（材料科学与工程专业论文）羟基磷灰石球粒堆积三维多孔支架及其体内异位成骨.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第l 页 摘要 骨组织工程支架作为组织工程学的一个分支得到了广泛的研究和发展， 它为解决和改善治疗人们生活中的骨缺损、骨修复提供了新的思路，带来了 新的希望。在骨组织工程支架的研究中，支架材料的选择是关键因素之一； 大量研究表明可作为骨组织工程支架的材料种类很多，它们都必须具备的共 同特点是：良好的生物相容性( 无毒、不致畸、无炎症反应等) ，良好的生 物降解性( 降解可控) ，适宜的力学性能( 满足实验所需) ，良好的材料表面 微环境( 微孔和粗糙程度等) 。而支架的形貌和结构又直接影响着它的功能， 随着研究的不断深入，对支架的要求也越来越具体：良好的三维贯通性，高 的孔隙率，合适的孔径大小，均匀的孔隙分布，高的比表面积和结构可控、 便于重复等等。为了满足这些要求，各种各样的支架制备方法被应用于实际， 但是到目前为止，还没能找到一种简单易行、经济实惠的制备方法。以此为 出发点，本论文进行了下面的探索性实验。 实验中选取以羟基磷灰石( h a ) 为原料：它属于生物陶瓷，其化学成份和 晶体结构与脊椎动物的牙齿、骨组织中的无机成分相似，具有优良的生物亲 和性，与骨组织极易结合，生物相容性好，更重要的是对人体组织无任何的 毒副作用。实验中采用球粒堆积的方式制备了新型的多孔陶瓷支架，为考察 该支架体系的生物活性，以动物狗为对象进行了体内非骨部位的诱导成骨性 能研究，并取得了满意的实验结果，其主要结论如下： 1 采用溶胶凝胶法和w o 乳化成球技术制备了多孔的h a 球粒，并对 其形貌结构进行了表征。结果显示：该方法制备的多孔h a 球粒粒径分布均 匀，球粒的粒径可通过搅拌的速率来调节且与搅拌的速率成反比：球形度优 良，具有很好的力学性能和高的比表面积，单颗纯h a 球粒的孔隙率分布在 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 l 页 1 5 2 0 之间。通过添加不同制孔剂的方法可以改变球粒内部的孔隙大小和 孔隙形貌，并可以提高单颗球粒的孔隙率，平均值最高可达到3 0 。 2 采用有机泡沫模板法制备了多孔h a 网管和盖子，通过球粒堆积的方 式制备了新型的三维多孔圆柱状支架，赋予了其规整的外形，优良的三维贯 通性和高孔隙率( 平均分在布4 8 6 6 9 左右，最高可达到7 0 ) 。该支架 主要优点在于：支架结构、孔隙结构可控，孔隙大小分布广泛，微孔和宏孔 相结合，孔隙形貌特别且可调。 3 在动物狗体内四个不同的非骨部位对支架的异位诱导成骨能力进行了 研究，具体部位为腹腔内大网膜包裹( a c ) 、壁层腹膜内( p ) 、股部肌肉( m ) 、 股骨旁骨膜覆盖( f p ) 。体内实验结果显示：在未载入任何生长因子或药物的 前提下，六个月时，本支架体系表现出良好的异位骨诱导性：在部位p 和m 的支架，微球问骨基质生长良好，血管生长丰富，有大量成熟的骨细胞镶嵌 在骨陷窝上；而在f p 部位的支架是生长情况最好的，可以明显的见到骨组 织生长优异且有片层状的新骨长成。这说明该支架孔隙结构合理，孔隙大小 适宜，利于细胞的粘附生长和新生血管的长入，为组织液和氧份等提供了便 捷的通道，有利于新陈代谢。在相同时间下，种植在a c 部位的支架内血管 生长数少，管径小，也未见到明显的骨基质生长。不同非骨部位的结果反应 出支架的异位诱导能力跟种植的部位密切相关，且支架在植入前期的内部血 管化程度是影响支架异位诱导能力的一个至关重要的因素。综合分析，在本 实验中，支架在同物种不同非骨部位诱导成骨能力的强弱顺序排列如下： f p p = m a c 。 关键词：羟基磷灰石，球粒堆积，多孔支架，异位成骨，骨诱导 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 l l 页 a b s t r a c t t h es c a f f o l do fb o n et i s s u ee n g i n e e r i n ga sab r a n c ho ft i s s u ee n g i n e e f i n gw a s g o tab r o a ds t u d ya n dd e v e l o p m e n t ，i tc o u l db eo f f e rs o m en e wi d e a sa n db r i n g s o m eh o p ef o rs o l v i n ga n di m p r o v i n gt h et h e r a p yo fb o n er e p a i ra n dr e p l a c e m e n t i np e o p l e sd a i l yl i f e i nt h es t u d yo ft h i sf i e l d ，k i n d so fm a t e r i a li st h ek e yf a c t o r al o to fs t u d yi n d i c a t et h a tm a n yk i n d so fm a t e r i a l sc a nb eu s e di nb o n