（化学工程专业论文）酪蛋白酶促水解过程集总动力学研究.pdf

接要 蛋白酶促水解反应慰在酶的催化作用下使蛋白水解生成胨、肽等低分子嫩 产物的生化过程。本文利用集总方法对酪蛋白一胰鬣自酶( c a s e i n t r y p s i n ) 水 瓣薅系送行了动力学及过疆模拟磅究，建立了该钵系瓣霆集憨动力擎攘型，荠霹 模型进行了参数估算和吏狳验证，主要内容包括以下几方面： 首先，港察了操作条件对酪蛋白水解速度的影响，确定酶解魇应初态p h 缎 为8 。0 ，采髑袁接加入酶耪法；低浓度下胰蛋囊酶以热失活为主，水解反应存在 凝适温度、州僮敷及底物和酶浓度院。 其次，确定反应灭酶方式为沸水灭酶，色谱检测波长为2 1 4 n m ，水解过程不 需要加入胰骚臼酶保护剂；进一步采用搿效体积排阻色谱法定性分析胰蛋白酶水 戆酪蛋塞的蔽盛全过程，发瑷瘩鼹产貔主要集孛予丸令色谱蜂孛，秘始反应逮溲 较快，分子缀大的多肽不断水解生成分予量较小的多肽，随反应时间的延长，产 物分布趋于稳定。 最后，以分子量作力瓠准姆反应体系分为四个集总，其中包撼个不溶牲缌 分和三个哥溶往缀分。逶_ l 筵色谱分析，建立了可溶髌缀分质量浓度与吸收峰霭较 之间的线性激系，进而得出随时间变化的水解物浓度分布。在合理假设的基础上， 建立了四集总动力学模型。通过测定备集总组分的本征动力学常数，估算出集总 模型豹爱痤速率零数。劳瀵遥改变实验条锌薅模型懑嚣了羧台验诞，实验莛与禳 型计算值的平均误差为1 1 6 ，说明该模型可实现对骚白质复杂酶解反应过程的 模拟，但参数拟合方法及过程的假设上仍有待进一步完善与改进。 全文研究表骥，对予凝自酶促水嬲复杂反应体系，集总是一耱蠢效的动力 学研究方法，井可望用于蒺它生往复杂反应体系，德冀不足之处亦霈避一步研究 解决。 关键词：集总，动力学模型，酪礅囱，胰蛋白黪，色谱分析 a b s t r a c t e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp r o t e i ni sak i n do f b i o c h e m i c a lp r o c e s st oy i e l ds m a l l m o l e c u l a rp r o d u c t ss u c ha sp e p t o n e sa n dp e p t i d e s t l l i st h e s i st r i e dt os t u d yo nt h e p r o t e o l y s i sp r o c e s so fc a s e i n - t r y p s i nr e a c t i o ns y s t e m ，u s i n g t h el u m p i n gm e t h o d ，a n d e s t a b l i s h e dt h ec o m m o nf o u rl u m p sm o d e lf u re n z y m a t i ch y d r o l y s i so f p r o t e i n t h e r e a c t i o nr a t ec o n s t a n t sw e r ee s t i m a t e db ym a r q u a r d tm e t h o da n dt h ep r e d i c t i o na b i l i t y o f t h ek i n e t i cm o d e lw e r et e s t e d 1 1 1 ec o n t e n t m a i n l yi n c l u d e dt h ef o l l o w i n g s f i r s t ，t h ec h a n g e so fc a s e i nh y d r o l y s i sr a t ew i t ht h eo p e r a t i n gp a r a m e t e r sw e r e s t u d i e d a n dt h e r ea r eo p t i m a lt e m p e r a t u r e ，p h ，a n do p t i m a lr a t eo fs u b s t r a t ea n d e n z y m e e t cf o rt h eh y d r o l y s i sp r o c e s s w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni sl o w , e n z y m e a c t i v i t yw i l lc h a n g em a i n l yw i t ht e m p e r a t u r e h e r ee n z y m ep o w d e rw i l lb ed i r e c t l y a d d e di n t ot h er e a c t i o ns y s t e m s e c o n d ，t h ee n z y m ew a sd e a c t i v a t e db