（分析化学专业论文）化学发光微流控传感器芯片和微流动注射芯片的研究.pdf

摘要 化学发光微流控传感器芯片和微流动注射 芯片的研究 分析化学专业博士研究生：何德勇( b 2 0 0 3 6 5 ) 指导教师：章竹君教授 ( 摘要) 微流控芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p ) 3 l 称微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，p t a s ) 或芯 片实验室( l a bo nac h i p ) ，它是以分析化学理论和方法为基础，以微机电加t 技术 ( m i c r o - e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m ，m z m s ) 为依托，以微管道网络为结构特征以生命科学和 环境科学为主要应用对象，将分析化学操作的整个程序( 包括取样、分离、化学反应和检测) 或部分程序都集成在芯片材料上，甚至能集成儿百台仪器于一个芯片上。微流控芯片不但使 珍贵的生物试样与试剂消耗大大降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度提高了十倍，百倍， 费用却降低了十倍，百倍，从而使分析技术的应用普及到家庭，个人成为可能。它充分体现 了当今分析设备微型化，集成化与便携化的发展趋势，为其在生物医学、药物合成筛选、环 境检测和保护、卫生检疫和司法鉴定等众多领域的应用提供了广阔的前景。 本论文的研究内容包括化学发光微流控传感器芯片和化学发光微流动注射芯片等两个 方面。 1 化学发光微流控传感嚣芯片的研究 传感器芯片的传统分子识别物质有酶( 包括纯酶、动植物组织和细胞) 、抗体和受体、 核酸、d n a 和蛋白质等。这些生物识别物质大都具有高度专一识别能力，用作传感器识别 元件具有特异性。但同时这些识别物质具有制备昂贵、容易失活以及实验操作条件苛刻等缺 点。分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，m i t ) 是以目标分子为模板，将功能单 体分子与模板分子通过共价键或非共价键的方式形成可逆复合物，再加入交联剂平u 引发剂进 行聚合反应将模板分子交联固定，最后将模板分子提取出来，形成具有与模扳分子空间结构 互补并具有多重作用位点的三维孔穴的分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ， m i p ) 。分子印迹聚合物具有可以和生物识别物质相媲美的专一识别能力以及其制作简单， 耐酸碱热等特点，己广泛的运用于了传感器的设计中。 分子印迹聚合物戍用于芯片的研究，主要集中在阵列芯片、s p r 传感器芯片、q c m 传 感器芯片和微固相萃取芯片等方面。将分子印迹聚合物作为分子识别物质，构建微流控传感 摘要 器芯片的文献还未见报道。本论文分别以特布他林、双嘧达葜、氯丙嗪和没食予酸为模板分 子合成了它靠j 嚣自的分予印迹聚合物，弗将其填充在化学发光微流控芯片的发光检测池中， 构建了一种新型的分子印迹微流拄传感器芯片，这种芯片具有如下特点。 1 。通掌传感器瓣分子识别元磐只是露分子识蹦功麓，羁其毽馋感器的势乎浞爨元l 誓不 同，本研究设计的微流控传感器芯片，分子印迹聚合物同时飘有在线寓集和分子识别两种功 能。宅强文献报遵的含眷分子窜遍聚合谚擞瓣相摹敬柱静徽漉控芯片键不司，在徽闵穗摹取 柱中，通常要使用大量的有机溶剂或者混合溶剂去洗脱模械分子，这种洗脱魑比较困难的， 特异性好、多使点结合的分子印迹聚合秘的洗脱就疆加困难。 2 由于模板物质的洗脱通常都要使用大量的霄机溶剂或者混合溶刹，它们会对化学发 光产生淬灭作用，从而降低化学发光的强发。而在本芯片中，由于化学发光反应破坏了横板 分子的结梅，馒褥m i p 上的结合经点褥以释敷出来，以馒再次结台摸板曩拣分子，因越该 传感器芯片具有很好的可逆性。又由于反脚后的模板分子发生了结构的改变，m i p 对它的结 合髓力下降，誊接翊求貔霹爨 褥之洗琏下来，避受了有辊试勰或者缓 孛溶液静攘霜，大夫提 高了芯片的响应值。 ( 1 ) 纯拳发巍分子印迹俺蒜纛芯靖测定入搬清串特布佳袜静禽量 特布他林为选择性b 。受体激动剂，肖明显的平喘、祛痰作用，临床用于治疗支气管哮 喘、哮喘型支气管炎等痰病。常常作为促生长剂添加到动物饲料中，其作用与克伦特罗相似。 以特稚蚀韩为横援分子，静基丙烯酸( m a a ) 为功能攀体，乙二醇二甲蒸疆烯酸魏( e g d m a ) 为交联剂，乙腈为溶剂，偶氮二弹丁腈( a i b n ) 为引发剂。在6 0 ( 2 的水浴中加热2 4 小时， 台戒了特毒链抟分予印遗聚会彩。跌晓聚念狻凄充在芯片静徽捡测涎中箨为分予谖囊狻凄， 并基于特布他林对鲁米诺，铁氰化钾化学发光体系的增敏作用，建立了一种新型的化学发光 徽流控分子簿遗传感器蕊片溅定特布德棒。该籍感器在s - o 1 0 t 1 o 1 0 - t g m l 范围肉瓣特 布他林有良好响应，检出限为4 o 1 0 g n g m l ( 3 0 ) 。该传感器芯片已成功的测定了血液巾特 布袍林的含量。 ( 2 ) 基于分子印涟识别的l e 学发搬黩滚澄传薯嚣芯冀测定双嚷达莫 阻聚甲基丙烯酸甲酯( p o l y ( m c t h y l m e t h a c r y l a t 0 ，p m m a ) 为材餍，用二氯化碳激光雕 刻祝在p m m a 上襄蛙出2 0 0 塾m 爨，1 5 0 p m 深豹擞遴遘，8 m m 茨，t m m 宽，o 5 r a m 澡瓣擞 检测池。