et i s s u e e n g i n e e r i n g , b u tt h e y m u s th a v et h ec o - c h a r a c t e r i s t i c s ：b e g o o d a t b i o c o m p a t i b i l i t y ( i n n o c u i t y , n o - t e r a t o g e n e s i s ，n o - i n f l a m m a t i o nr e s p o n s ee t c ) ， b i o d e g r a d a t i o n ( t h ev e l o c i t y o f d e g r a d a t i o n c a nb e c o n t r o l l e d ) ， m i c r o e n v i r o n m e n to fm a t e r i a l ss u r f a c e ( i n c l u d em i c r o p o r o u sa n dr o u g h n e s s ) a n dm e c h a n i c a lp r o p e r t y ( t og r a t i f yt h en e e do fe x p e r i m e n t ) o nac e r t a i ne x t e n t ， f u n c t i o no ft h es c a f f o l di si n f l u e n c e db yi t ss h a p ea n ds t r u c t u r e ，t h e r e f o r e ，m o r e a n dm o r ei d i o g r a p h i cr e q u i r e m e n t sc a nb ep r o p o s a l e di nt h ei n t e r e s to fi m p r o v i n g c a p a b i l i t yo fi t f o ri n s t a n c e ：t h r e e d i m e n s i o n a li n t e r c o n n e c t i o n ，h i g hp o r o s i t y a n d s p e c i f i cs u r f a c e 盯e a ，p o r es i z ea n dd i s t r i b u t i o n ，c a nb ec o n t r o l l e da n d r e p e a t e de a s i l y i no r d e rt os a t i s f yt h i sr e q u i r e m e n t sm a n ym e t h o d so ff a b r i c a t i o n s c a f f o l dw e r eu s e di np r a c t i c e ，b u t ，u pt on o w , p e o p l ea r em u c ht os e e kas o r to f p r e p a r a t i o nm e t h o dw h i c hi ss i m p l e n e s sa n de c o n o m y a tb e g i n n i n go ft h i s ，w e p u tu pae x p l o r i n ge x p e r i m e n ti nt h i sp a p e r h y d r o x y a p a t i t e ( h a ) b e l o n g st ob i o c e r a m i ci sp e r f o r m e di n t h i s s t u d y b e c a u s ei t sc h e m i c a lc o m p o s i t i o na n dc r y s t a ls t r u c t u r ei se x t r a o r d i n a r ys i m i l a r w i t hi n o r g a n i ci nd e n sa n do s s e o u st i s s u ei nv e r t e b r a t e ，w h i c hw i t he x c e l l e n t b i o c o m p a t i b i l i t ya n dc o m b i n ew i t ho s s e o u st i s s u ee a s i l y an o v e lp o r o u s 西南交通大学硕士研究生学位论文第页 b i o c e r a m i cs c a f f o l di sp r e p a r e db ya c c u m u l a t i n gh as p h e r u l e sa n di no r d e rt o s t u d ye c t o p i ao s t e o i n d u c t i o no f t h es c a f f o l d si nv i v ow h i c hw e r ei m p l a n t