（生物医学工程专业论文）基于MEMS技术的葡萄糖检测微系统的研究.pdf

a b s t r a c t w i t h 血ei n d u s t r i a l i z e dd e v e l o p m e n ta n di m p r o v e m e n to ft h el i v i n gs t a n d a r d i t l e a d st ot h ef a c tt h a tv e r yg r e a tc h a n g et a k e sp l a c ei np e o p l e sl i v i n ge n v i r o n m e n ta n d d i e ts t r u c t u r e i nt h e p a s t 2 0y e a r s ，t h ei n c i d e n c eo fd i s e a s e s ，s u c ha sd i a b e t e s ， c a r d i o v a s c u l a rv e s s e ld i s e a s ea n d m a l i g n a n t t u m o u r , e t c i s r a i s e d g r a d u a l l y e s p e c i a l l yf o rd i a b e t e s d e a t hr a t eo c c u p i e st h et h i r dp l a c ei nt h ew o r l d d i a b e t e si s c l a s s i f i e da so n eo ft h r e em a j o rd i s e a s e sb e s i d e sc a r d i o v a s c u l a rv e s s e la n dt u m o u ri n t h ew o r l d t h eb l o o ds u g a ri st h ei n d e xt h a tt h ed i a b e t i co f t e nm e a s u r e i th a s i m p o r t a n tm e a n i n g sf o rt h ed i a b e t i ca n dm a s s e s m e d i c a lt r e a t m e n t & h e a l t hc a r et o f a s t ，s e n s i t i v e l y , a c c u r a t e l ym e a s u r et ob l o o ds u g a r b e c a u s eb i o s e n s o r sh a v em a n y a d v a n t a g e s t h a tc h a r a c t e r i s t i co fi n f o r m a t i o n g a t h e r , c h a n g e ，t r a n s m i s s i o n a n d e x p r e s s i o ni si n t e g r a t e dt o g e t h e r ；a b i o s e n s o ri sd e t e c t e ds i m p l y ，c o n v e n i e n t l ya n df a s t ； t h ed e v i c ew i t hab i o s e n s o ri ss i m p l e ，c h e a pa n ds oo n ，b i o s e n s o r sa r ew i d e l ya p p l i e d t or e l e v a n td e t e c t i n gi n s t r u m e n t so fd i a b e t e s q u i c k l y g l u c o s es e n s o r s ，w h i c ha r e s t u d i e de a r l i e s t ，m o s t s u c c e s s f u l l y i n b i o s e n s o r s ，s h o u l dp o s s e s s t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n si np r a c t i c a la p p l i c a t i o n ：( 1 ) a c c u r a t e ，f a s t ，p e c u l i a r , s t r o n ga n ds t e a d y r e s p o n s et ob l o o ds u g a ri nal o n g - t e r m ，a n dm e a s u r e di nt e a l - t i m e ；( 2 ) w i t h i nt h e e x t e n s i v er a n g e ，r e s p o n s eh a se x c e l l e n tl i n e a rr e l a t i o n 、i t l lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ；( 3 ) o