微检测池中填八5 0 v a n 粒衽大小的双嘧达莫分子印迹聚合物作为识别物质，利用精 确时阗控髑戆注瓣泵控巷l 所有试涮，基于双壤这葵瓣铁氰纯镩一鲁米诺纯学发竞体系懿蹭敏 作用，建立了化学发光分子印迹传感器芯片测定烈峨达莫的方法。该传感器具有很高的灵敏 h 摘要 度和很好的选择性以及很好的可逆性。其响应值与双嘧达莫在1 - 2 0 n g m l 的范嗣内有良好的 线性。检出限为0 5 n g m l ( 3 神。该传感器芯片己成功的测定了人体液中的双嘧达萸含量。结 果令人满意。 ( 3 ) 氯丙嚷分子印迹化学发光微流控传感器芯片的研究 盐酸氯丙嗪作为抗精神失常药物，由于其潜在的对人体的危害，禁止在饲料和动物饮用 水中使用。因此建立一种快速高效的便携式的氯丙嗪质量监控方法是非常必要的。在本研究 中，以氯丙嗪分子印迹聚合物为识别物质，微流控芯片技术为载体，鲁米诺一铁氰化钾化学 发光体系为检测方法建立了一种新型的氯丙嗪化学发光分子印迹传感器芯片。该传感器的 设计简单，可逆性高，选择性好，重现性好，其响应特性为：线性范围为o 0 2 0 4 9 9 m l ， 检出限为8 n g m l ( 3 0 ) ，精密度为4 8 。该微流控传感器芯片已成功的测定了尿液中氯丙嗪 的含量。 ( 4 ) 没食子酸化学发光徽流控分子印迹传感器芯片的研究 没食子酸常用作食品抗氧化荆，防腐剂。本研究中利用没食子酸分子印迹聚合物为分子 识别物质，基于没食子酸对鲁米诺一铁氰化钾化学发光体系的增敏作用，结合微流控分析技 术，建立了化学发光微流控传感器芯片测定了没食子酸。该传感器芯片制作简单，重现性好， 其响应范围为5 - 2 0 0 n g m l ，检出限为3 n g m l ( 3 0 ) 。将该传感器运用于食品中没食子酸的测 定，结果满意。 2 化学发光微流动注射芯片的研究 微流动注射分析( m i c r of l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ，灯i a ) ，是微流控分析的一个分支，1 9 9 5 年s j h a w w e l l 首次对灯i a 作了报道。微流动注射分析与常规的流动注射分析相比，由于 其简单高教，操作方便，节约试剂等优点，近几年来发展的很快。本文在p m m a 材质上， 用二氧化碳激光烧蚀构建微通道和热压法键合，设计了一种具有精确时间控制的注射泵用于 控制进样体积，时问控制精度为0 0 1 秒，取样量为纳升至微升级，通过化学发光反应进行 检测，建立一系列的微流动注射分析芯片，测定了尿酸，旺硫酸钠、亚硝酸根和过氧化氢等。 ( 1 ) 化学发光徽流动注射芯片测定尿酸 微流控芯片测定尿酸的方法已有报道，但是这些方法都是基于酶化学的原理。由于酶试 剂昂贵且难于保存，在实际应用中，实验条件比较苛刻，所以建立一种无酶测定尿酸的方法 就显得尤为重要。 在本论文中，基于无酶化学发光体系( 鲁米诺铁氰化钾) 在强碱性介质中及高浓度亚 铁氰化钾存在的条件下，尿酸对鲁米诺铁氰化钾化学发光体系的增敏作用，建立了一种无 i l i 摘要 酶试剂的化学发光微流动注射芯片测定了入血清和尿液中的尿酸含量。该方法采用注射泵控 制所有试剂，简单高效，易于微型化。尿酸的浓度在0 8 - 3 0 m g l 范围内有良好的线性关系，检 山限是o 5 m g l ( 3 0 ) 。 ( 2 ) 化学发光徽流动注射芯片测定食品中的亚硫酸钠 亚硫酸钠作为一种食品添加剂，常常应用于食品的漂白。当亚硫酸钠摄入过量，会对人 体造成严重危害。冈此很有必要建立一种快速高效的方法监控食品中亚硫酸钠。 本研究发现，在硫酸介质中，亚硫酸钠对c e ( 1 r h 6 g t w e e n8 0 化学发光体系具有很 强的增敏作用，采用注射泵精确控制试剂，利用二氧化碳激光烧蚀，热压法在p m m a 材质 上建立一种高效快速，易于微型化的微流动注射芯片测定了食品中的亚硫酸钠。线性范围为 t 0 - 6 0 g m l ，检出限是o 5 l _ t g m l ( 3 0 ) 。 ( 3 ) 化学发光微流动注射芯片测定食品中的亚硝酸钠 基于无机偶合化学发光反应，即在酸性条件下，亚硝酸氧化亚铁氰化钾生成铁氰化钾， 铁氰化钾遇到鲁米诺溶液产生很强的化学发光，在5 0 x 4 0 5 m m 的p m m a 材质上用二二氧化 碳激光刻蚀出2 0 0 微米宽，1 0 0 微米深的微通道，利用精确时间控制的注射泵控制所有试剂， 建立了一种高灵敏度微流动注射分析芯片测定了食品中的亚硝酸。亚硝酸的浓度在 8 - 2 0 0 g l 范围内与发光强度成良好的线性，检出限是4 p g l ( 3 0 ) 。该芯片非常适合于监控食 品中的砸硝酸含量。 ( 4 ) 化学发光微流动注射芯片测定雨水中的过氧化氢 基y - l u m i n 0 1 h 2 0 2 一c 0 2 + 化学发光体系，设计了一种新的微流动注射芯片准确测定了雨 水中的过氧化氢含量。芯片由两块5 0 4 0 x 5 m m 的透明有机玻璃( p m m a ) 在实验室加工而 成。由c 0 2 激光雕刻机刻蚀出的微通道宽2 0 0 p m ，深1 5 0 j x m 。方法的线性范围为o 0 5 - 2 1 t m o l l ， 检出限为o 0 2 n o l l ( 3 0 ) 。