e di n f o u rd i f f e r e n tn o n - o s s e o u ss i t e si nd o g s a tl a s t ，w eg e tau s e f u la n ds a t i s f y i n g r e s u l t s ，t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ed r a w na sf o l l o w s ： 1 f a b r i c a t i o np o r o u sh a s p h e r u l eb yt h em e t h o do fs o l - g e la n dw a t e r o i l e m u l s i f i c a t i o nt e c h n o l o g y r e s u l t so fc h a r a c t e r i z a t i o nr e v e a lt h a t ：p o r o u sh a s p h e r u l e sw i t hah i g hs p e c i f i cs u r f a c ea r e a ，aa p p r o p r i a t em e c h a n i c a lp r o p e r t ya n d e x c e l l e n ts o p h e r i c i t y , p o r e ss i z ei si n v e r e s er a t i ot os t i r r i n gs p e e da n dp o r o s i t yo f h as p h e r u l ei nt h es c o p eo f1 5 t o2 0 ，m i c r o p o r e ss i z ea n ds h a p ec a nb e c h a n g e db yp o r e m a k e r , u n d e rt h i sc o n d i t i o n s ，p o r o s i t yo fh as p h e r u l e sc a nb e a r r i v e da t3 0 i nm a x 2 m e t h o do fp o l y m e rs p o n g et e m p l a t ei su s e dt op r e p a r a t i o np o r o u sh at u b e a n dd i s c s ，a n dan o v e lt h r e e - d i m e n s i o n a lp o r o u sb i o c e r a m i cs c a f f o l dc a l l e dt h e h as p h e r u l es c a f f o l dw i t hr e g u l a rs h a p e ，e x c e l l e n ti n t e r c o n n e c t i o na n dh i g h p o r o s i t y ( a v e r a g ei si nt h es c o p eo f4 8 t o6 6 9 ，t h em a x c a nb eu pt o7 0 ) m a n u f a c t u r e db ya c c u m u l a t i n gh as p h e r u l e s t h eg r e a t a d v a n t a g e so ft h i s s c a f f o l da r et h ec o n t r o l l e di n t e r c o n n e c t i o no fp o r e s ，t h ea d j u s t a b l em i c r o s t r u c t u r e o fh a s p h e r u l e sa n dt h ee a s yr e c o n s t r u c t i o no fp o r o u ss t r u c t u r e 3 t os t u d yaa b i l i t yo fo s t e o i n d u c t i o no ft h es c a f f o l d sw h i c hw e r ei m p l a n t e d i nf o u rd i f f e r e n tn o n o s s e o u ss i t e si nd o g s ：i na b d o m i n a lc a v i t y ( a c ) ，p e r i t o n e u m p o c k e t ( p ) ，m u s c l e ( m ) a n db e s i d et h ef e m u r ( f p ) s a m p l e sa r ec o l l e c t e da f t e rs i x m o n t h sa n dt h er e s u l t si n d i c a t et h a t ：t h eh as p h e r u l es c a f f o l dc a ni n d u c e a n g i o g e n