a 相) + 甲醇( b 相) ，对含有八种物质的标准样品进行梯度洗脱：9 0 a + l o b ( 1 8 m i l l ) 一 4 5 a + 5 5 b ( 1 5 m i n ) 一9 0 a + 1 0 b ( 2 4 m i n ) ，记录的分析时间见表2 1 4 。 5 9 5 8 5 7 5 6 5 5 5 4 9 8 7 6 5 4 一ui_自一娶恒毒蝴 第二章检测方法的确定 表2 1 4 柱温与分析时间 设定最高柱温 2 0 2 5 3 0 标准样品的检测时间( m i n ) 6 0