对o 6 p m o l l 的过氧化氢溶液平行测定9 次，其相对标准偏差 ( r s d ) 为4 6 。该方法己成功的测定了雨水中微量过氧化氢的含量。 关键词：微流控传感器芯片微流动注射分析分子印迹聚合物化学发光 a b s t r a c t i n v e s t i g a t i o no nt h ec h e m i l u m i n e s c e n c e m i c r o f l u i d i es e n s o ra n d t h ec h e m i l u m i n e s c e n c em i c r of l o wi n j e c t i o na n a l y s i so nac h i p s p e c i a l i z a t i o n ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y m e n t o r ：p r o f z h u j u nz h a n g r e s e a r c hd i r e c t i o n ：l u m i n e s c e n c ea n a l y s i s p o s t g r a d u t e ：d e y o n gh e ( b 2 0 0 3 6 5 ) a b s t r a c t t h er e s e a r c hw o r ko ft h ed i s s e r t a t i o ni sm a d eu po ft w os e c t i o n so fm i c r o f l u i d i cs e n s o ra n d m i c r of l o wi n j e c t i o na n a l y s i so nac h i p 1 i n v e s t i g a t i o no nc h e m i l u m i n e s c e n c em i c r o f l u i d i cs e n s o ro nac h i pb a s e do rm o l e c u l a r l y i m p r i n t e dp o l y m e r a st h er e c o g n i t i o ne l e m e n t s m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) t h a th a ss p e c i a lr e c o g n i t i o na n ds e l e c t i v i t yf u n c t i o nf o r t e m p l a t em o l e c u l ei ss y n t h e s i z e db yap o l y m e r i z i n gr e a c t i o no fam i x e ds o l u t i o nc o n t a i n i n ga f u n c t i o n a lm o n o m e r , ac r o s s 一一l i n k e ra n dat e m p l a t ei naw a t e rb a t h m i pn o to n l yh a sa t t r a c t i v e f e a t u r e ss u c ha sp h y s i c a lr o b u s t n e s s ，h i g hs t r e n g t h ，r e s i s t a n c et oe l e v a t e dt e m p e r a t u r ea n dp r e s s u r e ， a n di n e r t n e s st o w a r d sa c i d s ，b a s e s ，m e t a li o n sa n do r g a n i cs o l v e n 乜，b u ta l s oh a se x c e l l e n ts p e c i a l r e c o g n i t i o nc a p a c i t yc o m p a r e dw i t he n z y m e s u b s t r a t e ，a n t i b o d y - a n t i g e na n dm c e p t o r - l i g a n d t h ea p p l i c a t i o n so fm l pa st h er e c o g n i t i o ne l e m e n t si nm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ( t t a s ) w e r ef o c u s e do nt h es u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) s e n s o r ，q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) s e n s o r , s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) a n ds e n s o ra r r a y b u tt h ea p p