e s i sa n db o n ef o r m a t i o nw i t h o u tu s eo fc y t o k i n e sf o rv a s c u l o g e n e s i so r b o n e - i n d u c t i o n t h e r ew e r en o to n l yam a s so fb l o o dv e s s e l sa p p e a r e da n dal o t o fm a t u r eo s t e o c y t e si n l a y e do nt h eb o n el a c u n ab u ta l s ot h eb o n es t r o m ag r e w 西南交通大学硕士研究生学位论文第v 页 w e l la n dap l e n t yo fc o l l a g e nf i b r e sf i l l e di ni ta p p e a r e da r o u n dt h es p h e r u l e s w h i l es p e c i m e n t si m p l a n t e d e di npa n dm ，a n dw h e nt h es p e c i m e n t si nf pt h e g r o w t hc o n d i t i o n si st h eb e s tt h a tt h eo s s e o u st i s s u e sd e v e l o p e dq u i t ep e r f e c ta n d t h en e w l y - f o r m e db o n ee v e nh a dal a m e l l a rs t r u c t u r ew i t hm a n ym a t u r e o s t e o c y t e s s o ，t h e s ep r o v e dt h a tt h i ss c a f f o l dh a v ear e a s o n a b l ep o r es t r u c t u r e ， p o r es i z ea n dp o r o s i t y , w h i c h i nf a v o ro fa t t a c h m e n t ，d i f f e r e n t i a t i o na n d p r o l i f e r a t i o no fc e l l s ，p r o v i d eac o n v e n i e n tc h a n n e l st ot r a n s p o r tt i s s u ef l u i da n d n u t r i e n t ，s p e e du pm e t a b o l i s m i nc o n t r a s t ，t h e r ew e r eas m a l lq u a n t i t yo fb l o o d v e s s e l sa n da l m o s tn on e w l yf o r m e db o n ei nt h e s p e c i m e n si m p l a n t e di n a b d o m i n a lc a v i t yw h i l eaf e wo fc o l l a g e nf i b r e sa r o u n dh a s p h e r u l e s d i f f e r e n t r e s u l t sr e v e a lt h a t e c t o p i ao s t e o i n d u c t i o ni sd i r e c t l ya t t a c h e dt ot h es i t eo f n o n - o s s e o u sa n dt h ed e g r e eo fv a s c u l a r i z a t i o ni np r o p h a s ei sav i t a li m p o r t a n c et o o s t e o i n d u c t i o n i nt h i ss t u d y , t h es e q u e n c eo fo s t e o i n d u c t i o na b i l i t ya tt h ef o u r d i f f e r e n tn o n o s s e o u sa sf o l l o w s ：f p p = m a c k e yw o r d s ：h y d r o x y a p a t i t e ，s p h e r u l e sa c c u m u l a t i n g ，p o r o u ss c a f f o l d ，e c t o p i a b o n eg r o w t h ，o s t e o i n d u c t i o n 西南交通大学学位论文创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作 所得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承 担。 