p e r a t eb r i e f l ya sm u c h a sp o s s i b l e ；( 4 ) m i c r o m i n i a t u r i z a t i o n ，t h er a t i o n a lp r i c e s i n c et h e19 9 0 s ，w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm e m s t e c h n o l o g y ，g l u c o s es e n s o r s a n db i o c h e m i c a la n a l y t i c a li n s t r u m e n t sa r ed e v e l o p e dt o m i n i a t u r i z e d i g i t i z ea n d h i 曲l yd e p e n df u r t h e r e l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r sb a s e do nm e m st e c h n o l o g yh a v e h i g h e rs e n s i t i v i t y ( a b o u t4 0 0n a m m ，t w i c et h a ns c r e e n - p r i n t e ds e n s o r s ) ，e x c e l l e n t c o n s i s t e n c y ( c v s5 ，e v e nl o w e r ) ，b e t t e rd e p e n d e n c e ( u p t oo 9 9 ) ，s i m p l e rt e c h n i c s ， l o w e rc o s ti ne n o r m o u sq u a n t i t i e s c o m p a r e dw i t hs c r e e n p r i n t e de l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r s i nt h i s p a p e r , s i n g l e u s eg l u c o s es e n s o r sa r ep r e p a r e do nt h eb a s eo fm e m s t e c h n o l o g ya n db i o s e n s o rt e c h n o l o g y p l a t i n u m b l a c kp a r t i c l eh a sf i n ec h a r a c t e r i s t i c o fg o o da b i l i t yt oa b s o r b ，w i d es u r f a c ea r e a ，h i g hc a t a l y t i ca c t i v i t y i ti sc o m b i n e d w i t hb a s i ce l e c t r o d e s o nt h eb a s i so fm e m st e c h n o l o g y i m m o b i l i z e do l u c o s e o x i d a s e ( g o d ) o nt h es u r f a c eo fp l a t i n u m b l a c kg o l de l e c t r o d e s ，ah i g h p e r f o r m a n c e g l u c o s es e n s o rh a sb e e np r e s e n t e d t h eg l u c o s es e n s o r sa n dm i n i a t u r ei n s t r u m e n t sa r e m e a s u r e dt h r o u g hb e i j i n gh o s p i t a la n dc l i n i c a l l y d e t e c t i n gc e n t e ro fm i n i s t r yo f p u b l i ch e a l t h t h e p r e c i s i o n ( c v ) o fg l u c o s es e n s o r si s4 7 ；w i t h i nt h er a n g eo f0 2 4 r a m ，t h ec o r r e l a t i o nc o e 衔c i e n to b s e r v e di s0 9 9 9 ，w h i c hr e a c ht h e a n t i c i p a t e d e x p e r i m e n tg o a l t h eg l u c o s ed e t e c t i n gm i c r o s y s t e md e v e l o p e dh a sv e r yg o o d m a r k e t p r o s p e c t si nt h e f u t u r e k e y w o r d s ： b i o s e n s o r ；g l u c o s es e n s o r ；m e m s ；e l e c t r o c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ；p l a t i n u m b l a c k ； g l u c o s e d e t e c t i n gm i c r o s y s t e m ；e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表 或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：彬丝! 