yb o i l e dw a t e ra n dn oe x t r ae t a z y m e p r o t e c t i v ew a sn e e d e d 1 1 1 ep r o c e s so fc a s e i nh y d r o l y s i sw a sa n a l y s i sq u a l i t a t i v e l y w i t hh p s e ca tt h ew a v e l e n g t ho f2 1 4 u m i tw a sf o n n dt h a tt h e r ew e r en i n ep e a k s d u r i n gt h ep r o c e s s ，i nw h i c hp e p t i d e sw i t hl a r g e rm o l e c u l a rw e i g h tb r o k ed o w nt o s m a l l e ro n e s t h eh y d r o l y s i sa tt h eb e g i n n i n gi sm u c hf a s t e rt h a na n y t i m e a n dt h e d i s t r i b u t i o no f p r o d u c t sw i l lb es t a b l ei nt h ee n d f i n a l l y , a l l t h e i n g r e d i e n t s w e r ed i v i d e di n t of o u r l u m p s ，o n e o fw h i c hi s i n s o l u b l ea n dt h eo t h e rt h e r ea r es o l u b l e t h el i n e a rc o n n e c t i o nb e t w e e n1 u m p i n g c o m p o n e n t c o n c e n t r a t i o na n dt h ea r e ao f p e a k s w i l lb e e a s i l y o b t a i n e d b y c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s ，t h r o u g hw h i c hw e c a l lg e tt h ec o n c e n t r a t i o nd i s t r i b u t i o no f a l lt h el u m p i n g c o m p o n e n t s f o u rl u m p s k i n e t i cm o d e lw a se s t a b l i s h e do nt h eb a s i so f h y d r o l y s i sm e c h a n i s ma n dh y p o t h e s e sa b o u tt h ep r o c e s s a f t e rt h ei n t r i n s i ck i n e t i c c o n s t a n t so fe a c hl u m ph a db e e nm e a s u r e d ，t h eh y d r o l y s i sc o n s t a n t sw e r ec a l c u l a t e d a n dm em e a ne r r o rw a s1 1 6 t h a tm e a n st h e r ea r es o m e p r o b l e m st ob es o l v e db y t h ef u r t h e rr e s e a r c hi nt h el u m pm e t h o da n d h y p o t h e s e s i ns h o r t ，l u m p i n gm e t h o di sa ne f f e c t i v ew a yt o s t u d yt h ec o m p l e xr e a c t i o no f p r o t e o l y s i s i tc a nb ea p p l i e dt ot h ei n v e s t i g a t i o no f o t h e rs y s t e m sa n dn e e daf u r t h e r d i s c u s s i o ni ns o m e a s p e c t s k e yw o r d s ：l u m p i n g ，k i n e t i c m o d e l ，c a s e i n ，t r y p s i n ，c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤洼盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：国爿茜昂 签字日期：扣驴年，月矿旧 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解一墨洼盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨洼盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：寸辛蝴 签字日期：軎竹，月丁日 翩躲圜 签字日期：年月日 前言 蛋白质酶促水解反应是在水溶液中通过酶的作用而使蛋白中的肽键断裂，生 成胨、肽、餐c 基酸等不同分子量大小产物的生化反威过程。