本学位论文的主要创新点如下： 1 采用溶胶凝胶法和w o 乳化成球技术制备了球形良好，粒径分布 均匀的多孔h a 球粒。 2 制备了一种新型的球粒堆积三维多孔支架，并可实现支架结构、孔 隙率和孔径大小可控。 3 在不载入生长因子或药物的前提下，本论文中动物实验结果显示： 本支架体系在非骨部位具有良好的骨诱导性，不同非骨部位的实验 结果为后续实验奠定了基础，提供了参考的依据。 西南交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书； 2 不保密一，使用本授权书。 ( 请在以上方框内打“”) 指导老师签名： 吼叫年莎月手日 旁一妒 名 ，月 签 者 e 作忽厂姗卡 论 位 期 学 日 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 1 1 组织工程简介 第一章绪论帚一早珀 下匕 自现代医学诞生以来，伴随着病废组织器官的切除，总是有相应的组织 器官修复及功能重建。面对这些需进行的修复和重建，仍存在许多困难和问 题，如：自体移植中组织器官供源的局限性；异体移植中存在着的短期和长 期的免疫排斥问题等。为解决这些问题，医学专家和研究学者考虑使用人工 替代材料修复组织缺损和功能重建，认为依靠细胞本身作为生物替代材料修 复缺损以达到恢复组织器官的形态和功能是一种理想中的模式。为此，组织 工程的概念于1 9 8 7 年被正式提出并明确定义为：“组织工程是运用工程科 学和生命科学的原理和方法，从根本上认识正常和病理的哺乳动物的组织结 构一功能关系，并研究生物学替代物以恢复、维持和改进组织功能。”【“2 l “组织工程学( t i s s u ee n g i n c e d n g ) 的概念一经提出，就受到了广泛关 注和足够的重视。发展至今大致可为三个阶段：初期：探索了组织工程化 的组织构建并证明应用组织工程技术能够形成具有一定结构与形态的组织， 展示了组织工程研究的广阔前景；过渡期：为检验实验初期研究成果的可 行性，研究和实验向临床应用过渡并积累了丰富的实践经验和参数；发展 期：随着理论研究的不断深入和临床技术的提高，组织工程的临床应用与初 步产业化日趋成熟【”】。 考虑到在组织工程领域所取得的进展，有人称之为人体再造工程并设想 “将来医院会像一个人体配件工厂一样，为病人更换功能衰竭或缺失的组织 或器官 ，以至于美国生物学家、诺贝尔奖获得者吉尔伯特如此预言：“用 不了5 0 年，人类将能够培育出人体的所有器官。 【6 】 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 1 2 骨组织工程组织工程的重要分支 随着材料学、分子生物学、临床医学的发展，随着组织工程学的兴起， 骨组织工程( b o n et i s s u ee n g i n e e r i n g ) 作为组织工程的组成部分，得到了足够 重视和发展。目前已成为研究的热点和中心领域，其研究的重点是寻求能够 作为细胞移植与引导新骨生长的人工合成与天然的支架结构，作为细胞外基 质的替代物，其目的是为解决人们实际生活中骨缺损的修复和骨坏死的替换 等问题，为人类社会的医疗事业和人们的实际生活服务。 其具体定义为：将分离所得的成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞， 经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可 被人体逐步降解吸收的细胞支架( s c a f f o l d ) 或称细胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ，e c m ) 上，这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间，有利于 细胞获得足够的营养物质，进行气体交换排除废料使细胞在预制形态的三维 支架上生长，然后将这种细胞杂化材料( h y b r i dm a t e r i a l ) 植入骨缺损部位，在 生物材料逐步降解的同时种植的细胞不断增殖从而达到修复骨组织缺损的 目的川。 骨骼作为人体的支架，担负着支撑、承重和造血等功能。在临床上由于 创伤、感染和肿瘤等所造成的骨缺损现象很普遍，为解决骨缺损问题，有时 采用自体骨移植，但其来源有限，还会引起骨切除处的损伤，而异体骨具有 抗原性，有时会因强烈的排斥反应导致植入失败。为此，人们力求通过寻找 新的方式来解决诸如此类的困扰。通过在临床的检验和逐步应用取得的成果 说明：骨组织工程是组织工程中最具有可行性和前途的领域之一【踟。目前， 对骨组织工程的研究主要集中在种子细胞的选择，细胞外支架材料的选择、 支架的构建以及种子细胞与细胞支架复合植入体内后生存与生物相容性等 问题。 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 1 3 骨组织工程与三维多孔支架 1 3 1 骨组织工程对支架材料的要求 在骨组织工程中，支架材料的选择是关键，它不仅影响细胞的生物学行 为和培养效率，而且决定移植后能否与机体很好地适应、结合与修复。它的 发展方向之一就是寻找理想的细胞外基质替代材料，为细胞粘附、生长和增 殖提供良好的支架环境。