圣日期三! 丝! ：! 占 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可 以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：鱼鳖l 堡! 主导师签名： 题耻嗍 上海大学硕士毕业论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究目的与意义 随着世界人口进入老龄化社会，高龄者的健康问题日益引起全世界范围研究 人员的关注，同时，由于工业化的发展和生活水平的提高，导致人们的生活环境 和饮食结构发生变化。近2 0 年来，糖尿病、心血管病和恶性肿瘤等疾病发病率 逐渐提高，尤其是糖尿病发病率特别离，糖尿病是一种常见的代谢紊乱性或内分 泌疾病，它可诱发肾、心血管、视网膜和神经系统产生多种并发症，其死亡率仅 次于心血管、肿瘤，居世界第三位，被列为世界三大疾病之之一。有关资料显示， 1 9 9 7 年，全世界糖尿病患者人数是1 4 3 亿，到2 0 0 5 年将翻番达到3 0 0 亿；而 我国现有糖尿病患者4 0 0 0 万，并且每年还以5 ( 2 0 0 万) 的速度增加。为了遏 制此类疾病的发病率并有效的降低其死亡率，今后医疗手段的发展方向，必将由 现在的治疗医疗向将来的预防医疗转变，同时实现早期发现、早期诊断和早期治 疗。因此，对一些疾病的先期预兆，如血糖、蛋白质等生化指标的变化，以及某 些基因的突变进行有效、简便、快速、准确的测定，愈发引起医疗界的关注。用 于糖尿病患者体外检测的便携式血糖仪，较之大型生化分析仪，操作简单、取血 量少、价格便宜等优势，非常适合糖尿病患者在家庭使用。图1 为家庭用便携式 血糖仪的工作示意图，使用采血笔在手指末端取一滴血，放在试条反应沟道一端， 血液在毛细管力的作用下。几乎在瞬间，溶液就可以充满整个反应沟道，在半分 钟内就能得出测试结果，此类血糖仪在目前糖尿病检测仪市场上占有很大份额。 图l家庭用血糖仪工作示意图 在此检测微系统中最关键的部分是能快速、准确、稳定地检测血糖浓度的葡 萄糖传感器，而最初用于血糖浓度分析的化学比色法和酶比色法已经不能满足这 个系统的需要。为了满足临床医学所需要的自动、迅速和精确测量葡萄糖浓度的 要求，葡萄糖传感器应该具备以下条件：( 1 ) 对血糖浓度的反应精确、迅速、特 上海大学硕士毕业论文第一章绪论 异性强、长期稳定，并可实时测量：( 2 ) 在广泛的测定范围内，反应参数与葡萄 糖浓度呈线性关系：( 3 ) 操作并尽可能简单；( 4 ) 微型化，价格台理。 本课题通过微机电系统技术( 简称m e m g 技术) 制各一次性使用的葡萄糖传 感器传感器阵列，并进行多功能生化检测微系统的研究和开发。解决传感器的 设计、加工、酶固定化、稳定性、多种微型生化传感器与检测电路系统集成等关 键技术，实现全血中葡萄糖快速微创测量，这对医学检测、大众医疗保健及发展 我国高技术产业具有重要的现实意义。本论文工作主要是在蔡新霞研究员指导 下，在中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室北方基地完成。最后还 需指出的是，论文题目“葡萄糖检测微系统”所指的微系统，它是检测微仪表和 葡萄糖传感器两部分的总称，跟m e m s 技术另一称谓“微系统”不是同一概念， 文中所述的传感器与试条是同一物质的不同称谓，本文将不加区分。 1 2 生物传感器 1 2 1 生物传感器简介 传感器是一种信息获取与处理的装置。人体的感觉器官就是一套完美的传感 系统，通过眼、耳、鼻、皮肤来感知外界的光、声、温度、压力等物理信息，通 过鼻、舌感知气味和味道这样的化学刺激。对物质成分传感的器件就是化学传感 器，它是一种小型化的、能转移和可逆地对某种化学成分进行应答反应的器件， 并能产生与该成分浓度成比例的可测信号。而生物传感器“1 是作为一类特殊的 化学传感器，是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透 成长起来的高新技术，它是以生物活性单元( 如酶、抗体、核酸、细胞等) 作为 生物敏感基元，对被目标测物具有高度选择性的检测器。生物传感器的传感原理 如图2 所示，它通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的 反应，然后将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来，从而得出被测物的浓 度，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在 线连续监测的特点。