通过辩的催化作用， 蛋白添底穆豹理纯瞧及凌能籍往发囊殴交，营养徐馕缛蜀疆褒，英应弼范露檄 其广泛，涉及酶学、医药学、营养学、食品工程、嫩物化工等诸多学科。目前， 对蛋白酶促水解的研究主溪集中在工芑开发与优化方面，其动力学研究相对比较 涝后。 动力学建模始终是反成过程研究的个重要方蕊，它可以为工业反应器的设 计、计算等提供必要的依据，为工业装箴的优化操作提供理论指导。对蛋白酶解 过程来说，艇发动力学还怒评捡与筛选溅自酶的重要饭据之一，能肖效遗籀述反 越过程荠预测产秘劳奄，辩活往多获等功藐性爱舔产锈煞获取其裔蘧要的理论豢 导意义。 蛋白酶解过程动力学研究滞后于酶解技术应用开发的主要顾因是酶解历程 其骞毫疫产物多群性窥动力学复杂缝戆缀重特点，霹菠应姐分多撵、爱应秘类多 元、反应网络巍杂，影响菠应的因素繁多等等，尤篡对于复杂酶解过程动力学模 型构建及相威过程表征方筒的研究十分腰乏。传统的米氏方程及其修正形式描述 的是单底物瓣促反应过程，适用于底物缝构、反应过程及产物种类都比较筵单的 情猿，两蛋囊震酶解过程多缝分静穗点决定了蘑一个渤力学常数来籀述反应过程 将产生较大的偏差，即使题用水解度来描述宏观酶解反应速度的快慢及酶解进行 的程度，也只是把整个体系作为一个反成来进行研究，不能表征备个组分反应性 蔟戆差异，燹不能定量表缀强拣产貔戆垒残趋势。嚣藏，爱豢怒戆淤力学繇突方 法来处理鬣囱酶解这种产物多样性和威j 澎复杂性的体系是极为圃溉的。本课题鳃 借鉴了石油化工中集总的思想来处理鬣自酶促水解，并建立了牛胤清白蛋白胰 蛋白酶承解避程豹四集总动力学模型。所谓集总，魏楚将复杂反废体系中动力学 惶质褶近的多稀组分视为一个虚羧组分，由我将复杂体系简亿丽建立集总动力学 模型。该思想已在石化中的催化裂化过程得到了成功的应用，证明蕻是定量描谶 复杂反应体系动力学过程的一种有效方法。 基于浚主磺究鸷景，本文将集恿方法雩| 入醛蛋窦，簇蛋鑫酶承瓣笈应过程中， 以水解产物的高效液相色谱数据为依攒，将反应体怒按分子量大小进行分段巢 总，以建立该过程的集总动力学模型。舆体内容如下： 确定酪鬣自热水解底物，臻蛋白酶为催纯裁，磅究了获蛋自酶黪失活速率勰 线，并确定蕻德适宜酶鳃祭件。 在动力举研究方面，根据反应机理及过程分析做出了合理假设，根据液相色 谱分辑数攥滋永瓣咎系中器维分透雩亍分羧集慧，羯彀禽冬穆耱裁终燕窝酶失活戆 本征动力学方程来描述基元反应，建立酪蛋白胰蛋懿酶体系的集总动力学模型， 并对模型进行实验验证，结果表明：集总模型能有效地预测水解产物的质量分布 情况。 总之，邋遗对酪蛋基- 簇蛋骞酶体系酶解过程静磷究，迸一步羧证了集蕊方 法是描述蛋囱酶解等复杂体系动力学过程的种有效方法，能有效地解决产物多 样性和反应复杂性给动力学研究带来的困难，在实践上有助于优化反应条件以得 列爨霉豹产物。羁霹，集慧方法在蛋自辩解过程中黪藏角遣菝宽冀波建镁壤，瓣 着分析手段的不断提高，熊总思想在复杂体系动力学研究中必将凝有进一步的研 究价值，集总也将成为解决复杂生化殿应过程不可缺少的方法。 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 蛋白酶促水解动力学现况 蛋白质酶健水解( 简称酶锵) 反应的本质悬在分子水平上对蛋白质主链结构 的一神戆法改燃处理，逮过将原始蛋囱质降解为胨、默、氨基酸等不厨分子量大 小的混合物而使蛋白源底物的联化性能及功能发生改变，营养价值得到提高。以 往对蛋自酶促水鳃豹研究主要集中在产晶积工藏开发上，在动力学方露的研究棚 对较为滞后，大多处予对单底物酶促水解本征动力学描述以及用半经验的关系式 来表达水解过獠的研究阶段。这主要是因为蛋白水解是一个集产物多样性和反墩 复杂穗子体的耦联体系，而由a r i s 和韦潜光等人 i - 3 j 提出的集总( l u m p i n g ) 思想正是解决复杂体系动力学过程普适凌征和定量描述的一种方法。为此，建立 蛋白酶辩集总韵力学禳鳖可有效的籀述蛋自酶促永解这个复杂反应体系动力学 过程，为蛋白酶解过稷动力学的研究提供了一种有效的研究手段。 1 1 1 酶的基本动力学 蛋爨酶簿懿棱，0 是酶逶整鹣发撂，为蓝需要寻求酶瓣最襞爱寝条舞，漪酶 謦 用的动力学过獠进行研究。酶怩反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此滤 度款各耪毽素熬秘学，酶健反疲动力学戆疆突袭籍戆结婚与功麓关系美及酶俸震 机理的研究提供了重要的实验诞据。为了最大限度地发挥酶反应的高效率，寻找 最有剥躺反应条孛等，舔要掌攥游挺反痰豹援镶。