l i c a t i o no fc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) m i c r o f l u i d i cs e n s o ro nac h i pb a s e do nt h em i pa st h er e c o g n i t i o ne l e m e n t sh a sn o tb e e n r e p o r t e d i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，an o v e lm i c r o f l u i d i cs e n s o ro nac h i pb a s e do nf o u rm i p s ，i n c l u d i n g t e r b u t a l i n e m i p ，d i p y r i d a m o l e - m i p ，c h l o r p r o m a z i n e - m i pa n dg a l l i ca c i d m i pa st h er e c o g n i t i o n e l e m e n t sa n dc ld e t e c t i o ni sd e s c r i b e d t h ef o u rm i c r o f l u i d i cs e n s o rc h i p sa r es u c c e s s f u l l y a p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no ft e r b u t a l i n e ，d i p y r i d a m o l e ，c h l o r p r o m a z i n ea n dg a l l i ca c i d r e s p e c t i v e l y t h en o v e l t ya n di n n o v a t i o no f t h em i c r o f l u i d i cs e n s o rc h i pa l es h o w n a sf o l l o w i n g ： f i r s t ，t h ep r o p o s e dm i c r o f l u i d i cs e n s o rc h i pn o to n l yh a se x c e l l e n ts p e c i a lr e c o g n i t i o n c a p a c i t y , b u ta l s oh a st h eo n - l i n ee n r i c h m e n tf u n c t i o nf o rt h ea n a l y t e i nt h es p ec h i p ，o r g a n i c r e a g e n t sa n db u f f e rs o l u t i o na r er e q u i r e da st h ee l u e n tt oe x t r a c tt h ea n a l y t e ，w h i c hi sd i f f i c u l ta n d m a k e st h ea n a l y s i sp r o c e d u r em o r ec o m p l i c a t e d v a b s t r a c t s e c o n d ，t h ee l u e n ta r eu s u a l l yt h eq u e n c h e r sf o rc lr e a c t i o n b u ti nt h ep r o p o s e dm i c r l f l u i d i c s e n s o rc h i p ，t h es t r u c t u r eo f t h ea n a l y t ec a nb ed e s t r o y e dt h r o u g ht h ec lr e a c t i o na n dt h ec a v i t i e s o fm pc a r tb er e l e a s e d , s ot h er e a c t e da n a l y t ec a nb ee a s i l yw a s h e do f ff r o mt h em 1 pb yu s i n g w a t e ra s t h ee l u e n t s ot h ea n a l y s i sp r o c e d u r ei ss i m p l i f i e da n dt h ep r o p o s e dm i c r o f l u i d i cs e n s o ri s r e v e r s i b l ea n dr e u s a b l e ， ( 1 ) d e t e r m i n a t i o no f t e r b u t a l i n ei nh u m a ns e r u m b a s e do nam o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) t h er e c o g n i t i o ne l e m e n t , an