生物传感器的高度自动化、微型化与集成化，减少了对使用 者环境和技术的要求，适合野外现场分析的需求，在生物、医学、环境监测、食 品、医学及局势医学等领域有着重要应用价值，已引起世界各国的极大关注。 上海大学硕士毕业论文 第一章绪论 生物 埔骥信号懈 分子识别 图2 生物传感器的传感器原理 电 信 号 到目前为止，生物传感器大致经历了3 个发展阶段：第一代生物传感器是由 固定了生物成分的非活性基质膜( 透析膜或反应膜) 和电化学电极所组成；第二 代生物传感器是将生物成分直接吸附或共价结合到转换器的表面，而无需菲活性 的基质膜，测定时不必向样品中加入其他试剂：第三代生物传感器是把生物成分 直接固定在电子元件上，它们可以直接感知和放大界面物质的变化，从而把生物 识别和信号的转换处理结合在一起。 1 2 2 生物传感器的分类 生物传感器的结构般有两个主要组成部分：一是生物分子识别元件，是具 有分子识别能力的生物活性物质( 如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶等) ； 二是信号转换器，主要有电化学电极( 如电位、电流的测量) 、光学检测元件、 热敏电阻等。生物传感器的选择性取决于它的生物敏感元件，而生物传感器的其 他性能则和它的整体组成有关。 生物传感器一般可从以下3 个角度来进行分类：根据传感器输出信号的产生 方式，可分为生物亲和型生物传感器、代谢型生物传感器和催化型生物传感器； 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为酶传感器、微生物传感 器、组织传感器、基因传感器、免役传感器等；根据生物传感器的信号转化器可 分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传 感器、测声型生物传感器等，生物传感器的分类如图3 所示。 上海大学硕士毕业论文 第一章绪论 图3 生物传感器按生物分子识别元件敏感物质分类 与传统的分析方法相比，生物传感器这种新的检测手段具有以下的优点：1 ) 生物传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，因此一般不需要样品 的预处理，样品中被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不需加入其他 试剂；2 ) 由于它的体积小，可以实现连续在线监测；3 ) 响应快，样品用量少， 且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用：4 ) 传感器连同测定仪的成本 远低于大型的分析仪器，便于推广普及。 1 2 3 酶生物传感器的电子传递过程及工作原理 酶生物传感器是一个固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成， 它把固化酶和电化学传感器结合在起，因而具有独特的优点：1 ) 它既有不溶 性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；2 ) 由于酶的专属反应性，使 其具有高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。因此，酶电极在生物传感 器领域中占有非常重要的地位。 酶生物传感器的电子传递过程：基于生物酶催化的生物化学电极在生物酶与 电化学电极之间进行电子传递的工作原理如图4 所示，生物酶与电极之间的电子 传递是利用小分子量的电子交换媒体在生物酶与电极之间进行的。这种媒体辅助 型的电子交换特点是：1 ) 媒体作为第二目标物参与酶催化反应：2 ) 在电极表面 发生的电极与媒体之间的电子交换是可逆的。在媒体辅助型酶催化反应中，媒体 作为第二目标物和第一目标物( 分析物) 一起参与反应。作为催化反应的媒体物 质的生成物，在与电极表面进行电子交换后得以再生( 这个反应不需要酶得催化， 因而可以被认为是一个单独进行得反应) 。电子交换媒体直接参与电极表面的电 子交换，媒体的选择对测量的结果影响很大。 理想的电子交换媒体反应具有一下特点：1 ) 在酶的催化下反应速度快：2 ) 在电极表面能够表现出良好的电化学特性；3 ) 不论在氧化态，还是还原态，都 应该具有良好的化学稳定性：4 ) 为减少外界对测量结果的干扰，媒体的氧化峰 4 上海大学硕士毕业论文第一章绪 论 位应该与溶液的p h 值无关；5 ) 同时，媒体的废弃处理应该简单易行且无毒。 电极 氧化 目标物 产物 图4酶生物传感器电子传递过程示意图 酶生物传感器的工作原理是：当酶电极浸入被测溶液，待铡底物浸入酶层的 内部并参与反应，大部分酶反应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质，当反 应达到稳态时，电活性物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定。因此，酶 生物传感器可分为电位型酶传感器和电流型酶传感器。 电位型酶传感器是指酶电极与参比电极间输出的电位信号，它与被测物质之 间关系服从能斯特方程。所用的基础电极有p h 电极、气敏电极( c o 。、n h 。) 等， 它影响着酶电极的响应、检测下限等许多性能。电流性酶传感器与电位型酶传感 器相比具有更简单、更直观的结果，且灵敏度也高，表1 为常见的电位型酶生物 传感器。 