大量的研究结果f 9 - 1 4 l 表明：骨组织工程支架材料应 满足以下几个方面的要求：具有良好的生物相容性。不致畸，在体外培养 时无细胞毒性，植入体内时不会引起机体炎症和排斥反应；具有三维多孔 的立体结构。高度多孔的类似泡沫状，并有很大的比表面积，既有利于细胞 的植入、粘附和细胞外基质沉积，又有利于细胞营养成分、氧气的渗入和代 谢产物的排出，还可以有利于血管和神经的长入；具有良好的表面活性。 能促进细胞的粘附并为细胞在其表面的增殖提供良好的微环境；具有生物 可降解性。支架在组织形成过程中可逐渐被降解，降解速度应与组织细胞生 长速度相适应，降解时间能跟据组织生长特性进行调控，并且不影响新生成 组织的结构和功能；具有可塑性和一定的机械强度。在植入体内后的一定 时间内仍可保持其形状至新生组织长入后具有自身生物力学特性，并使新形 成的组织具有符合设计的外形。 就支架孔的要求来看，在尺寸上应该分不同的级别：外形尺寸( 伽) 、大 孔尺寸( 1 0 么m ) 、小孔尺寸以m ) 和微孔尺寸( 1 0 2 n m ) 。从制备方法上看，后三 者孔的结构取决于致孔方法，前者取决于成型方法。因此，组织工程支架的 制备应分为致孔和成型两个层次，二者相互结合才能获得相连的多孔结构和 合适的外形，制得满足要求的支架。 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 1 3 2 骨组织工程支架材料的研究和发展 支架材料在骨组织工程中起到细胞外基质的作用，是对细胞外基质的结 构和功能的仿生。它不仅起支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模 板作用，为细胞提供粘附、生长、分化和增殖的场所，从而引导受损组织的 再生和控制再生组织的结构。相应的它的具体作用体现如下：支架材料的 结构和形貌控制再生组织的结构、尺寸和形貌，引导组织生长成特定形态； 作为载体将信号分子运送到缺损部位，并作为缓释体使骨诱导因子缓慢发 挥作用引导组织的再生和成长；作为骨组织繁殖分化和新陈代谢的场所， 为细胞生长输送营养，排除废物：支架表面特殊位点与组织特异性反应， 对不同类型细胞起“身份鉴别，及选择粘附的作用；起到机械支撑作用， 抵抗外来的压力，维持组织原有的形状和组织的完整性。 目前，骨组织工程研究中可应用的细胞外基质材料主要有：生物类材料 ( 天然生物衍生材料) 、生物陶瓷类材料、聚合物类材料以及复合类材料。 1 3 2 1 生物类材料 生物类材料主要指同种异体骨和异种骨，两者都存在免疫原性和传播疾 病的问题。前者来源有限，而后者来源丰富、价格低廉，可降低抗原性，具 有一定的开发应用前景。异种骨天然网状孔隙结构系统未受明显破坏，具有 良好的孔隙率、孔径大小合适，有利于组织细胞黏附、生长并为细胞外基质 分泌提供宽大的内部空间。t s u a n g 等【1 5 】将鼠的成骨细胞与天然p y r o s t 骨体外 复合培养，结果p y r o s t 骨不仅有利于成骨细胞的附着，而且还适宜成骨细胞 增殖；h o f m a n 等【1 6 】将成骨细胞分别与两种不同理化方法处理过的天然异种 骨l a d d e c 骨和b i o o s s 骨体外复合培养后发现，前者周围形成的矿化骨量比 后者多，表明l a d d e e 骨能为成骨细胞提供更加适宜的成骨环境。但去除了 有机成分的骨矿材料疏松易碎，无机械强度，脱钙骨缺乏骨矿，质地柔软， 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 不具有力学刚度，从而限制了异种骨在骨组织工程中的应用。 而天然生物衍生材料具有很多人工合成材料难以相比的优点，其来源丰 富，造价低，并有很好的生物相容性以及有些材料具有天然的孔隙结构系统。 目前应用较多的主要有胶原( i 型胶原为主) 、甲壳素、壳聚糖、天然珊瑚及其 衍生物等。 胶原是骨组织的主要成分之一，它为钙化组织提供必不可少的三维结 构，对矿物沉积有诱导作用；用膜封闭的蜂房状胶原支架与环状纤维细胞联 合培养来进行椎间盘修复的组织工程学研究结果显示：细胞可以在支架中生 长和保持显型稳定【切。壳聚糖是甲壳质的脱乙酰产物，无毒、无味，有良好 的生物相容性，且其分解产物对人体无害，是一种新型天然医用生物材料。 实验表明1 1 8 1 壳聚糖能促进前期骨细胞分化，加速骨形成的作用，具有骨传导 性。珊瑚是一种海生无脊椎动物的骨骼，化学成分9 9 为碳酸钙，还有少量 其它元素和有机成分，类似无机骨；具有多孔性和高孔隙率，可生物降解， 生物相容性好，无明显免疫原性，在新骨形成过程中，其降解产物及残留的 磷酸钙成分可作为新骨组织的原料加以利用。a m a u d 等【1 9 l 采用天然珊瑚骨 携带成骨细胞和骨形态发生蛋白( b m p ) 来修复鼠的颅骨缺损取得良好效果。 1 3 2 2 生物陶瓷类材料 生物陶瓷是由金属离子及非金属离子以离子键结合的晶体材料。生物陶 瓷类材料很多，主要由钙、磷元素组成，它们是人类骨组织的主要无机成分。 其材料可加工成多孔隙结构，利于组织细胞长入和代谢及营养物质出入。试 验中显示出良好的生物相容性，植入骨断端易形成骨性结合，材料轻度溶解 所形成的高钙离子层及微碱性环境，可有效促进成骨细胞的黏附、增殖及分 泌基质 2 0 l 。