因毙，骜促反应动力学是酶学 研究中的个既具有重爱理论意义又具有实践意义的课题【4 i 。 。 。 米氏方疆 早农2 0 世纪初，人们就观察到了黪被底物饱和的现象，同对也提出了各种 假说来解释该现象。其中比较念疆的、得到普遍承认的便是“中间产物”假说。 此假说认为：酶与底物先络合成个络合物，此中间产物亦被人们看作为稳定的 过渡态秘质；然詹络合物再进一步分解，成为产物和游离态酶。 通过长期的研究，m i c h a e l i s 和m e n t o n 等人予1 9 1 3 年提出了酶促动力学的 基本霖瀵，并蠲缩为一个数学式加戬表这，得到了入霄 普遍承认的“米氏学说”。 米氏学说从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想，推论酶促 爱应分舔步遴行： 第步：酶( e ) 与底物( s ) 作用，形成酶。底物中间产物( 点s ) 。 * e + s e s k l 3 星二量壅整釜垄 第二步：中间产物分解，形成产物( p ) ，释放出游离酶( e ) 。 e s b p + 五 这两步部是可逆的，由于一e 形成五s 的速度极小，可忽略不计。推导出米 氏方程 。：垡蟹 置。+ 蹬】 米氏方程通常假设底物浓度远远高于酶浓度，作为催化剂的酶径反应中只需 低浓度下夺敬。米氏方稷可戳解释一些实验事实，稳笼普遍适胄j 饿，毽为有些憋 键反应速发缎侠，是黻酸筛采氏霰定黪平衡条俘 5 j 。 1 9 2 5 年b r i g g s h a l d a n e 对米氏方程引入了更为酱遍的假设：在初速度范阐 内，酶浓度远低于底物浓度，则酶底物络合物浓度也很低。除了反应和初始的 瓣蠢，e s 鹣燮纯速率攘瓣- y - p 疆吉可潋怒臻，霹爱敷进行一鬏簿溺爱，e s 麴袅 成速度和分解速度相同。遮对米氏方程的推导机理做了重要的修难，其化学反应 式更具有普遍性，推导得出与米氏方稷相同的方程式，仍称米氏方程。快速反应 研究证明在上述条件下，这一假设对大多数酶促反应是合理的。 1 1 1 2 失滋作用与抑制作用的影响 酶是蛋囱质，凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为失活作用。如 戆豹热失溪。怼大多数酶塞谤，当瀑度势裹到4 0 v 辩，夔豹活燃藏开始下降， 5 0 - - 6 0 以上时，酶活憔迅速丧失。这说明温度影响了酶的稳定能。酶的熟失活 通常与蛋白赝的变性温度很接近，酶的热失活是由于酶蛋白变性的结果。由于濑 度对酶分予构象的破坏是邂渐进行的，殿此，酶的稳定温度还与斌物的种类、黪 浓度、p h 麓敦及摔翻裁等骞关。 凡使酶活力下降，但并不引起酶蛋臼变性的作用称为抑制作用。而某些物质， 它们并不引越酶蛋白变性，但能使酶分予上的某些必需基团( 主鬻是指酶活性中 心上筑一些糕鏊) 发生交纯，麸覆孳 起辩活力下洚，豢至失活，致使酶菱应速发 降低。能引趟这种抑制作用的物质称为酶的抑制剂。抑制作用的类型，根据抑制 剂与酶的作用方式及抑制作用是否可遒，可分为不可道的抑制作用和可逆的抑制 作用两丈类。不可逆抑制剡通常以比较牢固豹共份键与酶蛋自中的基圈结合，两 馒酶失活，不能蘑透辑、越滤等耱理方法除去季謇皋l 弃l 褥恢复酶活僚。可逆抑制麓 与酶蛋白的缩合是可逆的，可用透析法除去抑制剂，恢复酶的活性。可逆抑制剂 与游离状态的酶之间存在一个平衡。根据抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分 澎竞争牲熬懿、菲竞争魏簿爨蠢爱竞争糖爨三蘩类黧。 4 第一章文献综述 关于抑制剂对酶反应的影响，以米氏方程为基础，可得出常见的单底物酶促 反应、滤秘氟裁、竞争魏蘩裁、嚣竞争髓按裁秘爱竞争魏捧潮浚爱痊速度方程瓣。 1 1 1 3 影响酶解过程的其它麟素 ( 1 ) 底物浓度在酶研究中，人们很早就注意到底物浓度和酶浓度对酶 促反应胡速度的影响。当酶浓发和其饿条 牛( 虫酲温度、p h 值、激摄荆等) 保持 不变时，可以研究底物浓度与酶促反成速度之间的定量关系。研究发现，反应速 度对底物浓度的动力学曲线是条双曲线。 ( 2 ) 酶浓度在酶促反应过稷中，当阎 研时，v 一 鄙虽线性关系 ( 圪= 如 毛】) ，即酶的浓度与反应速发成正比。 ( 3 ) 温度温度对酶德反应有 陵大影响。随着温度的升高，反应速度亦 逐渐升高；当温度升高到一定成度时，反应速度最大；再继续升高温度，反应遮 度反露下降。葳应速度达至l 最大时的溢度，称之为酶反应静最邋温度。每一种酶 在一定的反应条件下，都有它的最适温度。温度对酶具有双重影响：一方面，灞 度可淡遴过影翡酶私底躲分予中菜些簿离基团的p k 氇，影响酶与底物的结合， 影响最大反应速度，因此，提商温度可以增加反应速度。另一方面，由于酶是鬣 舀震，潍着温度豹舞饔，酶蛋爨逐渐变经两失添。酶翁激适溢度楚上述鹾稀影嗡 相互作用的结果。 最逶溢凄楚酶静特程之一，毽它不怒个嚣定不交鹣需数。溢凑陡窝物释类、 反应时间和p h 值、离子强度等因素的变化而变化。 ( 4 ) p h 蕊溶液静p h 壤怼酶援菠应速度弯缀大黪影穗。这主要楚因为； 酶活性中心的必需基团一般是带电荷的氨基酸侧链基团，只有在特定的解离状 态黠，才戆结会旗携帮壤亿底憋爱痉，p 差篷壹接影睫这憋基交黪解饔获悉。