表l 常见的电位型酶生物传感器 测定对象酶检测电极 尿素 脲酶 n h a ，c o z ，p h 中性脂类 蛋白质酶! o h 扁桃苷葡萄糖苷酶 c n 。 l 一精氨酸精氨酸酶n h q + 。c o z l 一天冬氦酸天冬酰胺酶n t t t + ，c o ： l 一赖氨酸赖胺酸脱羧酶c o z 青霉素青霉素酶 d h 苦杏仁苷苦杏仁苷酶c n 硝基化合物硝基还原酶一亚硝基还原酶n i t t ，c o z 亚硝基化合物亚硝基还原酶n i t a 电流型酶传感器是指将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应 产生的电流信号，在一定条件下，测得的电流信号与被测物浓度呈线性关系。其 5 圭童奎堂堡主兰些笙塞整二主堡堡 基础电极可采用氧、过氧化氢等电极，还可采用近年开发的介体修饰电极的炭、 铂、钯和金等基础电极，表2 为常见的电流型酶生物传感器。 表2常见的电流型酶生物传感器 测定对象酶检测电极 葡萄糖葡萄糖氧化酶 旺，h 2 麦芽糖淀粉酶 p t 蔗糖转化酶+ 变旋光酶+ 葡萄糖旺 半乳糖酶 p t 尿酸半乳酸酶 0 2 乳酸尿酸酶o z 胆固醇乳酸氧化酶o z ，h 2 0 2 l 一氨基酸胆固醇氧化酶h z 0 2 ，1 2 ，0 2 磷脂质l 一氨基酸酶 p t 单胺磷脂酶0 2 苯酚单胺氧化酶 p t 乙醇酪氨酸酶 0 2 丙酮酸乙醇氧化酶n 丙酮酸脱氧酶 1 3葡萄糖传感器及其微系统的国内外研究现状 1 3 1 葡萄糖传感器概况 1 9 6 7 年。u p d i k e 和h i c k 设计制作出第一支葡萄糖氧化酶电极传感器，它标 志着葡萄糖传感器的开始。该传感器是一支用p h 玻璃电极作为基体电极，用聚 丙烯酰胺凝胶固定酶与氧电极结合，用于血糖的测定。由于葡萄糖氧化酶的渗漏 使传感器不能长期地有效使用，同时该传感器体积大，在检测糖尿病人的l 临床应 用中受到限制。由于葡萄糖检测在医学上具有非常重要的意义，葡萄糖传感器的 研究一直是人们关注的热点。人们力图改进电极的设计使电极微型化：选择适合 的外层选择性渗透膜材料，扩大传感器的线性范围；改进固定酶的方法，减少葡 萄糖氧化酶的流失，提高传感器的稳定性。 葡萄糖传感器包括三种类型，即酶电极葡萄糖传感器、燃料电池型葡萄糖传 感器、光学葡萄糖传感器。 ( 1 ) 酶电极葡萄糖传感器：将葡萄糖氧化酶夹置于二层半透膜间固定，葡萄 糖氧化后生成过氧化氢，其生成量及氧消耗量与葡萄糖浓度成正比。此种传感器 6 上海大学硕士毕业论文第一章绪论 的优点是单纯测定葡萄糖，缺点是：温度不稳定时不易测准，寿命短，葡萄糖的 测试范围不宽，葡萄糖浓度高过2 0 0 m g d h 时，多得的结果不准。 ( 2 ) 燃料电池型葡萄糖传感器：将二白金网电极夹在三枚硅胶膜中，水、氧 可透过硅胶膜，而葡萄糖等溶质不能通过，葡萄糖在阴极受白金触媒作用而氧化， 氧在阳极被还原生成o h 一，因而两极间发生电位差，从阳极可测得血糖浓度。该 传感器的优点是寿命长，线性范围宽，在高血糖范围内可测定葡萄糖。缺点是特 异性差，受活体内物质的干扰，重复性差，葡萄糖氧化后，葡萄糖醛酸附着在阳 极上妨碍反应。 ( 3 ) 光学葡萄糖传感器非创伤血糖测定法：将细微光纤维插入血管内或 组织内，传感器前端对葡萄糖氧化时，p h 变化所致的指示剂变色度用分光分析 法测定，可得血糖值。光学的葡萄糖传感器具有灵敏度高，噪声低等优点，但也 存在一些弊病：a ) 容易受到背景光的干扰，需要严格控制外来光线进入测量池； b ) 与其它传感器比较，响应线性范围窄；c ) 响应信号与酶的量有关，微传感器 要求酶用量相对减少，信号强度亦随之减弱，使测试复杂化；d ) 固定化酶长期 受辐射，稳定性不高。 在这些葡萄糖浓度测定方法中，葡萄糖氧化酶传感器以准确、快速和最低的 成本而具有竞争性，是当前世界上葡萄糖传感器研究的焦点。目前决大多数葡萄 糖传感器均采用在电极表面上修饰葡萄糖氧化酶的方法来制各以期获得高灵敏 度和高选择性的电极响应，基于电化学的原理测定电极上葡萄糖氧化所产生的微 电流而测得葡萄糖的浓度。电化学葡萄糖传感器具有以下优点：1 ) 葡萄糖氧化 酶可以反复使用：2 ) 测量操作简单迅速：3 ) 可对微量样品进行测定；4 ) 可进 行定量测定；5 ) 可用于比色法难测定的污浊样品：6 ) 由于直接变成电信号，适 合于控制和自动测量，电化学的葡萄糖氧化酶传感器有三种：a ) 基于测量氧气 的葡萄糖氧化酶传感器；b ) 基于测量过氧化氢的葡萄糖氧化酶传感器：c ) 介体 型葡萄糖氧化酶传感器 基于测量氧气和过氧化氢的葡萄糖氧化酶传感器同属于第一代酶生物传感 器，反应如下： 酶层：g o d 。+ g l u c o s e g l u c o n 0 1 a c t o n e + g o d 刚 g o d 。d 十0 2 。- g o d o x + h 2 0 2 电极：h 2 0 2 卜0 2 + 2 h + + 2 e 一 反应结果是：0 ：浓度减小，h ：o ：浓度增大，通过检测产物h 。0 。浓度的变化或氧 气的消耗量来测定葡萄糖的浓度。该类型传感器的主要缺点： 1 溶解氧的变化可能引起电极响应的波动； 2 ，由于氧的溶解度有限，当溶解氧贫乏时，响应电流明显下降，从而影响检 出限。 3 ，生物传感器的响应性能受溶液中p h 值及温度影响很大。 