常用的有生物降解陶瓷( 如磷酸三钙：t c p ) 和生物活性陶瓷( 如羟 基磷灰石：h a ，生物活性玻璃陶瓷：b g c ，双相钙磷陶瓷：h a t c p ) ，其中h a 、 t c p 、b g c 和h a 厂r c p 是骨组织工程中常用的细胞外基质材料。 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 h a 是应用最广的高度亲骨性替代材料，在新骨形成过程中起骨引导作 用，。但降解非常慢，有望通过调节h a 厂r c p 复合物中二者的比例控制其降解 速率，使其成为理想的骨组织工程学细胞载体。h a 厂t p 和多相陶瓷具有骨 诱导作用，这种作用与材料结构有关，只有大孔壁上富含微孔的多孔陶瓷才 具有诱导成骨能力。一般也认为，材料中的钙磷比率( c a p ) 和物质结构是决 定其生物降解性的关键因素：t c p 的c 棚为1 5 0 ，在大于8 0 0 高温的条 件下烧结后表现为b 磷酸三钙( 1 3 t c p ) 物质结构，植入体内可逐渐降解；h a 的主要成分与t c p 相似，但c a p 为1 6 7 ，烧结后仍保持磷灰石( a p a t i t e ) 物质结构，所以植入体内后不发生降解或降解极微【2 1 1 。 1 3 2 3 聚合物类材料 人工合成可降解聚合物主要有：聚乳酸( p l a ) 、聚乙醇酸( p g a ) 、聚原酸 酯( p o e ) 、聚己内酯( p c l ) 、聚羟丁酯( p h b ) 及其共聚物等。目前组织工程常 用的合成聚合物是聚乳酸( p l a ) 、聚乙醇酸( p g a ) 及其共聚物，p l a 在体内 降解生成乳酸，是糖的代谢产物，p g a 在体内降解为羟基乙酸，易于参加体 内代谢。v a c a l l t i f 2 2 】首先将p g a 、p l a 用作软骨细胞体外培养基质材料，通 过组织工程方法获得新生软骨成功，显示出良好的成骨效应；b o r d e n 2 3 l 在球 形多孔p l g a 聚合体骨支架上的体外培养成骨细胞和成纤维细胞实验中发 现：体外培养1 4d 后成骨细胞已爬满骨支架的表面，并在各相通的小孔内连 成一体，骨支架降解的速率可通过调节聚合体的分子量来控制。 尽管目前p l a 、p g a 及其共聚物作为组织工程细胞外支架材料应用广 泛，但在应用过程中也发现一些缺点：亲水性差，细胞吸附力较弱；易 引起无菌性炎症；机械强度，抗压强度不足；聚合物中残留的有机溶剂 的细胞毒性作用以及与周围组织的免疫反应等1 2 4 】。 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 1 3 2 4 复合类材料 当单一类型的材料难以满足骨组织工程用细胞外支架材料的要求时，通 过合适的方法将几种单一材料复合，综合各种材料优缺点，取长补短，形成 复合型材料，在实际应用中取得了良好效果。 ( 1 ) 有机无机复合型材料 d c v i n 2 5 l 将h a 与p l g a 共聚物组成多孔复合支架材料，实验表明复合 材料抗压弹性模量随h a 含量增加而增加；同时，h a 的引入也延缓了聚合 物的降解时间。因此，将钙磷陶瓷引入p l g a 共聚物中，可改善p l g a 的机 械性能差、降解速度快、骨结合力弱等缺点。l u 【2 6 】研究p l g a 生物活性玻 璃三维多孔复合材料的生物活性、生物降解性和物理强度以及成骨细胞的黏 附和生长等特性及体外的钙磷沉积、体内的骨形成特性，认为复合类材料有 利于成骨细胞的黏附和生长，并有一定的骨诱导活性。 ( 2 ) 人工合成材料与天然生物衍生材料的复合材料， 在陶瓷类材料与胶原的复合研究中，h s u i 刎将羟基磷灰石与胶原复合后 与颅骨的成骨细胞体外培养实验表明羟基磷灰石一胶原复合物有利于成骨细 胞附着、生长、繁殖及功能发挥。b a k o s 2 s 等将羟基磷灰石与胶原复合后再 与透明质酸复合，得到排列紧密的生物材料。该材料不仅机械性能和溶胀模 数明显提高，而且具有很高的粘附性及生物相容性，更适合细胞粘附、生长 及功能发挥。 1 3 3 骨组织工程支架的制备方法 目前，组织工程多孔支架的孔形态主要有三种：纤维、多孔海绵或泡沫、 相连管状结构【2 9 】。相应地，其致孔方法和技术也各不相同。 1 3 3 1 纤维支架 纤维支架材料是组织工程研究中采用的细胞外基质替代物之一，主要由 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 p g a 或其共聚物等结晶性聚合物纤维构成。利用纺织技术制备的多孔支架其 孔隙率可高达9 7 ，但存在力学强度较差、承压时会坍塌的缺点，将织物热 处理或采用p u a 或p l g a 溶液涂覆织物的方法，可使相邻纤维间形成物理 连结，从而使纤维支架稳定、耐压【m3 。p g a 纤维支架易于借助于模具制 成各种形状，已成功地用于软骨等多种组织工程领域【1 2 3 2 1 。 纤维支架的不足之处在于孔隙率、孔尺寸不易控制和独立调节。 1 3 3 2 多孔泡沫或海绵支架 多孔泡沫或海绵支架的致孔方法主要有粒子致孔法、气体发泡法、热诱 导相分离法和烧结微球法等。 a ) 粒子致孔法 粒子致孔法指首先将组织工程材料和致孔剂粒子制成均匀的混合物，然 后利用二者不同的溶解性或挥发性，将致孔剂粒子除去。