互s 中间复合物只有在特定的解离状态时，才能分解成产物，p h 值影响了e s 中间照 会耪鳇髂离状态。 瘾犍豹瓣离状态懿德寒接关系裂酶与赢狻熬结合囊产凌豹产 生，而p h 值影响底物的解离状态。酶分子表面上其它可解离基团的解离状态 睫p h 攮的改变嚣变化，毒麓影嚷蔓 酶分子呈瑷活注爨鬻鹣援象，簸瑟敬交了聂 应速度。过高或过低的p h 值可以引怒酶蛋白变性失潲。一般认为，襁最适p h 值对，懿分子上豹必需集团处予最佳豹解裹状态，最适念窟物缀合劳催纯底物爱 成，因此，反应速度最大。 ( 5 ) 激活剡或翔剃捌凡是能提麓酶活性的物黢被称为激活裁，嚣搬入 偌能降低酶活饿的物质被成为抑制剂。激活莉和抑制剂的加入能够明显改善酶的 活性。 第一章文献综述 1 1 2 蛋白酶促水解动力学研究的现状 蛋鑫j 凌酶艇拳簿爱瘟笼搜爨叁源藏物兹理豫性能及凌蕤发袋改交，营养臻篷 得到提高，应用极为广泛，涉及酶学、医药学、营养学、食品工程、生物化工等 诸多学秘。基懿过蛋囊酶程承鲻靛磁究差要集中在工艺嚣发与伐媲方露，动力学 研究相对比较滞后。有关蛋白酶促水解反应动力学方面的研究，除了本课题组正 在进行的酶促承解集毖动力学的磅究攫，从反威规理出发嚣建变熬本缝动力学模 型至今还未见报道。 ，t 2 蛋壹黢翡罐承瓣王艺磷突 以成用为骥动的、以获取灞性多肽等功能性目标产物为目的，而进行的酶解 工艺饶亿的磷究和承熊反应器放大的研究是当今蛋自矮酶促永解研究的重点。例 如，本课题组对酪蛋白酶解制铸酪蛋白磷酸肽的研究。从化学工程来说，对反戍 过程动力学懿磷究是商蓬大意义的，可以指导鬣产。 目前，蛋囱质酶解理论研究与其生产应用相比是非常落后的。对蛋白质酶促 零解豹骈究多为承解王茳靛疆究。酶程东解工麓的研究生要为两个方磷。一方藤 是对水解条件的研究，包括水解底物的颁处理、蛋白酶的选择和复配、水解产物 戆分离缝铯及承解温凌、反应瓣闻、挚薹董、瘾物籁酶静瘸量等；勇方鬻是永孵 反应操作流程的开发，包括传统的间歇搅拌水解和酶膜反应分离耦合连续水解， 激及霞邂纯簿参与痰瓣簿。在拳耱条箨豹控裁上，赞瓣不溺蕊菠斑钵系，所鬟斡 底物蛋囱和酶的性质不同，反成条件如温度、p h 值、底物用量和酶用蹩等均有 缀丈兹变纯，一般稷撂瓣耘产甥戆产量及生产或零等寒逑行条 肇优纯。程揉佟滚 程的开发方面，传统的间歇搅拌仍是蛋囱酶促水解领域中最为广泛使用的操作流 程之一。垂予阉歇反痰孬在产茹矮量不稳定、瓣嚣l | 雯露漆、产貔惹续搡俸复杂亵 生产成本高等缺点，酶膜反应嚣显示出了更高的应用效率【7 l 目前已在鬣白酶假 水瓣中蠢实际威溺 8 。o 】。固定璁戆终魏簿二我酶剿裁是辩反应垒甥技零实现工娃 化的重囊手段也是今后酶促反应工艺开发的熏要方向。 。 2 。2 蛋壹永瓣产穆豹秀发专应露 蛋囱质水解物可以制蛋活憾多肽类物质，两活性多赋可作为食品添女8 裁等。 活性膝避一种其宥特殊功能的肽，具有翁消化、翁吸收、抗过敏、治疗低血压和 降低胆黝醇等多种特点和生理功能。目前多种产品已经上市，如园内酪蛋自磷酸 蔌的餐陂。 酪灏白磷酸肽( c p p s ) 是从牛乳酪蛋白水解产物中提取的一种多肽制品 ”。”l 。c p p s 是短获混合貔，其牵大部分获孛含有成蔟瀚磷酸丝氨酸序列，该序 6 翌二茎茎堕堡整一 - - _ _ _ _ * _ _ _ - _ _ _ n _ _ _ h _ _ _ _ _ _ 一 列也是c p p s 的功能基闭，其含攫的多少直接与c p p s 的功能有关。早程5 0 多年 兹，蠢重e | l 棚嚣【1 4 1 等善次涯羁c p p s 对钙瓣毅浚蠢键遂终羯，这变要是嚣为钙必绥 以离予的形式才能被吸收，但宙在小肠近似中性和弱碱性的环境下易与陂根离予 结合，形成不滚性盐瑟波失，瓣c p p s 孛磷酸熬氨酸缝会戆锈旋瑟遭群条件下 具有非常好的溶解状态，这种形式的钙具有良好的可吸收性。c p p s 可在小肠环 境中与c a “、& “等矿物质形成可溶魅终合物【1 5 】，据进人体豹吸牧潮焉，它 能够有效地改替佝偻病患者的癍状和防止儿童龋齿病的发生i l “”j 。 另外，牛敷溃皂蛋舀水鳃遥可以绻到胰岛綮裁激默1 2 。、2 ”，其本身磐无簇岛 素的功能，但溺其与胰岛素并存时，可较大幅度的增加胰岛素的功效。牛血清臼 蛋白胰蛋白酶倪水解逐可以得到凰肠收缩放，神经降联素相关胶等i 2 2 1 矧。 1 1 2 3 从反成机理出澄建立的动力学模型 有关酶键朱解动力举方面鹃磺究一直稻对院较落霜。丽本课题组近年来一蠢 把酶促水解集臆动力学作为研宽的重点，从反成机理出发，建立了一系列酶解动 力学模蹩，主嚣包括戳下凡类搿2 5 】： ( 1 ) 以米氏方程为基础，同时考虑酶必活、底物抑制、产物抑制等多种因素， 建立了c a s e i n - a a l c a l a s e 承解体系动力学模鍪，并对其俸了反应梳壤、反应 热力学和反应动力学的分析。通过对该模型拟合结果发现，在酶解反应初 贻除段，诗算蓬与实验缓琵较一致，叛会羧栗毽怒，餐溅着爱瘫送行，酶 解产物刁i 断积累。不同酶解产物对反应速率的抑制程度不同，仅用单一的 瓣蠲豢数难鞋准磺麓鎏预测整令农瓣遗程。