介体型葡萄糖氧化酶传感器属于第二代酶生物传感器，它是以媒介体修饰剂 7 上海大学硕士毕业论文第一章绪论 为基础的电催化，反应如下： 酶层：g o d o x + g l u c o s e 叶g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d 修饰层：g o d r e d + m o x + g o d o x + m r e d 电极：m r e m o x + n e 第二代酶生物传感器，即增加了化学修饰层。化学修饰层的目的是为了扩大 基体电极可测化学物质范围及提高测定的灵敏度。基体电极经过修饰后，可以看 成是一个改进了的信号转换器，这种修饰剂成为电子转移媒介体。电子媒介体的 作用是能促进电子传递过程，降低工作电位，以排除其它电活性物质的干扰。媒 介体在近十年以来得到迅速发展，使用的媒介体也越来越多，据其作用的机理主 要可分为两大类：1 ) 含有过度金属元素的化合物或配合物，通过过度金属的价 态变化来传递电子。2 ) 通过分子中的特殊官能团的结构变化来传递电子。这些 化合物的共同特点是都含有大兀键的环及与环相联的双键，这些双键容易打开与 再形成，电子的传递就是靠这些双键打开与再形成得以实现。常见的媒介体主要 有以下几中：二茂铁及其衍生物、钌及其化合物、铁氰酸盐、醌类、有机介体。 其中有机介体和有机导电盐是一类较为新型的媒介体，它对生物大分子的氧化有 明显的催化作用。 1 3 2 葡萄糖传感器的国内外发展现状 葡萄糖传感器是研究最早、最多、也最成功的酶电极传感器。1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 就发表了第一篇关于酶电极的报道”3 ，他们首次通过检测在葡萄糖氧化 酶( g l u c o s eo x i d e ，g o d ) 的催化下，葡萄糖氧化成葡萄糖酸时，电极附近氧的 消耗量来获得溶液中葡萄糖的浓度，但他们所用的酶是溶解性，难于重复使用。 1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 将固定化葡萄糖氧化酶( g o d ) 膜结合至氯电极上”1 做 成了第一支酶电极，并引入了“酶电强”这一术语。继后g u i b a u l t 及各国学 者做了大量工作，使葡萄糖传感器发展亦趋完善。常规c l a r k 氧电极背景电流大， 易受环境中氧浓度影响，g a s s 等报道了第一种介体酶电极0 1 ，由于介体代替了 氧的作用，克服了氧电极的缺点，二茂铁及其衍生物作为葡萄糖传感器介体的研 究有一些报道”3 。 随着微电子技术的发展，人们将生物酶固定化技术和m e m s 技术结合起 来应用于化学传感器的研制，可以将生物传感器敏感元件的三维尺寸充分压缩， 制成体积微小，功耗低，易于智能化的传感器。由于m e m s 具有体积小、重量轻、 性能稳定，通过i c 等工艺可批量生产，成本低，性能一致性好等优点，于是人 们进行了以玻璃、硅、二氧化硅、氮化硅、氧化铝为基片的微型葡萄糖传感器的 研究。按照设计的电极图形，应用微电子薄膜技术在基片上溅射铂和银，以铂电 极为工作电极，一般采用共价键法固定酶，形成具有单分子层的酶电极，希望能 得到微型化、线性范围宽、灵敏度高、稳定性高的葡萄糖传感器。1 9 8 3 年， 上海大学硕士毕业论文第一章绪 论 i k a r u b e 和s s u z u k 首次采用微机械加工技术和微电子平面工艺将c l a r k 氧电 极微型化，并与g o d 结合成功研制了微型葡萄糖传感器”“。朱建中等在i k a r u b e 和s s u z u k 的基础上，通过改进制备工艺和传感器结构，使微型葡萄糖传感器的 制各更简单易行，而性能相当“。i s a b e l l a 矾o s e r 等在玻璃芯片上集成了葡萄 糖、乳酸、谷胺酸盐、麸酸胺微型传感器用于全血检测，微阵列传感器具有了很 高的稳定性，并很好的解决了电极之间的交叉干扰( c r o s s t a l k i n g ) 问题“。 微阵列传感器的应用已有很多报道1 。 1 3 3 葡萄糖检测微系统的国内外研究发展现状 便携式葡萄糖检测微系统很多公司开发出自己的产品( 图5 ) ，是目前发展 最成熟，也是竞争最为激烈的产品。从售价上看，一般国外公司新推出的产品价 格都在1 0 0 0 元以上，如强生系列产品中，稳步倍加型价格为1 1 8 8 元，稳捷全能 型价格为2 0 7 0 ；德国罗氏优越品牌的电子感应血糖检测仪价格为1 0 9 9 元。国内 公司的产品售价大都在4 0 0 1 0 0 0 元，稳灵型血糖仪市价为7 6 8 元，怡成血糖仪 售价5 6 0 元，金鹊血糖仪售价4 5 0 元。根据市场的需要，很多微仪表具有几合一 的功能，通过使用不同的校准试条，完成对多种生化参数的检测。如德国罗氏开 发的爱康全牌的血糖胆固醇甘油三脂三用血糖仪，美国雅培公司推出的血糖 血酮仪( 图6 ) ；国内台湾一家公司最近推出“贴心”牌血糖测试仪，该血糖仪 采用先进的电容计法，成本较高，但精度比市场上普遍采用的a d 转换法有大幅 度的提高：且具有四合一的功能，可检测血糖、尿酸、胆固醇和三酸甘油脂四个 生理参数。市场上相应的公司血糖试条价格国外产品大概在5 元条左右，国内 公司产品在2 3 元之间； 图5 已商品化的各种便携式全血生化检测仪 上海大学硕士毕业论文 第一章绪论 图6 美国雅培血糖血酮仪 l - 4 葡萄糖氧化酶的固定化方法瞳u 生物传感器有生物敏感元件和信号转换器两个主要部分组成。