由m i k o s 等【3 3 1 作为 纤维连结法的改进而提出的溶剂浇铸粒子浸出法，已成功地用于软骨细胞的 培养和软骨组织的生成，且该方法制得的多孔支架的孔隙率可达9 1 9 3 ， 孔尺寸在5 0 5 0 0 l m ，孔的比表面积随粒子用量增大和粒径减小而增大，变 化范围为o 0 6 4 加1 1 9 9 m 一。s h a s t r i 等【卅报道了采用含蜡的碳氢化合物作为致 孔剂制备的p u a 和p l g a 泡沫的孔隙率高达8 7 ，孔径超过1 0 0 z m 。 粒子致孔法简单、适用性广，孔隙率和孔尺寸易独立调节，但致孔时往 往需用到有机溶剂。 b ) 气体发泡法 气体发泡技术采用气体作为致孔剂，形成的泡沫材料中孔与孔之间大多 数是非连通的，非连通的孔结构影响细胞在该支架材料中的种植和生长。气 体发泡法分为物理发泡法和化学发泡法。物理发泡技术1 3 5 】是将聚合物压成 片，浸泡在高压c 0 2 中至饱和，甚至超临界状态，然后降至常压，气体的热 力学不稳定性导致气泡成核和增长形成多孔支架，但孔为闭孔。该技术中影 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 响孔隙率和孔结构的因素主要有聚合物结晶性和分子量、平衡时间、放气速 率等。n a m 等【蚓报道了一种采用化学发泡技术与粒子沥滤相结合的方法，采 用该技术制备的支架材料的孔隙率达9 0 ，孔径在2 0 0 - 5 0 0 m 范围内。 c ) 相分离法冷冻干燥法 相分离冷冻干燥法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷 冻过程中发生相分离，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构。该方法制 得的支架材料孑l 尺寸往往偏小，应用存在一定的局限性。w h a n g 掣3 7 】采用该 方法制备的多孔支架孔隙率达到9 0 9 5 ，大孔尺寸达2 0 0 。u m ，溶剂挥发 还会形成0 0 1 z m 以下的微孔，孔与孔之间互相连通。n a m 等【3 8 1 通过冷冻过 程参数的调控并利用加粗效应制备了孔尺寸超过1 0 0 , u m 的多孔支架，发现 孔尺寸的影响因素主要有溶液浓度、冷冻速率和冷冻温度梯度。 d ) 烧结微球法 烧结微球法是将可降解聚合物微球加入模具中，加热至玻璃化温度以 上，保温一段时间后冷却、脱模可制得烧结微球支架【3 9 1 。热处理时微球相互 接触处由于链运动而连结在一起，冷却至室温后该结构被固定下来，因而得 到多孔的烧结微球支架，支架的孔隙率就是微球间的间隙，它直接与微粒的 直径相关。微球紧密堆积产生的孔隙成为支架的孔，孔尺寸与微球尺寸成正 比，且孔相连性好。该支架的孔隙率与松质骨中相近，力学性能也与松质骨 相当，因而可作为松质骨修复的“负”模板，修复完成后孔的部分成为组织， 聚合物微球部分降解后成为松质骨的空隙【2 9 1 。 该法优点在于微粒可包裹生长因子，进行可控释放，孔连通，孔尺寸易 调控，力学强度大，缺点则是孔尺寸偏小，孔隙率低。如果将烧结微球法制 得的多孔支架作为“负 支架，在该支架的孔道中填充陶瓷浆料，然后通过 热处理除去“负 支架，即可制得高孔隙率、孔尺寸可控的多孔陶瓷支架。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 0 页 1333 相连管状孔道支架 将糖纤维等水溶性纤维材料预先构建成具有特定结构的三维“负”支架， 经水蒸汽处理后形成连结，然后将聚合物溶液滴在“负”支架上，冷冻使聚 合物溶液凝胶化，用水浸出糖纤维，然后冷冻干燥脱除溶剂，得到的多孔支 架具有预先设计的相连管状孔道结构，孔隙率高达9 0 以上，并具有纳米纤 维孔壁结构i 删。该支架的相连管状孔道结构更有利于支架内的传质过程，其 纳米纤维孔壁结构则更有利于细胞粘附。 133 4 其它方法类支架 除上述介绍的方法之外，随着科学技术的发展和研究的深入，一些先进 的技术方法也被融入进来，实现了设计、制造现代化和自动化。比如：超临 界c 0 2 法( 图3 1 ) ，静电纺丝技术( 图3 2 ) 以及计算机辅助成型技术，低温 沉积技术( 图3 - 3 ，3 - 4 ) 等。此外，如今得以快速发展和应用的还有一类“快 速成型”的方法p ”，比如：立体光刻法( s i c r e o l i l b o g r a p h y ，s l a ) i 4 2 j 、选择性 激光烧结他l e c t i v el a s e rs i m e r i n g ，s is ) i 州、熔融沉积成型( f i l s e dd e p o s i t i o n m o d e l l i n g ，f d d m 、分层实体制造a 姗岫砒e d o b j e c t m a n u f a c t u r i n g ，l o m ) 盯l 和三维立体喷涂仙他e - d i m e n s i o n a lp r i n t ，3d - 叫n t i n g ) 州等；这些技术方法的 优势明显，具体的制各技术在这里就不一一介绍，可参考相应的文献。 重愿塞 麓， m 1 # t 心 图3 - 1 超临界c 0 2 s u 各支架示意图图3 - 2 静电纺丝过程示意图 西南交通大学硕