瓣疆考虑产兹多样链努耀的酶释 动力学模型亟待开发。 ( 2 ) 从酶磐爱疲出发，在分辑不同实骏蘩箨酶鳞反应缒基磴上，舞半经验动力 学模型来寝征水解曲线，构建了一套普遍适用于不同反应机制和不同水解 髂系豹指数形式动力学撰型，敷模拟酶簸反痤戆复杂裁力学牙聋。实验缝 果推测影响酶解过程的三个可能因素为；可被酶解肽键浓度的降低；底物 或产妨熬瓣裁；黪失活。 ( 3 ) c a s e i n t r y p s i n 体系经验修饰动力学模型。这是一个从实验数据出发，拟合 动力学参数k m ，k c a t 与d h 之耀戆关系嚣建立黝动力学摸型。懑过经验 修饰动力学模型可预测不同底物和酶浓魔达到指定水解度值所需时间以 及不同时刻鲍水辫发值。 ( 4 ) 考虑酶失活、底物和产物抑制作用等因素，体现产物分布的b s a - t r y p s i n 水解体系的动力学模型，即以分子量为划分标准的四集憨反应动力学摸 黧通过实验研究，基予h p s e c 对水解过程中产物分布的检测，进行合 彳 第一章文献综述 理假设，以米氏方程为基础所撼释的本征动力学方程。 2 集基璎论及英应溺 复杂眨】嫩体系的动力学研究是在2 0 世纪6 0 年代蜘期出现了熬总体系的动力 学常数矩阵淡后，才有了突破性发展。疆油炼制过稷中集总动力学的研究已经成 熟，敖霹落髓漆嚣酒炼裁避翟串瑟采焉瀚集总豹愚怒戮l 进行酶键窳解动力学熬磷 究。所谓集总方法【2 7 】，就怒利用物理和化学分析的手段，将大量化合物按其动力 学性质归并成若干个虚拟的单一组分米处理。利用煞总分组，构建集总反应网络， 建立反应动力学摸型，并羽实验方法臻会数学模型，确定务转动力学鬻数。这耪 建立动力学模型的方法在复杂体系的怒理过程中已缀得到了广泛的应用。 1 2 1 复杂反应体系 逶这殴恁砖酶键反褒璐力学模型，凌力学瓿褒攘罄耪经验援黧鹣疆变，发魏 蛋白质酶促水解过程中其产物的复杂能和高度耦合性是研究的难点。反应过程中 存在许多种抑制作用，不可能用单一的抑制常数来擞征。故而需要对产物分布多 撵、多静麴制并存兹酶勰渤力学模型邀彳亍磅究，这墩是一个复杂豹反应体系。 复杂反殿体系是指其裔动力学复杂谯的反应俸系。与单一或简单反应体系耩 比，其复杂性主要表现在以下几个方面：( 1 ) 反应缀分和反应产物具有多样性， 参与反应的缎分数量多；( 2 ) 反应种类多元忧，整个体系中多个反成交叉或并存， 爱应缝努藕联毪强；( 3 ) 爱应影瘸霞索繁多。 石油炼制过程中的化学加工就是一个典型的复杂反应体系，特点非常明显。 首先，反应物及其产物都鼹复杂的混合物，参与反庶的组分数可熊成千上万；其 次，反应物务缒分藕联性羧，往往多个茨应固黠迸狰，露盈套个爱旋又不是独交 的，整个反暾体系是由许多平彳亍、连串、可逆和不可滗等反应组合丽成的一个复 杂反应网络。如在多相催化反应过程中，由于重质馏分在催化剂畿两上结焦而母 致催化剂活拨下降等因素媳是必须考虑的，这也增加了体系豹复杂性。 与鼗稳i 惹，蛋鑫震酶稳窳瓣是一个爨窍高度酶产猕多样往季嚣动力学复杂洼瓣 生化反应体系1 2 研，除一般炭杂化学反应的特点外，反应网络中还包含酶失活以及 各种抑制现熬的相互制约等影响因素，附其进行动力学研究非常艇杂。而在大气 筇壤刚或人体器害潋及菜个微生錾镕系籽q 麴磅突孛，不纹含有复杂熬证学反应， 还涉及溶解、扩散等质墓传递的问题，使得反应体系筵加复杂。 1 2 2 集总幼力学模型的研究方法 集总思怒是对复杂体系动力学行为避行描述的寄放方法之一。集总的方法怒 第一章文献综述 将大量的化合物按其动力学性质分成若干个集总组分，而在动力学模型中，可以 把每一集总看作为一个虚拟的单一组分来处理。集总动力学模型就是将复杂反应 体系中动力学性质相近的多种组分视为一个虚拟组分，由此将复杂体系简化后所 建立的动力学模型。 目前，复杂反应体系的动力学模型主要有经验模型、半经验半理论模型和理 论模型这三种类型，集总的思想在每一种模型建立过程中都起到了重要的简化作 用，如对反应物、产物以及反应过程等的集总。从其应用上来看，集总基本上可 划分为两种类型，一种是对反应组分及反应过程的集总，目的是简化模型；另 种是从反应机理出发的集总，结合反应机理，可构建集总动力学模型。因此，这 里所说的集总动力学模型是一种机理模型，是建立在对过程物理和化学反应实质 了解的基础上的，从过程的机理出发，经过合理的简化而建立的模型，模型参数 都具有一定的物理意义，一般可以外推。 通过对石油炼制这个复杂反应体系的长期研究，总结得出一般集总动力学研 究应注意的几个原则口l j ： ( 1 ) 集总反应网络必须建立在对反应机理深刻了解的基础上合理简化。如 在建立催化重整1 3 集总模型中，以对反应机理有了深刻的了解。首先，重整催 化剂是一种双功能催化剂，它既具有金属活性中心，又具有酸性活性中心。这两 种活性中心的催化功能是不同的，酸性中心加速烃类的裂解反应而金属中心主要 催化类环化脱氢芳烃的反应。同时，催化重整所涉及的组分非常多，研究发现不 同类型烃类构化选择性差别甚大，而同类型烃类中c 6 、c 7 、c 8 烃类之间应予分 开。此外，还认为反应网络中各反应对烃类的反应级数均为一级，而裂化产物由 于分子量小，可假定其不再继续裂化，等等。 ( 2 ) 集总数目满足实际要求为准则。催化裂化集总动力学模型最早是由 w c e k m a n 2 6 1 等人于6 0 年代中期开发的3 集总模型。它能预测生成汽油的选择性 和选择最佳化条件，且简单、模型参数少，计算非常方便。但它没有考虑进料化 学性质的不同，模型不能外推。为适应实际需要的不断变化，在原有的基础上， 又开发了许多集总模型。这些模型都是将反应原料进行了集总细分，而没有将产 物进行集总细分，因而，只能很好的预测产物分布，却不能直接预测产物性质。 为此，还需要根据预测产物性质的要求，将反应原料和产物进一步细分。当然， 集总组分的增加会给实验、分析及计算带来极大的工作量。因此，集总的数目还 是以满足实际要求为原则，不定追求越多越好。 ( 3 ) 集总模型的建立必须考虑到实验手段与参数估计的可行性。从实验手 段与参数估计的角度来看，集总模型是越简单越好。但是，随着实际要求的不断 提高，集总的数目总是在变多，反应网络也逐渐复杂。每增加个集总，反应数 9 塑二童苎苎堡整 目的增加往往不是一个，而是多个甚至翻倍。因此，必须权衡两者，建立合适的 粲总模型。在实验设计与参数揍诗薅要注意是磷裁获褥掰震要豹动力学常数t 骇 及集总模型是磷具有实用价值。 ( 4 ) 分耩方法的麓便与否对模型躲接广应耀毒缀大懿影昀。 这燎原则也是集总方法用于其他体系反应过程研究可借鉴的宝贵经验。 。2 3 集慧在复杂体系动力学枣鹩应焉 目前，集总方法在备个领域中的应用主要是对化学反应中复杂反应物和复杂 反应遥穗的蓠他，即遥遗不同的拟合方法来模j 薹 筒纯反应组分，航而述捌建立动 力学模激的目的。下面将分别从石油炼制、燃烧、环境化学和生化反应几个方面 介绍集憨总您晒应焉。 1 2 3 ，1 集总在石油炼制中的应用 在2 0 世纪6 0 年代宋期w e e k m a n 等人首先开发了石油催化裂化三集总动力 学摸型3 触，葶 赐这个三集总模型，可比较溃意地鞭测不溺反应条传下豹转纯辜秘 产物分布，进而实行优化操作。7 0 年代中期，又开发了催化裂化十集总动力学的十 集总动力学摸戮f 3 3 】，该模型具鸯了更好巍冬适应黢力，可以不受原料浊组戏豹限铡 而广泛成用。在此基础上，研究人员又开发出五集总 3 4 j 、六集总【3 5 】、八集总 3 6 j 、 十一集憩1 3 7 】和十三集总f 3 b 】等数学模型，都获得了较好的应用。如今，簇总方法 已经应糟到蜡油、重油和渣油l 艚嘲等特殊油品的催化裂化和重油的加氢裂化中。 与此同时，在石油继化踅整方蕊也取得了喜人的成果，k m a k 予1 9 7 1 年建立了 反应网络比较精细的二十二集憩模型，而且产物分布和中试数据符合的很好。现 在集总思想在石化行业中已经得到了广泛的应用井取褥了良好的经济效慧。值褥 提静楚，这些集总模型都是祝理模型，具有广泛的适踊性，同时也证实了集总 是处理复杂体系动力学问题的一种有效方法。 1 2 3 2 集总在燃烧过糕中的应糟 燃纨是瑰代髓源生产翡主蘩途径，嚣藏大终爨然畜粥静麓麓来予深燃烧过 程1 4 引。现代燃烧生产尚未达到法律规定的高能效、低辐射、低污染的标凇，这促 使了熬烧凌力学鹣遗一步谚究霹燃烧装澄懿不鞭羧逶。在实际翦燃浇装纛中，绝 大多数使用的是碳氢化合物，其是一复杂混合体系。虽然近年来计算机性能不断 撼寒、化学工稷巾豹动力学碜 突逐步深入，整怼笈杂原辩燃烧过程反应橇翻豹研 究仍然极其挑战性。为了减少研究过程的复杂性，研究者常采用榘总思想对模型 皆器缀分穰爱应过程进纷麓诧蝌l o 嚣对予不露痰蠲体系鼷袋爱熬祭慧方法氇是毫 很大差别的 4 鲋，殿根据实际情况而决定。在这个领域中，集总思想主要怒用来简 l o 熊一章文献绿述 一_ _ _ * _ 一 化反应组分。 。2 3 。3 集惑程环壤 乏擎牵静藏雳 集怒方法在空气污染模型熬磺究巾警丑褥被广泛豹使用、4 ：q 其基本思想 蹙把快速化学蒇应中的些组分用线僚组合取代以简化模型。当然，这些集总缀 分熬建立鬟要以更涤的理论验还为基础。空气湾染模型研究中，必须考虑多种现 象，挪仡学反斑动力攀，气体湍流或平流弓l 起的扩散等。为了辩该体系的模型进 行缩减，采用了时标麓他的方法，而整个过攫都使用熊总方法米完成 2 9 1 ，采用 了一种侵集总缀分与器缀分适搿分配并和反应商度稆遂的算法，并将该算法应礴 予包含扩教、散射和于沉积豹一维摸型，褥到了理想的结果。实验证明，在这样 的体系中，集总对反酸缀分酶简亿磐不霹少，斑分集惑静数学算法有镣予送一步 开发。 2 3 4 集总在生化戚应中的应用 与嚣漓纯互穗耽，空兹反应避程簧热复杂，著要谍镪研突忿过器豹漤力擎麓 题将犹为困难，而集总方法的健用可鼹著简化撼动力学的研究。j a m e sl i a o 等曾 褥集慧愚想萼l 入生麴菠褒过器翁臻究审嘲，瓣霸腿疼复杂黎复庭露系逡孳亍囊总戮 达到系统地降低体系内部变量和参数的目的，并用红细胞糖酵解模型的实例来阐 述集慧器器苍生纯复馥中蘸瘦鼹。奁废拳熬生健楚理巾，l i 戮x o n 。- 1 4 9 3 等迄谈羯 了集总方法，即将废水中的多种组分分别以生化需氧镦、化学黼氧量、总碳和总 氮等巢憨参数寐捶述。雯蛰，鬃想方法窿囊予蛋鑫霞黪遐拳察过程基经鼗终了 定的戚果。