生物传感器的 选择性主要取决于生物敏感材料，而灵敏度的高低则与信号转换器的类型、生物 材料的固定化技术等有很大的关系，因此，生物组分固定技术的发展是提高传感 器性能的关键因素之一。通常的生物组分阉化技术应满足以下条件： 1 ) 固化后的生物组分仍能维持良好的生物活性； 2 ) 生物膜与转换器需紧密接触，且能适应多种测试环境； 3 ) 固定化层要有良好的稳定性和耐用性； 4 ) 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性： 在葡萄糖氧化酶传感器的制各过程中，葡萄搪氧化酶的固定是一个极为重要 的环节，酶的固定方法将影响酶的活性和传感器的稳定性。目前，酶的固定方法 如图7 所示，主要有吸附法，交联法，共价法，包埋法，电化学聚合法，各种固 定方法的优缺点如表3 所示。 吸附法 k dl kg )( e 】 共价法交联法包埋法 图7 各种酶固定化方法 在包埋法、交联法、共价键法三种酶固定化方法中，影响固定酶数量的因素 是不同的。在包埋法、交联法中，酶膜中包含酶分子的数量为： z = a 2 d c n 10 0 0 a 2 表示传感器电极的尺寸( m 2 ) ：d 是酶膜的厚度( m ) ：c 是在酶膜中酶的 1 0 匿 一一一二一一一亡 上海大学硕士毕业论文第一章绪论 浓度( m o l l ) ：n 是阿弗加德罗常数。 表3 各种酶固定化方法比较 项目吸附法包埋法交联法 共价法 制法难易易较难较难难 结合力弱强强强 固定后的稳定性较差较好良好良好 底物专一性不变不变可变可变 再生 可能不可能不可能不可能 制备时的失活 ，i 、 人大 固定化成本低低中等 在包埋法、交联法制各传感器的过程中，由于酶膜厚度的控制较难，固定 的酶分子数量有较大误差。 另一方面，共价键法结合在铂电极表面的酶分子数量为： z = a 2 r 中巾。a 。2( i = 1 ，2 ，n ) a 2 表示传感器电极的尺寸( m 2 ) ：r 是表面粗糙度的校正参数：o 是表面覆 盖程度：中，是被酶i 占据表面的相对量：a 2 是酶i 占据表面的绝对面积。前 三项参数主要受传感器基片性能的影响：a ，2 是与酶尺寸有关的常数：o 是一 个非常复杂的，与酶表面化学反应有关的参数。 共价键法制各传感器的过程中，电极表面的性能对酶电极的性能有很大的 影响。 1 4 1 吸附法 吸附法可分为物理吸附法和离子交换吸附法，本文根据实验需要主要介绍物 理吸附法。酶或其他生物组分在电极表面的物理吸附是一种较为简单的固定化技 术，此法主要通过极性键、氢键、疏水键的作用，将酶吸附于不溶性载体上，常 用的载体有多孔玻璃、活性炭、氧化铝等，已用此法固定的酶如脂肪酶、过氧化 物酶等。物理吸附法无需化学试剂、极少的活化和清洗步骤，以及同其他化学法 相比，对生物分子活性影响较小。但对溶液的p h 变化、温度、离子强度和电极 基底状况较为敏感，此种吸附是不可逆的，生物组分易从电极表面脱落，由于所 以电极稳定性较差而不被广泛采用，而且同其他固定化技术相比，生物组分往往 在几天之内就失活，寿命较短。 1 4 2 包埋法 包埋法是将生物组分包埋于高分予三维空间网状结构中，形成稳定生物组分 敏感膜。该技术的特点是：可采用温和的实验条件及多中凝胶聚合物；大多数生 物组分可很容易地掺入聚合物膜中，一般不产生化学修饰，对生物组分的活性影 响较小：膜的孔径和集合形状可任意控制，可固定高浓度的活性生物组分等。其 局限性为必须控制很多实验因素；聚合物形成过程中的产生的自由基对生物活性 单元可能产生失活作用；聚合物的空间结构使之局限于测定较小尺寸的物质；而 且，由于大的扩散排阻使响应时间增加。采用这种固定化技术时，通常采用物理 l l 上海大学硕士毕业论文第一章绪论 的方法将凝胶聚合物限制在电极表面，这使得传感器难以微型化，包埋法包括 基质包埋法和微胶包埋法两种。近来研究结果表明采用溶胶一凝胶技术将生物分 子固定于无机陶瓷或玻璃材料内，能明显改善活性的保持。常用的凝胶有：聚 丙烯酰胺、明胶、聚乙烯醇、丝素蛋白胶等 1 4 2 共价键固定法 将生物组分通过共价键与电极表面结合而固定的方法称共价键固定法，通常 要求在低温( o 。c ) 、低离子强度和生理p h 条件下进行。通过对电极进行化学修 饰，再利用酶蛋白分子中可以进行结合的，n h 、一o h 、一s h 、c o o h 等活性基 团与电极连接，该方法形成的酶膜厚度与吸附法相似，且酶电极的响应速度快、 稳定性好，酶紧密结合在电极上，酶的损失很少，无酶膜脱落和开裂现象。由于 酶分子与载体材料表面形成较大的多点结合界面，共价法的结合力较强，结合效 率较高，使酶的活性降低。该方法的操作比较复杂，影响固定的因素较为复杂， 酶、载体材料表面和连接试剂官能团的性质及其相互作用对结合效率有较大的影 响。 由于共价键法固定酶具有结合力较强，电极表面覆盖均匀，传感器具有重 复性好等优点，薄膜传感器的制各一般均采用该方法。但该方法的操作比较复 杂，影响固定酶的因素较多，电极表面的性能对酶电极的性能有很大的影响。 另外，在共价键固定酶过程中，有大量非共价键结合的酶吸附在电极上，存在 连续的解吸，影响传感器的性能。 1 4 4 化学交联法 借助于交联剂的作用，使酶分子之间发生共价结合，将酶分子直接与载体共 价结合。最常用的交联试剂为戊二醛，己报道的载体有胶原蛋白膜、肠膜、尼龙 布、透析膜、聚酰胺膜、蚕丝蛋白膜。