o v e l c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) m i e r of l o ws e n s o ro nac h i pf o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft e r b u t a l i n ei n h u m a ns e f l l mi sd e s c r i b e d t h em 伊v c a sp r e p a r e db yu s i n gt e r b u t a l i n ea st h et e m p l a t e ， m e t h a c r y l i ca c i d ( m a a ) a st h ef i m c t i o n a lm o n o m e r , e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a e r y l a t e ( e g d m a ) a s t h ec r o s s - l i n k i n gm o n o m e r , a n da c e t o n i t r i l ea st h es o l v e n t t h ec h i pw a sf a b r i c a t e df i - o mt w o 5 0 4 0 x 5 m mt r a n s p a r e n tp o l y m e t h y l m e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) s l i c e s t h em i c r o c h a r m e l so nt h e c h i pe t c h e db yc 0 2l a s e rw e r e2 0 0 1 m aw i d ea n d1 5 0 p md e e p t h em i c r o f l u i d i cs e n s o rc e l l f i l l e d w i t h2 m gm i pf o rs e l e c t i v e l yo nl i n ea d s o r b i n gt e r b u t a l i n ew a s1 0 m ml o n g , l m mw i d ea n d 0 5 m md e e p a l lr e a g e n t sw e r ec o n t r o l l e db yt h es y r i n g ep u m pw i t hb i ia c c u r a t et i m e r t h eo nl i n e a d s o r b e dt e r b u t a l i n eb yt h em i pc a ne n h a n c et h ec li n t e r s i t yo ft h er e a c t i o no fl u m i n o lw i t h f e r r i c y a n i d e t h ee n h a n c e dc li n t e n s i t yi s l i n e a rw i t ht e r b u t a l i n ec o n c e n t r a t i o nf r o m8 0t o 1 0 0 n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f4 0 n g m l ( 3 西t h em i c r of l o ws e n s o rp r o v i d e sf o rg o o d r e p r o d u c i b i f i t yw i t ht h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f 3 6 翻2 7 ) f o r2 0 n g m lt e r b u t a l i n e ( 2 ) d e t e r m i n a t i o no f d i p y r i d a m o l ei nh u m a ns e r u ma n du r i n e an o v e lc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c dm i e r o f l u i d i cs e n s o ro nac h i pb a s e do n 弑pa st h e r e c o g n i t i o ne l e m e n tf o r t h ed e t e r m i n a t i o no fd i p y r i d a m o l ei sd e s c r i b e d t h em i p t h a tp r e p a r e db y u s i n gd i p y r i d a m o l ea st e m p l a t e , m a aa st h ef u n c t i o n a lm o n o m e ra n de g d m aa s t h e c r o s s - 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