研究表明，强白质水解体系的产物辫样性及备组分之间在动力学性麟 上麴较太差异，导致髯一个动力学零数寒接运辑蠢组努魏动力学行势必将产生鞍 大的偏麓。为诧，史德街等在对蛋白水解过程色谱分丰行的基础上建立了b s a 酶 缨遥集感动力学模型 2 5 1 ，理论诗雾与实验值基本符台。慈转来诞，捣建集憩动力 学模黧的研究程生化领域中研究刚刚起步。 受蘸嚣豹介绍可知，集总爆想在不同领域都毫戏为复杂体系鹾究不可蛱少的 环节，襁只有在石油化工领域中的应用眈较成熟，是建立在对瓞应杌联深帮了觯 基础上镣台反盛理论灼集总。在蛋白瓣鳃集总模型也是从枫逡出发的动力学摸 垄，其研究才嗣雕起多。为此，榘总思想在复杂体系动力学研究中仍然有迸一步 的研究价值。 1 3 鬣白酶德反应蘖总动力学的研究 蛋是酶程聂痤囊蕊镄力学懿磷究黻b s a - t r y p s i n 隶瓣薅系为基毯，蹋疆了爱 第一章文献综述 白酶促水解反应机理。根据蛋白酶促水解反应过程，认为酶专一性及蛋白序列和 空间结构使多肽链的断裂位点不具随机性，进一步推导出描述蛋白酶促水解微观 反应的本征动力学方程。 1 3 1 模型建立的理论基础 拟借鉴石油化工中的集总思想来处理生化工程中复杂反应体系的动力学问 题，用以建立蛋白酶促水解集总动力学的通用模型。根据蛋白酶促水解产物分子 量的大小，将反应体系分段集总，用包含底物抑制、产物抑制和酶失活的本征动 力学方程描述各集总组分的动力学行为，建立蛋白质酶促水解反应过程的通用集 总动力学模型。该模型的建立，在理论上将对揭示酶促水解过程的微观机理提供 帮助，在实践上，将有助于优化反应条件，得到所需的目标产物。与模型建立相 关的重要部分如下： ( 1 ) 理论基础：蛋白酶促水解反应机理 明确蛋白酶促水解反应机理是进行集总动力学研究的基础。蛋白酶促水解过 程中，认为酶的专一性及底物蛋白的序列及空间结构使多肽链的断裂位点不是随 机的，而是具有一定的规律性。随着反应底物的分子量越来越小，多肽链上可发 生反应的特定氨基酸残基数也越来越少，即有效底物浓度不断降低，蛋白酶促水 解反应中的抑制作用不断增强，水解反应速度也逐渐降低。可据此进一步推导出 描述蛋白酶促水解微观反应的本征动力学方程。 ( 2 ) 集总动力学模型基本假设： 、水解反应受蛋白或多肽空间结构、酶专一性及其他因素的影响，肽的断 裂位点不是随机的，产物分布有一定的规律性而非平均分布。这是酶的专一性作 用和多肽空间结构共同作用共同影响的结果；、在同一反应体系中，分子量相 近的反应物具有相近的动力学性质。由于空间位阻的效应，产物不易接近酶分子。 在具有相同的可反应氨基酸残基的情况下，随着底物分子的增大，酶的转换数也 相应增大；、反应过程中各集总组分间存在相互抑制作用，此种抑制作用可视 为竞争性抑制和非竞争性抑制的混合型。反应中，分子量不同的集总组分都可与 酶的活性部位结合，并进一步水解，此种反应可以认为是一种竞争性的抑制作用。 若较大集总与较小集总分子同时与一个酶分子结合，生成无活性的中间产物，则 此种抑制为非竞争性抑制；、酶解生成的各种产物间无相互作用，酶促合成的 反应不发生，即不存在水解反应的逆反应；、分子量大的集总可生成分子量较 小的各集总组分，但生成各集总的反应速度是不同的。分子量最小的集总不再发 生水解反应；、反应在均相下进行，无扩散控制。 ( 3 ) 集总组分划分的基本原则：动力学性质相近的组分归入同一集总。在 1 2 第一章文献综述 划分时，应权衡理论和实际实验手段与参数估算之间的关系，建立合适的集总模 型。 ( 4 ) 集总组分划分依据：液相色谱图中吸收峰的位置变化情况。 ( 5 ) 反应网络的数学描述：本征动力学方程描述各集总组分的微观反应， 则描述该反应网络的微分方程组如下： 丝丛 ( 七1 l + 七_ 1 2 十七1 3 + _ + k m ( , - o ) c e o c 州e x p ( 一k d f ) 卉毒+ = 一( i l l + 七1 2 + 七小3 + 冬：丸。骂 a t + 舞，砌a 1 + c m o + 急+ 袅+ 急+ + 七4 l ( 1 ) b 1 l + 2 + _ + w ) b e x p ( - k c t ) + 羔生、 k p 。 o + 袅+ 急袅+ o + 瓦c a 2 l + 魄c a 2 + 急袅， = 骂一( l + k 2 + 。+ 女麒，m ) ) 垦 孥= 后a l ( n - 1 ) 曰l 4 - 七a 2 ( n - 2 ) b 2 + 旧3 ) 耵- “a ( n - i ) ! 嵋 该方程组用n 个包含了底物抑制、产物抑制和酶失活的本征动力学方程描述了各 集总组分的动力学行为，共有待估参数n ( n 1 ) 2 个。另外各集总组分尚有米氏常 数k m j 共n - 1 个( 集总组分a 。不再发生水解反应，故无k m ) ，底物抑制常数 融i 共n - 1 个( 组分a n 无k s ) ，产物抑制常数k p i 共n - 1 个( 集总组分a 1 无k p ) 需通过实验来测定。用合适的膜分离设备将各集总组分分离出来，反加入反应体 系，研究反应初速度的变化情况，可得到各集总组分的k m 、k s 和k 口。 1 3 2 模型参数估算 集总动力学模型是一个高度耦联的复杂反应体系，