也可加入少量牛血清蛋白作为辅助剂。采 用蚕丝蛋白膜作为载体进行固化时，由于蚕丝蛋白膜带有一n h 2 基团，从而可省 去牛血清蛋白，这样交联制成的酶薄膜，底物扩散阻力小，响应快。由于制备过 程涉及的试剂较小，酶失活的可能性小，且键合牢固，寿命长。 1 4 5 电化学聚合法 用电化学聚合方法制各生物传感器通常在中性溶液中。在酶、聚合单体、介 体和辅酶同时存在时，通过恒电位或电位循环扫描法使单体电氧化或还原聚合在 基体电极上。聚合过程中由于吸附或静电作用，酶或介体的功能其它物质同时嵌 入聚合膜中，与传统的固定化方法相比，有以下几个优点： 1 简单，电化学聚合和酶的固定化可一步完成并直接固定于电极表面。 2 聚合层厚度和酶的聚合量容易制得和调节从而制得重现性好的电极。 3 有些高分子膜具有选择性透过某些物质的功能，可起到降低干扰，防止电 极污染的作用。 在电化学聚合生物传感器中使用的电聚高分子膜有导电的和非导电的两大 类。导电的高分子主要有：聚吡咯、聚邻苯二胺、聚苯酚及其衍生物。聚合过程 是在中性或微酸性水溶液中进行，单体如毗咯，则将电位置于+ o 6 v 时，毗咯单 体便可在电上电氧化聚合。因为聚毗咯是导电的，聚合膜可随着电氧化的进行而 上海大学硕士毕业论文第一章绪 论 不断生长，通过控制电量则可随意控制聚合膜的厚度。聚吡咯的骨架是带正电的， 在聚合中需偶合进一些阴离子以保持电荷平衡。在聚合液中有酶存在时，例如 g o d ，其等电点为p i = 4 2 ，当溶液的p h 高于等电点时，g o d 便带负电荷，它与带 正电的聚毗咯膜发生静电作用，而使酶嵌入聚合膜中，因此，这种固定化方法实 质上是靠静电作用或吸附作用来固定酶。 1 5 影响酶活性的因素 酶分子的分子量很大，葡萄糖氧化酶的分子量为( 1 5 0 ，0 0 0 1 5 2 ，0 0 0 ) ， 具有活性，构象变化复杂。酶是比较脆弱的物质，在不合适的条件和容易发生变 性和失活。因此在处理酶时，首先应考虑避免酶的失活，即使在最适宜的条件下， 酶也会缓慢失活。采用比较强烈的处理( 强酸、高温、剧烈的试剂) 会使酶立刻 失活，研究酶的工作成功与否决定于能否避免使酶不稳定的条件，在处理酶时最 好不宜过分地延长时间。整个的制备过程应在2 3 天内结束，使酶储存而不失 活，最方便的是将其保存于深度冰冻的状态，此时它一般能稳定数月之久。 1 5 1 温度对酶的影响 温度对酶促反应速度的影响有两个方面：一个方面是在一定范围内当温度升 高时，反应速度也加快。这与一般化学反应一样；另一方面，随着温度的升高而 使酶蛋白质逐渐变性。 1 5 2 电场作用对酶的影响 电场的作用，可用于分离蛋白质，由于蛋白质分子电荷的性质和电量的不同， 各种分子向两极泳动的方向和速度有所不同。氨基酸既含有酸性的羧基，又含有 碱性的氨基，羧基可以电离释放质子( 酸性) ，氨基可以结合质子( 碱性) ，氨基 酸为一种两性电解质。当它处于酸性环境时，由于羧基结合质子而使氨基酸带正 电荷：若处于碱性环境时，由于氨基电离使氨基酸带负电荷：氨基酸带正电荷， 在电场中向阴极移动；氨基酸带负电荷，在电场中向阳极移动：移动的速度与外 加电场强度和它本身所带电荷成正比。 1 5 2 离子浓度对酶的影响 不同浓度的中性盐溶液对蛋白质有两方面的影响。一方面盐离子与酶分子的 极性和离子基团作用，降低酶分子的活度系数，使其溶解度增加，另一方面，盐 离子与水这种偶极分子作用，导致酶水合程度的降低，从而使酶的溶解度降低。 在盐浓度较低时，酶表现为易于溶解，产生盐溶现象。将盐的浓度提高到一定程 1 3 圭塑盔兰堡主兰些堡苎茎二兰堕堕 度以后，溶解度降低，发生沉淀，产生盐析。过高或过低盐的浓度都可以破坏酶 分子中的离子键，导致酶的活性受到影响。 1 5 3 有机溶剂对酶的影响 在溶液中加入与水互溶的有机物，可通过改变溶剂的介电常数，使酶分子间 的静电引力改变而发生沉淀。一些有机溶剂易使酶造成不可逆的活性损失，以致 引起完全变性。 1 5 5 p h 值对酶的影响 在一定的p h 值下，氨基酸所带正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此时的 p h 称为氨基酸的等电点，由于氨基酸具有两性电离，其带电情况就取决于环境 的p h 值。当氨基酸处于等电点时，由于所带正负电荷相等，在外加电场中就不 会发生移动；介质的p h 值小于氨基酸的等电点，氨基酸带正电荷，此时在电场 中向阴极移动：介质的p h 值大于氨基酸的等电点。氢基酸带负电荷，此时在电 场中向阳极移动；象其他蛋白质变性一样，酶的失活速度在大多数的情况下决定 于溶液中的p h 值。大多数的酶在室温下p h 值4 5 或8 l o 的溶液中失活。 1 6 主要研究内容和方法 本课题采用电化学电流法、多通道微弱信号检测技术、数字化和智能化应用 技术，在m e m s 技术基础上研制出一次性使用的葡萄糖传感器传感器阵列及其多 功能全血生化检测微系统。主要解决流路设计、加工、金属纳米颗粒组装、酶固 定化、稳定性、封装、多种微型生化传感器与检测电路集成等关键技术。采用的 研究方法如下： i ) 微芯片阵列芯片设计和制作：利用m e m s 工艺设计多种电极尺寸和工艺 流程，不断优化和改进，使器件结构更为合理，便于制作。将选用生物兼容性材 料制备微型金属电极电极阵列和毛细管取样沟道，使位于取样口的微量液体样 品在瞬间( 1 2 秒内) 就能布满反应沟道